用于将皮肤重编程为产生胰岛素的组织的组合物和方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月1日提交的美国临时申请号62/713,239的权益，将该临时申请通过引用以其全文特此并入本文。

序列表

本申请含有2019年8月1日创建的、以名为“321501-2330sequencelisting_st25”的ascii.txt文件的电子形式提交的序列表。序列表的内容以其全文并入本文。

背景技术：

1型糖尿病(t1d)是一种慢性、衰弱性自身免疫病，其靶向胰腺β细胞，降低β细胞量，导致胰岛素产生不足。尽管尚不清楚t1d的确切病因，但它在幼儿中普遍存在，并且尽管它是最常见的内分泌紊乱之一，但仍无法有效治愈。胰岛或胰腺的成功移植可以减少t1d的一些并发症。但是，器官短缺严重限制了这种方法。因此，需要改善的组合物和方法来补充产生内源性胰岛素的细胞。

技术实现要素：

本文披露了用于在体外和体内将皮肤细胞重编程为产生胰岛素的细胞的组合物和方法。一个实施例披露了包含编码pdx1、ng3、mafa和tcf3(“pmn-t因子”)的两个或更多个核酸序列的多核苷酸。在一些实施例中，pmn-t因子是哺乳类蛋白，例如人蛋白。

在一些实施例中，pmn-t因子以近似相等的比率表达。在一些实施例中，pdx1、ng3、mafa和tcf3蛋白以约1:1:1:1、2:1:1:1、1:2:1:1、1:1:2:1、1:1:1:2、2:2:1:1、2:1:2:1、2:1:1:2、1:2:2:1、1:1:2:2、1:2:1:2、3:1:1:1、1:3:1:1、1:1:3:1、1:1:1:3、3:2:1:1、3:1:2:1、3:1:1:2、1:3:2:1、1:1:3:2、1:3:1:2、2:3:1:1、2:1:3:1、2:1:1:3、1:2:3:1、1:1:2:3、1:2:1:3(pdx1:ng3:mafa:tcf3)的比率表达。

还披露了含有所披露的多核苷酸的非病毒运载体。在特定实施例中，运载体是重组细菌质粒。例如，在一些实施例中，非病毒运载体具有pcdna3骨架。在一些实施例中，运载体包含内部核糖体进入位点(ires)。

还披露了将皮肤细胞重编程为产生胰岛素的细胞的方法，该方法涉及将包含编码pdx1、ng3、mafa和tcf3的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。每个pnm-t因子可以同时递送、依次递送或其任何组合。在一些实施例中，该方法涉及首先将包含编码pdx1的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。该方法还可以涉及在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天后将包含编码ng3、mafa和tcf3的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。在一些实施例中，该方法涉及首先将包含编码tcf3的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。该方法还可以涉及在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天后将包含编码ng3、mafa和pdx1的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。在一些实施例中，该方法涉及首先将包含编码mafa的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。该方法还可以涉及在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天后将包含编码ng3、tcf3和pdx1的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。在一些实施例中，该方法涉及首先将包含编码ng3的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。该方法还可以涉及在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天后将包含编码mafa、tcf3和pdx1的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。

在一些实施例中，在用编码pmn-t因子的核酸序列转染靶细胞后，这些细胞然后可以将转染的基因(例如cdna)包装到ev中，其随后通过其他皮肤细胞可以帮助形成产生胰岛素的细胞。因此，还披露了将皮肤细胞重编程为产生胰岛素的细胞的方法，该方法涉及使这些皮肤细胞暴露于细胞外囊泡(extracellularvesicle)，该细胞外囊泡由含有或表达pmn-t因子的细胞产生。

在这些实施例中，可以将多核苷酸和组合物在细胞内递送到皮肤细胞或供体细胞中，该递送是经由基因枪、适于这种递送的微粒或纳米颗粒、电穿孔转染、三维纳米通道电穿孔、组织纳米转染装置、适于这种递送的脂质体、或深层局部组织纳米电注射装置。在这些实施例中的一些中，可以将多核苷酸掺入非病毒运载体，例如细菌质粒。在一些实施例中，可以使用病毒运载体。例如，可以将多核苷酸掺入病毒运载体，例如腺病毒运载体。然而，在其他实施例中，多核苷酸不通过病毒递送。

还披露了一种用于治疗受试者的糖尿病的方法，该方法涉及使用本文披露的方法将该受试者中有效量的皮肤细胞重编程为产生胰岛素的细胞。例如，在一些实施例中，受试者患有胰岛素依赖型糖尿病。在一些实施例中，受试者患有胰岛素抗性糖尿病。在一些实施例中，受试者在治疗期间具有受控的血糖(不是高血糖)。例如，在一些实施例中，受试者的空腹血糖水平在治疗期间低于180、170、160、150、140、130、120或110mg/dl，包括在治疗期间为70至130mg/dl。

在附图和下文的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。根据描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将是明显的。

附图说明

图1a至1e是显示在用pbs(图1a)、用pnm因子(图1b)、用pnm-t因子(图1c)、仅用tcf3(图1d)、或第1天用tcf3且第7天用pnm(图1e)治疗后从第1周至第14周，由链脲佐菌素(streptozotocin)注射诱导的1型糖尿病小鼠的血糖的图。

具体实施方式

在更详细地描述本披露之前，应理解的是本披露不限于所描述的特定实施例，因此这些当然可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅是为了描述特定实施例的目的，而并不旨在进行限制，因为本披露的范围将仅由所附权利要求限定。

在提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则每个中间值均应为下限单位的十分之一；所述每个中间值应介于该范围的上限和下限之间以及在所述范围内的任何其它所述数值或中间值。所述每个中间值被涵盖在本披露内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也应被涵盖在本披露内，但要遵守所述范围内任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本披露中。

除非另有定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。现在描述了优选的方法和材料，但与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可以用于实践或测试本披露。

在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用并入本文，就像每个单独公开物或专利被特定地并且单独地指示为通过引用并入，并且通过引用并入本文以结合所引用的这些公开物来披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日之前的披露，并且不能理解为承认因为先前披露而本披露无权先于这些公开物。此外，所提供的公开物的日期可能与实际的公开物的日期不同，实际的公开物的日期可能需要单独地确认。

如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本披露时，本文描述和展示的单独实施例的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本披露的范围或精神的情况下易于与任何其他几个实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的次序或按照逻辑上可行的任何其他次序来进行任何叙述的方法。

除非另有说明，否则本披露的实施例将采用本领域技术范围内的化学、生物学等技术。

提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何进行方法和使用探针(如本文披露和要求保护)的完整披露和描述。虽然已尽力确保数字(例如量、温度等)的准确性，但仍应考虑一些误差和偏差。除非另有指示，否则份数是重量份数，温度是℃，并且压力是大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

在详细描述本披露的实施例之前，应当理解，除非另有说明，否则本披露不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造方法等，因为这些可以改变。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在进行限制。在本披露中，在逻辑上可行的情况下，也能以不同的顺序执行步骤。

必须注意的是，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。

定义

术语“受试者”是指作为施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳类。因此，受试者可以是人患者或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生(例如医师)治疗下的受试者。

术语“治疗上有效的”是指所使用的组合物的量有足够的数量以改善疾病或障碍的一种或多种病因或症状。这种改善仅需要减少或改变，而不必消除。

术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“载体(carrier)”是指当与化合物或组合物组合时，有助于或促进该化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或任何其他特征以用于其预期用途或目的的化合物、组合物、物质或结构。例如，可以选择载体以最小化活性成分的任何降解并且最小化受试者中的任何不良副作用。

术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍而对患者进行的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或障碍的治疗，并且该术语还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或障碍的病因的治疗。另外，该术语包括姑息治疗，即设计用于减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或障碍的治疗；预防性治疗，即针对最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充针对改善相关疾病、病理状况或障碍的另一种特定疗法的治疗。

术语“抑制”是指活性、应答、状况、疾病或其他生物学参数的降低。这可以包括但不限于活性、应答、状况或疾病的完全消除。这还可以包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、应答、状况或疾病降低10％。因此，与天然或对照水平相比，降低可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何降低量。

术语“多肽”是指通过肽键或修饰的肽键(例如肽等排体等)彼此连接的氨基酸，并且可以含有除20种基因编码的氨基酸以外的修饰的氨基酸。多肽可以通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰。修饰可以发生在多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。相同类型的修饰能以相同或不同的程度存在于给定多肽的几个位点。同样，给定多肽可以具有许多类型的修饰。修饰包括但不限于乙酰化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、共价交联或环化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、二硫键形成、脱甲基化、半胱氨酸或焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、gpi锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化和转运rna介导的氨基酸添加至蛋白质(如精氨酰化)(参见proteins-structureandmolecularproperties[蛋白质-结构和分子特性]第2版,t.e.creighton,w.h.freemanandcompany[w.h.弗里曼公司],纽约(1993)；posttranslationalcovalentmodificationofproteins[蛋白质的翻译后共价修饰],b.c.johnson编辑,academicpress[学术出版社],纽约,第1-12页(1983))。

如本文所用，术语“氨基酸序列”是指代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或单词的列表。本文所用的氨基酸缩写是氨基酸的常规单字母代码，并表示如下：a，丙氨酸；b，天冬酰胺或天冬氨酸；c，半胱氨酸；d，天冬氨酸；e，谷氨酸盐，谷氨酸；f，苯丙氨酸；g，甘氨酸；h，组氨酸；i，异亮氨酸；k，赖氨酸；l，亮氨酸；m，蛋氨酸；n，天冬酰胺；p，脯氨酸；q，谷氨酰胺；r，精氨酸；s，丝氨酸；t，苏氨酸；v，缬氨酸；w，色氨酸；y，酪氨酸；z，谷氨酰胺或谷氨酸。

如本文所用的短语“核酸”是指能够通过沃森-克里克(watson-crick)碱基配对与互补核酸杂交的、天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是dna或rna或dna-rna杂交、单链或双链、有义或反义的。核酸还可包括核苷酸类似物(例如，brdu)和非磷酸二酯核苷间键(例如，肽核酸(pna)或硫代二酯键)。特别地，核酸可包括但不限于dna、rna、cdna、gdna、ssdna、dsdna或其任何组合。

如本文所用，“核苷酸”是含有碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可通过其磷酸部分和糖部分连接在一起，形成核苷间键。术语“寡核苷酸”有时用于指含有连接在一起的两个或多个核苷酸的分子。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(a)、胞嘧啶-1-基(c)、鸟嘌呤-9-基(g)、尿嘧啶-1-基(u)和胸腺嘧啶-1-基(t)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价磷酸。核苷酸的非限制性实例是3’-amp(3’-腺苷一磷酸)或5’-gmp(5’-鸟苷一磷酸)。

核苷酸类似物是含有对碱基、糖和/或磷酸部分的某种类型的修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域熟知的，并且将包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤、以及糖或磷酸部分的修饰。

核苷酸替代物是具有与核苷酸相似的功能特性，但不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(pna)。核苷酸替代物是以沃森-克里克(watson-crick)或胡斯坦(hoogsteen)方式识别核酸，但通过除磷酸部分以外的部分连接在一起的分子。当与适当的靶核酸相互作用时，核苷酸替代物能够符合双螺旋型结构。

术语“运载体(vector)”或“构建体”是指能够将已经与运载体序列连接的另一核酸转运到细胞中的核酸序列。术语“表达运载体”包括含有基因构建体的任何运载体(例如质粒、粘粒或噬菌体染色体)，该基因构建体的形式适合于由细胞表达(例如，连接至转录控制元件)。“质粒”和“运载体”可互换使用，因为质粒是运载体的常用形式。此外，本发明旨在包括具有等效功能的其他运载体。

术语“可操作地连接到”是指核酸与另一核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列是可操作地连接到其他序列的核酸序列的实例。例如，dna与转录控制元件的可操作连接是指dna与启动子之间的物理和功能关系，使得这种dna的转录通过特异性识别、结合和转录dna的rna聚合酶从启动子启动。

出于本文的目的，给定核苷酸或氨基酸序列c与给定核酸序列d、同给定核酸序列d或相对于给定核酸序列d的％序列同一性(其可替代地表述为给定序列c具有或包含与给定序列d、同给定序列d或相对于给定序列d的一定％序列同一性)计算如下：

100乘以分数w/z，

其中w是序列比对程序在c和d的该程序比对中评为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中z是d中核苷酸或氨基酸的总数。应理解，当序列c的长度不等于序列d的长度时，c与d的％序列同一性不等于d与c的％序列同一性。出于确定百分比序列同一性的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如blast、blast-2、align、align-2或megalign(dnastar公司)软件。

“特异性杂交”是指探针、引物或寡核苷酸在高严格条件下识别基本上互补的核酸(例如，c-met核酸)并与其发生物理相互作用(即碱基配对)，并且基本上不与其他核酸碱基配对。

如本文所用，术语“严格杂交条件”是指如果在探针和靶序列之间具有至少95％、优选至少97％序列同一性，通常会发生杂交。严格杂交条件的实例是在包含50％甲酰胺、5xssc(150mmnacl、15mm柠檬酸三钠)、50mm磷酸钠(ph7.6)、5x邓哈特氏溶液(denhardt’ssolution)、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml变性的剪切载体dna(例如鲑鱼精dna)的溶液中孵育过夜，然后在约65℃在0.1xssc中洗涤杂交支持物。其他杂交和洗涤条件是熟知的，并在sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册],第二版,coldspringharbor[冷泉港],纽约(1989)，特别是第11章中举例说明。

本文披露了用于在体外和体内将皮肤细胞重编程为产生胰岛素的细胞的组合物和方法。

组合物

披露了包含编码选自由pdx1、ng3、mafa和tcf3(“pmn-t因子”)组成的组的蛋白的核酸序列的多核苷酸。编码pdx1、ng3、mafa和tcf3的氨基酸和核酸序列是本领域已知的。

在一些实施例中，pdx1包含氨基酸序列：

mngeeqyyaatqlykdpcafqrgpapefsasppaclymgrqpppppphpfpgalgaleqgsppdispyevppladdpavahlhhhlpaqlalphppagpfpegaepgvleepnrvqlpfpwmkstkahawkgqwaggayaaepeenkrtrtaytraqllelekeflfnkyisrprrvelavmlnlterhikiwfqnrrmkwkkeedkkrgggtavggggvaepeqdcavtsgeellalppppppggavppaapvaaregrlppglsaspqpssvaprrpqepr(seqidno:1)，或与seqidno:1具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，编码pdx1的核酸序列包含核酸序列：

atgaacggcgaggagcagtactacgcggccacgcagctttacaaggacccatgcgcgttccagcgaggcccggcgccggagttcagcgccagcccccctgcgtgcctgtacatgggccgccagcccccgccgccgccgccgcacccgttccctggcgccctgggcgcgctggagcagggcagcccccctgacatctccccgtacgaggtgccccccctcgccgacgaccccgcggtggcgcaccttcaccaccacctcccggctcagctcgcgctcccccacccgcccgccgggcccttcccggagggagccgaaccgggcgtcctggaggagcccaaccgcgtccagctgcctttcccatggatgaagtctaccaaagctcacgcgtggaaaggccagtgggcaggcggcgcctacgctgcggagccggaggagaacaagcggacgcgcacggcctacacgcgcgcacagctgctagagctggagaaggagttcctattcaacaagtacatctcacggccgcgccgggtggagctggctgtcatgttgaacttgaccgagagacacatcaagatctggttccaaaaccgccgcatgaagtggaaaaaggaggaggacaagaagcgcggcggcgggacagctgtcgggggtggcggggtcgcggagcctgagcaggactgcgccgtgacctccggcgaggagcttctggcgctgccgccgccgccgccccccggaggtgctgtgccgcccgctgcccccgttgccgcccgagagggccgcctgccgcctggccttagcgcgtcgccacagccctccagcgtcgcgcctcggcggccgcaggaaccacga(seqidno:2)，或在严格杂交条件下与由seqidno:2组成的核酸序列杂交的核酸序列。

在一些实施例中，ng3包含氨基酸序列：

mtpqpsgaptvqvtretersfprasedevtcptsappsptrtrgncaeaeeggcrgaprklrarrggrsrpkselalskqrrsrrkkandrernrmhnlnsaldalrgvlptfpddakltkietlrfahnyiwaltqtlriadhslyaleppaphcgelgspggspgdwgslyspvsqagslspaasleerpgllgatssaclspgslafsdfl(seqidno:3)，或与seqidno:3具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，编码ng3的核酸序列包含核酸序列：

atgacgcctcaaccctcgggtgcgcccactgtccaagtgacccgtgagacggagcggtccttccccagagcctcggaagacgaagtgacctgccccacgtccgccccgcccagccccactcgcacacgggggaactgcgcagaggcggaagagggaggctgccgaggggccccgaggaagctccgggcacggcgcgggggacgcagccggcctaagagcgagttggcactgagcaagcagcgacggagtcggcgaaagaaggccaacgaccgcgagcgcaatcgaatgcacaacctcaactcggcactggacgccctgcgcggtgtcctgcccaccttcccagacgacgcgaagctcaccaagatcgagacgctgcgcttcgcccacaactacatctgggcgctgactcaaacgctgcgcatagcggaccacagcttgtacgcgctggagccgccggcgccgcactgcggggagctgggcagcccaggcggttcccccggggactgggggtccctctactccccagtctcccaggctggcagcctgagtcccgccgcgtcgctggaggagcgacccgggctgctgggggccacctcttccgcctgcttgagcccaggcagtctggctttctcagattttctg(seqidno:4)，或在严格杂交条件下与由seqidno:4组成的核酸序列杂交的核酸序列。

在一些实施例中，mafa包含氨基酸序列：

maaelamgaelpssplaieyvndfdlmkfevkkeppeaerfchrlppgslsstplstpcssvpsspsfcapspgtgggggagggggssqaggapgppsggpgavggtsgkpaledlywmsgyqhhlnpealnltpedavealigsghhgahhgahhpaaaaayeafrgpgfaggggaddmgaghhhgahhaahhhhaahhhhhhhhhhggaghgggaghhvrleerfsddqlvsmsvrelnrqlrgfskeevirlkqkrrtlknrgyaqscrfkrvqqrhilesekcqlqsqveqlklevgrlakerdlykekyeklagrggpgsaggagfprepsppqagpggakgtadffl(seqidno:5)，或与seqidno:5具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，编码mafa的核酸序列包含核酸序列：

atggccgcggagctggcgatgggcgccgagctgcccagcagcccgctggccatcgagtacgtcaacgacttcgacctgatgaagttcgaggtgaagaaggagcctcccgaggccgagcgcttctgccaccgcctgccgccaggctcgctgtcctcgacgccgctcagcacgccctgctcctccgtgccctcctcgcccagcttctgcgcgcccagcccgggcaccggcggcggcggcggcgcggggggcggcggcggctcgtctcaggccgggggcgcccccgggccgccgagcgggggccccggcgccgtcgggggcacctcggggaagccggcgctggaggatctgtactggatgagcggctaccagcatcacctcaaccccgaggcgctcaacctgacgcccgaggacgcggtggaggcgctcatcggcagcggccaccacggcgcgcaccacggcgcgcaccacccggcggccgccgcagcctacgaggctttccgcggcccgggcttcgcgggcggcggcggagcggacgacatgggcgccggccaccaccacggcgcgcaccacgccgcccaccaccaccacgccgcccaccaccaccaccaccaccaccaccaccatggcggcgcgggacacggcggtggcgcgggccaccacgtgcgcctggaggagcgcttctccgacgaccagctggtgtccatgtcggtgcgcgagctgaaccggcagctccgcggcttcagcaaggaggaggtcatccggctcaagcagaagcggcgcacgctcaagaaccgcggctacgcgcagtcctgccgcttcaagcgggtgcagcagcggcacattctggagagcgagaagtgccaactccagagccaggtggagcagctgaagctggaggtggggcgcctggccaaagagcgggacctgtacaaggagaaatacgagaagctggcgggccggggcggccccgggagcgcgggcggggccggtttcccgcgggagccttcgccgccgcaggccggtcccggcggggccaagggcacggccgacttcttcctg(seqidno:6)，或在严格杂交条件下与由seqidno:6组成的核酸序列杂交的核酸序列。

在一些实施例中，tcf3包含氨基酸序列：

mnqpqrmapvgtdkelsdlldfsmmfplpvtngkgrpaslagaqfggsgledrpssgswgsgdqssssfdpsrtfsegthfteshsslssstflgpglggksgergayasfgrdagvggltqagflsgelalnspgplspsgmkgtsqyypsysgssrrraadgsldtqpkkvrkvppglpssvyppssgedygrdataypsaktpsstypapfyvadgslhpsaelwsppgqagfgpmlgggssplplppgsgpvgssgssstfgglhqhermgyqlhgaevngglpsassfssapgatyggvsshtppvsgadsllgsrgttagssgdalgkalasiyspdhssnnfssspstpvgspqglagtsqwpragapgalspsydgglhglqskiedhldeaihvlrshavgtagdmhtllpghgalasgftspmslggrhaglvggshpedglagstslmhnhaalpsqpgtlpdlsrppdsysglgragataaaseikreekedeentsaadhseeekkelkaprartspdededdllppeqkaerekerrvannarerlrvrdineafkelgrmcqlhlnsekpqtkllilhqavsvilnleqqvrernlnpkaaclkrreeekvsgvvgdpqmvlsaphpglseahnpaghm(seqidno:7)，或与seqidno:7具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，tcf3包含氨基酸序列：

mnqpqrmapvgtdkelsdlldfsmmfplpvtngkgrpaslagaqfggsgledrpssgswgsgdqssssfdpsrtfsegthfteshsslssstflgpglggksgergayasfgrdagvggltqagflsgelalnspgplspsgmkgtsqyypsysgssrrraadgsldtqpkkvrkvppglpssvyppssgedygrdataypsaktpsstypapfyvadgslhpsaelwsppgqagfgpmlgggssplplppgsgpvgssgssstfgglhqhermgyqlhgaevngglpsassfssapgatyggvsshtppvsgadsllgsrgttagssgdalgkalasiyspdhssnnfssspstpvgspqglagtsqwpragapgalspsydgglhglqskiedhldeaihvlrshavgtagdmhtllpghgalasgftgpmslggrhaglvggshpedglagstslmhnhaalpsqpgtlpdlsrppdsysglgragataaaseikreekedeentsaadhseeekkelkaprartsstdevlsleekdlrdrerrmannarervrvrdineafrelgrmcqmhlksdkaqtkllilqqavqvilgleqqvrernlnpkaaclkrreeekvsgvvgdpqmvlsaphpglseahnpaghm(seqidno:8)，或与seqidno:8具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，编码tcf3的核酸序列包含核酸序列：

atgaaccagccgcagaggatggcgcctgtgggcacagacaaggagctcagtgacctcctggacttcagcatgatgttcccgctgcctgtcaccaacgggaagggccggcccgcctccctggccggggcgcagttcggaggttcaggtcttgaggaccggcccagctcaggctcctggggcagcggcgaccagagcagctcctcctttgaccccagccggaccttcagcgagggcacccacttcactgagtcgcacagcagcctctcttcatccacattcctgggaccgggactcggaggcaagagcggtgagcggggcgcctatgcctccttcgggagagacgcaggcgtgggcggcctgactcaggctggcttcctgtcaggcgagctggccctcaacagccccgggcccctgtccccttcgggcatgaaggggacctcccagtactacccctcctactccggcagctcccggcggagagcggcagacggcagcctagacacgcagcccaagaaggtccggaaggtcccgccgggtcttccatcctcggtgtacccacccagctcaggtgaggactacggcagggatgccaccgcctacccgtccgccaagacccccagcagcacctatcccgcccccttctacgtggcagatggcagcctgcacccctcagccgagctctggagtcccccgggccaggcgggcttcgggcccatgctgggtgggggctcatccccgctgcccctcccgcccggtagcggcccggtgggcagcagtggaagcagcagcacgtttggtggcctgcaccagcacgagcgtatgggctaccagctgcatggagcagaggtgaacggtgggctcccatctgcatcctccttctcctcagcccccggagccacgtacggcggcgtctccagccacacgccgcctgtcagcggggccgacagcctcctgggctcccgagggaccacagctggcagctccggggatgccctcggcaaagcactggcctcgatctactccccggatcactcaagcaataacttctcgtccagcccttctacccccgtgggctccccccagggcctggcaggaacgtcacagtggcctcgagcaggagcccccggtgccttatcgcccagctacgacgggggtctccacggcctgcagagtaagatagaagaccacctggacgaggccatccacgtgctccgcagccacgccgtgggcacagccggcgacatgcacacgctgctgcctggccacggggcgctggcctcaggtttcaccagtcccatgtcgctgggtgggcggcacgcaggcctggttggaggcagccaccccgaggacggcctcgcaggcagcaccagcctcatgcacaaccacgcggccctccccagccagccaggcaccctccctgacctgtctcggcctcccgactcctacagtgggctagggcgagcaggtgccacggcggccgccagcgagatcaagcgggaggagaaggaggacgaggagaacacgtcagcggctgaccactcggaggaggagaagaaggagctgaaggccccccgggcccggaccagcccagacgaggacgaggacgaccttctccccccagagcagaaggccgagcgggagaaggagcgccgggtggccaataacgcccgggagcggctgcgggtccgtgacatcaacgaggcctttaaggagctggggcgcatgtgccaactgcacctcaacagcgagaagccccagaccaaactgctcatcctgcaccaggctgtctcggtcatcctgaacttggagcagcaagtgcgagagcggaacctgaatcccaaagcagcctgtttgaaacggcgagaagaggaaaaggtgtcaggtgtggttggagacccccagatggtgctttcagctccccacccaggcctgagcgaagcccacaaccccgccgggcacatg(seqidno:9)，或在严格杂交条件下与由seqidno:9组成的核酸序列杂交的核酸序列。

在一些实施例中，编码tcf3的核酸序列包含核酸序列：

atgaaccagccgcagaggatggcgcctgtgggcacagacaaggagctcagtgacctcctggacttcagcatgatgttcccgctgcctgtcaccaacgggaagggccggcccgcctccctggccggggcgcagttcggaggttcaggtcttgaggaccggcccagctcaggctcctggggcagcggcgaccagagcagctcctcctttgaccccagccggaccttcagcgagggcacccacttcactgagtcgcacagcagcctctcttcatccacattcctgggaccgggactcggaggcaagagcggtgagcggggcgcctatgcctccttcgggagagacgcaggcgtgggcggcctgactcaggctggcttcctgtcaggcgagctggccctcaacagccccgggcccctgtccccttcgggcatgaaggggacctcccagtactacccctcctactccggcagctcccggcggagagcggcagacggcagcctagacacgcagcccaagaaggtccggaaggtcccgccgggtcttccatcctcggtgtacccacccagctcaggtgaggactacggcagggatgccaccgcctacccgtccgccaagacccccagcagcacctatcccgcccccttctacgtggcagatggcagcctgcacccctcagccgagctctggagtcccccgggccaggcgggcttcgggcccatgctgggtgggggctcatccccgctgcccctcccgcccggtagcggcccggtgggcagcagtggaagcagcagcacgtttggtggcctgcaccagcacgagcgtatgggctaccagctgcatggagcagaggtgaacggtgggctcccatctgcatcctccttctcctcagcccccggagccacgtacggcggcgtctccagccacacgccgcctgtcagcggggccgacagcctcctgggctcccgagggaccacagctggcagctccggggatgccctcggcaaagcactggcctcgatctactccccggatcactcaagcaataacttctcgtccagcccttctacccccgtgggctccccccagggcctggcaggaacgtcacagtggcctcgagcaggagcccccggtgccttatcgcccagctacgacgggggtctccacggcctgcagagtaagatagaagaccacctggacgaggccatccacgtgctccgcagccacgccgtgggcacagccggtgacatgcacacgctgctgcctggccacggggcgctggcctcaggtttcaccggccccatgtcactgggcgggcggcacgcaggcctggttggaggcagccaccccgaggacggcctcgcaggcagcaccagcctcatgcacaaccacgcggccctccccagccagccaggcaccctccctgacctgtctcggcctcccgactcctacagtgggctagggcgagcaggtgccacggcggccgccagcgagatcaagcgggaggagaaggaggacgaggagaacacgtcagcggctgaccactcggaggaggagaagaaggagctgaaggccccccgggcccggaccagcagtacggacgaggtgctgtccctggaggagaaagacctgagggaccgggagaggcgcatggccaataacgcgcgggagcgggtgcgcgtgcgggatattaacgaggccttccgggagctggggcgcatgtgccagatgcacctcaagtcggacaaagcgcagaccaagctgctcatcctgcagcaggccgtgcaggtcatcctggggctggagcagcaggtgcgagagcggaacctgaatcccaaagcagcctgtttgaaacggcgagaagaggaaaaggtgtcaggtgtggttggagacccccagatggtgctttcagctccccacccaggcctgagcgaagcccacaaccccgccgggcacatg(seqidno:10)，或在严格杂交条件下与由seqidno:10组成的核酸序列杂交的核酸序列。

为了表达多肽或功能性核酸，可以将核苷酸编码序列插入适当的表达运载体中。因此，还披露了包含多核苷酸的非病毒运载体，该多核苷酸包含编码2、3或4个选自由pdx1、ng3、mafa和tcf3组成的组的蛋白的核酸序列，其中这些核酸序列可操作地连接到表达控制序列。在一些实施例中，核酸序列可操作地连接到单个表达控制序列。在其他实施例中，核酸序列可操作地连接到两个或更多个隔开的表达控制序列。

构建含有遗传序列以及适当的转录和翻译控制元件的表达运载体的方法是本领域熟知的。这些方法包括体外重组dna技术、合成技术和体内遗传重组。此类技术描述于sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual[分子克隆实验室手册](coldspringharborpress[冷泉港出版社],plainview,n.y.[普莱恩维尤，纽约州],1989)，以及ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学现代方法](johnwiley&sons[约翰威利父子公司],纽约市,纽约州,1989)中。

表达运载体通常含有调节序列，其是翻译和/或转录插入的编码序列所必需的元件。例如，编码序列优选地可操作地连接到启动子和/或增强子，以帮助控制所需基因产物的表达。

“控制元件”或“调节序列”是运载体的那些非翻译区(增强子、启动子、5'和3'非翻译区)，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可能有所不同。

“启动子”通常是当相对于转录起始位点处于相对固定位置时起作用的dna的一个或多个序列。“启动子”含有rna聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以含有上游元件和应答元件。

“增强子”通常是指在距转录起始位点不固定距离处起作用的dna序列，并且可以是转录单位的5'或3'。此外，增强子可以在内含子内以及在编码序列本身内。它们的长度通常为10至300bp，并且它们顺式作用。增强子的功能是增加从附近启动子的转录。像启动子一样，增强子也通常含有介导转录调节的应答元件。增强子通常决定表达的调节。

“内源性”增强子/启动子是与基因组中给定基因天然连接的增强子/启动子。“外源性”或“异源性”增强子/启动子是通过遗传操作(即分子生物学技术)与基因并列放置使得该基因的转录由连接的增强子/启动子指导的增强子/启动子。

根据基因表达控制的预期类型，生物技术中使用的启动子具有不同类型。它们通常可分为组成型启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子和合成启动子。

组成型启动子指导几乎所有组织中的表达，并且在很大程度上(如果不是全部的话)不依赖于环境和发育因素。因为它们的表达通常不受内源性因子的制约，所以组成型启动子通常在物种之间甚至在界之间都具有活性。组成型启动子的实例包括cmv、ef1a、sv40、pgk1、ubc、人β肌动蛋白和cag。

组织特异性或发育阶段特异性启动子指导基因在一个或多个特定组织中或在发育的某些阶段的表达。对于植物，在脉管系统、光合组织、块茎、根和其他营养器官、或种子和其他生殖器官中表达或影响基因表达的启动子元件可在异源性系统(例如远缘物种或甚至其他界)中发现，但最特异性通常通过同源性启动子(即来自相同物种、属或科)来实现。这可能是因为转录因子的协同表达对于调节启动子的活性是必需的。

诱导型启动子的性能不受内源性因子的制约，而受可以人工控制的环境条件和外部刺激的制约。在这组中，存在受非生物因素如光、氧水平、热、冷和创伤调制的启动子。由于这些因素中的一些难以在实验环境之外进行控制，在感兴趣的生物中未天然发现的、对化学化合物有反应的启动子尤其令人关注。由此，对抗生素、铜、醇、类固醇和除草剂以及其他化合物有反应的启动子已经过适应和改进，以允许随意且独立于其他生物或非生物因素来诱导基因活性。

用于真核细胞生物学研究的两种最常用的诱导型表达系统被称为tet-off和tet-on。tet-off系统利用四环素反式激活因子(tta)蛋白，其是通过将大肠杆菌细菌中发现的一种蛋白tetr(四环素阻遏物)与单纯疱疹病毒中发现的另一种蛋白vp16的激活结构域融合而产生的。所得的tta蛋白能够在特异性teto操纵子序列上结合dna。在大多数tet-off系统中，这些teto序列的几个重复序列被置于最小启动子如cmv启动子的上游。具有最小启动子的几个teto序列整体被称为四环素响应元件(tre)，因为它通过增加其启动子下游的一个或多个基因的表达来响应四环素反式激活因子蛋白tta的结合。在tet-off系统中，四环素及其衍生物可以抑制tre控制基因的表达。它们结合tta并使其不能结合tre序列，从而阻止tre控制基因的反式激活。tet-on系统以类似但相反的方式工作。虽然在tet-off系统中，tta仅在未与四环素或其衍生物之一(例如强力霉素)结合时才能与操纵子结合，但在tet-on系统中，rtta蛋白仅在与四环素结合时才能与操纵子结合。因此，将强力霉素引入系统可启动基因产物的转录。tet-on系统有时因其更快的响应性而优于tet-off。

在一些实施例中，编码pdx1、ng3、mafa和tcf3的核酸序列可操作地连接到相同的表达控制序列。可替代地，内部核糖体进入位点(ires)元件可用于产生多基因或多顺反子(polycistronic)信息。ires元件能够绕过5'甲基化cap依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译。ires元件可以连接到异源性开放阅读框。可以将多个开放阅读框一起转录，每个被ires隔开，从而产生多顺反子信息。借助于ires元件，核糖体可以接近每个开放阅读框以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信息可有效表达多个基因。

披露了非病毒运载体，这些非病毒运载体含有可操作地连接到表达控制序列的一个或多个本文披露的多核苷酸。这些非病毒运载体的实例包括单独的寡核苷酸或与合适的蛋白质、多糖或脂质配方组合。与病毒方法相比，非病毒方法具有某些优势，大规模生产简单和宿主免疫原性低仅是其中两个。以前，低水平的基因转染和表达使非病毒方法处于不利地位；然而，运载体技术的最新进展产生了分子和技术，其转染效率类似于病毒的分子和技术。

合适的非病毒运载体的实例包括但不限于pires-hrgfp-2a、pcmv6、pmax、pcag、pad-ires-gfp和pcdna3.0。

所披露的组合物可以在治疗上与药学上可接受的载体组合使用。“药学上可接受的”是指不是生物学上或其他方面不期望的材料，即，该材料可以与核酸或运载体一起施用于受试者，而不会引起任何不期望的生物效应或以有害方式与含有其的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的，可以自然地选择载体以最小化活性成分的任何降解和最小化受试者中的任何不良副作用。

材料可以是溶液、悬浮液(例如，掺入微粒、脂质体或细胞中)。这些可以经由抗体、受体或受体配体靶向特定细胞类型。以下参考文献是使用该技术将特异性蛋白靶向肿瘤组织的实例(senter等人,bioconjugatechem.[生物缀合化学],2:447-451,(1991)；bagshawe,k.d.,br.j.cancer[英国癌症杂志],60:275-281,(1989)；bagshawe等人,br.j.cancer[英国癌症杂志],58:700-703,(1988)；senter等人,bioconjugatechem.[生物缀合化学],4:3-9,(1993)；battelli等人,cancerimmunol.immunother.[癌症免疫学与免疫治疗],35:421-425,(1992)；pietersz和mckenzie,immunolog.reviews[免疫学综述],129:57-80,(1992)；以及roffler等人,biochem.pharmacol[生化药理学],42:2062-2065,(1991))。媒介物如“隐形(stealth)”和其他缀合抗体的脂质体(包括脂质介导的靶向结肠癌的药物)，通过细胞特异性配体的受体介导的dna靶向，淋巴细胞定向的肿瘤靶向以及在体内对鼠神经胶质瘤细胞的高度特异性治疗性逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用该技术将特异性蛋白靶向肿瘤组织的实例(hughes等人,cancerresearch[癌症研究],49:6214-6220,(1989)；以及litzinger和huang,biochimicaetbiophysicaacta[生物化学与生物物理学报],1104:179-187,(1992))。通常，受体涉及组成型或配体诱导的内吞途径。这些受体聚集在网格蛋白包被的小窝中，经由网格蛋白包被的囊泡进入细胞，穿过酸化的内吞体(在其中对受体进行分选)，然后循环到细胞表面、在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，例如摄取营养、去除活化蛋白、清除大分子、病毒和毒素的机会性进入、解离和降解配体、以及调节受体水平。许多受体遵循一种以上的细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体化合价和配体浓度。已经综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(brown和greene,dnaandcellbiology[dna与细胞生物学]10:6,399-409(1991))。

合适的载体及其配方描述于remington:thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：药学科学与实践](第19版)a.r.gennaro编辑,mackpublishingcompany[马克出版公司]，easton,pa[宾夕法尼亚州伊斯顿]1995中。通常，在配方中使用适当量的药学上可接受的盐以使该配方等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的ph优选为约5至约8，更优选约7至约7.5。其他载体包括缓释制剂，例如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，这些基质为成形制品的形式，例如膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员显而易见的是，取决于例如施用途径和所施用组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。

药物载体是本领域技术人员已知的。这些最典型地将是用于向人施用药物的标准载体，包括溶液，例如无菌水、盐水以及在生理ph下的缓冲溶液。组合物可以肌内或皮下施用。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序来施用。

除所选择的分子外，药物组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，例如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

用于局部施用的配方可以包括软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可能是必需的或期望的。

用于口服施用的组合物包括粉末或颗粒剂、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、袋剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是期望的。

一些组合物可能潜在地作为药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐施用，该酸加成盐通过与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)以及有机酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸)反应形成，该碱加成盐通过与无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(例如单、二、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺)反应形成。

本文披露的组合物(包括药物组合物)能以多种方式施用，这取决于需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。例如，可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或经皮施用所披露的组合物。可以口服、肠胃外(例如静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、经皮、体外、经眼、经阴道、经直肠、鼻内、局部等施用(包括局部鼻内施用或通过吸入剂施用)组合物。

方法

还披露了将皮肤细胞重编程为产生胰岛素的细胞的方法，这些方法涉及将包含编码pdx1、ng3、mafa和tcf3的核酸序列的多核苷酸在细胞内递送到皮肤细胞中。在一些实施例中，核酸序列存在于非病毒运载体中。在一些实施例中，核酸序列可操作地连接到表达控制序列。在其他实施例中，核酸可操作地连接到两个或更多个表达控制序列。

多种方法是本领域已知的并且适于将核酸引入细胞中，包括病毒和非病毒介导的技术。典型的非病毒介导的技术的实例包括但不限于电穿孔、磷酸钙介导的转移、核转染、声孔效应、热休克、磁转染、脂质体介导的转移、显微注射、微抛射体介导的转移(纳米颗粒)、阳离子聚合物介导的转移(deae-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇(peg)等)或细胞融合。

在一些实施例中，在用pmn-t因子转染靶细胞后，细胞可以将转染的基因(例如cdna)包装到ev中，其随后可以诱导其他皮肤细胞形成产生胰岛素的细胞。因此，还披露了将皮肤细胞重编程为产生胰岛素的细胞的方法，这些方法涉及使体细胞暴露于细胞外囊泡，该细胞外囊泡由含有或pdx1、ng3、mafa和tcf3的细胞产生。

因此，披露了将皮肤细胞重编程为产生胰岛素的细胞的方法，该方法涉及将皮肤细胞暴露于从如下细胞分离的细胞外囊泡(ev)，这些细胞表达或含有包含编码pdx1、ng3、mafa和tcf3的一个或多个核酸序列的外源性多核苷酸。然后可以从培养基中收集供体细胞分泌的ev。然后可以将这些ev施用于皮肤细胞，以将其重编程为产生胰岛素的细胞。在一些实施例中，供体细胞可以是来自受试者中能够产生ev的任何细胞，包括(但不限于)皮肤细胞(例如成纤维细胞、角质形成细胞、皮肤干细胞)、脂肪细胞、树突状细胞、外周血单核细胞(pbmc)、胰腺细胞(例如导管上皮细胞)、肝脏细胞(例如肝细胞)、免疫细胞(例如t细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞)。

外排体和微泡是基于它们的生物发生过程和生物物理特性(包括大小和表面蛋白标记)而不同的ev。外排体是大小范围为40至150nm的均质小颗粒，并且它们通常衍生自内吞循环途径。在内吞作用中，内吞囊泡在质膜上形成并融合形成早期内吞体。这些成熟的并成为晚期的内吞体，其中腔内囊泡(intraluminalvesicle)出芽进入囊泡内腔(intra-vesicularlumen)。这些多泡体不与溶酶体融合，而是直接与质膜融合并将外排体释放到细胞外空间中。外排体生物发生、蛋白质货物分选和释放涉及运输所需的内体分选复合物(escrt复合物)和其他相关蛋白质，例如alix和tsg101。相反，微泡直接通过膜囊泡从质膜向外出芽和分裂而产生，因此它们的表面标记很大程度上取决于起源膜的组合物。此外，它们倾向于构成更大且更异质的细胞外囊泡群体，直径为150至1000nm。然而，已显示两种类型的囊泡均向受体细胞递送功能性mrna、mirna和蛋白质。

在一些实施例中，将多核苷酸在细胞内递送到体细胞或ev的供体细胞中，该递送是经由基因枪、适于这种递送的微粒或纳米颗粒、电穿孔转染、三维纳米通道电穿孔、组织纳米转染装置、适于这种递送的脂质体、或深层局部组织纳米电注射装置。在一些实施例中，可以使用病毒运载体。然而，在其他实施例中，多核苷酸不通过病毒递送。

电穿孔是一种向细胞施加电场以增加细胞膜的渗透性，从而允许将货物(例如重编程因子)导入细胞中的技术。电穿孔是将外源dna导入细胞的常用技术。

组织纳米转染允许通过阵列纳米通道施加高强度且聚焦的电场，良性地将并置的组织细胞成员纳米穿孔并通过电泳将货物驱入细胞中，从而将货物(例如重编程因子)直接胞质递送到细胞中。

在一个实施例中，所披露的组合物以相当于肠胃外施用约0.1ng至约100g/kg体重、约10ng至约50g/kg体重、约100ng至约1g/kg体重、从约1μg至约100mg/kg体重、从约1μg至约50mg/kg体重、从约1mg至约500mg/kg体重、和从约1mg至约50mg/kg体重的剂量施用。可替代地，为达到治疗有效剂量而施用的所披露的组合物的量为约0.1ng、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、500mg/kg体重或更高。

所披露的方法可用于治疗各种形式的糖尿病。在一些实施例中，所披露的组合物和方法用于治疗受试者的胰岛素依赖型(1型)糖尿病或胰岛素抗性(2型)糖尿病。例如，受试者可患有自身免疫性糖尿病、胰腺切除术相关的糖尿病或导致胰岛素抵抗的代谢综合征。在一些实施例中，所披露的组合物和方法用于治疗妊娠糖尿病。在某些情况下，该方法可用于治疗患有前驱糖尿病的受试者。所披露的方法可用于治疗受胰岛素缺乏(例如胰腺炎或胰腺切除术)影响的疾病、障碍或病症。

已经描述了本发明的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其他实施例在所附权利要求的范围内。

实例

实例1：注射链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠的血糖控制pbs基线比较

图1a至1e显示了研究结果，其中将糖尿病小鼠用不同的基因鸡尾酒(geneticcocktail)治疗一次(通过向皮肤进行深层局部纳米电注射)。从(治疗后)第1周至第14周(x轴)测量血糖(y轴)。结果表明，与对照/未治疗的小鼠以及鸡尾酒的其他排列相比，同时递送或依次递送的pnm-t鸡尾酒都能够支持更受控的血糖水平(即，更类似于小鼠开始时的基线)。

尽管先前已报道pnm基因(pdx1、ngn3、mafa)调制胰腺腺泡重编程为β样细胞，但尚未开发出在体内成功地将皮肤组织非病毒重编程为产生胰岛素的组织的方法。tcf3(一种在调制皮肤可塑性中起重要作用的转录因子)的引入使得能够开发出针对皮肤定制的重编程基因鸡尾酒，其可以递送到皮肤中并促进在其他糖尿病/高血糖生物中建立全身性正常血糖。

除非另有定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有如所披露的本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文所引用的出版物及其所引用的材料通过引用特定地并入。

本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效形式。此类等效形式旨在由以下权利要求涵盖。