细胞培养基片以及使用了该细胞培养基片的细胞培养方法与流程

1.本发明涉及细胞培养基片，特别涉及用于独立地培养多个细胞的用途的细胞培养基片。另外，本发明涉及使用了该细胞培养基片的细胞培养方法。


背景技术：

2.以往，以同时培养多个细胞为目的，已知有具备多个孔的细胞培养基片。这种细胞培养基片被称作“多孔型”的培养基片。在图10及图11中示出以往的多孔型的细胞培养基片的构造。图10对应于立体图，图11对应于剖面图。
3.图10所示的细胞培养基片100具备六个相同形状的孔110。更详细地说，细胞培养基片100具备具有贯通孔的上部托盘120、以及与上部托盘120接触地配置的下部托盘130，通过下部托盘130的面与上部托盘120的贯通孔而形成有孔110。
4.如图11所示，细胞140配置于各孔110的底面，培养液150以覆盖细胞140的方式添加。
5.但是，在图10所示的细胞培养基片100的构成中，由于各孔110独立，因此无法用于检查配置于各孔110的细胞140彼此的相互作用的目的。从该观点出发，例如在下述专利文献1中，公开了能够使收容于不同的孔的培养液(培养基)共用的细胞培养基片。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：日本特开2007－510429号公报


技术实现要素：

9.发明要解决的课题
10.图12及图13是专利文献1所公开的多孔型的细胞培养基片的构造例。图12对应于立体图，图13对应于剖面图。
11.图12所示的多孔型的细胞培养基片200具有主体205、以及配置于主体205的上表面210的外壁215。在主体205的上表面210的规定的位置设有六个凹部，由此形成有孔220。
12.在培养细胞时，将细胞140配置于各孔220的底面，以覆盖细胞140的方式添加培养液150。这里，如图13所示，对细胞培养基片200供给培养液150，直到培养液150的液面达到超过各孔220的上表面的位置为止。此时，各孔220经由培养液150而连通。因此，能够观察从在某一孔220内培养的细胞140释放的生理活性物质对在其他孔220内培养的另一细胞140产生的影响。
13.然而，本发明人们模拟更接近生物体内的环境研究了es/ips细胞的功能
·
作用。在该研究的过程中，发现了在研究模拟接近生物体内的环境的情况下，同时培养某一细胞a与另一细胞b，存在在排除了从细胞b释放的生理活性物质xb对细胞a造成的影响的状态下，观察从细胞a释放的生理活性物质xa对细胞b造成的影响的必要性。
14.但是，在图12及图13所示的细胞培养基片200的情况下，虽然能够观察在所有孔
220中培养的各细胞140间的相互作用，但无法用于观察特定的某个细胞对其他特定的某个细胞的影响的用途。
15.作为其他方法，考虑了使用泵等驱动机构一边使培养液向一个方向强制地流动一边培养细胞的方法。但是，在培养细胞时，若使用泵等驱动机构，则存在不仅基片的尺寸极其大型化，而且电源的处理等复杂化的课题。若使基片的尺寸小型化，则能够在相同的面积内培养多个细胞，因此研究的效率极大地提高。
16.鉴于上述的课题，本发明的目的在于提供一种不另外使用驱动机构就能够在具有方向性的状态下观察细胞彼此的相互作用的细胞培养基片以及细胞培养方法。
17.用来解决课题的手段
18.本发明的细胞培养基片，其特征在于，具备：
19.第一培养室，能够培养细胞；
20.第二培养室，配置于与所述第一培养室分离的位置，能够相对于所述第一培养室独立地培养细胞；
21.第一孔，与所述第一培养室连结，能够存储液体；
22.第二孔，与所述第二培养室连结，能够存储液体；以及
23.连结部，当存储于所述第一孔的第一液体的液面达到规定的高度位置以上时，使所述第一液体从所述第一孔流入所述第二孔。
24.根据所述细胞培养基片，仅控制培养液的溶液量就能够使第一液体从第一孔流入第二孔。该第一液体存储于与第一培养室连结的第一孔，因此包含从在第一培养室内培养的细胞(以下，称作“第一细胞”。)释放的生理活性物质(以下，称作“第一生理活性物质”。)。由此，该第一液体经由第二孔流入第二培养室，从而第一液体所含的第一生理活性物质与在第二培养室内培养的细胞(以下，称作“第二细胞”。)接触。其结果，能够观察第一生理活性物质对第二细胞产生的影响。
25.另一方面，根据所述细胞培养基片，与第二培养室接触的培养液不会流入第一培养室侧。其结果，能够避免从第二细胞释放的生理活性物质(以下，称作“第二生理活性物质”。)对第一细胞产生影响。
26.另外，根据所述细胞培养基片，仅调整培养液的供给量就能够使第一生理活性物质与第二细胞接触，因此无需另外设置泵等驱动机构。其结果，可实现细胞培养基片的尺寸的小型化。
27.在所述细胞培养基片中，也可以是，
28.所述第一孔与所述第二孔隔着隔壁而邻接，
29.所述连结部由所述隔壁构成。
30.在这种情况下，也可以是，所述隔壁具备缺口部，该缺口部的底面的高度位置根据部位而变化。
31.根据上述构成，能够根据缺口部的形状，自如地调整第一液体流入第二孔内的速度、用于使第一液体流入第二孔内而供给的培养液的量。
32.在所述细胞培养基片中，也可以是，
33.所述第一孔与所述第二孔隔着槽状流路而邻接，
34.所述连结部由所述槽状流路构成。
35.在所述细胞培养基片中，也可以是，
36.所述第一孔的底面与所述第一培养室的底面由共同的面构成，
37.所述第一培养室的铅垂方向的长度比从所述第一孔的底面到所述规定的高度位置的长度短。
38.根据该构成，由于第一孔的底面与第一培养室的底面共用，因此能够用简易的方法制造细胞培养基片。
39.所述细胞培养基片也可以具备：
40.第三孔，相对于所述第一培养室，在与所述第一孔相反的一侧的位置连结；以及
41.第四孔，相对于所述第二培养室，在与所述第二孔相反的一侧的位置连结。
42.根据上述构成，通过从第三孔侧使培养液流入，将存储于第一孔内的第一液体向第二孔侧挤出。另外，能够将流过了第二培养室的液体从第四孔侧取出。
43.另外，在上述构成中，也可以是，所述第一孔的底面、所述第一培养室的底面、所述第三孔的底面、所述第二孔的底面、所述第二培养室的底面、以及所述第四孔的底面全部由共同的面构成。
44.本发明的细胞培养方法，其特征在于，具有：
45.工序(a)，在所述第一培养室内以及所述第二培养室内，分别独立地培养细胞；以及
46.工序(b)，经由所述第一培养室流入培养液，使存储于所述第一孔内的所述第一液体的液面的高度位置上升，
47.在所述工序(b)中，调整所述培养液的流入量，以使所述第一液体经由所述连结部、所述第二孔流入所述第二培养室内。
48.在所述细胞培养方法中，也可以是，
49.所述细胞培养基片具备第三孔，该第三孔相对于所述第一培养室，在与所述第一孔相反的一侧的位置连结，
50.所述工序(b)是从所述第三孔流入所述培养液的工序。
51.发明效果
52.根据本发明，可实现不另外使用驱动机构就能够在具有方向性的状态下观察细胞彼此的相互作用的细胞培养基片以及细胞培养方法。
附图说明
53.图1是表示细胞培养基片的一实施方式的构造的照片。
54.图2是示意地表示图1所示的细胞培养基片的构造的俯视图。
55.图3是图2内的x1－x1线剖面图。
56.图4是图2内的x2－x2线剖面图。
57.图5是图2内的x3－x3线剖面图。
58.图6是对第一孔与第二孔的部分进行图示的示意性的立体图。
59.图7是在图6中从第一孔朝向第二孔的方向观察隔壁时的示意性的俯视图。
60.图8a是示意地表示细胞培养基片的使用方法的工序图。
61.图8b是示意地表示细胞培养基片的使用方法的工序图。
62.图9是示意地表示细胞培养基片的其他实施方式的构造的立体图。
63.图10是示意地表示以往的多孔型的细胞培养基片的构造的一个例子的立体图。
64.图11是示意地表示图10所示的细胞培养基片的构造的剖面图。
65.图12是示意地表示以往的多孔型的细胞培养基片的构造的一个例子的立体图。
66.图13是示意地表示图12所示的细胞培养基片的构造的剖面图。
具体实施方式
67.参照附图，对本发明的细胞培养基片以及细胞培养方法进行说明。另外，以下的各附图只不过是示意性地进行图示的图。即，附图上的尺寸比不一定与实际的尺寸比一致，另外，在各附图间尺寸比也不一定一致。
68.[构造]
[0069]
图1是表示细胞培养基片的一实施方式的构造的照片。图2是示意地表示图1所示的细胞培养基片1的构造的俯视图。图3是以图2内的x1－x1线切断细胞培养基片1时的示意性的剖面图。图4是以图2内的x2－x2线切断细胞培养基片1时的示意性的剖面图。图5是以图2内的x3－x3线切断细胞培养基片1时的示意性的剖面图。
[0070]
图1～图5所示的细胞培养基片1具备第一培养室11、第二培养室12、第一孔21、第二孔22、第三孔23、以及第四孔24。第一培养室11、第二培养室12、第一孔21、第二孔22、第三孔23、以及第四孔24均构成周围被壁部覆盖的筒状或者管状的空间。第一培养室11以及第二培养室12构成培养细胞的空间。
[0071]
在本实施方式中，细胞培养基片1具备底部3与主体5。主体5具有四个贯通孔，该贯通孔的一方的面与底部3接触，从而形成有各孔(21～24)。另外，主体5在底部3侧的面具有一对细管状的凹部，通过该凹部与底部3之间的区域形成有各培养室(11、12)。
[0072]
第一培养室11的一方的端部与第三孔23连结，另一方的端部与第一孔21连结。第二培养室12的一方的端部与第二孔22连结，另一方的端部与第四孔24连结。
[0073]
如图1～图4所示，第一培养室11与第二培养室12配置于分离的位置。另外，在第一孔21与第二孔22之间形成有隔壁6。在本实施方式中，该隔壁6构成“连结部”。另一方面，如图5所示，第三孔23与第四孔24通过主体5的壁而被完全分离。
[0074]
图6是从细胞培养基片1仅提取第一孔21与第二孔22的部分来进行图示的示意性的立体图。在第一孔21与第二孔22之间实施有隔壁6。在本实施方式中，隔壁6具有根据位置而高度不同的缺口部6a。图7是从第一孔21朝向第二孔22的方向观察隔壁6时的示意性的俯视图。
[0075]
第一培养室11的高度h11比隔壁6的高度h6低。另外，第一孔21的高度h21比隔壁6的高度h6高。
[0076]
尺寸的一个例子如下所述。底部3的高度(厚度)w3为约1mm，优选为100μm以上且2mm以下。第一孔21的高度h21、第二孔22的高度h22、第三孔23的高度h23、以及第四孔24的高度h24均为约5mm。第一培养室11的高度h11以及第二培养室12的高度h12均为约400μm。隔壁6的高度h6为约3mm。第一孔21、第二孔22、第三孔23、以及第四孔24的与底部3的面平行的方向的面(开口面)的大小为约3.5mm
□
。从第三孔23的与第一孔21相反的一侧的端面23a到第一孔21的与第三孔23相反的一侧的端面21a的距离为约12.5mm。从第二孔22的与第四孔
24相反的一侧的端面22a到第四孔24的与第二孔22相反的一侧的端面24a的距离为约12.5mm。第一培养室11的长度方向的长度t11以及第二培养室12的长度方向的长度t12均为约5.5mm。
[0077]
构成细胞培养基片1的底部3以及主体5均优选由具有透明性的材料构成。由此，能够从细胞培养基片1的外侧目视确认在第一培养室11以及第二培养室12内培养的细胞。除此之外，构成细胞培养基片1的底部3以及主体5优选为能够注射成型的材料。
[0078]
[使用方法]
[0079]
以下，参照图8a及图8b，对上述的细胞培养基片1的使用方法的一个例子进行说明。
[0080]
如图8a的(a)所示，从第三孔23侧流入包含规定的细胞41的培养液42，从第四孔24侧流入包含规定的细胞51的培养液52。另外，细胞51是评价从细胞41释放的生理活性物质所带来的影响的对象细胞。作为一个例子，能够将细胞41设为肝脏细胞，将细胞51设为肾脏细胞，此外，作为另一个例子，能够将细胞41设为心脏细胞，将细胞51设为肾脏细胞。另外，它们也可以相反。
[0081]
在流入培养液(42、52)时，例如能够使用微量移液管。从第三孔23侧流入的培养液42通过第一培养室11而到达第一孔21内。从第四孔24侧流入的培养液52通过第二培养室12而到达第二孔22内。
[0082]
此时，培养液42的流入量为在到达第一孔21内时不越过隔壁6的范围内的量。同样，培养液52的流入量为在到达第二孔22内时不越过隔壁6的程度的量。
[0083]
接下来，如图8a的(b)所示，去除存储于第一孔21内的培养液42、以及存储于第二孔22内和第四孔24内的培养液52。在去除培养液(42、52)时，也能够使用微量移液管。之后，存储于第三孔23内的培养液42向第一孔21侧流入，成为图8a的(c)所示的状况。
[0084]
通过该工序，在第一培养室11内保持包含细胞41的培养液42，在第二培养室12内保持包含细胞51的培养液52。即，形成在第一培养室11内培养细胞41、在第二培养室12内培养细胞51的环境。该工序对应于工序(a)。
[0085]
通过在该状态下保持规定的时间，使得在第一培养室11内培养的细胞41向培养液42内释放生理活性物质。这里所说的生理活性物质是指，例如可列举表示内分泌作用的细胞因子、激素、脂质、细胞外基质、微rna、外泌体、营养素、或者药剂等。另外，根据需要，也可以使存储于第一孔21内的培养液42不超过隔壁6的范围内的量的培养液42从第三孔23侧追加地流入。
[0086]
在经过了规定时间之后，从第三孔23侧流入培养液43(图8b的(a))。培养液43可以是与培养液42相同的材料，在对细胞41不产生影响的范围内也可以是与培养液42不同的材料。培养液42对应于“第一液体”。由此，存储于第一孔21内的培养液42的液面上升。培养液43以培养液42可越过隔壁6的程度的量流入。其结果，包含从细胞41释放的生理活性物质的培养液42经由第二孔22向第二培养室12供给(图8b的(b)、图8b的(c))。该工序对应于工序(b)。
[0087]
然后，在图8b的(c)的状态下等待规定时间。由此，从细胞41释放的生理活性物质在与第二培养室12内培养的细胞51接触的状态下保持一定时间，因此能够评价从细胞41释放的生理活性物质对细胞51的影响的有无及其形态。
[0088]
如以上那样，根据细胞培养基片1，仅调整从第三孔23侧流入的培养液43的供给量就能够使从细胞41释放的生理活性物质与细胞51接触，因此无需另外设置泵等驱动机构。另外，由于从细胞51释放的生理活性物质不会对细胞41起作用，因此能够更正确地评价从细胞41释放的生理活性物质对细胞51赋予的影响。
[0089]
[其他实施方式]
[0090]
以下，对其他实施方式进行说明。
[0091]
〈1〉上述实施方式的细胞培养基片1为如下构成：第一孔21与第二孔22之间由隔壁6隔开，培养液42的液面越过隔壁6的高度，从而使培养液42从第一孔21向第二孔22侧流入。但是，细胞培养基片1并不限定于这种方式。即，细胞培养基片1不限于隔壁6，只要是具备在培养液42的液面超过规定的高度时才使培养液42从第一孔21向第二孔22流入的连结部的构成即可。
[0092]
作为一个例子，如图9中示意地图示的那样，细胞培养基片1也能够采用具备连结第一孔21与第二孔22的槽状流路7的构成。当存储于第一孔21内的培养液42的液面超过槽状流路7的高度h7时，该槽状流路7才首次将培养液42向第二孔22侧引导。通过该构成，也能够仅通过调整从第三孔23侧流入的培养液43的供给量使从细胞41释放的生理活性物质与细胞51接触。
[0093]
另外，作为其他例子，细胞培养基片1也可以具备连结第一孔21与第二孔22的管状流路。
[0094]
〈2〉细胞培养基片1只要能够对第一培养室11注入培养液42(43)即可，在该范围内也可以不一定具备第三孔23。同样，细胞培养基片1也可以不一定具备第四孔24。
[0095]
〈3〉在上述实施方式中，对细胞培养基片1具备两个培养室(11、12)的情况进行了说明。但是，细胞培养基片1也可以具备串联连接的三个以上的培养室。
[0096]
〈4〉在上述实施方式中，对各孔(21、22、23、24)以及各培养室(11、12)将底部3的上表面作为共同的底面的情况进行了说明。但是，该方式为一个例子。但是，从能够使细胞培养基片1的制造工序容易化并且能够使细胞培养基片1的尺寸极其小型化的观点出发，优选使各孔(21、22、23、24)以及各培养室(11、12)的底面共用。
[0097]
〈5〉在上述实施方式中，对隔壁6表示具有缺口部6a的形状的情况进行了说明。但是，在细胞培养基片1具备隔壁6的情况下，若隔壁6的高度构成为比第一孔21的其他壁面的高度低，则也可以是隔壁6不一定具备缺口部6a的形状。另外，在具备具有缺口部6a的隔壁6的情况下，能够根据缺口部6a的形状、高度位置适当调整使培养液42向第二培养室12侧流入的速度。
[0098]
附图标记说明
[0099]
1：细胞培养基片
[0100]
3：底部
[0101]
5：主体
[0102]
6：隔壁
[0103]
6a：隔壁的缺口部
[0104]
7：槽状流路
[0105]
11：第一培养室
[0106]
12：第二培养室
[0107]
21：第一孔
[0108]
21a：第一孔的壁面
[0109]
22：第二孔
[0110]
22a：第二孔的壁面
[0111]
23：第三孔
[0112]
23a：第三孔的壁面
[0113]
24：第四孔
[0114]
24a：第四孔的壁面
[0115]
41：细胞
[0116]
42、43：培养液
[0117]
51：细胞
[0118]
52：培养液
[0119]
100：以往的细胞培养基片
[0120]
110：孔
[0121]
120：上部托盘
[0122]
130：下部托盘
[0123]
140：细胞
[0124]
150：培养液
[0125]
200：以往的细胞培养基片
[0126]
205：主体
[0127]
210：主体的上表面
[0128]
215：外壁
[0129]
220：孔