包含变体inc编码链的核酸分子的制作方法

文档序号：24984352发布日期：2021-05-07 23:01阅读：473来源：国知局

本发明涉及包含变体inc编码链的核酸分子，其中所述变体inc编码链编码变体incrna，并且所述变体incrna为质粒拷贝数目的调控因子。

背景技术：

质粒在生物技术中起到重要作用，提供用于引入靶基因、修饰靶基因和从微生物中去除靶基因的方式，以及用于产生由靶基因编码的相应蛋白的方式。质粒是天然存在于广泛范围的细菌、古生菌和真核生物领域的核酸分子，其与它们所存在的微生物的染色体物理分离并且独立于染色体而复制。质粒通常是双链环状dna分子，但是也可为线性dna分子和/或rna分子。质粒以约1kb至超过2mb范围内的尺寸存在。例如，根据最新综述文章shintani等人,frontiersinmicrobiology6:242(2015)，在genbank数据库中发现的4602个质粒中观察到广泛的尺寸变化，其中质粒的尺寸范围为744bp至2.58mb，并且质粒的平均尺寸为80kb。质粒也以拷贝数/细胞的范围存在。例如，质粒的特征通常在于低拷贝数(例如1-20个拷贝/细胞)、中等拷贝数(例如20-100个拷贝/细胞)或高拷贝数(例如500-700个拷贝或更多个拷贝/细胞)。质粒可被修饰为包含靶基因。

生物技术中与使用质粒相关的挑战为，生物技术应用通常需要将靶基因稳定掺入微生物中并小心控制靶基因及其相应蛋白质产物在培养期间的产率，但实现一种应用的努力可能不利于实现另一种应用。在培养包含具有靶基因的质粒的微生物期间，通常有利的是使质粒在微生物细胞生长并分裂时稳定聚集，使得更高百分比的微生物细胞将在整个培养过程中包含靶基因。通常有利的是，使靶基因在结构上保持稳定，从而维持恒定核苷酸序列，以确保仅产生期望产物。通常有利的是，在足够高到实现所需结果的水平下表达靶基因，所述结果例如以足够量并以活性形式产生相应蛋白质产物。不幸的是，用于复制质粒并由所述质粒特别地以高水平表达靶基因的技术对细胞施加代谢负荷。这可能导致质粒从细胞中丧失和/或导致改变靶基因的表达水平或身份的突变。这还可能导致相应蛋白质产物聚集且无活性。因此，在生物技术应用中使用质粒期间平衡稳定结合与产率控制通常是涉及试验和误差的经验过程。

质粒拷贝数是关于稳定结合和产率控制二者的重要考虑因素。质粒拷贝数通常由三种因素决定，所述因素为质粒的复制起点、质粒的尺寸(包含其中所包含的靶基因)和培养条件。关于复制起点，质粒可基于其复制的特征、特别是其复制起点来分类到不相容组中。特别地，质粒通常包含复制子，其与质粒的从单一复制起点复制的区域相对应。质粒通常还包含编码识别质粒复制起点并在此启动复制的蛋白质的基因。质粒的蛋白质与复制起点之间的相互作用决定了复制的特异性和复制子的拷贝数，并因此决定质粒的拷贝数。具有相同复制起点的质粒基于关于聚集体不稳定性的质粒彼此不相容性而分类到相同不相容组。具有不同复制起点的质粒可在质粒彼此相容时分类到不同的不相容组中。关于质粒的尺寸，增加尺寸通常导致与质粒复制和由所述质粒表达靶基因相关联的代谢负荷逐渐增加并且因此导致质粒的拷贝数减少。关于培养条件，这些也影响代谢负荷，并且根据特定条件，可导致拷贝数增加或减少。

在三种因素中，复制起点通常为选择用于特定应用的质粒的主要考虑因素，因为复制起点建立拷贝数的基线。不幸的是，不存在用于通过改变质粒复制起点来可预测地改变质粒拷贝数基线的一般方法。确定特定复制起点是否可被修饰以改变拷贝数、或修饰的程度如何也将是一个经验过程。

repfic是示例复制子。如saadi等人,journalofbacteriology169:1836-1846(1987)所述，repfic为incfi质粒的复制子。repfic以完整形式存在于质粒p307中。repfic也以截短形式存在于质粒f中。repfic编码rna(称为incrna)。repfic的incrna基于其序列和结构确定repfic复制子的不相容性。

incrna的rna序列已由repfic复制子的dna序列推测出来。repfic的incrna的推测序列根据repfic复制子的来源而改变。该推测序列也根据对incrna预测的5’端和3’端而改变。

例如，质粒p307的repfic的incrna由与repfic复制子一部分的核苷酸575至665的反向互补序列相对应的dna编码链编码，如saadi等人所公开。此编码链对应于91个核苷酸的序列，如seqidno:23内所提供，特别是seqidno:23的核苷酸8-98。还根据saadi等人，质粒f的repfic的incrna由与质粒p307的repfic的incrna相差两个碱基的取代的dna编码链编码。此编码链对应于91个核苷酸的序列，如seqidno：21内所提供，特别是seqidno:21的核苷酸8-98。例如，还根据genbank，大肠杆菌菌株k-12的repfic的incrna由与genbank登录号001918.1的位置3747至3839的反向互补序列相对应的dna编码链编码。此编码链对应于93个核苷酸的序列，如seqidno：21内所提供，特别是seqidno:21的核苷酸1-93。还根据genbank，大肠杆菌菌株tolc的非编码rna序列(称为copa，与incrna相对应)由与genbank登录号cp018801.1的位置3,463,977至3,464,067相对应的dna编码链编码。此编码链对应于91个核苷酸的序列，如seqidno:21中所提供，特别是seqidno:21的核苷酸8-98。还根据genbank，大肠杆菌菌株ncm3722f样质粒的序列(明显与incrna相对应)由与genbank登录号cp011496.1的位置37765至37862的反向互补序列相对应的dna编码链编码。此编码链对应于98个核苷酸的序列，如seqidno:19中所提供。

repfic的incrna被预测为具有茎-环结构。根据saadi等人，此结构被认为是对于incrna的功能十分重要。

根据saadi等人，repfic的incrna与另一复制子repfiia的incrna相差九个碱基对。基于此差异，repfic复制子和repfiia复制子为相容的。相比之下，正如所述，还根据saadi等人，质粒f的incrna序列与质粒p307的incrna序列相差两个碱基。根据saadi等人，此差异对不相容性不具有可证明的作用，这表明表达质粒f的incrna序列的质粒将与表达质粒p307的incrna序列的质粒相容。

关于包含repfic复制子的质粒的拷贝数，saadi保持沉默。关于使用此类质粒进行生物技术应用，saadi也保持沉默。

使用突变体rna聚合酶是另一种改变质粒拷贝数的潜在方法。rna聚合酶在转录中起作用。rna聚合酶也在染色体和质粒的复制中起作用。rna聚合酶序列已在许多细菌中得到确定，从而提供用于鉴定rna聚合酶内的保守区域的基础。例如，lee等人,antimicrobialagentsandchemotherapy57:56-65(2013)提供了来自21条链的rna聚合酶β’亚基的c端结构域的比对。还已确定细菌rna聚合酶的结构。例如，据mukhopadhyay等人,cell135:295-307(2008)报告，结构揭示，rna聚合酶具有～150埃×～100埃×～100埃的尺寸和蟹爪状的形状联想。rna聚合酶β’亚基构成称为“夹钳”的钳子和活性中心裂缝的一部分。

据报告大肠杆菌rpoc基因中编码rna聚合酶β’亚基的两个突变引起cole1型质粒的拷贝数减少。特别地，ederth等人,moleculargeneticsandgenomics267：587-592(2002)鉴定单一氨基酸取代(g1161r)和41个氨基酸缺失。二者均位于rpoc基因的3'-端区域附近。两个突变分别引起cole1质粒拷贝数减少超过10倍和20倍(可能分别对应于超过90％和95％的减少)。ederth等人提出，编码dna聚合酶i的前体引物和前体引物的反义抑制剂的rnaii和rnai的启动子的表达发生改变可引起减少。

还据报告，rpoc中的突变引起质粒pbr322的拷贝数增加。特别地，petersen等人,journalofbacteriology173:5200-5206(1991)鉴定了单一氨基酸取代(g1033d)，其也位于rpoc基因的3’端区域附近，在39℃半允许生长温度下引起pbr322拷贝数增加。petersen注意到，突变也引起染色体拷贝数增加。

不幸的是，不存在用于可预测地修饰rna聚合酶β’亚基以获得改变质粒的拷贝数的其他突变体的一般方法。确定特定突变是否可改变拷贝数或改变的程度如何也将是一个经验过程。而且，不存在用于可预测地修饰rna聚合酶β’亚基以获得不引起染色体拷贝数相应改变的此类突变体的一般方法。

如上文所述，质粒拷贝数倾向于是关于在生物技术应用中使用质粒期间平衡稳定结合与产率控制的重要考虑因素，但不存在用于通过改变质粒复制起点来可预测地改变质粒拷贝数的基线的一般方法。

技术实现要素：

技术问题

因此，需要如下复制起点，其被修饰来改变包含所述修饰的复制起点的质粒的拷贝数的基线。还需要rna聚合酶β’亚基的其他突变体，其被修饰来改变质粒的拷贝数，理想地不引起染色体拷贝数的相应改变。

技术方案

根据本公开的一个方面，公开了一种包含含有seqidno:15的变体inc编码链的核酸分子。变体inc编码链编码变体incrna。变体incrna是质粒拷贝数的调控因子。

在一些实例中，相对于由包含seqidno：19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达增加了载体拷贝数。

还在一些实例中，变体inc编码链包含与seqidno:17具有至少90％同一性的核苷酸序列。

还在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17。

根据本公开的另一方面，公开了一种包含核酸分子、启动子和复制起点的复制子。启动子可操作地连接至变体inc编码链。变体incrna调控复制子的拷贝数。

根据本公开的另一方面，公开了一种包含复制子的载体。

根据本公开的另一方面，公开了一种包含复制子的重组微生物。

根据本公开的另一方面，公开了一种包含载体的重组微生物。

根据本公开的另一方面，公开了一种用于调控重组微生物中载体的拷贝数的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将所述载体引入到前体微生物中，从而获得所述重组微生物，以及(2)在足以使载体复制的条件下在培养基中培养重组微生物，从而调控载体的拷贝数。

根据本公开的另一方面，公开了一种包含载体和另一种核酸分子的重组微生物。另一种核酸分子包含变体rpocrnaj聚合酶β’亚基蛋白编码序列(也称为“变体rpoc编码序列”)。变体rpoc编码序列编码变体rpocrna聚合酶β’亚基蛋白(也称为“变体rpoc”)。变体rpoc包含r47c取代，其中r47c取代的编号基于大肠杆菌的野生型rpocrna聚合酶β’亚基蛋白(也称为“野生型rpoc”；seqidno:44)来定义。

根据本公开的另一方面，公开了一种用于调控重组微生物中载体的拷贝数的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将所述载体引入到前体微生物中，从而获得所述重组微生物，以及(2)在足以使载体复制的条件下在培养基中培养重组微生物，从而调控载体的拷贝数。所述重组微生物包含含有变体rpoc编码序列的另一种核酸分子。变体rpoc编码链编码变体rpoc。变体rpoc包含r47c取代，其中r47c取代的编号基于大肠杆菌的野生型rpoc来定义。

根据本公开的另一方面，公开了一种用于制备目标产物的方法，其通过在重组微生物中使用载体来进行。所述载体进一步包含用于制备目标产物的靶基因。所述方法包括以下步骤：(1)将所述载体引入到前体微生物中，从而获得重组微生物，(2)在重组微生物表达靶基因的条件下在培养基中培养重组微生物，从而制备目标产物，以及(3)从所述重组微生物和/或培养基中回收目标产物。所述重组微生物包含含有变体rpoc编码序列的另一种核酸分子。变体rpoc编码链编码变体rpoc。变体rpoc包含r47c取代，其中r47c取代的编号基于大肠杆菌的野生型rpoc来定义。

有益效果

本文所公开的包含含有seqidno:15的变体inc编码链的核酸分子可用于调控包含含有核酸分子的复制子的载体诸如质粒的拷贝数，特别可用于增加载体的拷贝数，并且因此可用于改善通过使用载体对目标产物所进行的商业生产。

附图说明

图1示出了以下的编码链的dna序列的多个序列比对：

(1)质粒p307的repfic的incrna，其由与repfic复制子一部分的核苷酸575至665的反向互补序列相对应的dna编码链编码，如saadi等人所公开(seqidno:23，核苷酸8-98)；

(2)质粒f的repfic的incrna，其由与质粒p307的repfic的incrna相差两个碱基的取代的dna编码链编码，如saadi等人所公开(seqidno:21，核苷酸8-98)；

(3)大肠杆菌菌株tolc的非编码rna序列(称为copa，与incrna相对应)，其由与genbank登录号cp018801.1的位置3,463,977至3,464,067相对应的dna编码链编码(seqidno:21，核苷酸8-98)；

(4)大肠杆菌菌株k-12的repfic的incrna，其由与genbank登录号ap001918.1位置3747至3839的反向互补序列相对应的dna编码链编码(seqidno:21，核苷酸1-93)；以及

(5)大肠杆菌菌株ncm3722f样质粒的序列(明显与incrna相对应)，由与genbank登录号cp011496.1的位置37765至37862的反向互补序列相对应的dna编码链编码(seqidno：19)。

图2示出了与图1所示的序列对应的编码链的比对的dna序列的差异，其中质粒p307的repfic的incrna的编码链以全长形式提供并且其他序列的编码链被提供来显示差异，并且还示出了以全长形式提供的野生型incrna(seqidno：23，核苷酸43-65)的编码链的中心结构域。

图3示出了以下的编码链的dna序列的序列比对：

(1)大肠杆菌菌株ncm3722f样质粒的序列(明显与incrna相对应)，由与genbank登录号cp011496.1的位置37765至37862的反向互补序列相对应的dna编码链编码(seqidno:19)；以及

(2)变体inc编码链的序列(seqidno:17)，其包含中心结构域中的c至t取代并且因此包含seqidno:15。

图4示出了与图3所示的序列相对应的编码链的比对的dna序列的差异，其中大肠杆菌菌株ncm3722f样质粒的序列的编码链以全长形式提供并且变体inc编码链被提供来显示差异，并且还示出了以全长形式提供的变体incrna(seqidno:15)的编码链的中心结构域。

图5a-b示出了构建称为pjsl40的重组质粒的过程，所述重组质粒包含与大肠杆菌菌株ncm3722f样质粒(seqidno:19)具有同一性的野生型repfic。

图6a-b示出了构建称为pjsl41的重组质粒的过程，所述重组质粒包含repfic的修饰的dna序列，其与变体inc编码链的序列(seqidno:17)相对应，所述变体序列包含中心结构域中的c至t取代并因此包含seqidno:15。

图7示出了通过clustalo(1.2.4)对以下各者的n末端结构域进行的多个序列比对：嗜热栖热菌(thermusthermophilus)rpoc(q8rqe8)(seqidno:34)、巴氏醋杆菌(acetobacterpasteurianus)rpoc(bah99075.1)(seqidno:35)、淋病奈瑟菌(neisseriagonorrhoeae)rpoc(q5f5r6)(seqidno：36)、嗜肺军团菌(legionellapneumophila)rpoc(q5x865)(seqidno:37)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)rpoc(q9hwc9)(seqidno:38)、霍乱弧菌(vibriocholerae)rpoc(q9kv29)(seqidno:39)、大肠杆菌(escherichiacoli)(p0a8t7)(seqidno:26)、鼠伤寒沙门菌(salmonellaentericaserovartyphimurium)rpoc(p0a2r4)(seqidno:40)、龋齿放线菌(actinomycesodontolyticus)rpoc(edn79927.1)(seqidno：41)、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)rpoc(q8cjt1)(seqidno:42)、白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)rpoc(q6njf6)(seqidno:43)、结核分支杆菌(mycobacteriumtuberculosis)rpoc(a5u053)(seqidno:44)、马红球菌(rhodococcusequi)rpoc(cbh49656.1)(seqidno：45)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)rpoc(o84316)(seqidno：46)、肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)rpoc(a7fz76)(seqidno：47)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)rpoc(p37871)(seqidno：48)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)rpoc(q97nq8)(seqidno:49)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)rpoc(q82z41)(seqidno：50)和短乳杆菌(lactobacillusbrevis)rpoc(q03pv0)(seqidno：51)。

图8示出了通过clustalo(1.2.4)对如图7所示的rpoc蛋白质的中心结构域(分别为seqidno：34-39、26和40-51)进行的多个序列比对。

图9a-b示出了通过clustalo(1.2.4)对如图7所示的rpoc蛋白质的c末端结构域(分别为seqidno:34-39、26和40-51)进行的多个序列比对。

图10示出了大肠杆菌的rpoc蛋白质(seqidno:26)和变体rpoc(seqidno:27)的n末端结构域的序列比对。

图11示出大肠杆菌rpoc蛋白质(seqidno:26)和变体rpoc(seqidno：27)的比对的末端结构域中的差异，其中大肠杆菌rpoc的n末端结构域的序列以全长形式提供并且变体rpoc的序列被提供来显示差异。

图12a-b示出了重构称为pjsl47的重组质粒的过程，所述重组质粒用于置换染色体上的rpoc序列。

图13a-b示出了重构称为pjsl48的重组质粒的过程，所述重组质粒包含野生型repfic复制子。

图14a-b示出了重构称为pjsl49的重组质粒的过程，所述重组质粒包含修饰的repfic复制子。

具体实施方式

公开了一种包含含有seqidno:15的变体inc编码链的核酸分子。变体inc编码链编码变体incrna。变体incrna是质粒拷贝数的调控因子。

出乎意料地，已确定包含含有seqidno:15的变体inc编码链的核酸分子可以用于实现包含所述核酸分子的质粒的拷贝数显著增加，其中所述变体inc编码链编码变体incrna，并且所述变体incrna为质粒拷贝数调控因子。

不希望受到理论约束，据信incrna的编码链包含在野生型序列内为保守的中心结构域。野生型中心结构域对应于seqidno:19的核苷酸43-65。如图1和图2所示，此序列在五个先前公开的incrna的编码链的每个中保守，该编码链即质粒p307的repfic、如saadi等人所公开的质粒f的repfic、大肠杆菌菌株tolc的copa、大肠杆菌菌株k-12的repfic和大肠杆菌菌株ncm3722的f样质粒。如图1和图2所示，编码链关于其序列可发生改变，例如在核苷酸位置42(c或t)、66(c或a)和89(t或g)，其中位置根据seqidno:19来编码。如上文所述，根据saadi等人，质粒f的incrna的编码链的序列与质粒p307的incrna的序列相差两个碱基，并且此差异对不相容性不具有可证明的作用。因此，尽管存在此类变化，但编码链还可维持不相容性。而且，还可以看出根据saadi等人的质粒f的incrna编码序列与大肠杆菌菌株ncm3722的f样质粒的编码序列相差单个取代。这表明此取代也不具有可证明的作用。如图2所示，中心结构域对应于从核苷酸位置43至核苷酸位置65的23个核苷酸序列，其中位置根据seqidno:19来编号。中心结构域位于可以改变的核苷酸位置中的两个核苷酸之间，所述核苷酸位置即核苷酸位置42和66。鉴于中心结构域序列在五个先前公开的incrna的编码链并且编码链其他位置中的改变似乎不具有可证明的作用，对应于seqidno:19的核苷酸43-65的中心结构域序列被认为是野生型。

还不希望受到理论约束，据信incrna的中心结构域在确定包含repfic复制子的质粒的拷贝数方面起重要作用。如图3和图4所示，变体inc编码链包含中心结构域，其包含seqidno:15并与野生型中心结构域相差一个取代，即核苷酸位置60中的c至t取代，其中位置根据seqidno：17来编号。包含此取代并另外与大肠杆菌ncm3722的incrna的编码链具有同一性的变体inc编码链表现出质粒拷贝数例如约5至15倍增加，其中精确增加明显取决于诸如质粒尺寸和菌株的因素。因为中心结构域中的c至t取代为变体inc编码链与大肠杆菌ncm3722的incrna的编码链之间的唯一差异，并且因为中心结构域位于可在不具有明显可证明作用的情况下发生改变的核苷酸位置中的两个核苷酸位置之间，并且还因为在五个先前公开的incrna的编码链内的中心结构域内不存在其他取代，所以中心结构域似乎在确定质粒拷贝数方面是重要的。

如本文所用，术语核酸分子意指dna和/或rna分子，包括例如双链dna分子、单链dna分子、双链rna分子、单链rna分子或dna/rna杂合分子，其中核酸分子的结构取决于核酸分子是包含dna序列、rna序列或二者。

如本文所用，术语incrna意指基于incrna的序列和结构来确定incfi质粒的repfic复制子的不相容性的rna。incfi质粒的repfic复制子的不相容性可例如通过测量驻留质粒由于将进入质粒引入到微生物中而从微生物中丧失来测量，例如saadi等人所讨论的。

如本文所用，术语inc编码链意指编码incrna序列的dna分子链或dna分子链的一部分。

如本文所用，术语变体incrna意指具有基于相对于野生型incrna序列的至少一个核苷酸的添加、缺失和/或取代而与野生型incrna序列相差的核苷酸序列的incrna。

如本文所用，术语inc编码链意指编码变体incrna序列的dna分子。

如本文所用，术语复制子意指dna分子的从单一复制起点复制的区域。

如本文所用，术语载体意指可天然地或通过引入到微生物中而存在于微生物中的核酸分子，例如质粒、病毒载体、粘粒或人工染色体。

如本文所用，术语质粒意指可天然地或通过引入到微生物中而存在于微生物中的核酸分子，其在物理上与微生物的一个或多个染色体分离并独立于所述一个或多个染色体而复制。如上文所讨论，质粒通常是双链环状dna分子，但是也可为线性dna分子和/或rna分子。质粒以约1kb至超过2mb范围内的尺寸存在。质粒也以从低拷贝数到高拷贝数的拷贝数/细胞的范围存在。质粒可被修饰为包含靶基因。

如本文所用，术语质粒拷贝数意指微生物细胞中的拷贝数。除了其他方法以外，质粒拷贝数可以例如通过使用实时pcr来测量微生物中的质粒，以比较以单个拷贝存在于质粒上的细胞相对于以单个拷贝存在于微生物染色体上的基因的拷贝数。

如本文所用，术语质粒拷贝数的调节因子意指引起微生物中的质粒拷贝数发生改变的因子诸如rna分子或蛋白质，例如在因子存在于微生物中时对比在因子不存在于微生物中时拷贝数增加或减小。通过调控质粒拷贝数，可以稳定表达所述质粒，从而使得包含所述质粒的微生物能够稳定生长。

正如所述，公开了一种包含含有seqidno:15的变体inc编码链的核酸分子。还如所述，seqidno：15对应于dna序列。核酸分子可为例如双链dna分子、单链dna分子或其组合。

变体inc编码链编码变体incrna。变体incrna的rna信用卡可由变体inc编码链的dna序列推测。如上文所讨论，变体inc编码链包含中心结构域，其与野生型中心结构域相差一个取代，即核苷酸位置60中的c至t取代，其中位置根据seqidno:17来编号。因此，变体incrna的推测序列包含在此位置处的相应c至u取代。与五个先前公开的incrna的编码链相似，变体incrna也可根据变体inc编码链的来源而改变。所述推测序列也可根据对incrna预测的5’端和3’端而改变。因此，例如，变体inc编码链可包含在核苷酸位置60处的c至t取代并且另外与大肠杆菌ncm3722的incrna的编码链具有同一性。而且例如，变体inc编码链可包含图2所示的五个先前公开的incrna的编码链之间观察到的取代中的一种或多种并因此包含在核苷酸位置42(c或t)、66(c或a)和89(t或g)处的取代，其中位置根据seqidno:17来编号。还例如，变体inc编码链可在其5’端和其3’端根据由变体inc编码链编码的变体incrna的实际5’端和实际3’端而改变。

在一些实例中，变体inc编码链包含与seqidno:17有至少90％同一性的核苷酸序列。为了参考，seqidno:17对应变体inc编码链，其包含在核苷酸位置60处的c至t取代并另外与大肠杆菌ncm3722的incrna的编码链具有同一性。且还为了参考，变体inc编码链的核苷酸序列与seqidno:17的序列同一性百分比可通过进行成对序列比对来确定。这可使用embossneedle成对序列比对(nucleotide)工具使用默认设置(矩阵：dnafull；间隙开口：10；间隙延伸：0.5；输出格式：配对；末端间隙罚分：假；末端间隙开口：10；末端间隙延伸：0.5)进行(网址：ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)。这也可以使用其他类似的成对序列比对工具来进行。例如，变体inc编码链可包含与seqidno:17具有至少91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。

在一些实例中，变体inc编码链包含对于seqidno：17的至少90个核苷酸与seqidno:17具有同一性的核苷酸序列。例如，变体inc编码链可以包含对于seqidno：17的至少91、92、93、94、95、96、97或98个核苷酸与seqidno：17具有同一性的核苷酸序列。

在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17。在一些实例中，变体inc编码链由seqidno:17组成。

在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其包含如下一个或多个取代：核苷酸位置42处的t至c取代、核酸位置66处的a至c取代或核苷酸位置89处的g至t取代，其中位置根据seqidno:17来编号。例如，变体inc编码链可以包含seqidno：17的变体，其包含如下一个取代：核苷酸位置42处的t至c取代、核酸位置66处的a至c取代、或核苷酸位置89处的g至t取代，其中位置根据seqidno：17来编号。还例如，变体inc编码链可以包含seqidno:17的变体，其包含这些取代中任何两个的组合。还例如，变体inc编码链可以包含seqidno：17的变体，其包含这些取代中的所有三种。还例如，变体inc编码链可以由seqidno:17的变体组成，所述变体包含如下一个取代：核苷酸位置42处的t至c取代、核酸位置66处的a至c取代或核苷酸位置89处的g至t取代，其中位置根据seqidno:17来编号。还例如，变体inc编码链可以由seqidno:17的变体组成，所述变体包含这些取代中任何两个的组合。还例如，变体inc编码链可以由seqidno:17的变体组成，所述变体包含这些取代中的所有三种。

在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno：17的核苷酸1-7中的一种或多种。例如，变体inc编码链可包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸1、1和2、1-3、1-4、1-5、1-6或1-7。还例如，变体inc编码链可由seqidno:17的变体组成，所述变体缺乏seqidno:17的核苷酸1、1和2、1-3、1-4、1-5、1-6或1-7。

在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸94-98中的一种或多种。例如，变体inc编码链可包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸94-98、95-98、96-98、97-98或98。还例如，变体inc编码链可由seqidno：17的变体组成，所述变体缺乏seqidno：17的核苷酸94-98、95-98、96-98、97-98或98。

在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其包含除了核苷酸位置42、66和89处的取代以外的一个或多个其他取代。例如，如上文所讨论，repfic的incrna被预测为具有茎-环结构，所述结构被认为对于incrna的功能十分重要。因此，在一些实例中，变体inc编码链可包含不破坏茎-环结构的额外取代，例如保持所述茎-环结构的取代对。

变体incrna是质粒拷贝数的调控因子。更广泛而言，变体incrna为复制子拷贝数和载体拷贝数的调控因子。还如上文对于质粒所讨论，复制子对应于dna分子的从单一复制起点复制的区域。dna分子可以例如为载体，诸如质粒、病毒载体、粘粒或人工染色体。如上文所讨论，repfic为incfi质粒的复制子。还如所讨论，repfic的incrna基于其序列和结构确定repfic复制子的不相容性。还如所讨论，变体inc编码链包含c至t取代并且另外与大肠杆菌ncm3722的incrna的编码链具有同一性，表现出质粒拷贝数增加。

因此，基于确定编码变体incrna的复制子的不相容性，变体incrna可为质粒拷贝数的调控因子。例如，变体incrna可在包含质粒和另一个不相容质粒的菌株中影响质粒的聚集稳定性并因此影响质粒的拷贝数。而且，基于包含c至t取代并因此在包含所述质粒的菌株中相对于包含含有复制子(所述复制子包含有不包含c至t取代的incrna的编码链)的质粒的菌株表现出质粒拷贝数增加，变体incrna可以是拷贝数的调控因子。例如，变体incrna可表现出质粒拷贝数的例如5至15倍增加。

更通常，变体incrna可为复制子拷贝数和载体拷贝数的调控因子。因此，也是质粒拷贝数的调控因子，例如对应于质粒的载体的拷贝数的调控因子，变体incrna也可以是病毒载体、粘粒和/或人工染色体的拷贝数的调控因子，例如对应于病毒载体、粘粒和/或人工染色体的载体的拷贝数的调控因子。

在一些实例中，相对于由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达增加了载体拷贝数。例如，相对于由大肠杆菌ncm3722的incrna的编码链编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达可以增加载体的拷贝数。在一些实例中，载体对应于质粒、病毒载体、粘粒或人工染色体中的一种或多种。在一些实例中，相对于由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达使载体拷贝数增加1至50倍，例如2至40倍、3至30倍、4至20倍、1至10倍、5至15倍、10至20倍、15至25倍、20至30倍、25至35倍、30至40倍、35至45倍或40至50倍。

还公开了一种包含核酸分子、启动子和复制起点的复制子。启动子可操作地连接至变体inc编码链。变体incrna调控复制子的拷贝数。

所述核酸分子可以如上文所述。因此，在一些实例中，相对于由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达增加了载体拷贝数，如上文所讨论。在一些实例中，变体inc编码链包含与seqidno:17具有至少90％同一性的核苷酸序列，如上文所讨论。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17，如上文所讨论。

为了参考，启动子为结合rna聚合酶以便开始基因转录的短序列元件的组合。将启动子可操作地连接至变体inc编码链，意指启动子为变体inc编码链的启动子复制起点为开启复制的特定序列。

在一些实例中，复制子包括变体repfic复制子，且核酸分子为变体repfic复制子的一部分。如上文所讨论，repfic为incfi质粒的复制子，其以完整形成存在于质粒p307中并且以截短形式存在于质粒f中。还如所讨论，repfic的incrna的推测序列根据来源和预测末端而改变。基于包含与野生型中心结构域相差单个c至t取代的中心结构域，变体repfic复制子为变体，如上文所讨论。因此，变体repfic复制子可为相对于以完整形式存在的另一种repfic复制子或以截短形式存在的repfic复制子的变体，其中变体repfic复制子包含与野生型中心结构域相差单个c至t取代的中心结构域，并且其他repfic复制子不包含单个c至t取代。而且，变体repfic复制子可为相对于包含任何上文所讨论的其他取代或其他额外取代的另一种repfic复制子的变体，其中变体repfic复制子包含与野生型中心结构域相差单个c至t取代的中心结构域，并且其他repfic复制子不包含单个c至t取代。

还公开了一种包含复制子的载体。复制子可以如上文所述。因此，在一些实例中，复制子包括变体repfic复制子，并且核酸分子为变体repfic复制子的一部分，如上文所讨论。

在一些实例中，相对于由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达增加了载体拷贝数，如上文所讨论。

在一些实例中，载体包括质粒。如上文所讨论，载体可以对应于质粒、病毒载体、粘粒或人工染色体中的一种或多种。因此，在一些实例中，载体对应于质粒。

在一些实例中，载体进一步包含用于制备目标产物的靶基因。载体可以为例如包含来自生物体诸如细菌、古生菌或真核生物领域微生物、动物和/或植物以及其他生物体的靶基因的重组质粒。特别地，关于细菌领域微生物，靶基因可以例如来自埃希氏菌属细菌诸如大肠杆菌、棒状杆菌属细菌诸如谷氨酸棒状杆菌、或芽孢杆菌属细菌诸如枯草芽孢杆菌、以及其他细菌。已经开发用于遗传工程化的许多技术，从而允许不同生物体(包括细菌、古细菌和真核生物领域微生物以及动物和植物以及其他生物体)的基因重组表达。此类技术可用于根据本公开在重组微生物中克隆并表达来自不同生物体的靶基因，如本领域普通技术人员将清楚的。

在一些实例中，目标产物包括以下一种或多种：(i)目标rna；(ii)目标蛋白；(iii)目标生物材料；(iv)目标聚合物、其前体和/或其生产酶；(v)目标甜味剂、其前体和/或其生产酶；(vi)目标油、其前体和/或其生产酶；(vii)目标脂肪、其前体和/或其生产酶；(viii)目标多糖、其前体和/或其生产酶；(ix)目标氨基酸、其前体和/或其生产酶；(x)目标核苷酸、其前体和/或其生产酶；(xi)目标疫苗、其前体和/或其生产酶；或(xii)目标药物产品、其前体和/或其生产酶。因此，在一些实例中，靶基因编码目标rna，并且目标产物对应于目标rna。还在一些实例中，靶基因编码目标蛋白质，并且目标产物对应于目标蛋白质。还在一些实例中，靶基因编码目标rna和/或目标蛋白质，并且目标rna和/或目标蛋白质进而在产生目标生物材料；目标聚合物、其前体和/或其生产酶；目标甜味剂、其前体和/或其生产酶；目标油、其前体和/或其生产酶；目标脂肪、其前体和/或其生产酶；目标多糖、其前体和/或其生产酶；目标氨基酸、其前体和/或其生产酶；目标核苷酸、其前体和/或其生产酶；目标疫苗、其前体和/或其生产酶；或目标药物产品、其前体和/或其生产酶方面起作用。例如，关于目标聚合物、目标甜味剂、目标油、目标脂肪、目标多糖、目标氨基酸和/或目标核苷酸，靶基因可以编码对应于直接或通过前体产生所述目标聚合物、目标甜味剂、目标油、目标脂肪、目标多糖、目标氨基酸和/或目标核苷酸的酶的目标蛋白质。还例如，关于疫苗，靶基因可以编码对应于病原微生物的抗原或抗原片段例如蛋白质亚基、受体或其他蛋白质或其片段的目标蛋白质，其可用作疫苗抵抗病原微生物的组分。还例如，关于目标药物产品，靶基因可以编码目标蛋白质诸如抗体、受体或激素，所述目标蛋白质可以用作药物产品的组分。

在一些实例中，在于包含多个靶基因，例如来自特定生物体的多个靶基因和/或来自多个生物体中每个生物体的一个或多个靶基因。还在一些实例中，靶基因用于制备多种目标产物。

在一些实例中，载体(例如质粒)的尺寸为3至120kb。重组载体通常以3至120kb的尺寸存在，因为这些尺寸为已克隆靶基因的载体的典型尺寸。如上文所述，变体inc编码链包含c至t取代并且另外与大肠杆菌ncm3722的incrna的编码链具有同一性，表现出质粒拷贝数例如约5至15倍的增加。如下文所讨论并且如图5和图6所示，观察到质粒拷贝数增加的对应质粒和获得相应repfic复制子的大肠杆菌ncm3722的f样质粒以3至120kb范围内的尺寸存在，这表明变体inc编码链在调控质粒拷贝数方面的相关性，并且因此质粒具有在此范围内的尺寸。

还公开了一种包含复制子的重组微生物。复制子可以如上文所述。

还公开了一种包含载体的重组微生物。载体可以如上文所述。因此，在一些实例中，相对于由包含seqidno：19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达增加了载体拷贝数。而且在一些实例中，载体包括质粒。还在一些实例中，载体进一步包含用于制备目标产物的靶基因。还在一些实例中，目标产物包括一种或多种如上文所述的目标产物。

在一些实例中，相对于对照微生物中由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，重组微生物中变体incrna的表达增加了载体拷贝数。对照微生物可以例如来源于与重组微生物相同的属、物种和/或菌株，并且可包含类似或相同质粒和/或靶基因，并且因此可以与重组微生物的变体inc编码序列和对照微生物的相应inc序列之间的差异系统地类似、密切相关和/或遗传上相同。类似地，如上文所讨论，增加可为1至50倍，例如2至40倍、3至30倍、4至20倍、1至10倍、5至15倍、10至20倍、15至25倍、20至30倍、25至35倍、30至40倍、35至45倍或40至50倍。

在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含与seqidno:17具有至少90％同一性的核苷酸序列，如上文所讨论的。例如，变体inc编码链可包含与seqidno：17具有至少91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，如所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含对于seqidno:17的至少90个核苷酸与seqidno:17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。例如，变体inc编码链可以包含对于seqidno:17的至少91、92、93、94、95、96、97或98个核苷酸与seqidno：17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。

在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含seqidno:17，如上文所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其包含如下一个或多个取代：核苷酸位置42处的t至c取代、核酸位置66处的a至c取代、或核苷酸位置89处的g至t取代，其中位置根据seqidno：17来编号，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸1-7中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸94-98中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其包含除了核苷酸位置42、66和89处的取代以外的一个或多个其他取代，如所讨论的。

在一些实例中，重组微生物可以通过经由转化、缀合或转导中的一种或多种将载体引入到前体微生物中来制备。前体微生物可以是直接引入载体的微生物，使得重组微生物在遗传上与前体微生物相同，除了重组微生物包含载体。转化可以通过将分离形式的载体转移到前体微生物的细胞中，例如通过化学技术(例如氯化钙转化)或通过物理技术(例如通过电穿孔)来进行。缀合可以基于包含用于合成菌毛的基因的载体并且使包含载体的供体微生物与将接受载体的前体微生物的细胞接触来进行。转导可以基于使用病毒完成载体到前体微生物细胞的转移来进行。各自可以通过标准分子生物学技术来进行。

在一些实例中，重组微生物可由埃希氏菌属细菌或大肠杆菌种类细菌中的一种或多种制备。如上文所述的，repfic为incfi质粒的复制子。这些质粒天然地存在于大肠杆菌中。repfic复制子在大肠杆菌中起作用。因此，包含变体inc编码链的核酸分子可以调控埃希氏菌属细菌(特别是大肠杆菌种类细菌)中的质粒拷贝数。还在一些实例中，重组微生物可由另一种细菌、即除埃希氏菌属或大肠杆菌种类以外的细菌制备。

还公开了用于调控重组微生物中的载体拷贝数的方法。还公开了变体inc编码链用于调控重组微生物中的载体拷贝数的用途。

载体可以如上文所述。因此，又在一些实例中，相对于由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达增加了载体拷贝数。而且在一些实例中，载体包括质粒。还在一些实例中，载体进一步包含用于制备目标产物的靶基因。还在一些实例中，目标产物包括一种或多种如上文所述的目标产物。

重组微生物也可以如上文所述。因此，又在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含与seqidno：17具有至少90％同一性的核苷酸序列，如上文所讨论的。再次，例如，变体inc编码链可包含与seqidno：17具有至少91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，如所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含对于seqidno：17的至少90个核苷酸与seqidno:17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。例如，变体inc编码链可以包含对于seqidno:17的至少91、92、93、94、95、96、97或98个核苷酸与seqidno：17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。又再次，在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含seqidno:17，如上文所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其包含如下一个或多个取代：核苷酸位置42处的t至c取代、核酸位置66处的a至c取代、或核苷酸位置89处的g至t取代，其中位置根据seqidno:17来编号，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸1-7中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸94-98中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其包含除了核苷酸位置42、66和89处的取代以外的一个或多个其他取代，如所讨论的。

所述方法包括以下步骤：(1)将载体引入到前体微生物中，从而获得重组微生物。所述载体可以例如通过如上文所讨论的转化、缀合或转导中的一种或多种来引入。重组微生物可例如由埃希氏菌属细菌或大肠杆菌种类细菌中的一种或多种制备，如所讨论的。

所述方法还包括以下步骤：(2)在足以使载体复制的条件下在培养基中培养重组微生物，从而调控载体的拷贝数。所述培养可以通过标准微生物学技术，例如在培养管、烧瓶和/或生物反应器中进行，所述培养的详情将为本领域普通技术人员清楚的。所述培养可以在合适培养基中，例如营养丰富培养基或基本培养基中进行，所述培养的详情将为本领域普通技术人员清楚的。所述培养可以在合适孵育温度下，例如在或约25-38℃、28-37℃或37℃下进行，所述培养的详情也将为本领域普通技术人员清楚的。随着重组微生物在培养期间生长并分裂，载体将复制。因此，例如，关于由大肠杆菌制备的重组微生物，所述重组微生物可以通过发酵技术在生物反应器中分批或连续培养。所述培养可以在基本培养基中进行，所述基本培养基例如包含限定量的盐(诸如m9最小盐培养基)和一种或多种碳源(例如葡萄糖、蔗糖或脂质纤维素材料)以及其他的的培养基。所述培养可以在约37℃下进行。此类条件支持大肠杆菌生长和分裂，并且因此将支持载体复制。用于培养由大肠杆菌制备以及由其他微生物制备的重组微生物的其他合适条件为本领域普通技术人员已知且将清楚的。

在一些实例中，相对于对照微生物中由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，重组微生物中变体incrna的表达增加了载体拷贝数，如上文所讨论。因此，对照微生物可以例如来源于与重组微生物相同的属、种类和/或菌株，并且可以包含类似或相同的质粒和/或靶基因。

还公开了一种用于制备目标产物的方法，这通过使用重组微生物中的载体来进行。还公开了重组微生物中的载体用于制备目标产物的用途。

载体可以如上文所述。因此，又在一些实例中，相对于由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达增加了载体拷贝数。而且在一些实例中，载体包括质粒。

重组微生物也可以如上文所述。因此，又在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含与seqidno:17具有至少90％同一性的核苷酸序列，如上文所讨论的。再次，例如，变体inc编码链可包含与seqidno：17具有至少91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，如所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含对于seqidno：17的至少90个核苷酸与seqidno:17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。例如，变体inc编码链可包含对于seqidno：17的至少91、92、93、94、95、96、97或98个核苷酸与seqidno:17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。又再次，在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含seqidno:17，如上文所讨论。还在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其包含如下一个或多个取代：核苷酸位置42处的t至c取代、核酸位置66处的a至c取代或核苷酸位置89处的g至t取代，其中位置根据seqidno:17来编号，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸1-7中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其缺乏seqidno:17的核苷酸94-98中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno:17的变体，其包含除了核苷酸位置42、66和89处的取代以外的一个或多个其他取代，如所讨论的。

目标产物也可以如上文所述。例如，目标产物可以包括以下一种或多种：(i)目标rna；(ii)目标蛋白；(iii)目标生物材料；(iv)目标聚合物、其前体和/或其生产酶；(v)目标甜味剂、其前体和/或其生产酶；(vi)目标油、其前体和/或其生产酶；(vii)目标脂肪、其前体和/或其生产酶；(viii)目标多糖、其前体和/或其生产酶；(ix)目标氨基酸、其前体和/或其生产酶；(x)目标核苷酸、其前体和/或其生产酶；(xi)目标疫苗、其前体和/或其生产酶；或(xii)目标药物产品、其前体和/或其生产酶。

所述载体进一步包含用于制备目标产物的靶基因，如上文所讨论的。

所述方法包括以下步骤：(1)将载体引入到前体微生物中，从而获得重组微生物，如上文所讨论的。再次，所述载体可以例如通过如上文所讨论的转化、缀合或转导中的一种或多种来引入。重组微生物可例如由埃希氏菌属细菌或大肠杆菌种类细菌中的一种或多种制备，如所讨论的。

所述方法包括以下步骤：(2)在重组微生物表达靶基因的条件下在培养基中培养重组微生物，从而制备目标产物，如上文所讨论的。

所述方法还包括以下步骤：(3)从重组微生物和/或培养基回收目标产物。用于回收目标产物的适合方法可以基于目标产物的详情来开放，例如对与目标蛋白质相对应的目标产物进行蛋白质纯化的标准技术或对与目标聚合物相对应的目标产物进行聚合物萃取和沉淀的技术以及其他方法，所述方法的详情将为本领域普通技术人员清楚的，这取决于例如目标产物的类型(例如rna、蛋白质、聚合物等)、目标产物的特定详情(例如化学结构、分子量、亲和力标签等)以及所需纯度(例如低到高)。例如，关于与目标rna相对应的目标产物，在培养重组微生物之后，可以通过以下方法来从重组微生物回收目标rna：使用rnasnap(tm)方法，如通过stead等人,nucleicacidsresearch40(20),e156:1-9(2012)所述；或者通过可商购获得的方法，诸如trizol(r)max(tm)细菌rna分离试剂盒(thermofisherscientific)、rneasy(r)保护细菌分离试剂盒(qiagen)或ribopure(tm)细菌rna分离(thermofisherscientific)、以及本领域已知的其他方法。对于与目标蛋白质相对应的目标产物，根据本领域已熟知的程序，可以通过提取、离子交换色谱法、亲和色谱法和/或通过沉淀浓缩来从重组微生物中回收目标蛋白质。对于与目标聚合物相对应的目标产物，还根据本领域已熟知的程序，可以通过提取、洗涤和浓缩来回收目标聚合物，其中基于化学结构和分子量选择组合物用于洗涤并选择沉淀物用于浓缩。对于与目标甜味剂、目标油、目标脂肪、目标多糖、目标氨基酸或目标核苷酸相对应的目标产物，再次根据本领域已熟知的程序，如果目标产物在重组微生物内累积，那么还可以使用类似的方法，而如果目标产物在细胞外累积，那么可以例如通过从培养基中沉淀来回收目标产物。对于与目标疫苗或目标药物产品相对应的目标产物，例如上文对于目标蛋白质所述，例如基于与抗原或抗原片段相对应的目标疫苗的离子交换色谱法或基于与单克隆抗体相对应的药物产品的亲和色谱法以及其他方法，再次基于本领域已熟知的程序，可以回收目标产物。

在一些实例中，相对于对照微生物中由包含seqidno:19的inc序列编码的野生型incrna的表达，重组微生物中变体incrna的表达增加了载体拷贝数，如上文所讨论。再次，对照微生物可以例如来源于与重组微生物相同的属、种类和/或菌株，并且可以包含类似或相同的质粒和/或靶基因。

更详细地考虑到目标产物，在一些实例中，目标产物包括以下一种或多种：(i)目标聚合物、其前体和/或其生产酶或(ii)目标生物聚合物、其前体和/或其生产酶。基于在重组微生物中协调引入并表达多种靶基因的需要，特别是对于基于具有复杂化学结构的单体的聚合物和/或包含两个或更多个单体的共聚物，聚合物(包括生物聚合物)的生物学产生可能具有挑战性。关于如上文所讨论的其他目标产物，特别是目标甜味剂、目标脂肪、目标多糖、目标氨基酸、目标核苷酸、目标疫苗和目标药物产物，类似考虑因素也是适用的。

所述方法可用于快速确定包含多种靶基因的载体的适合拷贝数，例如可用于产生目标聚合物、目标生物聚合物、目标甜味剂、目标脂肪、目标多糖、目标氨基酸或目标核苷酸，用于平衡载体在重组微生物中的平衡并入并控制靶基因的产物的产率。可以制备包含第一组载体，其包含含有野生型中心结构域的repfic复制子并覆盖第一个范围的载体拷贝数，从低到高(例如基于相对大至小的载体尺寸)。可以制备第二组载体，其与第一组载体相同，除了第二组载体包含变体中心结构域，并且因此覆盖第二更高范围的载体拷贝数。一组靶基因可以被克隆岛每个载体中。所述方法可以使用每种载体进行，包括以下步骤：(1)引入载体，(2)培养相应重组微生物，以及(3)回收一种或多种相应目标产物。可以在培养期间确定每种载体的拷贝数。可以在回收期间确定目标产物的产率或其他相关特征。此方法可以基本上增加对于第一组载体可以实现的拷贝数上限，这可能在良好耐受靶基因的过表达的情况下对于使产率最大化是有利的。关于测试载体拷贝数对目标产物的产率的作用，此方法还可以有效地将样品尺寸增加一倍。此方法可以特别用于与质粒(包括尺寸为3至120kb的质粒和/或包含多种靶基因)相对应的载体。

还公开了另一种重组微生物，其包含所述载体并且在此情况下还包含含有变体rpocrna聚合酶β’亚基蛋白质编码序列(也称为“变体rpoc编码序列”)的核酸分子。

载体可以如上文所述。因此，又在一些实例中，相对于由包含seqidno：19的inc序列编码的野生型incrna的表达，变体incrna的表达增加了载体拷贝数。而且在一些实例中，载体包括质粒。

重组微生物也可以如上文所述。因此，又在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含与seqidno：17具有至少90％同一性的核苷酸序列，如上文所讨论的。再次，例如，变体inc编码链可包含与seqidno：17具有至少91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，如所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含对于seqidno：17的至少90个核苷酸与seqidno：17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。例如，变体inc编码链可以包含对于seqidno：17的至少91、92、93、94、95、96、97或98个核苷酸与seqidno：17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。又再次，在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含seqidno：17，如上文所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其包含如下一个或多个取代：核苷酸位置42处的t至c取代、核酸位置66处的a至c取代、或核苷酸位置89处的g至t取代，其中位置根据seqidno：17来编号，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno：17的核苷酸1-7中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno：17的核苷酸94-98中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其包含除了核苷酸位置42、66和89处的取代以外的一个或多个其他取代，如所讨论的。

正如所述，在此情况下，重组微生物包含含有变体rpoc编码序列的另一种核酸分子以及载体。变体rpoc编码序列编码变体rpocrna聚合酶β’亚基蛋白(也称为“变体rpoc”)。变体rpoc包含r47c取代，其中r47c取代的编号基于大肠杆菌的野生型rpocrna聚合酶β’亚基蛋白(野生型rpoc)来定义。

出乎意料地，已经确定，包含变体rpoc编码序列的核酸分子可以用于引起包含所述核苷酸序列的重组微生物中的质粒拷贝数显著降低而不引起染色体拷贝数相应降低，其中所述变体rpoc编码序列编码变体rpoc，并且所述变体rpoc包含r47c取代。这是意外的，除了其他原因以外，还因为如本文所公开的r47c取代存在于rpoc的n端结构域序列中，而包含如ederth等人和petersen等人所述的单取代的大肠杆菌rpoc的突变体仅在rpoc基因的3’端区域附近包含突变并且因此在rpoc的c端结构域序列内包含突变。这也是意外的，因为如本文所公开的r47c取代存在于在九个氨基酸残基n端结构域序列(所述结构域序列另外在不同细菌的rpoc内是严格保守的)内，而如ederth等人和petersen等人所述的大肠杆菌rpoc的突变体中的单个取代存在于rpoc序列内并未被保守性残基围绕并因此未存在于保守性序列内的位置处。

不希望受到理论约束，据信来自不同细菌的野生型rpoc包含与seqidno：44的残基40-48相对应的且在野生型rpoc内严格保守的n端结构域序列。如图7所示，此序列在19种不同细菌内是严格保守性的，所述细菌即嗜热栖热菌、巴氏醋杆菌、淋病奈瑟菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、龋齿放线菌、天蓝色链霉菌、白喉杆菌、结核分支杆菌、马红球菌、沙眼衣原体、肉毒杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、粪肠球菌和短乳杆菌，代表了不同的种系发生、代谢和环境。为了参考，这些序列与由比对如lee等人提供的21种菌株的rpoc的c端结构域获得的全长rpoc序列相对应。还据信，来自一系列不同细菌的野生型rpoc还包含与seqidno：47相对应的且在野生型rpoc内为严格保守性的中心结构域序列。如图8所示，此序列在19种不同的细菌内也为严格保守性的。还据信，来自一系列不同细菌的野生型rpoc还包含与seqidno：48相对应的且在野生型rpoc内为严格保守性的c端结构域序列。如图9a-9b所示，此序列在19种不同的细菌内也为严格保守性的。

还据信，与seqidno：44的残基33-57相对应的较长n端结构域序列、与seqidno：50相对应的较长中心结构域序列和与eqidno：51相对应的较长c端结构域序列(分别包括严格保守性n端结构域、中心结构域和c端结构域序列)包含在19种不同细菌的rpoc内为大体保守性的许多残基。如图7、图8和图9a-9b所示，大肠杆菌rpoc包含这些较长序列。而且，来自其他细菌的rpoc包含高度类似于这些较长序列的序列。

因为来自不同细菌的野生型rpoc包含严格保守性n端结构域、中心结构域和c端结构域序列，据信这些序列在其他细菌的野生型rpoc内也是严格保守性的。对于上下文，如表1所示，大肠杆菌的rpoc与其他18种不同细菌的rpoc相比的成对序列比对结果指示相对高的序列同一性和相似性程度，甚至对于在种系发生、代谢和环境方面远离大肠杆菌的细菌诸如极度嗜热菌嗜热栖热菌的rpoc也是如此。这与rpoc在转录和复制方面所起到的基本作用一致。

[表1]

大肠杆菌的rpoc与其他细菌的rpoc相比的成对序列比对结果。*

*使用embossneedle成对序列比对(protein)工具使用默认设置(矩阵：blosum62；间隙开口：10；间隙延伸：0.5；输出格式：配对；末端间隙罚分：假；末端间隙开口：10；末端间隙延伸：0.5)来进行(网址：ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/)。

而且，因为来自不同细菌的野生型rpoc包含高度类似于较长n端结构域、中心结构域和c端结构域序列的序列，据信其他细菌的野生型rpoc包含也高度类似于这些序列的序列。另外，基于严格保守性或大体保守性的各种序列，据信相应n端结构域、中心结构域和c端结构域序列在结构上和/或功能上在rpoc于染色体和质粒的转录和复制中所起到的作用方面做出重要贡献。

还不希望受到理论约束，据信rpoc中的n端结构域特别在确定质粒的拷贝数方面起重要作用。如图1和图11所示，变体rpoc编码序列包含含有seqidno：46的n端结构域，其与野生型n端结构域的严格保守性序列相差单个取代，即在氨基酸位置47处的r(即精氨酸)至c(即半胱氨酸)取代(也称为“r47c”)，其中编号基于大肠杆菌的野生型rpoc来限定。包含此r47c取代并另外与大肠杆菌的野生型rpoc具有同一性的变体rpoc表现出质粒拷贝数的例如约25％至75％降低。因为n端结构域中的r47c取代仅为大肠杆菌的变体rpoc与野生型rpoc之间的差异，并且因为r47c取代位于包含在19种不同细菌内为大体保守性的许多残基的较长n端结构域序列内，并且因为在来自19种不同细菌的野生型rpoc内与seqidno：44的残基40-48相对应的严格保守性n端结构域序列内不存在其他取代，所以n端结构域似乎在确定质粒拷贝数方面是重要的。

如本文所用，术语rna-聚合酶β’亚基蛋白质意指rna聚合酶的rna聚合酶β’亚基。如上文所讨论的，rna聚合酶在转录中起作用。rna聚合酶也在染色体和质粒的复制中起作用。rna聚合酶β’亚基蛋白质可以基于与已知rna聚合酶β’亚基蛋白质的结构和/或功能相似性，例如基于如lee等人所示的序列比对和/或如mukhopadhyay等人所讨论的结构特征来确定。rna聚合酶活性可以例如chamberlin等人,thejournalofbiologicalchemistry254(20)：10061-10069(1979)所述来测量。

如本文所用，术语rpocrna聚合酶β’亚基蛋白质编码序列意指编码rna聚合酶β’亚基蛋白质的dna分子链或dna分子链的一部分。

如本文所用，术语野生型rna聚合酶β’亚基蛋白质意指在天然条件下存在于一种种类的个体中的rna聚合酶β’亚基蛋白质。

如本文所用，术语n末端结构域意指蛋白质的存在于蛋白质的n末端或附近的一部分，例如在蛋白质的起始第三氨基酸序列内。

如本文所用，术语中心结构域意指蛋白质的存在于蛋白质的中心或附近的一部分，例如在蛋白质的中间第三氨基酸序列内。

如本文所用，术语c末端结构域意指蛋白质的存在于蛋白质的c末端或附近的一部分，例如在蛋白质的最后第三氨基酸序列。

正如所述，公开了一种包含变体rpoc编码序列的核酸分子。核酸分子可以是例如双链dna分子，诸如已引入变体rpoc编码序列的染色体dna或已克隆变体rpoc编码序列的质粒。

还如所述，变体rpoc编码链编码变体rpoc。变体rpoc是基于包含r47c取代的变体，其中r47c取代的编号基于大肠杆菌的野生型rpoc来定义。变体rpoc为rpoc，并且因此在染色体的转录、复制以及质粒的复制中起作用。仅在19种不同细菌的野生型rpoc相对于彼此改变时，例如在非保守性氨基酸位置处改变时，变体rpoc也可根据变体rpoc编码序列的来源而改变。因此，例如，变体rpoc可包含r47c取代并因此另外与大肠杆菌的野生型rpoc具有至少90％同一性。还例如，变体rpoc可包含r47c取代并且另外与其他18种不同细菌中任一者的野生型rpoc具有至少90％同一性，所述不同细菌即嗜热栖热菌、巴氏醋杆菌、淋病奈瑟菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、鼠伤寒沙门菌、龋齿放线菌、天蓝色链霉菌、白喉杆菌、结核分支杆菌、马红球菌、沙眼衣原体、肉毒杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌、粪肠球菌和短乳杆菌。还例如，变体rpoc可包含r47c取代和大肠杆菌或其他18种不同细菌的野生型rpoc中的一种或多种的一个或多个部分。

在一些实例中，变体rpoc进一步包括：(1)包含seqidno：46的n末端结构域，(2)包含seqidno：47的中心结构域，以及(3)包含seqidno：48的c末端结构域，其中所述r47c取代存在于n末端结构域中。在这些实例中，变体rpoc包含与seqidno：46相对应的包含r47c取代的n末端结构域序列。变体rpoc还包含与seqidno：47相对应的严格保守性中心结构域序列和与seqidno：48相对应的严格保守性c末端结构域，这与rpoc在染色体和质粒的转录和复制中所起到的作用一致。

在一些实例中，变体rpoc进一步包括：(1)包含seqidno：49的n末端结构域，(2)包含seqidno：50的中心结构域，以及(3)包含seqidno：51的c末端结构域，其中所述r47c取代存在于n末端结构域中。在这些实例中，变体rpoc包含与seqidno：49相对应的包含r47c取代的n末端结构域序列。变体rpoc还包含与seqidno：50相对应的大体保守性的更长中心结构域序列和与seqidno：51相对应的严格保守性的更长c末端结构域，这也与rpoc在染色体和质粒的转录和复制中所起到的作用一致。

在一些实例中，变体rpoc包含与seqidno：45具有至少90％同一性的氨基酸序列。为了参考，seqidno：45对应于包含r47c取代并另外与大肠杆菌的野生型rpoc具有同一性的变体rpoc。还为了参考，变体rpoc的氨基酸序列与seqidno：45之间的序列同一性百分比可以通过进行成对序列比对来确定。这可以使用embossneedle成对序列比对(protein)工具使用默认设置(矩阵：blosum62；间隙开口：10；间隙延伸：0.5；输出格式：配对；末端间隙罚分：假；末端间隙开口：10；末端间隙延伸：0.5)来进行(网址：ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/)。这也可以使用其他类似的成对序列比对工具来进行。

变体rpoc的氨基酸序列可不同于seqidno：45，例如主要或完全基于在大肠杆菌的野生型rpoc与其他18种不同细菌的rpoc之间并不保守的氨基酸残基的取代。参考表1，尽管大肠杆菌的rpoc与其他18种不同细菌的rpoc相比的成对序列比对结果指示相对高的序列同一性和相似性程度，但结果也指示17种不同细菌的rpoc与大肠杆菌的野生型rpoc相比的序列同一性范围为36.1％至82.4％，并且因此将低于90％。与保守性氨基酸残基的取代相比，在类似蛋白质之间并不保守的氨基酸残基的取代通常更可能耐受，例如不破坏结构和/或功能。表1的结果指示，rpoc包含并不保守的许多氨基酸残基并且因此可能易于取代。

例如基于包含一些或许多保守性取代，变体rpoc的氨基酸序列也可不同于seqidno：45，这意味着相对于seqidno：45，将氨基酸残基用另一种结构上相似的氨基酸残基置换。保守性取代通常包括以下基团内的取代：(1)甘氨酸和丙氨酸，(2)缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，(3)天冬氨酸和谷氨酸，(4)天冬酰胺和谷氨酰胺，(5)丝氨酸和苏氨酸，(6)赖氨酸和精氨酸，以及(7)苯丙氨酸和酪氨酸。与非保守性取代相比，保守性取代通常更可能耐受。

因此，在这些实例中，变体rpoc包含r47c取代。变体rpoc还包含与seqidno：45具有至少90％同一性的氨基酸序列。例如，变体rpoc可包含与seqidno：45具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实例中，变体rpoc包含seqidno：45。

在一些实例中，变体rpoc的表达相对于包含seqidno：44的野生型rpoc的表达降低了质粒拷贝数。为了残基，seqidno：44对应于大肠杆菌的野生型rpoc。如上文所述，变体rpoc为rpoc，并且因此在染色体的转录、复制以及质粒的复制中起作用。还如所述，包含r47c取代并另外与大肠杆菌的野生型rpoc具有同一性的变体rpoc表现出质粒拷贝数的例如约25％至75％降低。

重要的是，在如上文所讨论的还包含载体(所述载体包含含有seqidno：15的变体inc编码链)的重组微生物的情况下，变体rpoc的存在可引起质粒拷贝数降低。所述降低可以是例如以下之间的拷贝数中间值：(i)包含含有与野生型中心结构域相差单个c至t取代的中心结构域的变体repfic复制子的载体的拷贝数，如表达野生型rpoc的微生物中所呈现的，以及(ii)包含有不包含单个c至t取代的repfic复制子的相应载体的拷贝数，如表达野生型rpoc的微生物中所呈现的。因此，变体rpoc的存在可用于调节质粒拷贝数，例如使用变体inc编码链获得的水平对比使用野生型inc编码链获得的水平之间。

在一些实例中，变体rpoc的表达相对于包含seqidno：44的野生型rpoc的表达使质粒拷贝数降低了10％至80％，例如25％至75％、30％至70％、35％至65％、40％至60％、45％至55％、10％至40％、20％至50％、30％至60％、40％至70％或50％至80％。

包含含有变体rpoc编码序列的核酸分子的重组微生物可以例如通过将例如克隆在载体中的完整变体rpoc编码序列引入到前体微生物中(例如通过转化、缀合或转导)以获得重组微生物并且然后将完成变体rpoc编码序列保持在重组微生物中(例如通过选择所述载体)来获得。这可以通过标准分子生物学技术来完成。在一些实例中，重组微生物可以通过经由转化、缀合或转导中的一种或多种将包含核酸序列的rpoc编码序列载体(例如质粒)引入到前体微生物中来制备。

包含含有变体rpoc编码序列的核酸分子的重组微生物可以例如通过引入例如克隆在载体中的变体rpoc编码序列的一部分并使用所述部分置换内源性染色体野生型rpoc编码序列的相应部分(例如通过经由同源重组例如使用sacb载体进行基因置换)来获得。这也可以通过标准分子生物学技术来完成。因此，在一些实例中，基于变体rpoc编码序列对内源性rpoc编码序列的置换，重组微生物包含染色体并且变体rpoc编码序列存在于染色体中。

如上文所述，包含r47c取代并另外与大肠杆菌的野生型rpoc具有同一性的变体rpoc表现出质粒拷贝数的例如约25％至75％降低。如下文所讨论，这已在各种大肠杆菌菌株中实现。因此，包含变体rpoc编码链的核酸分子可以特别调控埃希氏菌属细菌(特别是大肠杆菌种类细菌)中的质粒拷贝数。

还公开了另一种用于调控重组微生物中的载体拷贝数的方法，在此情况下，重组微生物包含含有如上文所述的变体rpoc编码序列的核酸分子。

重组微生物也可以如上文所述。因此，又在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含与seqidno：17具有至少90％同一性的核苷酸序列，如上文所讨论的。再次，例如，变体inc编码链可包含与seqidno：17具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，如所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含对于seqidno：17的至少90个核苷酸与seqidno：17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。例如，变体inc编码链可以包含对于seqidno：17的至少91、92、93、94、95、96、97或98个核苷酸与seqidno：17具有同一性的核苷酸序列，如所讨论的。又再次，在一些实例中，重组微生物的变体inc编码链包含seqidno：17，如上文所讨论的。还在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其包含如下一个或多个取代：核苷酸位置42处的t至c取代、核酸位置66处的a至c取代或核苷酸位置89处的g至t取代，其中位置根据seqidno：17来编号，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno：17的核苷酸1-7中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其缺乏seqidno：17的核苷酸94-98中的一种或多种，如所讨论的。在一些实例中，变体inc编码链包含seqidno：17的变体，其包含除了核苷酸位置42、66和89处的取代以外的一个或多个其他取代，如所讨论的。

所述方法包括以下步骤：(1)将载体引入到前体微生物中，从而获得重组微生物。

所述方法还包括以下步骤：(2)在足以使载体复制的条件下在培养基中培养重组微生物，从而调控载体的拷贝数。再次，培养可以通过标准微生物学技术，例如在培养管、烧瓶和/或生物反应器中，在合适培养基例如营养丰富培养基或基本培养基中，在适合孵育温度例如在或约25-38℃、28-37℃或37℃下进行，所述培养的详情为本领域普通技术人员清楚的。

正如所述，所述重组微生物还包含含有如上文所述的变体rpoc编码序列的核酸分子。再次，变体rpoc编码链编码变体rpoc。变体rpoc包含r47c取代，其中r47c取代的编号基于大肠杆菌的野生型rpoc来定义。因此，在一些实例中，变体rpoc进一步包括：(1)包含seqidno：46的n末端结构域，(2)包含seqidno：47的中心结构域，以及(3)包含seqidno：48的c末端结构域，其中所述r47c取代存在于n末端结构域中。在一些实例中，变体rpoc进一步包括：(1)包含seqidno：49的n末端结构域，(2)包含seqidno：50的中心结构域，以及(3)包含seqidno：51的c末端结构域，其中所述r47c取代存在于n末端结构域中。在一些实例中，变体rpoc可包含与seqidno：45具有至少90％同一性，例如与seqidno：45具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实例中，变体rpoc包含seqidno：45。在一些实例中，变体rpoc的表达相对于包含seqidno：44的野生型rpoc的表达使质粒拷贝数降低了例如10％至80％，例如25％至75％、30％至70％、35％至65％、40％至60％、45％至55％、10％至40％、20％至50％、30％至60％、40％至70％或50％至80％。

还公开了另一种用于制备目标产物的方法，其通过在重组微生物中使用载体来进行，在此情况下，重组微生物包含含有如上文所述的变体rpoc编码序列的核酸分子。

根据此方法，所述载体进一步包含用于制备目标产物的靶基因，如上文所讨论的。

所述方法包括以下步骤：(1)将载体引入到前体微生物中，从而获得重组微生物。所述方法还包括以下步骤：(2)在重组微生物表达靶基因的条件下在培养基中培养重组微生物，从而制备目标产物。所述方法还包括以下步骤：(3)从重组微生物和/或培养基回收目标产物。

正如所述，所述重组微生物还包含含有如上文所述的变体rpoc编码序列的核酸分子。再次，变体rpoc编码链编码变体rpoc。变体rpoc包含r47c取代，其中r47c取代的编号基于大肠杆菌的野生型rpoc来定义。因此，在一些实例中，变体rpoc进一步包括：(1)包含seqidno:46的n末端结构域，(2)包含seqidno:47的中心结构域，以及(3)包含seqidno:48的c末端结构域，其中所述r47c取代存在于n末端结构域中。在一些实例中，变体rpoc进一步包括：(1)包含seqidno:49的n末端结构域，(2)包含seqidno:50的中心结构域，以及(3)包含seqidno：51的c末端结构域，其中所述r47c取代存在于n末端结构域中。在一些实例中，变体rpoc可包含与seqidno：45具有至少90％同一性，例如与seqidno:45具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实例中，变体rpoc包含seqidno:45。在一些实例中，变体rpoc的表达相对于包含seqidno:44的野生型rpoc的表达使质粒拷贝数降低了例如10％至80％，例如25％至75％、30％至70％、35％至65％、40％至60％、45％至55％、10％至40％、20％至50％、30％至60％、40％至70％、或50％至80％。

所述方法可以可用于进一步快速确定包含多种靶基因的载体的适合拷贝数，例如可用于产生目标聚合物、目标生物聚合物、目标甜味剂、目标脂肪、目标多糖、目标氨基酸、目标核苷酸、目标疫苗或目标药物产品，可用于平衡载体在重组微生物中的稳定并入与靶基因的产物产率的控制。如上文所讨论的，可以制备包含第一组载体，其包含含有野生型中心结构域的repfic复制子并覆盖第一个范围的载体拷贝数，从低到高(例如基于相对大至小的载体尺寸)。可以制备第二组载体，其与第一组载体相同，除了第二组载体包含变体中心结构域，并且因此覆盖第二更高范围的载体拷贝数。一组靶基因可以被克隆岛每个载体中。第一组载体和第二组载体可以引入到包含野生型rpoc编码序列并因此表达野生型rpoc的第一细菌菌株例如大肠杆菌菌株中，以获得包含第一组载体和第二组载体并表达野生型rpoc的第一组大肠杆菌菌株。第一组载体和第二组载体也可以引入到包含编码包含r47c取代的变体rpoc的变体rpoc编码序列并因此表达变体rpoc的相应第二重组细菌菌株例如重组大肠杆菌菌株中，所述第二菌株另外与第一菌株具有同一性，以获得包含第一组载体和第二组载体并表达变体rpoc的第二组相应大肠杆菌菌株。所述方法可以使用每种载体进行，包括以下步骤：(1)引入载体、(2)培养相应重组微生物以及(3)回收一种或多种相应目标产物。可以在培养期间确定每种载体的拷贝数。可以在回收期间确定目标产物的产率或其他相关特征。同时大致上增加对于第一组载体关于使用如上文所讨论的repfic复制子的变体中心结构域可以实现的拷贝数上限，此方法还可以大致上降低对于第一组载体基于变体rpoc的表达可以实现的拷贝数下限，这对于在靶基因的表达有害的情况下，例如对于编码在细胞中表达超过某些水平时对细胞有毒的目标rna和/或目标蛋白质的靶基因，保持菌株细胞的活力可为有利的。关于测试载体拷贝数对目标产物的产率的作用，此方法还可以有效地将样品尺寸增加四倍。再次，此方法可以特别用于与质粒(包括尺寸为3kb至120kb的质粒和/或包含多种靶基因)相对应的载体。

实施例

实施例1.构建含有repfic复制子的修饰的dna序列的质粒

(1)制备repfic片段和卡那霉素抗性基因片段

为了扩增含有repfic复制子(seqidno:1)的5.2kbdna片段，使用qiagengenomic-tip系统提取作为原养型k-12菌株且获得自大肠杆菌遗传储备中心(coligeneticstockcenter，cgsc)(菌株12355)的大肠杆菌菌株ncm3722的基因组dna(gdna)，并且使用gdna作为模板使用pfuultraiifusionhsdna聚合酶(由agilent公司制造)进行聚合酶链反应(pcr)。使用seqidno:2和seqidno:3的引物如下进行pcr：在95℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、并在72℃下延长5分钟的30个循环。

为了扩增含有卡那霉素抗性基因的1.4kbdna片段，使用质粒pkd4作为模板使用pfuultraiifusionhsdna聚合酶进行pcr。使用seqidno:4和seqidno:5的引物如下进行pcr：在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、并在72℃下延长1分30秒的30个循环。

在完成pcr反应后，将来自thermofisherscientific的1.3mldpni和5.7ml10x缓冲液tango(目录号er1701)添加到50μlpcr混合物中，然后将所述混合物在37℃下孵育1小时，以去除模板dna。使用qiagen纯化试剂盒纯化混合物并且然后洗脱，以获得5.2kbdna片段(也称为“repfic片段”)和1.4kbdna片段(也称为“kanr片段”)。

(2)制备含有修饰序列的repfic片段。

为了扩增含有具有修饰序列(seqidno:17，反向补体seqidno:6)的repfic复制子的5.2kbdna片段，使用大肠杆菌ncm3722的gdna作为模板使用pfuultraiifusionhsdna聚合酶进行pcr。使用seqidno:2和seqidno:7的引物如下进行pcr：在95℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、并在72℃下延长3分钟的30个循环。使用seqidno:8和seqidno:3的引物在72℃下延长2分30秒来进行另一个pcr。

在完成pcr反应后，将1.3mldpni和5.7ml10x缓冲液tango添加到50μlpcr反应混合物中，然后将所述混合物在37℃下孵育1小时，以去除模板dna。使用qiagen纯化试剂盒纯化混合物并且然后洗脱，以获得2.8kbdna片段和2.4kbdna片段。

(3)构建含有repfic复制子的野生型或修饰序列的质粒

将实施例1-(1)中所述的repfic和kanr片段用于构建图5a-5b所示的称为pjsl40的质粒。使用nebuilderhifidna组装主要混合物(由neb制造)构建pjsl40质粒。

将实施例1-(2)中所述的2.8kb和2.4kbdna片段以及实施例1-(1)中所述的kanr片段用于构建图6a-6b所示的称为pjsl41的另一种质粒。使用nebuilderhifidna组装主要混合物进行三种片段的gibson组装。

(4)构建含有repfic复制子的修饰序列的f样质粒

为了检查repfic复制子的修饰序列对大小范围为数万碱基对至超过100千碱基(kb)的大质粒的拷贝数的作用，通过使用已知一步灭活方法将大肠杆菌ncm3722的f样质粒上的repfic序列用上文所述的修饰序列(seqidno:6)置换(warner等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.97(12):6640-6645,(2000))。首先，通过pcr制备使用cre-loxp重组酶系统引入repfic的修饰序列的线性dna片段，所述pcr使用质粒pkd3作为模板通过使用seqidno:9和seqidno：10的引物如下进行：在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、并在72℃下延长1分钟的30个循环，以获得1.2kbpcr片段。将pcr混合物用如上文所述的dpni进行处理并且使用qiagen纯化试剂盒纯化扩增的dna片段。

将线性dna片段通过电穿孔引入到大肠杆菌ncm3722/pkd46中，所述大肠杆菌通过将pkd46质粒引入到大肠杆菌ncm3722中来构建(warner等人)，并且然后在含有15μg/ml氯霉素的luria-bertani(lb)板上分离单个菌落。对分离菌株中的repfic区域进行测序并且选择含有置换f样质粒的野生型序列的repfic的修饰序列的菌株。将质粒pjw168(bmgbiotechnol.2001；1:7.电子版2001年9月26日)引入到所选菌株中，以制备重组pjsl42，其中野生型repfic被repfic的修饰序列取代。将含有pjsl42质粒的大肠杆菌ncm3722分离物表示为大肠杆菌菌株cc06-9612。

实施例2：测量质粒拷贝数

为了测量质粒拷贝数，将质粒pjsl40和pjsl41引入到获得自大肠杆菌遗传储备中心(cgsc号6300)的大肠杆菌菌株mg1655中。将构建的具有pjsl40和pjsl41的菌株mg1655分别表示为大肠杆菌菌株cc06-9614和cc06-9615。

使用实时pcr(也称为“qpcr”)方法测量大肠杆菌菌株cc06-9614、cc06-9615、ncm3722和cc06-9612中的质粒拷贝数。所述方法包括使用sybr(r)greeni染料以通过结合pcr期间形成的双链dna来检测pcr产物。所述方法采用fastsybr(r)greencells-to-ct(tm)试剂盒在“一锅法”中在appliedbiosystems7500fast实时pcr系统中进行细胞裂解和pcr反应。

为了制备细胞裂解物，将lb肉汤中的每种菌株的过夜培养物用冷(4℃)1xpbs缓冲液稀释，随后添加裂解溶液、终止溶液(fastsybr(r)greencells-to-ct(tm)试剂盒，目录号4402956)和rna酶a(lifetechnologies，目录号12091-021，20mg/ml)。

通过将4μl细胞裂解物添加到16μlpcr混合物中来制备qpcr反应混合物，所述pcr混合物的组成示出在表2中。

[表2]

pcr混合物组成

由质粒上标记物dna序列repfic相对于单个拷贝染色体基因lacz编码β半乳糖苷酶的相对丰度评估细胞样品中的质粒拷贝数。用于repfic的引物为seqidno:11和seqidno：12并且用于lacz的引物为seqidno：13和seqidno：14。作为每个样品的内部对照，相对于lacz，测量16srdna(rrsh)的拷贝数。基于rrsh的七个染色体拷贝的存在，rrsh相对于lacz的相对丰度被预测为约7。用于rrsh的引物为seqidno:25和seqidno:26。

使用7500fast实时pcr默认程序如下进行实时pcr反应：在95℃下酶活化20秒的1个循环，在95℃下变性3秒、在60℃下退火、和延长30秒的40个循环，以及解离曲线。

通过计算2^dct来测量质粒拷贝数，其中dct通过从lacz基因ct值减去repficct值(dct＝ct_lacz-ct_repfic.)来计算。

[表3]

qpcr拷贝数测量结果

如表3所示，大肠杆菌菌株cc06-9615的质粒拷贝数比对照菌株cc06-9614的质粒拷贝数高约14倍。而且，大肠杆菌菌株cc06-9612的拷贝数高于菌株ncm3722中的f样质粒拷贝数约10倍。因此，证实了repfic的修饰序列导致质粒拷贝数独立于质粒大小(例如对于小质粒和大质粒)和大肠杆菌背景菌株(例如对于mg1655和ncm3722)而增加。

实施例3：在大肠杆菌ls5218中构建含有修饰的repfic复制子的f样质粒并测量质粒拷贝数

为了重新检查repfic复制子的修饰序列对质粒拷贝数的作用并测试不同的大肠杆菌菌株，通过使用如实施例1-(4)所述的相同方法和材料将大肠杆菌ls5218(cgsc菌株号6966)的f样质粒上的repfic序列用上文所述修饰序列(seqidno:6)置换。大肠杆菌ls5218的repfic序列与大肠杆菌ncm3722的序列相同。创建重组质粒pjsl33，以重新检查修饰的repfic的作用，在重组质粒中野生型repfic被repfic的修饰序列取代。将含有pjsl33质粒的大肠杆菌菌株ls5218表示为大肠杆菌菌株cc06-9667。

使用如实施例2所述的实时pcr测量大肠杆菌菌株ls5218和cc06-9667中的质粒拷贝数。进行qpcr，以阐明质粒拷贝数的增加。repfia是呈现于质粒上的另一个复制子。用于repfia的引物为seqidno:27和seqidno：28。再次，作为每个样品的内部对照，相对于lacz，测量16srdna(rrsh)的拷贝数。

[表4]

qpcr拷贝数测量结果

如表4所示，大肠杆菌菌株cc06-9667的拷贝数高于菌株ls5218中的f样质粒拷贝数约5.5倍。因此，再次证实repfic的修饰序列导致质粒拷贝数独立于所使用的背景菌株而增加。

实施例4：构建质粒用于置换染色体上的rpoc序列

(1)制备rpoc片段和sacb载体。

为了扩增两个含有具有修饰序列(seqidno:33)的部分变体rpoc序列的0.5kbdna片段，使用qiagengenomic-tip系统提取获得自大肠杆菌遗传储备中心(cgsc)(菌株6966)的大肠杆菌菌株ls5218的基因组dna(gdna)，并且使用gdna作为模板使用pfuultraiifusionhsdna聚合酶(由agilent公司制造)进行聚合酶链反应(pcr)。如由核苷酸序列推断的相应修饰的rpoc蛋白质为seqidno:45。修饰的rpoc蛋白质序列考虑到的是，rpoc核苷酸序列包含替代性起始密码子gtg，而不是atg。尽管gtg通常编码缬氨酸，但gtg也作为替代性起始密码子编码甲硫氨酸。使用seqidno:35和seqidno：36的引物如下进行pcr：在95℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、并在72℃下延长30秒的30个循环。使用seqidno:5和seqidno:6的引物在72℃下延长30秒来进行另一个pcr。使用qiagen纯化试剂盒纯化混合物并且然后洗脱，以获得两个不同的0.5kbdna片段。

为了制备含有sacb基因和r6k起点的基因置换载体(图12a-12b)，用限制性酶ecorv消化pskh130。将pcr混合物和ecorv消化的反应混合物用qiagen纯化试剂盒纯化并且然后洗脱，以获得第一0.5kbdna片段、第二0.5kbdna片段和4.7kb载体dna片段(也称为“sacb载体切割片段”)。

(2)构建质粒用于置换rpoc序列

将如实施例4-(1)中所述的第一0.5kbdna片段、第二0.5kbdna片段和sacb载体切割片段用于构建pjsl47。使用nebuilderhifidna组装主要混合物(由neb制造)和大肠杆菌遗传储备中心(cgsc)的菌株7636即bw25113构建pjsl47质粒。

(3)制备重组大肠杆菌cc06-9642。

为了用变体rpoc序列(seqidno:33)取代大肠杆菌ls5218的染色体上的rpoc(seqidno:39)，将pjsl47质粒通过电穿孔引入到大肠杆菌菌株ls5218中，随后选择在含有50mg/l卡那霉素的luria-bertani(lb)琼脂板上生长的单个菌落。通过pcr使用seqidno：40和seqidno:41的引物证实pjsl47插入到所选菌落的染色体中。使所选菌株在缺乏nacl但含有10％蔗糖的lb琼脂板上生长，以便“剔除”sacb基因和r6k起点。通过pcr和序列证实来验证转化株中ls5218rpoc(seqidno:39)被变体rpoc序列(seqidno：33)置换。将具有正确基因型的所得菌株表示为大肠杆菌cc06-9642。

实施例5：测量质粒拷贝数

野生型菌株ls5218和菌株cc06-9642含有f样质粒(67,502bp)。在创建cc06-9642之后，通过pcr方法证实f样质粒的存在。所用引物例如为seqidno:11和12。当创建cc06-9642时，还创建cc06-9637。它们之间的差异在于，cc06-9642含有f样质粒，而cc06-9637不含所述质粒。cc06-9637的rpoc也是变体rpoc。

使用实时pcr(也称为“qpcr”)方法测量两种菌株的质粒拷贝数，所述实时pcr方法使用sybr(r)greeni染料以通过结合在pcr期间形成的双链dna来检测pcr产物。所述方法采用fastsybr(r)greencells-to-ct(tm)试剂盒在“一锅法”中在appliedbiosystems7500fast实时pcr系统中进行细胞裂解和pcr反应。

为了制备细胞裂解物，将lb肉汤中的每种菌株的过夜培养物用冷(4℃)1xpbs缓冲液稀释，随后添加裂解溶液、终止溶液(fastsybr(r)greencells-to-ct试剂盒，目录号4402956)和rna酶a(lifetechnologies，目录号12091-021，20mg/ml)。通过将4μl细胞裂解物添加到16μlpcr混合物中来制备qpcr反应混合物，所述pcr混合物的组成示出在表5中。

[表5]

pcr混合物组成

由质粒上标记物dna序列(特别是repfia和repfic)相对于单个拷贝染色体基因lacz编码β半乳糖苷酶的相对丰度评估ls5218和cc06-9642细胞样品中的f样质粒拷贝数。用于repfia的引物为seqidno:27和seqidno：28。用于repfic的引物为seqidno：11和seqidno:12。用于lacz的引物为seqidno：13和seqidno:14。

使用7500fast实时pcr默认程序如下进行实时pcr反应：在95℃下酶活化20秒的1个循环，在95℃下变性3秒、在60℃下退火和延长30秒的40个循环，以及解离曲线。

通过计算2^dct来测量质粒拷贝数，其中dct通过从lacz基因ct值减去repficct值(dct＝ct_lacz-ct_repfic.)来计算。

[表6]

使用qpcr得到的拷贝数测量结果

如表6所示，cc06-9642的f样质粒的拷贝数低于对照ls5218的拷贝数。因此，证实变体rpoc序列导致f样质粒的拷贝数降低。当质粒拷贝数过量时，可能在微生物细胞中施加代谢负荷。以上结果指示，变体rpoc具有调控质粒拷贝数的功能，并且因此可由以上结果已知的是，菌株可以稳定生长并且质粒可以稳定表达。

实施例6：构建含有repfic复制子的修饰的dna序列的质粒

(1)制备repfic片段和卡那霉素抗性基因片段

为了扩增含有repfic复制子(seqidno：1)的5.2kbdna片段，使用qiagengenomic-tip系统提取作为原养型k-12菌株且获得自大肠杆菌遗传储备中心(cgsc)(菌株12355)的大肠杆菌ls5218的基因组dna(gdna)，并且使用gdna作为模板使用pfuultraiifusionhsdna聚合酶(由agilent公司制造)进行聚合酶链反应(pcr)。使用seqidno:2和seqidno:3的引物如下进行pcr：在95℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、并在72℃下延长5分钟的30个循环。

在完成pcr反应并且然后混合之后，将1.3mldpni和5.7ml10x缓冲液tango添加到各个50μlpcr混合物中，然后将所述混合物在37℃下孵育1小时，以去除模板dna。使用qiagen纯化试剂盒纯化混合物并且然后洗脱，以获得5.2kbdna片段(也称为“repfic片段”)和1.4kbdna片段(也称为“kanr片段”)。

(2)制备含有修饰序列的repfic片段。

为了扩增含有具有修饰序列(seqidno:6)的repfic复制子的5.2kbdna片段，使用大肠杆菌ncm3722的gdna作为模板使用pfuultraiifusionhsdna聚合酶进行pcr。使用seqidno:2和seqidno:7的引物如下进行pcr：在95℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、并在72℃下延长3分钟的30个循环。使用seqidno:8和seqidno:3的引物在72℃下延长2分30秒来进行另一个pcr。

(3)构建含有repfic复制子的野生型或修饰序列的质粒

将实施例6-(1)中所述的repfic片段和kanr片段用于构建称为pjsl48的质粒。使用nebuilderhifidna组装主要混合物(由neb制造)构建pjsl48质粒，如图13a-13b所示。

将实施例6-(2)中所述的2.8kb和2.4kbdna片段和实施例6-(1)中所述的kanr片段用于构建称为pjsl49的另一个质粒。使用nebuilderhifidna组装主要混合物进行三个片段的gibson组装，如图14a-14b所示。

实施例7：测量质粒拷贝数

为了测量质粒拷贝数，将质粒pjsl48和pjsl49引入到大肠杆菌ls5218中，从而得到大肠杆菌菌株cc06-9665和cc06-9666。也将质粒pjsl48和pjsl49引入到cc06-9642中，从而分别得到大肠杆菌菌株cc06-9638和cc06-9639。

使用如实施例5所述的实时pcr方法测量大肠杆菌菌株cc06-9665、9666、9638和9639中的质粒拷贝数。

由质粒上标记物dna序列repfic复制子相对于单个拷贝染色体lacz基因编码β半乳糖苷酶的相对丰度评估细胞样品中的质粒拷贝数。用于repfic的引物为seqidno:11和seqidno:12。用于lacz的引物为seqidno:13和seqidno:14。用于卡那霉素抗性基因的引物为seqidno:42和seqidno:43。

[表7]

qpcr拷贝数测量结果

如表7所示，作为含有引入到质粒pjsl49中的变体repfic序列的菌株，菌株cc06-9666和9639的质粒拷贝数高于菌株cc06-9665和9638的质粒拷贝数。菌株cc06-9665的质粒拷贝数高于cc06-9638的质粒拷贝数，并且菌株cc06-9666的质粒拷贝数高于cc06-9639的质粒拷贝数。因此，证实了置换的rpoc序列导致质粒拷贝数独立于所使用的野生型或变体repfic复制子而降低。

[工业实用性]

关于生物保藏的信息

如上文所述制备被转化为包含含有变体inc编码链(seqidno:6)的核酸分子的大肠杆菌菌株，将其表示为大肠杆菌cc06-9612，并且在2018年6月15日根据布达佩斯条约以登录号kccm12275p保藏在国际保藏单位韩国微生物培养中心。此菌株根据布达佩斯条约由国际保藏单位保藏。

如上文所述制备被转化为包含含有编码包含r47c取代的变体rpoc的变体rpoc编码序列的核酸分子的大肠杆菌菌株，将其表示为大肠杆菌cc06-9637，并且在2018年6月15日根据布达佩斯条约以登录号kccm12276p保藏在国际保藏单位韩国微生物培养中心。此菌株根据布达佩斯条约由国际保藏单位保藏。

<110>cj第一制糖株式会社

<120>包含变体inc编码链的核酸分子

<130>opa18577

<150>us62/715,571

<151>2018-08-07

<160>69

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>2459

<212>dna

<213>大肠杆菌

<400>1

atgtcgcagacagaaaatgcagtgacttcctcatcaggtaacaagcgtgcataccggaaa60

ggtaaccctgttccggccagagagaggcaaagggcttctctagctcgcagaagcaacact120

cataaggcttttcatgcggttatccaggcccggttaaaagacaggctgagtgaactggca180

gatgaggaaggtattacccaggcgcagatgcttgaaaaactgattgaatcagagctgaaa240

cgcagagcgactttgtaaatattcacattcttgcttatctcaggcgtgagtgatagattg300

ctgatcgtttaaggaattttgtggctggccacgccataaggtggcagggaactggttctg360

atgtggatttacaggagccagaaaagcaaaaaccccgataatcttcatctagttttgcga420

cgaggagaagattaccgggatccacttaaaccgtatagccaacaattcagctatgcgggg480

agtatagttatatgcccggaaaagttcaagacttctttctgtgctcactccttctgtgca540

ttgtaagtgcaggatggtgtggctaatcatgaaacacattcagtaatagcgggtgggatt600

gaatcagatcttcacattgattccagcaagtatcctcacccgttttgcagccttctccag660

aaaagggctcattttgactccttcaagcatctgatcttcatcagaggtttgcttgtaata720

gcgcatggcaaacgtaaaaataaaatcagcgcgtcgatggttagtttttatgtttccctc780

gtacaagtaatgtgcgcacactacatccctgatacgaacaaagttaacttatctgttaaa840

gagctttcagtttgtagtggaggttcatacactcgtgtttggagagccctcaaaactctt900

gataatgatcttcatctcatcgcttttgatggaggaaccatctggttcagaccagatatg960

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gttggagggggacatggctgatctccttcaaaaatactattcacaggttaaaaacccgaa1080

tccggtgttcacaccccgtgaaggtgccggaacgctgaagttctgcgaaaaactgatgga1140

aaaggcggtgggcttcacctcccgttttgatttcgccattcatgtggcacatgctcgttc1200

gaagggactgcgtcggcgcatgccaccggtactgcgtcgccgggctattgatgcgctgct1260

gcaggggctgtgttttcactatgacccgctggccaaccgcgtccagtgctccatcactac1320

gctggccattgagtgcggactggcgacggagtctgctgccggaaaactctccatcacccg1380

ggccacccgagccttgacgttccttgcagagctgggactgattacctaccagacggaata1440

tgatccgcttatcgggtgctacattccgaccgatatcacgttcacaccggcgctatttgc1500

cgcccttgatgtgtctgaggatgcagtggttgctgcgcgccgcagtcgtgttgaatggga1560

aaacagacagcgcaaaaagcagggactggataccctgggtatggatgaactgatagcgaa1620

agcctggcgttttgtgcgtgagcgtttccgcagttaccagacagagcttaagtcccgtgg1680

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ttacagccggctggccacagcttccccctgaaagtgacctcctctgaataatccggcccg1920

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caaagggccggaacagagtcgcttttaattatgaatgttgtaactacacagcatcatcg2459

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体inc引物

<400>2

ttccggaagtgtgaggcggccgcacttgtgtataa35

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体inc引物

<400>3

gtcgacaagctttacgcggccagatctgatcaaga35

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体卡那霉素引物

<400>4

atcagatctggccgcgtaaagcttgtcgacgaatt35

<210>5

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体卡那霉素引物

<400>5

cacaagtgcggccgcctcacacttccggaaagcgg35

<210>6

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>包含变化的合成构建体inc+copa

<400>6

aagcaaaaaccccgataatcttcatctagttttgcgacaaggagaagattaccgggatcc60

acttaaaccgtatagccaacaattcagctatgcgggga98

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体变体引物

<400>7

tcttctccttgtcgcaaaac20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体变体引物

<400>8

gttttgcgacaaggagaaga20

<210>9

<211>100

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体微型f质粒引物

<400>9

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tgtatgctatacgaagttatggaataggaacttcatttaa100

<210>10

<211>200

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体微型f质粒引物

<400>10

tgaattgttggctatacggtttaagtggatcccggtaatcttctccttgtcgcaaaacta60

gatgaagattatcggggtttttgcttttctggctcctgtaaatccacatcagaaccagtt120

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ggcgcgcctacctgtgacgg200

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体repfic引物

<400>11

cgggtgggattgaatcagat20

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体repfic引物

<400>12

tacgtttgccatgcgctatta21

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体lacz引物

<400>13

ccttactgccgcctgttttg20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体lacz引物

<400>14

ccactggtgtgggccataat20

<210>15

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有inc变体的合成构建体inc中心结构域编码链

<400>15

cccggtaatcttctccttgtcgc23

<210>16

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有inc变体的合成构建体inc中心结构域非编码链

<400>16

gcgacaaggagaagattaccggg23

<210>17

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有inc变体的合成构建体大肠杆菌ncm3722f质粒编码链

<400>17

tccccgcatagctgaattgttggctatacggtttaagtggatcccggtaatcttctcctt60

gtcgcaaaactagatgaagattatcggggtttttgctt98

<210>18

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有inc变体的合成构建体大肠杆菌ncm3722f质粒非编码链

<400>18

aagcaaaaaccccgataatcttcatctagttttgcgacaaggagaagattaccgggatcc60

acttaaaccgtatagccaacaattcagctatgcgggga98

<210>19

<211>98

<212>dna

<213>大肠杆菌

<400>19

tccccgcatagctgaattgttggctatacggtttaagtggatcccggtaatcttctcctc60

gtcgcaaaactagatgaagattatcggggtttttgctt98

<210>20

<211>98

<212>dna

<213>大肠杆菌

<400>20

aagcaaaaaccccgataatcttcatctagttttgcgacgaggagaagattaccgggatcc60

acttaaaccgtatagccaacaattcagctatgcgggga98

<210>21

<211>98

<212>dna

<213>大肠杆菌

<400>21

tccccgcatagctgaattgttggctatacggtttaagtggatcccggtaatcttctcctc60

gtcgccaaactagatgaagattatcggggtttttgctt98

<210>22

<211>98

<212>dna

<213>大肠杆菌

<400>22

aagcaaaaaccccgataatcttcatctagtttggcgacgaggagaagattaccgggatcc60

acttaaaccgtatagccaacaattcagctatgcgggga98

<210>23

<211>98

<212>dna

<213>大肠杆菌

<400>23

tccccgcatagctgaattgttggctatacggtttaagtggaccccggtaatcttctcctc60

gtcgccaaactagatgaagattatcgggttttttgctt98

<210>24

<211>98

<212>dna

<213>大肠杆菌

<400>24

aagcaaaaaacccgataatcttcatctagtttggcgacgaggagaagattaccggggtcc60

acttaaaccgtatagccaacaattcagctatgcgggga98

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体rrsh引物

<400>25

gcataacgtcgcaagaccaa20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体rrsh引物

<400>26

gtgagccgttaccccaccta20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体repfia引物

<400>27

atggctcaggcatcgtctct20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体repfia引物

<400>28

agaggcgcattggagttctg20

<210>29

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有inc变体的合成构建体其他大肠杆菌编码链

<400>29

tccccgcatagctgaattgttggctatacggtttaagtggatcccggtaatcttctcctt60

gtcgccaaactagatgaagattatcggggtttttgctt98

<210>30

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有inc变体的合成构建体其他大肠杆菌非编码链

<400>30

aagcaaaaaccccgataatcttcatctagtttggcgacaaggagaagattaccgggatcc60

acttaaaccgtatagccaacaattcagctatgcgggga98

<210>31

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有inc变体的合成构建体大肠杆菌p307质粒编码链

<400>31

tccccgcatagctgaattgttggctatacggtttaagtggaccccggtaatcttctcctt60

gtcgccaaactagatgaagattatcgggttttttgctt98

<210>32

<211>98

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有inc变体的合成构建体大肠杆菌p307非编码链

<400>32

aagcaaaaaacccgataatcttcatctagtttggcgacaaggagaagattaccggggtcc60

acttaaaccgtatagccaacaattcagctatgcgggga98

<210>33

<211>4224

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体的修饰的rpoc

<400>33

gtgaaagatttattaaagtttctgaaagcgcagactaaaaccgaagagtttgatgcgatc60

aaaattgctctggcttcgccagacatgatccgttcatggtctttcggtgaagttaaaaag120

ccggaaaccatcaactactgtacgttcaaaccagaacgtgacggccttttctgcgcccgt180

atctttgggccggtaaaagattacgagtgcctgtgcggtaagtacaagcgcctgaaacac240

cgtggcgtcatctgtgagaagtgcggcgttgaagtgacccagactaaagtacgccgtgag300

cgtatgggccacatcgaactggcttccccgactgcgcacatctggttcctgaaatcgctg360

ccgtcccgtatcggtctgctgctcgatatgccgctgcgcgatatcgaacgcgtactgtac420

tttgaatcctatgtggttatcgaaggcggtatgaccaacctggaacgtcagcagatcctg480

actgaagagcagtatctggacgcgctggaagagttcggtgacgaattcgacgcgaagatg540

ggggcggaagcaatccaggctctgctgaagagcatggatctggagcaagagtgcgaacag600

ctgcgtgaagagctgaacgaaaccaactccgaaaccaagcgtaaaaagctgaccaagcgt660

atcaaactgctggaagcgttcgttcagtctggtaacaaaccagagtggatgatcctgacc720

gttctgccggtactgccgccagatctgcgtccgctggttccgctggatggtggtcgtttc780

gcgacttctgacctgaacgatctgtatcgtcgcgtcattaaccgtaacaaccgtctgaaa840

cgtctgctggatctggctgcgccggacatcatcgtacgtaacgaaaaacgtatgctgcag900

gaagcggtagacgccctgctggataacggtcgtcgcggtcgtgcgatcaccggttctaac960

aagcgtcctctgaaatctttggccgacatgatcaaaggtaaacagggtcgtttccgtcag1020

aacctgctcggtaagcgtgttgactactccggtcgttctgtaatcaccgtaggtccatac1080

ctgcgtctgcatcagtgcggtctgccgaagaaaatggcactggagctgttcaaaccgttc1140

atctacggcaagctggaactgcgtggtcttgctaccaccattaaagctgcgaagaaaatg1200

gttgagcgcgaagaagctgtcgtttgggatatcctggacgaagttatccgcgaacacccg1260

gtactgctgaaccgtgcaccgactctgcaccgtctgggtatccaggcatttgaaccggta1320

ctgatcgaaggtaaagctatccagctgcacccgctggtttgtgcggcatataacgccgac1380

ttcgatggtgaccagatggctgttcacgtaccgctgacgctggaagcccagctggaagcg1440

cgtgcgctgatgatgtctaccaacaacatcctgtccccggcgaacggcgaaccaatcatc1500

gttccgtctcaggacgttgtactgggtctgtactacatgacccgtgactgtgttaacgcc1560

aaaggcgaaggcatggtgctgactggcccgaaagaagcagaacgtctgtatcgctctggt1620

ctggcttctctgcatgcgcgcgttaaagtgcgtatcaccgagtatgaaaaagatgctaac1680

ggtgaattagtagcgaaaaccagcctgaaagacacgactgttggccgtgccattctgtgg1740

atgattgtaccgaaaggtctgccttactccatcgtcaaccaggcgctgggtaaaaaagca1800

atctccaaaatgctgaacacctgctaccgcattctcggtctgaaaccgaccgttattttt1860

gcggaccagatcatgtacaccggcttcgcctatgcagcgcgttctggtgcatctgttggt1920

atcgatgacatggtcatcccggagaagaaacacgaaatcatctccgaggcagaagcagaa1980

gttgctgaaattcaggagcagttccagtctggtctggtaactgcgggcgaacgctacaac2040

aaagttatcgatatctgggctgcggcgaacgatcgtgtatccaaagcgatgatggataac2100

ctgcaaactgaaaccgtgattaaccgtgacggtcaggaagagaagcaggtttccttcaac2160

agcatctacatgatggccgactccggtgcgcgtggttctgcggcacagattcgtcagctt2220

gctggtatgcgtggtctgatggcgaagccggatggctccatcatcgaaacgccaatcacc2280

gcgaacttccgtgaaggtctgaacgtactccagtacttcatctccacccacggtgctcgt2340

aaaggtctggcggataccgcactgaaaactgcgaactccggttacctgactcgtcgtctg2400

gttgacgtggcgcaggacctggtggttaccgaagacgattgtggtacccatgaaggtatc2460

atgatgactccggttatcgagggtggtgacgttaaagagccgctgcgcgatcgcgtactg2520

ggtcgtgtaactgctgaagacgttctgaagccgggtactgctgatatcctcgttccgcgc2580

aacacgctgctgcacgaacagtggtgtgacctgctggaagagaactctgtcgacgcggtt2640

aaagtacgttctgttgtatcttgtgacaccgactttggtgtatgtgcgcactgctacggt2700

cgtgacctggcgcgtggccacatcatcaacaagggtgaagcaatcggtgttatcgcggca2760

cagtccatcggtgaaccgggtacacagctgaccatgcgtacgttccacatcggtggtgcg2820

gcatctcgtgcggctgctgaatccagcatccaagtgaaaaacaaaggtagcatcaagctc2880

agcaacgtgaagtcggttgtgaactccagcggtaaactggttatcacttcccgtaatact2940

gaactgaaactgatcgacgaattcggtcgtactaaagaaagctacaaagtaccttacggt3000

gcggtactggcgaaaggcgatggcgaacaggttgctggcggcgaaaccgttgcaaactgg3060

gacccgcacaccatgccggttatcaccgaagtaagcggttttgtacgctttactgacatg3120

atcgacggccagaccattacgcgtcagaccgacgaactgaccggtctgtcttcgctggtg3180

gttctggattccgcagaacgtaccgcaggtggtaaagatctgcgtccggcactgaaaatc3240

gttgatgctcagggtaacgacgttctgatcccaggtaccgatatgccagcgcagtacttc3300

ctgccgggtaaagcgattgttcagctggaagatggcgtacagatcagctctggtgacacc3360

ctggcgcgtattccgcaggaatccggcggtaccaaggacatcaccggtggtctgccgcgc3420

gttgcggacctgttcgaagcacgtcgtccgaaagagccggcaatcctggctgaaatcagc3480

ggtatcgtttccttcggtaaagaaaccaaaggtaaacgtcgtctggttatcaccccggta3540

gacggtagcgatccgtacgaagagatgattccgaaatggcgtcagctcaacgtgttcgaa3600

ggtgaacgtgtagaacgtggtgacgtaatttccgacggtccggaagcgccgcacgacatt3660

ctgcgtctgcgtggtgttcatgctgttactcgttacatcgttaacgaagtacaggacgta3720

taccgtctgcagggcgttaagattaacgataaacacatcgaagttatcgttcgtcagatg3780

ctgcgtaaagctaccatcgttaacgcgggtagctccgacttcctggaaggcgaacaggtt3840

gaatactctcgcgtcaagatcgcaaaccgcgaactggaagcgaacggcaaagtgggtgca3900

acttactcccgcgatctgctgggtatcaccaaagcgtctctggcaaccgagtccttcatc3960

tccgcggcatcgttccaggagaccactcgcgtgctgaccgaagcagccgttgcgggcaaa4020

cgcgacgaactgcgcggcctgaaagagaacgttatcgtgggtcgtctgatcccggcaggt4080

accggttacgcgtaccaccaggatcgtatgcgtcgccgtgctgcgggtgaagctccggct4140

gcaccgcaggtgactgcagaagacgcatctgccagcctggcagaactgctgaacgcaggt4200

ctgggcggttctgataacgagtaa4224

<210>34

<211>1407

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体的修饰的rpoc

<400>34

vallysaspleuleulyspheleulysalaglnthrlysthrgluglu

151015

pheaspalailelysilealaleualaserproaspmetileargser

202530

trpserpheglygluvallyslysprogluthrileasntyrcysthr

354045

phelysprogluargaspglyleuphecysalaargilepheglypro

505560

vallysasptyrglucysleucysglylystyrlysargleulyshis

65707580

argglyvalilecysglulyscysglyvalgluvalthrglnthrlys

859095

valargarggluargmetglyhisilegluleualaserprothrala

100105110

hisiletrppheleulysserleuproserargileglyleuleuleu

115120125

aspmetproleuargaspilegluargvalleutyrpheglusertyr

130135140

valvalilegluglyglymetthrasnleugluargglnglnileleu

145150155160

thrglugluglntyrleuaspalaleugluglupheglyaspgluphe

165170175

aspalalysmetglyalaglualaileglnalaleuleulyssermet

180185190

aspleugluglnglucysgluglnleuargglugluleuasngluthr

195200205

asnsergluthrlysarglyslysleuthrlysargilelysleuleu

210215220

glualaphevalglnserglyasnlysproglutrpmetileleuthr

225230235240

valleuprovalleuproproaspleuargproleuvalproleuasp

245250255

glyglyargphealathrseraspleuasnaspleutyrargargval

260265270

ileasnargasnasnargleulysargleuleuaspleualaalapro

275280285

aspileilevalargasnglulysargmetleuglnglualavalasp

290295300

alaleuleuaspasnglyargargglyargalailethrglyserasn

305310315320

lysargproleulysserleualaaspmetilelysglylysglngly

325330335

argpheargglnasnleuleuglylysargvalasptyrserglyarg

340345350

servalilethrvalglyprotyrleuargleuhisglncysglyleu

355360365

prolyslysmetalaleugluleuphelyspropheiletyrglylys

370375380

leugluleuargglyleualathrthrilelysalaalalyslysmet

385390395400

valgluarggluglualavalvaltrpaspileleuaspgluvalile

405410415

arggluhisprovalleuleuasnargalaprothrleuhisargleu

420425430

glyileglnalaphegluprovalleuilegluglylysalailegln

435440445

leuhisproleuvalcysalaalatyrasnalaasppheaspglyasp

450455460

glnmetalavalhisvalproleuthrleuglualaglnleugluala

465470475480

argalaleumetmetserthrasnasnileleuserproalaasngly

485490495

gluproileilevalproserglnaspvalvalleuglyleutyrtyr

500505510

metthrargaspcysvalasnalalysglygluglymetvalleuthr

515520525

glyprolysglualagluargleutyrargserglyleualaserleu

530535540

hisalaargvallysvalargilethrglutyrglulysaspalaasn

545550555560

glygluleuvalalalysthrserleulysaspthrthrvalglyarg

565570575

alaileleutrpmetilevalprolysglyleuprotyrserileval

580585590

asnglnalaleuglylyslysalaileserlysmetleuasnthrcys

595600605

tyrargileleuglyleulysprothrvalilephealaaspglnile

610615620

mettyrthrglyphealatyralaalaargserglyalaservalgly

625630635640

ileaspaspmetvalileproglulyslyshisgluileileserglu

645650655

alaglualagluvalalagluileglngluglnpheglnserglyleu

660665670

valthralaglygluargtyrasnlysvalileaspiletrpalaala

675680685

alaasnaspargvalserlysalametmetaspasnleuglnthrglu

690695700

thrvalileasnargaspglyglngluglulysglnvalserpheasn

705710715720

seriletyrmetmetalaaspserglyalaargglyseralaalagln

725730735

ileargglnleualaglymetargglyleumetalalysproaspgly

740745750

serileilegluthrproilethralaasnphearggluglyleuasn

755760765

valleuglntyrpheileserthrhisglyalaarglysglyleuala

770775780

aspthralaleulysthralaasnserglytyrleuthrargargleu

785790795800

valaspvalalaglnaspleuvalvalthrgluaspaspcysglythr

805810815

hisgluglyilemetmetthrprovalilegluglyglyaspvallys

820825830

gluproleuargaspargvalleuglyargvalthralagluaspval

835840845

leulysproglythralaaspileleuvalproargasnthrleuleu

850855860

hisgluglntrpcysaspleuleuglugluasnservalaspalaval

865870875880

lysvalargservalvalsercysaspthrasppheglyvalcysala

885890895

hiscystyrglyargaspleualaargglyhisileileasnlysgly

900905910

glualaileglyvalilealaalaglnserileglygluproglythr

915920925

glnleuthrmetargthrphehisileglyglyalaalaserargala

930935940

alaalagluserserileglnvallysasnlysglyserilelysleu

945950955960

serasnvallysservalvalasnserserglylysleuvalilethr

965970975

serargasnthrgluleulysleuileaspglupheglyargthrlys

980985990

glusertyrlysvalprotyrglyalavalleualalysglyaspgly

99510001005

gluglnvalalaglyglygluthrvalalaasntrpaspprohisthr

101010151020

metprovalilethrgluvalserglyphevalargphethraspmet

1025103010351040

ileaspglyglnthrilethrargglnthraspgluleuthrglyleu

104510501055

serserleuvalvalleuaspseralagluargthralaglyglylys

106010651070

aspleuargproalaleulysilevalaspalaglnglyasnaspval

107510801085

leuileproglythraspmetproalaglntyrpheleuproglylys

109010951100

alailevalglnleugluaspglyvalglnileserserglyaspthr

1105111011151120

leualaargileproglngluserglyglythrlysaspilethrgly

112511301135

glyleuproargvalalaaspleupheglualaargargprolysglu

114011451150

proalaileleualagluileserglyilevalserpheglylysglu

115511601165

thrlysglylysargargleuvalilethrprovalaspglyserasp

117011751180

protyrgluglumetileprolystrpargglnleuasnvalpheglu

1185119011951200

glygluargvalgluargglyaspvalileseraspglyprogluala

120512101215

prohisaspileleuargleuargglyvalhisalavalthrargtyr

122012251230

ilevalasngluvalglnaspvaltyrargleuglnglyvallysile

123512401245

asnasplyshisilegluvalilevalargglnmetleuarglysala

125012551260

thrilevalasnalaglyserserasppheleugluglygluglnval

1265127012751280

glutyrserargvallysilealaasnarggluleuglualaasngly

128512901295

lysvalglyalathrtyrserargaspleuleuglyilethrlysala

130013051310

serleualathrgluserpheileseralaalaserpheglngluthr

131513201325

thrargvalleuthrglualaalavalalaglylysargaspgluleu

133013351340

argglyleulysgluasnvalilevalglyargleuileproalagly

1345135013551360

thrglytyralatyrhisglnaspargmetargargargalaalagly

136513701375

glualaproalaalaproglnvalthralagluaspalaseralaser

138013851390

leualagluleuleuasnalaglyleuglyglyseraspasnglu

139514001405

<210>35

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体rpoc引物

<400>35

ctgcaggaattcgatcggttcttacagcctggttac36

<210>36

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体rpoc引物

<400>36

gaacgtacagtagttgatgg20

<210>37

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体rpoc引物

<400>37

ccatcaactactgtacgttc20

<210>38

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体rpoc引物

<400>38

gtcgactagcgtgatcttggtttcggagttggtttc36

<210>39

<211>4224

<212>dna

<213>大肠杆菌

<400>39

gtgaaagatttattaaagtttctgaaagcgcagactaaaaccgaagagtttgatgcgatc60

aaaattgctctggcttcgccagacatgatccgttcatggtctttcggtgaagttaaaaag120

ccggaaaccatcaactaccgtacgttcaaaccagaacgtgacggccttttctgcgcccgt180