作为Toll样受体7(TLR7)激动剂的1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶化合物及其方法与用途与流程

本申请案根据35u.s.c.§119(e)主张2018年8月3日申请的美国临时申请案序列号62/714,238的权益；该申请案的公开内容以引用的方式并入本文中。

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背景技术：
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本发明涉及toll样受体7(“tlr7”)的激动剂及其偶联物，以及此类激动剂及其偶联物的制备方法与用途。

toll样受体(toll-likereceptor，“tlr”)为识别病原体相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，“pamp”)的受体，所述病原体相关分子模式为在某些类别的病原体中保留的小分子基元。tlr可位于细胞表面或细胞内。tlr通过结合同源pamp而活化表明宿主内部存在相关病原体，亦即感染，且刺激宿主免疫系统来对抗感染。人类具有10种tlr，称为tlr1、tlr2、tlr3等。

通过激动剂对tlr进行活化(最主要研究tlr7)可通过整体刺激免疫反应而对疫苗及免疫治疗剂在治疗除真正病原体感染外的多种病状中的作用具有积极效果。因此，对使用tlr7激动剂作为疫苗佐剂或作为癌症免疫疗法中的增强剂相当关注。参见例如vasilakos及tomai2013、sato-kaneko等人2017、smits等人2008及ota等人2019。

tlr7为位于核内体膜上的细胞内受体，其识别与单股rna病毒相关的pamp。其活化诱导诸如ifnα及ifnβ的i型干扰素分泌(lund等人2004)。tlr7具有两个结合位点，一个用于单股rna配体(等人2007)且一个用于诸如鸟苷的小分子(zhang等人2016)。

tlr7可结合于类鸟苷合成激动剂且由其活化，所述激动剂诸如基于1h-咪唑并[4,5-c]喹啉骨架的咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod)及嘎德莫特(gardiquimod)。关于小分子tlr7激动剂的综述，参见cortez及va2018。

基于喋啶酮分子骨架的合成tlr7激动剂亦为已知的，如例如威沙立德(vesatolimod)(desai等人2015)。

已公开其他基于类嘌呤骨架的通常根据通式(a)的合成tlr7激动剂：

其中r、r'及r”为结构式变量，其中r”通常含有未经取代或经取代的芳环或杂芳环。

有关具有类嘌呤骨架的生物活性分子及其在治疗诸如纤维化、炎性病症、癌症或病原性感染的病状中的用途的公开案包括：akinbobuyi等人2015及2016；barberis等人2012；carson等人2014；ding等人2016、2017a及2017b；graupe等人2015；hashimoto等人2009；he等人2019a及2019b；holldack等人2012；isobe等人2009a及2012；poudel等人2019a及2019b；pryde2010；及young等人2019。

基团r”可为吡啶基：bonfanti等人2015a及2015b；halcomb等人2015；hirota等人2000；isobe等人2002、2004、2006、2009a、2009b、2011及2012；kasibhatla等人2007；koga-yamakawa等人2013；musmuca等人2009；nakamura2012；ogita等人2007；及yu等人2013。

存在其中式(a)的6,5-稠环系统(与咪唑五元环稠合的嘧啶六元环)经改质的相关分子的公开案。(a)dellaria等人2007、jones等人2010及2012及pilatte等人2017公开其中嘧啶环经吡啶环替换的化合物。(b)chen等人2011、coe等人2017及zhang等人2018公开其中咪唑环经吡唑环替换的化合物。(c)cortez等人2017及2018、li等人2018及mcgowan等人2016a、2016b及2017公开其中咪唑环经吡咯环替换的化合物。

bonfanti等人2015b及2016及purandare等人2019公开其中一个巨环跨越嘌呤部分的两个环的tlr7调节剂：

tlr7激动剂可与搭配分子偶联，该搭配分子可为例如磷脂、聚(乙二醇)(“peg”)、抗体或另一tlr(通常为tlr2)。例示性公开案包括：carson等人2013、2015及2016、chan等人2009及2011、cortez等人2017、gadd等人2015、lioux等人2016、maj等人2015、vernejoul等人2014及zurawski等人2012。常见偶联位点位于式(a)的r”基团处。

jensen等人2015公开阳离子脂质媒剂用于递送tlr7激动剂的用途。

一些tlr7激动剂(包括雷西莫特)为tlr7/tlr8双激动剂。参见例如beesu等人2017、embrechts等人2018、lioux等人2016及vernejoul等人2014。

本文通过第一作者或发明者及年份引用的文献的完整引用列于本说明书末尾。

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技术实现要素：
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本说明书涉及具有1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶芳族系统且具有作为tlr7激动剂的活性的化合物。

1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶

在一个方面中，提供一种具有式i的结构的化合物

其中

各x¹独立地为n或cr²；

x²为o、ch2、nh、s或n(c1-c3烷基)；

r¹为h、ch3(ch2)1-3、ch3(ch2)0-1o(ch2)2-3、ch3(ch2)0-3c(＝o)、

ch3(ch2)0-1o(ch2)2-3c(＝o)、

r²为h、o(c1-c3烷基)、c1-c3烷基、cl、f或cn；

r³为h、卤基、oh、cn、nh2、nh(c1-c5烷基)、n(c1-c5烷基)2、nh(ch2)0-1(c3-c6环烷基)、nh(c4-c8双环烷基)、nh(c6-c10螺环烷基)、n(c3-c6环烷基)2、nh(ch2)1-3(芳基)、n((ch2)1-3(芳基))2、具有结构的环胺部分、6元芳族或杂芳族部分或者5元杂芳族部分；

其中

烷基、环烷基、双环烷基、螺环烷基、环胺、6元芳族或杂芳族部分或5元杂芳族部分任选经一或多个选自以下的取代基取代：oh、卤基、cn、(c1-c3烷基))、o(c1-c3烷基)、c(＝o)(me)、so2(c1-c3烷基)、c(＝o)(et)、nh2、nh(me)、n(me)2、nh(et)、n(et)2及n(c1-c3烷基)、(ch2)1-2oh、(ch2)1-2ome；及

环烷基、双环烷基、螺环烷基或环胺部分的ch2基团可经o、s、nh、n(c1-c3烷基)或n(boc)替换；

m为0或1；

且

n为1、2或3；

或其药学上可接受的盐。

本文公开的化合物具有作为tlr7激动剂的活性，且一些可与抗体偶联以靶向递送至预期作用的目标组织或器官。其亦可聚乙二醇化以调节其药物特性。

本文所公开的化合物或其偶联物或其聚乙二醇化衍生物可用于通过活化免疫系统来治疗罹患能够治疗的病状的个体，该治疗为通过向此类个体给予治疗有效量的此类化合物或其偶联物或其聚乙二醇化衍生物，尤其与疫苗或癌症免疫治疗剂组合给予。

[附图说明]

图1、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5、6a、6b、7、8、9、10、11、12、13及14展示制备本文所公开的化合物的反应流程。

图15及16展示将接头附接至本发明的化合物以使得所述化合物适合于偶联的流程。

[具体实施方式]

定义

“抗体”是指完整抗体及其任何抗原结合片段(亦即“抗原结合部分”)或单链变异体。完整或全长抗体为包含通过二硫键互连的至少两条重(h)链及两条轻(l)链的蛋白质。各重链包含重链可变区(vh)及包含ch1、ch2及ch3三个结构域的重链恒定区。各轻链包含轻链可变区(vl或vk)及包含一个单结构域cl的轻链恒定区。vh及vl区可进一步再分成高变区，称为互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr)，穿插有较保守构架区(frameworkregion，fr)。各vh及vl包含三个cdr及四个fr，其自氨基至羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3及fr4。可变区含有与抗原相互作用的结合域。恒定区可介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(clq)。若抗体以5×10^-8m或更小，更优选1×10^-8m或更小，更优选6×10^-9m或更小，更优选3×10^-9m或更小，甚至更优选2×10^-9m或更小的kd结合于抗原x，则称该抗体“特异性结合”于抗原x。抗体可为嵌合抗体、人类化抗体或优选人类抗体。重链恒定区可经工程改造以影响糖基化类型或程度，延长抗体半衰期，增强或减弱与效应细胞或补体系统的相互作用或调节一些其他特性。该工程改造可通过替换、添加或删除一或多个氨基酸或通过用来自另一免疫球蛋白类型的结构域替换结构域或前述方法的组合来实现。

抗体的“抗原结合片段”及“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”或“抗体片段”)是指保留特异性结合于抗原的能力的一或多个抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过诸如以下的全长抗体的片段进行：(i)fab片段，其为由vl、vh、cl及ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，其为包含两个在铰链区通过二硫桥键连接的fab片段的二价片段；(iii)fab'片段，其基本上为具有铰链区一部分的fab(参见例如abbas等人，cellularandmolecularimmunology,第6版,saunderselsevier2007)；(iv)fd片段，其由vh及ch1结构域组成；(v)fv片段，其由抗体的单臂的vl结构域及vh结构域组成；(vi)dab片段(ward等人，(1989)nature341:544-546)，其由vh结构域组成；(vii)分离的互补决定区(cdr)；及(viii)纳米抗体，其为含有单一可变域及两个恒定域的重链可变区。优选抗原结合片段为fab、f(ab')2、fab'、fv及fd片段。此外，尽管fv片段的两个结构域vl及vh由独立基因编码，但其可使用重组方法，通过使其制成其中vl与vh区配对形成单价分子(称为单链fv或scfv)的单一蛋白链的合成接头接合。参见例如bird等人(1988)science242:423-426；及huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883)。此类单链抗体亦涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。

除非另外指明(例如通过提及seqidno:列表中的线性编号)，对抗体重链或轻链可变区(vh或vl)中的氨基酸位置的编号的提及为根据kabat系统(kabat等人，“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”,第5版,出版号91-3242,u.s.dept.health&humanservices,nih,bethesda,md.,1991,在下文中“kabat”)及对抗体重链或轻链恒定区(ch1、ch2、ch3或cl)中的氨基酸位置的编号的提及为根据如kabat中所阐述的eu索引。参见lazar等人的us2008/0248028a1，该文献的公开内容以引用例如此类用法的方式并入本文中。此外，免疫遗传学信息系统(immunogeneticsinformationsystem；imgt)在其网站提供名称为“imgtscientificchart:correspondencebetweencnumberings”的表，展示其针对重链恒定区的编号系统、eu编号及kabat编号之间的对应关系。

“经分离的抗体”是指实质上不含其他具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如特异性结合抗原x的经分离的抗体实质上不含特异性结合除抗原x以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合抗原x的经分离的抗体可与诸如来自其他物种的抗原x分子的其他抗原具有交叉反应性。在某些实施方案中，经分离的抗体特异性结合于人类抗原x且不与其他(非人类)抗原x抗原交叉反应。此外，经分离的抗体可实质上不含其他细胞材料及/或化学物质。

“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子制剂，其呈现对特定抗原决定基的单一结合特异性及亲和力。

“人类抗体”是指具有其中构架区与cdr区(及若存在，恒定区)均来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。人类抗体可包括后续修饰，包括天然或合成修饰。人类抗体可包括未由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过活体外随机或定点突变引入或通过活体内体细胞突变引入的突变)。然而，“人类抗体”不包括来源于另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的生殖系的cdr序列已移植至人类构架序列上的抗体。

“人类单克隆抗体”是指呈现单一结合特异性的抗体，其具有其中构架区与cdr区均来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人类单克隆抗体由包括b细胞与永生化细胞融合的融合瘤产生，该b细胞自具有包含人类重链转殖基因及轻链转殖基因的基因组转殖基因非人类动物(例如转殖基因小鼠)获得。

“脂族”是指具有指定碳原子数(例如，如在“c3脂族”、“c1-5脂族”、“c1-c5脂族”或“c1至c5脂族”中，后三个词组为具有1至5个碳原子的脂族部分的同义词)，或在碳原子数未明确指定下，具有1至4个碳原子(在不饱和脂族部分的情况下为2至4个碳)的直链或分支链、饱和或不饱和、非芳族烃部分。类似理解适用于其他类型中的碳数，如在c2-4烯烃、c4-c7环脂族等中。以类似方式，诸如“(ch2)1-3”的术语应理解为下标为1、2或3的简写，因而此类术语表示ch2、ch2ch2及ch2ch2ch2。

“烷基”是指饱和脂族部分，其中指明碳原子数的相同惯例适用。以说明的方式，c1-c4烷基部分包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基及其类似基团。“亚烷基”是指烷基的二价对应物，诸如ch2ch2、ch2ch2ch2及ch2ch2ch2ch2。

“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的脂族部分，其中指明碳原子数的相同惯例适用。以说明的方式，c2-c4烯基部分包括(但不限于)乙烯基(ethenyl/vinyl)、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、顺-1-丙烯基、反-1-丙烯基、e-(或z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基(丁-1,3-二烯基)及其类似基团。

“炔基”是指具有至少一个碳-碳叁键的脂族部分，其中指明碳原子数的相同惯例适用。以说明的方式，c2-c4炔基包括乙炔基(ethynyl/acetylenyl)、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基及其类似基团。

“环脂族”是指具有1至3个环的饱和或不饱和、非芳族烃部分，各环具有3至8个(优选3至6个)碳原子。“环烷基”是指其中各环饱和的环脂族部分。“环烯基”是指其中至少一个环具有至少一个碳-碳双键的环脂族部分。“环炔基”是指其中至少一个环具有至少一个碳-碳叁键的环脂族部分。以说明的方式，环脂族部分包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基及金刚烷基。优选环脂族部分为环烷基部分，尤其环丙基、环丁基、环戊基及环己基。“亚环烷基”是指环烷基的二价对应物。类似地，“亚双环烷基”及“亚螺环烷基”(或“亚螺烷基”)为指双环烷基及螺环烷基/螺烷基的二价对应物。

“杂环脂族”是指在至少一个环中至多三个(优选1至2个)碳经独立地选自n、o或s的杂原子替换的环脂族部分，其中n及s可任选经氧化且n可任选经四级铵化。优选环脂族部分由大小为5元至6元之一个环组成。类似地，“杂环烷基”、“杂环烯基”及“杂环炔基”分别是指其中至少一个环经如此修饰的环烷基、环烯基或环炔基部分。例示性杂环脂族部分包括氮丙啶基、氮杂环丁烷基、1,3-二氧杂环己烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢硫吡喃基、四氢硫吡喃基砜、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜、1,3-二氧戊环基、四氢-1,1-二侧氧基噻吩基、1,4-二氧杂环己烷基、硫杂环丁烷基及其类似基团。“亚杂环烷基”是指杂环烷基的二价对应物。

“烷氧基”、“芳氧基”、“烷硫基”及“芳硫基”分别是指-o(烷基)、-o(芳基)、-s(烷基)及-s(芳基)。实施例分别为甲氧基、苯氧基、甲硫基及苯硫基。

除非指示更窄含义，否则“卤素”或“卤基”是指氟、氯、溴或碘。

“芳基”是指具有单环、双环或三环环系统(优选单环)的烃部分，其中各环具有3至7个碳原子且至少一个环为芳族。环系统中的环可彼此稠合(如在萘基中)或彼此键结(如在联苯中)且可与非芳族环稠合或键结(如在茚烷基或环己基苯基中)。以进一步说明的方式，芳基部分包括(但不限于)苯基、萘基、四氢萘基、茚烷基、联苯、菲基、蒽基及苊基。“亚芳基”是指芳基的二价对应物，例如1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基。

“杂芳基”是指具有单环、双环或三环环系统(优选5元至7元单环)的部分，其中各环具有3至7个碳原子且至少一个环为含有1至4个独立地选自n、o或s的杂原子的芳环，其中n及s可任选经氧化且n可任选经四级铵化。此类含至少一个杂原子的芳环可与其他类型的环稠合(如在苯并呋喃基或四氢异喹啉基中)或与其他类型的环直接键结(如在苯基吡啶基或2-环戊基吡啶基中)。以进一步说明的方式，杂芳基部分包括吡咯基、呋喃基、苯硫基(噻吩基)、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、n-侧氧基吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉炔基、喹唑啉基、噌啉基、喹噁啉基(quinozalinyl)、啶基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并苯硫基、噁二唑基、噻二唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基及其类似基团。“亚杂芳基”是指杂芳基的二价对应物。

若指示部分可经取代，诸如在“未经取代或经取代的c1-c5烷基”或“任选经取代的杂芳基”中通过使用“未经取代或经取代”或“任选经取代”措辞，则此类部分可具有一或多个独立选择的取代基，优选数目为一至五个，更优选数目为一或两个。取代基及取代模式可由一般技术者考虑取代基所附接的部分来选择，以提供化学上稳定且可通过此项技术中已知的技术以及本文所阐述的方法合成的化合物。若一个部分鉴别为“未经取代或经取代”或“任选经取代”，则在一优选实施方案中，此类部分未经取代。

“芳基烷基”、“(杂环脂族)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“联芳基烷基”及其类似基团是指任选可经芳基、杂环脂族、联芳基等部分取代的烷基、烯基或炔基部分，任选可在烷基、烯基或炔基部分上具有开放(不饱和)价态，例如如在苯甲基、苯乙基、n-咪唑基乙基、n-吗啉基乙基及其类似基团中。相反地，“烷基芳基”、“烯基环烷基”及其类似基团是指任选可经烷基、烯基等部分取代的芳基、环烷基等部分，任选可例如如在甲基苯基(甲苯基)或烯丙基环己基中。“羟基烷基”、“卤烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”及其类似基团是指任选可经一或多个所鉴别的取代基(任选可为羟基、卤基等)取代的烷基、芳基等部分。

举例而言，可容许取代基包括(但不限于)烷基(尤其甲基或乙基)、烯基(尤其烯丙基)、炔基、芳基、杂芳基、环脂族、杂环脂族、卤基(尤其氟基)、卤烷基(尤其三氟甲基)、羟基、羟烷基(尤其羟乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-o(羟烷基)、-o(卤烷基)(尤其-ocf3)、-o(环烷基)、-o(杂环烷基)、-o(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝o、＝nh、＝n(烷基)、＝noh、＝no(烷基)、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羟基烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羟基烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羟基烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、叠氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羟基烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(环烷基)、-s(＝o)烷基、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)、-so2n(烷基)2及其类似基团。

在经取代的部分为脂族部分的情况下，优选取代基为芳基、杂芳基、环脂族、杂环脂族、卤基、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羟烷基)、-o(卤烷基)、-o(环烷基)、-o(杂环烷基)、-o(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝o、＝nh、＝n(烷基)、＝noh、＝no(烷基)、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羟烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羟烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羟烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、叠氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羟烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(＝o)烷基、-s(环烷基)、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)及-so2n(烷基)2。更优选取代基为卤基、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-o(芳基)、＝o、＝noh、＝no(烷基)、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、叠氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2及-nhc(＝nh)nh2。尤其优选为苯基、氰基、卤基、羟基、硝基、c1-c4烷氧基、o(c2-c4亚烷基)oh及o(c2-c4亚烷基)卤基。

在经取代的部分为环脂族、杂环脂族、芳基或杂芳基部分时，优选取代基为烷基、烯基、炔基、卤基、卤烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羟烷基)、-o(卤烷基)、-o(芳基)、-o(环烷基)、-o(杂环烷基)、烷基硫基、芳基硫基、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羟烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羟烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羟烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、叠氮基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nh(羟烷基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-oso2(烷基)、-sh、-s(烷基)、-s(芳基)、-s(环烷基)、-s(＝o)烷基、-so2(烷基)、-so2nh2、-so2nh(烷基)及-so2n(烷基)2。更优选取代基为烷基、烯基、卤基、卤烷基、羟基、羟烷基、氰基、硝基、烷氧基、-o(羟烷基)、-c(＝o)(烷基)、-c(＝o)h、-co2h、-c(＝o)nhoh、-c(＝o)o(烷基)、-c(＝o)o(羟烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)nh(烷基)、-c(＝o)n(烷基)2、-oc(＝o)(烷基)、-oc(＝o)(羟烷基)、-oc(＝o)o(烷基)、-oc(＝o)o(羟烷基)、-oc(＝o)nh2、-oc(＝o)nh(烷基)、-oc(＝o)n(烷基)2、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(芳基)、-nhc(＝o)(烷基)、-nhc(＝o)h、-nhc(＝o)nh2、-nhc(＝o)nh(烷基)、-nhc(＝o)n(烷基)2及-nhc(＝nh)nh2。尤其优选为c1-c4烷基、氰基、硝基、卤基及c1-c4烷氧基。

在陈述范围的情况下，如“c1-c5烷基”或“5％至10％”，此类范围包括范围的端点，如第一实例中的c1及c5与第二实例中的5％及10％。

除非特别指示特定立体异构体(例如通过结构式中相关立体中心的加粗或虚键，通过将结构式中的双键描述为具有e或z组态或通过使用立体化学指明的命名法或符号)，否则所有立体异构体包括在本发明的范畴内，呈纯化合物以及其混合物的形式。除非另外指明，否则外消旋体、个别对映异构体(不论光学上纯的或部分解析的)、非对映异构体、几何异构体及其组合及混合物均涵盖于本发明内。

本领域技术人员将了解化合物可具有互变异构形式(例如酮及烯醇形式)、共振形式及两性离子形式，等同于本文所用的结构式中所描绘的形式，且结构式涵盖此类互变异构、共振或两性离子形式。

“药学上可接受的酯”是指活体内(例如在人体中)水解产生母化合物或其盐或自身活性类似于母化合物的酯。适合的酯包括c1-c5烷基酯、c2-c5烯基酯或c2-c5炔基酯，尤其甲酯、乙酯或正丙酯。

“药学上可接受的盐”是指适用于药物调配物的化合物的盐。若化合物具有一或多个碱性基团，则盐可为酸加成盐，诸如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、顺丁烯二酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、甲基硫酸盐、反丁烯二酸盐、苯甲酸盐、丁二酸盐、甲磺酸盐、乳糖酸盐、辛二酸盐、甲苯磺酸盐及其类似盐。若化合物具有一或多个酸性基团，则盐可为如下盐，诸如钙盐、钾盐、镁盐、葡甲胺盐、铵盐、锌盐、哌嗪盐、缓血酸胺盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己胺盐、苄星青霉素(benzathine)盐、钠盐、四甲铵盐及其类似盐。多晶型结晶形式及溶剂合物亦涵盖在本发明的范畴内。

“个体”为指动物，包括(但不限于)灵长类动物(例如人类)、猴、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“个体”及“患者”在本文中提及例如哺乳动物个体(诸如人类)时可互换使用。

在治疗疾病或病症的情形下，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”及“治疗(treatment)”是指包括缓解或消除病症、疾病或病状或与该病症、疾病或病状有关的症状中的一或多者；或减缓疾病、病症或病状或一或多种其症状的进展、扩散或恶化。“癌症治疗”为指一或多种以下作用：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括(i)减缓及(ii)完全生长阻滞；(2)减少肿瘤细胞数目；(3)维持肿瘤大小；(4)减小肿瘤大小；(5)抑制，包括(i)减少、(ii)减缓或(iii)完全阻止肿瘤细胞浸润至周边器官中；(6)抑制，包括(i)减少、(ii)减缓或(iii)完全阻止癌转移；(7)增强抗肿瘤免疫反应，其可(i)维持肿瘤大小，(ii)减小肿瘤大小，(iii)减缓肿瘤生长，(iv)减少、减缓或防止侵袭及/或(8)在一定程度上减轻与病症相关的一或多种症状的严重程度或数目。

在本说明书的式中，相对于键横向的波浪线或位于键末端的星号(*)表示共价附接位点。举例而言，式中r为或r为的表述是指

在本说明书的式中，横穿芳环的两个碳之间的键是指附接至键的基团可位于芳环中通过移除隐含的氢而变得可用的任何位置处。以说明的方式，式

表示

在其他说明中，

表示

且

表示

本领域技术人员将了解，某些结构可以一种互变异构形式或另一种互变异构形式(例如酮相对于烯醇)绘制，且两种形式为等效的。

化合物

在一个实施方案中，在以下部分中各x¹为cr²或不超过两个x¹'为n：

其实施例为

及

优选实施例为

等同

适合的基团r¹包括：

及

优选地，基团r¹为

适合的基团r³的实施例包括cl、oh、

及

其中基团r³具有结构的实施例(包括一或多个亚甲基(ch2)任选经o、s、so2、nh、c(＝o)、n(c1-c3烷基)、nc(＝o)(c1-c3烷基)或n(boc)中的一或多者替换的情况，或具有稠合至其的另一环，如上文所公开)为：

及

在另一实施方案中，r³为选自由以下组成的群：

及

在式i的一个实施方案中，m为0，在此情况下，该式简化为式i'：

式i化合物的另一实施方案由式ia表示：

其中r¹及r³如上文关于式i所定义。

其中m为1的式i化合物的一个实施方案由式ib表示，其中r¹、r³及x¹如上文关于式i所定义。

优选地，在式ib中

为

更优选为

以下列出本说明书中各化合物的特定实施例。其制备方法及其特性提供于下文实验部分中。

偶联物

概要

本文中所公开的tlr7激动剂可通过局部给予或通过以与靶向部分的偶联物形式靶向递送而递送至预期作用位点。优选地，靶向部分为抗体或其抗原结合部分，且其抗原位于预期作用位置，例如在预期作用位点位于肿瘤(癌症)时为肿瘤相关抗原。优选地，相比于正常细胞，肿瘤相关抗原由癌细胞唯一表达或过度表达。肿瘤相关抗原可位于癌细胞表面上或由癌细胞分泌至其环境中。

在一个方面中，提供一种包含本发明化合物及配体的偶联物，其由式(iv)表示

[d(x^d)a(c)c(x^z)b]mz(iv)

其中z为靶向部分，d为本发明的激动剂，且-(x^d)ac(x^z)b-由于其连接z与d而统称为“连接部分”或“接头”。在接头内，c为经设计以在d的预期生物学作用位点处或附近裂解的可裂解基团；x^d及x^z分别为间隔开d与c及c与z之间隔部分(或“间隔子”)；下标a、b及c独立地为0或1(亦即，x^d、x^z及c任选存在)。下标m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(优选1、2、3或4)。d、x^d、c、x^z及z更充分描述于下文中。

通过结合于其抗原或受体所位于的目标组织或细胞，z将偶联物引导至此处。基团c在目标组织或细胞处裂解释放d，从而局部地发挥其作用。以此方式，实现d在预期作用位点的精确递送，从而降低所需剂量。另外，d在处于其偶联状态时通常无生物活性(或活性明显更低)，从而减少脱靶效应。

如下标m所反映，各z可与多于一个d偶联，视可供用于偶联的位点z的数目及所采用实验条件而定。本领域技术人员将了解，虽然各个别z与整数数目的d偶联，但是偶联物的制备方法可分析d与z的非整数比率，其反映统计平均值。此比率称为取代比率(“sr(substitutionratio)”)或药物-抗体比率(“dar(drug-antibodyratio)”)。

靶向部分z

优选地，靶向部分z为抗体。为方便及简洁起见且以非限制方式，本说明书中关于z及其偶联物的详细论述以其为抗体的情形书写，但本领域技术人员将了解，其他类型的z亦可在细节上作必要修改后偶联。举例而言，叶酸作为靶向部分的偶联物可靶向其表面上具有叶酸受体的细胞(leamon等人，cancerres.2008,68(23),9839)。出于相同原因，本说明书中的详细论述主要按照1:1比率的z/d(m＝1)书写。

可用于本发明偶联物中的抗体包括识别以下抗原的抗体：间皮素、前列腺特异性膜抗原(prostatespecificmembraneantigen，psma)、cd19、cd22、cd30、cd70、b7h3、b7h4(亦称为o8e)、蛋白质酪氨酸激酶7(ptk7)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、rg1、岩藻糖基-gm1、ctla-4及cd44。抗体可为动物(例如鼠类)抗体、嵌合抗体、人类化抗体或优选人类抗体。抗体优选为单克隆抗体，尤其单克隆人类抗体。针对一些上述抗原的人类单克隆抗体的制备方法公开于以下文献中：korman等人，us8,609,816b2(2013；b7h4，亦称作08e；尤其抗体2a7、1g11、及2f9)；rao-naik等人，8,097,703b2(2012；cd19；尤其抗体5g7、13f1、46e8、21d4、21d4a、47g4、27f3及3c10)；king等人，us8,481,683b2(2013；cd22；尤其抗体12c5、19a3、16f7及23c6)；keler等人，us7,387,776b2(2008；cd30；尤其抗体5f11、2h9及17g1)；terrett等人，us8,124,738b2(2012；cd70；尤其抗体2h5、10b4、8b5、18e7及69a7)；korman等人，us6,984,720b1(2006；ctla-4；尤其抗体10d1、4b6及1e2)；korman等人，us8,008,449b2(2011；pd-1；尤其抗体17d8、2d3、4h1、5c4、4a11、7d3及5f4)；huang等人，us2009/0297438a1(2009；psma，尤其抗体1c3、2a10、2f5、2c6)；cardarelli等人，us7,875,278b2(2011；psma；尤其抗体4a3、7f12、8c12、8a11、16f9、2a10、2c6、2f5及1c3)；terrett等人，us8,222,375b2(2012；ptk7；尤其抗体3g8、4d5、12c6、12c6a及7c8)；harkins等人，us7,335,748b2(2008；rg1；尤其抗体a、b、c及d)；terrett等人，us8,268,970b2(2012；间皮素；尤其抗体3c10、6a4及7b1)；xu等人，us2010/0092484a1(2010；cd44；尤其抗体14g9.b8.b4、2d1.a3.d12及1a9.a6.b9)；deshpande等人，us8,258,266b2(2012；ip10；尤其抗体1d4、1e1、2g1、3c4、6a5、6a8、7c10、8f6、10a12、10a12s及13c4)；kuhne等人，us8,450,464b2(2013；cxcr4；尤其抗体f7、f9、d1及e2)；及korman等人，us7,943,743b2(2011；pd-l1；尤其抗体3g10、12a4、10a5、5f8、10h10、1b12、7h1、11e6、12b7及13g4)；其公开内容以引用的方式并入本文中。优选地，抗体为抗间皮素抗体。

除为抗体外，z亦可为抗体片段(诸如fab、fab'、f(ab')2、fd或fv)或抗体模拟物，诸如亲和抗体(affibody)、域抗体(dab)、纳米抗体、单抗体、darpin、抗运载蛋白(anticalin)、万能抗体(versabody)、双运载蛋白(duocalin)、脂质运载蛋白(lipocalin)或高亲和性多聚体(avimer)。

z上若干不同反应性基团中的任一者可为偶联位点，包括赖氨酸残基中的ε-氨基、侧链碳水化合物部分、天冬氨酸或谷氨酸侧链上的羧酸基、半胱氨酸-半胱氨酸二硫基及半胱氨酸硫醇基。适用于偶联的抗体反应性基团的综述参见例如garnett,adv.drugdeliveryrev.2001,53,171-216及dubowchik及walker,pharmacology&therapeutics1999,83,67-123，其公开内容以引用的方式并入本文中。

大部分抗体具有多个赖氨酸残基，所述残基可经由其ε-氨基通过酰胺、脲、硫脲或氨基甲酸酯键而偶联。

可通过若干方法使用半胱氨酸的侧链中的硫醇(-sh)基来形成偶联物。该硫醇基可用于在其与接头上的硫醇基之间形成双硫键。另一方法为经由其与接头上的顺丁烯二酰亚氨基的迈克尔加成反应(michaeladdition)。

通常，尽管抗体具有半胱氨酸残基，但其缺乏游离硫醇基，因为其所有半胱氨酸均形成链内或链间二硫键。为产生游离硫醇基，可还原天然二硫基。参见例如packard等人，biochemistry1986,25,3548；king等人，cancerres.1994,54,6176；及doronina等人，naturebiotechnol.2003,21,778。或者，可通过使抗体突变，用半胱氨酸取代另一氨基酸或将半胱氨酸插入多肽链中而引入具有游离-sh基团的半胱氨酸。参见例如eigenbrot等人，us7,521,541b2(2009)；chilkoti等人，bioconjugatechem.1994,5,504；urnovitz等人，us4,698,420(1987)；stimmel等人，j.biol.chem.2000,275,30445；bam等人，us7,311,902b2(2007)；kuan等人，j.biol.chem.1994,269,7610；poon等人，j.biol.chem.1995,270,8571；junutula等人，naturebiotechnology2008,26,925及rajpal等人，2015年12月21日申请的美国临时申请案第62/270245号。在另一方法中，将半胱氨酸添加至重链或轻链的c端。参见例如liu等人，us8,865,875b2(2014)；cumber等人，j.immunol.1992,149,120；king等人，cancerres.1994,54,6176；li等人，bioconjugatechem.2002,13,985；yang等人，proteinengineering2003,16,761；及olafson等人，proteinengineeringdesign&selection2004,17,21。此段落中引用的文献的公开内容以引用的方式并入本文中。

接头及其组分

如上文所提及，接头包含至多三个要素：可裂解基团c及任选存在之间隔子x^z及x^d。

基团c在生理条件下可裂解。优选地，基团c在偶联物处于血液循环中时相对稳定，但在偶联物到达其预期作用位点后容易裂解。

优选基团c为肽，其由目标细胞内的蛋白酶选择性裂解，而不是由血清中的蛋白酶裂解。通常，肽包含1至20个氨基酸，优选1至6个氨基酸，更优选2至3个氨基酸。氨基酸可为天然及/或非天然α-氨基酸。天然氨基酸为由遗传密码编码的氨基酸以及衍生自其的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸及o-磷酸丝氨酸。在本说明书中，术语“氨基酸”亦包括氨基酸类似物及模拟物。类似物为具有天然氨基酸的相同通用h2n(r)chco2h结构，但r基团并非天然氨基酸中发现的基团的化合物。类似物的实施例包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸-亚砜及甲硫氨酸甲基锍。氨基酸模拟物为结构不同于α-氨基酸的通用化学结构，但以类似于α-氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸可具有遗传编码氨基酸的“l”立体化学以及对映异构“d”立体化学。

优选地，c含有作为蛋白酶裂解识别序列的氨基酸序列。许多裂解识别序列为此项技术中已知的。参见例如matayoshi等人science247:954(1990)；dunn等人meth.enzymol.241:254(1994)；seidah等人meth.enzymol.244:175(1994)；thornberry,meth.enzymol.244:615(1994)；weber等人meth.enzymol.244:595(1994)；smith等人meth.enzymol.244:412(1994)；及bouvier等人meth.enzymol.248:614(1995)；其公开内容以引用的方式并入本文中。

基团c可经选择以使得其由存在于癌症附近的细胞外基质中的蛋白酶裂解，例如由附近濒死癌细胞所释放的蛋白酶或由癌细胞所分泌的肿瘤相关蛋白酶裂解。例示性细胞外肿瘤相关蛋白酶为纤维蛋白溶酶、基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotease，mmp)、甲拌磷寡肽酶(thimetoligopeptidase，top)及cd10。参见例如trouet等人，us7,402,556b2(2008)；dubois等人，us7,425,541b2(2008)；及bebbington等人，us6,897,034b2(2005)。组织蛋白酶d(通常为存在于细胞内部的溶酶体酶)有时存在于肿瘤环境中，有可能由死亡癌细胞释放。

对于经设计以由酶裂解的偶联物而言，c优选包含经选择以通过诸如组织蛋白酶b、c、d、h、l及s(尤其组织蛋白酶b)的蛋白酶裂解的氨基酸序列。例示性组织蛋白酶b可裂解肽包括val-ala、val-cit、val-lys、lys-val-ala、asp-val-ala、val-ala、lys-val-cit、ala-val-cit、val-gly、val-gln及asp-val-cit。(在本文中，除非上下文另有明确指示，否则氨基酸序列以n-至-c方向书写，如同h2n-aa²-aa¹-co2h。)参见dubowchik等人，biorg.med.chem.lett.1998,8,3341；dubowchik等人，bioorg.med.chem.lett.1998,8,3347；及dubowchik等人，bioconjugatechem.2002,13,855；其公开内容以引用的方式并入。

可用于裂解肽基接头的另一酶为豆荚蛋白，一种优选在ala-ala-asn处进行裂解的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。

在一个实施方案中，基团c为包含两氨基酸序列-aa²-aa¹-的肽，其中aa¹为赖氨酸、精氨酸或瓜氨酸，且aa²为苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在另一实施方案中，c由具有一至三个氨基酸的序列组成，其选自由以下组成的群：val-cit、ala-val、val-ala-val、lys-lys、ala-asn-val、val-leu-lys、cit-cit、val-lys、ala-ala-asn、lys、cit、ser及glu。更优选地，c为前述群中的两氨基酸肽至三氨基酸肽。

由单个氨基酸组成的可裂解基团c的制备及设计如chen等人，us8,664,407b2(2014)中所公开，其公开内容以引用的方式并入本文中。

基团c可直接键结至z或d；亦即，间隔子x^z或x^d任选可不存在。

在存在时，间隔基x^z提供c与z之间的空间分隔，以免前者在空间上干扰后者的抗原结合或后者在空间上干扰前者的裂解。此外，间隔基x^z可用于赋予偶联物增加的溶解性或降低的凝集特性。间隔基x^z可包含一或多个模块区段，其可呈任何数目的组合组装。间隔基x^z的适合区段的实施例为：

及其组合，

其中下标g为0或1，且下标h为1至24，优选2至4。这些区段可组合，诸如如下所说明：

若存在，间隔基x^d提供c与d之间的空间分隔，以免后者在空间上或电子学上干扰前者的裂解。间隔基x^d亦可用于将其他分子量及化学官能基引入偶联物中。一般而言，其他质量及官能基将影响偶联物的血清半衰期及其他特性。因此，经由明智地选择间隔基，可调节偶联物的血清半衰期。间隔基x^d亦可类似于上文关于间隔基x^z的描述由模块区段组装。

间隔基x^z及/或x^d在存在时优选在z与c或d与c之间分别提供4至25个原子，更优选4至20个原子的线性分隔。

除共价连接抗体与药物以外，接头可执行其他功能。举例而言，接头可含有聚(乙二醇)(“peg”)基团。由于偶联步骤通常涉及在水性介质中将药物-接头偶合至抗体，因此peg基团可增加药物-接头的水溶解度。另外，peg基团可增加所得adc的溶解度或减少其凝集。若存在peg基团，则可将其并入间隔基x^z或x^d或两者中。peg基团中重复单元的数目可为2至20，优选4至10。

间隔基x^z或x^d或两者可包含自我分解型部分。自我分解型部分为如下部分，其(1)键结至c以及z或d中之一者，且(2)具有使得自基团c的裂解引发反应序列，从而使自我分解型部分自身任选与z或d脱离的结构。换言之，远离z或d的位点处的反应(自基团c的裂解)使得x^z-z或x^d-d键亦断裂。在间隔基x^d的情况下希望存在自我分解型部分，因为若在偶联物裂解后间隔基x^d或其一部分保持连接于d，则d的生物活性可能受损。在可裂解基团c为多肽的情形下尤其希望使用自我分解型部分，在此情况下自我分解型部分通常邻近于该多肽定位，以防d在空间上或在电子学上干扰肽裂解。

键结至d的羟基或氨基的例示性自我分解型部分(i)-(v)如下所示：

自我分解型部分为点线a与b(或点线b与c)之间的结构，其中展示相邻结构特征以提供背景。自我分解型部分(i)及(v)键结至d-nh2(亦即经由氨基偶联)，而自我分解型部分(ii)、(iii)及(iv)键结至d-oh(亦即经由羟基或羧基偶联)。点线b处的键由酶(在结构(i)-(v)的情况下为肽酶且在结构(vi)的情况下为β-葡糖醛酸酶)裂解，引发自我分解型反应序列，从而引起点线a处的键裂解以及任选d-oh或d-nh2的随后释放。以说明的方式，结构(i)及(iv)的自我分解机制如下所示：

换言之，自我分解型基团之一个部分处的第一化学键的裂解引发一系列步骤，从而引起自我分解型基团的不同部分处的第二化学键(将自我分解型基团连接至药物的化学键)裂解，从而释放药物。

在一些情况下，自我分解型基团可串联使用，如结构(vii)所示。在此情况下，点线c处的裂解触发点线b与c之间的部分通过1,6-消除反应而自我分解，接着点线a与b之间的部分通过环化-消除反应而自我分解。关于自我分解型部分的其他公开案参见carl等人，j.med.chem.1981,24,479；carl等人，wo81/01145(1981)；dubowchik等人，pharmacology&therapeutics1999,83,67；firestone等人，us6,214,345b1(2001)；toki等人，j.org.chem.2002,67,1866；doronina等人，naturebiotechnology2003,21,778(勘误,第941页)；boyd等人，us7,691,962b2；boyd等人，us2008/0279868a1；sufi等人，wo2008/083312a2；feng,us7,375,078b2；jeffrey等人，us8,039,273；及senter等人，us2003/0096743a1；其公开内容以引用的方式并入。

在另一实施方案中，z与d通过不可裂解接头连接，亦即不存在c。d的代谢最终将接头减小成不会干扰d的生物活性的较小附加部分。

偶联技术

本文中所公开的tlr7激动剂的偶联物优选通过以下方式制得：首先制备包含d及接头(x^d)a(c)c(x^z)b(其中x^d、c、x^z、a、b及c如针对式(ii)所定义)的化合物，以形成由式(v)表示的药物-接头化合物：

d-(x^d)a(c)c(x^z)b-r³¹(v)

其中r³¹为适于与抗体z上的互补官能基反应形成偶联物的官能基。适合基团r³¹的实施例包括氨基、叠氮基、硫醇、环辛炔、

及

其中r³²为cl、br、f、甲磺酸酯基或甲苯磺酸酯基，且r³³为cl、br、i、f、oh、-o-n-丁二酰亚氨基、-o-(4-硝基苯基)、-o-五氟苯基或-o-四氟苯基。通常可用于制备适合部分d-(x^d)ac(x^z)b-r³¹的化学方法公开于以下中：ng等人，us7,087,600b2(2006)；ng等人，us6,989,452b2(2006)；ng等人，us7,129,261b2(2006)；ng等人，wo02/096910a1；boyd等人，us7,691,962b2；chen等人，us7,517,903b2(2009)；gangwar等人，us7,714,016b2(2010)；boyd等人，us2008/0279868a1；gangwar等人，us7,847,105b2(2010)；gangwar等人，us7,968,586b2(2011)；sufi等人，us8,461,117b2(2013)；及chen等人，us8,664,407b2(2014)；其公开内容以引用的方式并入本文中。

优选反应性官能基-r³¹为-nh2、-oh、-co2h、-sh、顺丁烯二酰亚氨基、环辛炔、叠氮基(-n3)、羟基氨基(-onh2)或n-羟基丁二酰亚氨基。

尤其优选的官能基-r³¹为：

-oh基团可用抗体上，例如天冬氨酸或谷氨酸侧链上的羧基酯化。

-co2h基团可用抗体上的-oh基团酯化或用抗体上(例如赖氨酸侧链上)的氨基酰胺化。

n-羟基丁二酰亚氨基为功能上活化的羧基且可便利地通过与氨基(例如来自赖氨酸)反应而酰胺化。

在迈克尔加成反应中，顺丁烯二酰亚氨基可与抗体上的-sh基团(例如来自半胱氨酸或来自引入硫氢基官能基的抗体的化学修饰)偶联。

若抗体不具有可用于偶联的半胱氨酸-sh，则赖氨酸残基的侧链中的ε-氨基可与2-亚氨基硫杂环戊烷或n-丁二酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(“spdp”)反应以引入游离硫醇(-sh)基，从而实际上产生半胱氨酸替代物。硫醇基可与顺丁烯二酰亚胺或其他亲核试剂受体基团反应以实现偶联。下方示出利用2-亚氨基硫杂环戊烷的机制。

通常，实现每个抗体二至三个硫醇的硫醇化水平。关于代表性程序，参见cong等人，us8,980,824b2(2015)，其公开内容以引用的方式并入本文中。

在相反配置中，可用4-(顺丁烯二酰亚氨基甲基)-环己烷甲酸n-丁二酰亚氨基酯(“smcc”)或其磺酸化变异体磺酸基-smcc(该两者可购自sigma-aldrich)来修饰抗体z，以向其中引入顺丁烯二酰亚氨基。随后，可使用接头上具有-sh基团的药物-接头化合物来达成偶联。

替代偶联方法使用无铜“点击化学法(clickchemistry)”，其中将叠氮基添加在紧绷的环辛炔上，以形成1,2,3-三唑环。参见例如agard等人，j.amer.chem.soc.2004,126,15046；best,biochemistry2009,48,6571,其公开内容以引用的方式并入本文中。叠氮基可位于抗体上且环辛炔位于药物-接头部分上或反之亦然。优选环辛炔基为二苯并环辛炔(dibo)。具有dibo基团的各种试剂可获自invitrogen/molecularprobes,eugene,oregon。以下反应说明dibo基团附接于抗体(ab)的情况下的点击化学法偶联：

另一偶联技术包括将非天然氨基酸引入抗体中，其中非天然氨基酸提供用于与药物部分中的反应性官能基偶联的官能基。举例而言，非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸可并入至抗体或其他多肽中，如tian等人，wo2008/030612a2(2008)中所教示。对乙酰基苯丙氨酸中的酮基可经由与接头-药物部分上的羟基氨基形成肟，而成为偶联位点。或者，可将非天然氨基酸对叠氮基苯丙氨酸并入抗体中，得到叠氮基官能基，以供经由点击化学法偶联，如上所述。非天然氨基酸亦可使用无细胞方法而并入抗体或其他多肽中，如goerke等人，us2010/0093024a1(2010)及goerke等人，biotechnol.bioeng.2009,102(2),400-416中所教示。前述公开内容以引用的方式并入本文中。因此，在一个实施方案中，用于制备偶联物的抗体具有一或多个经非天然氨基酸替换的氨基酸，该非天然氨基酸优选为对乙酰基苯丙氨酸或对叠氮基苯丙氨酸，更优选为对乙酰基苯丙氨酸。

另一偶联技术使用酵素谷氨酰胺转氨酶(优选来自茂原链霉菌(streptomycesmobaraensis)的细菌谷氨酰胺转氨酶或btg)，根据jeger等人，angew.chem.int.ed.2010,49,9995。btg在谷氨酰胺的侧链甲酰胺(胺受体)与亚烷基氨基(胺供体)(其可为例如赖氨酸的ε-氨基或5-氨基-正戊基)之间形成酰胺键。在典型偶联反应中，如下所示，谷氨酰胺残基位于抗体上，而亚烷基氨基位于接头-药物部分上：

谷氨酰胺残基位于多肽链上对其对btg介导的转酰胺作用的敏感性具有很大影响。抗体上的谷氨酰胺残基通常均不为btg底物。然而，若抗体去糖基化，糖基化位点为重链的天冬酰胺297(n297；根据如kabat等人，“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”,第5版,公开案第91-3242号,u.s.dept.health&humanservices,nih,bethesda,md.,1991；下文简称“kabat”中所阐述的eu索引进行编号)，则邻近的谷氨酰胺295(q295)呈现对btg敏感。抗体可通过用pngasef(肽-n-糖苷酶f)酶促去糖基化。或者，抗体可通过在恒定区中引入n297a突变而以无糖苷的形式合成，从而消除n297糖基化位点。此外，已证实n297q取代不仅消除糖基化，且亦引入同样为胺受体的第二谷氨酰胺残基(位置297)。由此，在一个实施方案中，抗体去糖基化。在另一实施方案中，抗体具有n297q取代。本领域技术人员将了解，通过合成后修饰或通过引入n297a突变进行的去糖基化使每个抗体产生两个btg反应性谷氨酰胺残基(每条重链一个，在位置295处)，而具有n297q取代的抗体具有四个btg反应性谷氨酰胺残基(每条重链两个，在位置295及297处)。

通过向抗体中引入含有谷氨酰胺的肽或“标签”，亦可使抗体对btg介导的偶联敏感，例如pons等人，us2013/0230543a1(2013)及rao-naik等人，wo2016/144608a1中所教示。

在补充方法中，可通过改变btg的氨基酸序列，使得其变得能够与未经修饰抗体中的谷氨酰胺295反应来改变其底物特异性，如rao-naik等人，wo2017/059158a1(2017)中所教示。

虽然最常用的细菌性谷氨酰胺转氨酶为来自茂原链霉菌的细菌性谷氨酰胺转氨酶，但亦可考虑来自底物特异性略微不同的其他细菌的谷氨酰胺转氨酶，诸如来自拉达喀尔链轮丝菌(streptoverticilliumladakanum)的谷氨酰胺转氨酶(hu等人，us2009/0318349a1(2009)、us2010/0099610a1(2010)及us2010/0087371a1(2010))。

具有一级或二级烷基胺的本发明tlr7激动剂尤其适用于偶联物中，因为二级胺提供用于附接接头的官能基。此类tlr7激动剂-接头化合物的实施例为化合物41，其含有酶促可裂解接头。图15展示制备化合物41可根据的流程。

含有非酶促可裂解接头的tlr7激动剂-接头化合物的实施例为化合物43。图16展示合成化合物43的方式。

化合物41及43均含有一级烷基氨基，使得其能够与谷氨酰胺转氨酶偶联。下文实施例中描述适合的偶联步骤。

亦可使用酶分选酶a实现偶联，如以下中所教示：levary等人，plosone2011,6(4),e18342；proft,biotechnol.lett.2010,32,1-10；ploegh等人，wo2010/087994a2(2010)；及mao等人，wo2005/051976a2(2005)。分选酶a识别基元(通常lpxtg，其中x为任何天然氨基酸)可位于配体z上，且亲核性受体基元(通常ggg)可为式(iii)中的基团r³¹，或反之亦然。

tlr7激动剂偶联物

应用前述技术，可制备诸如下方所示出的tlr7激动剂偶联物：

其中m为1、2、3或4，且ab为抗体。

聚乙二醇化

将聚(乙二醇)(peg)链附接至药物(“聚乙二醇化”)可改良药物的药物动力学特性。药物的循环半衰期增加，有时增加超过一个数量级，同时降低实现所要治疗作用所需的剂量。聚乙二醇化亦可减少药物的代谢降解且降低其免疫原性。关于综述，参见kolate等人，j.controlledrelease2014,192,167。

聚乙二醇化最初应用于生物药物。截至2016年，已批准超过十种聚乙二醇化生物制剂。turecek等人，j.pharmaceuticalsci.2016,105,460。最近，受该概念成功应用于生物制剂的刺激，人们注意力已转向其应用于小分子药物。除前述益处外，聚乙二醇化小分子药物可具有增加的溶解性且引起较少毒性作用。li等人prog.polymersci.2013,38,421。

本文所公开的化合物可聚乙二醇化。在化合物具有脂族一级或二级胺或脂族羟基的情况下，诸如下文所展示的化合物的情况(箭头)，其可利用诸如二环己基碳化二亚胺、hatu、n-羟基丁二酰亚胺酯及其类似物的常规技术，经由酯、酰胺、碳酸酯或氨基甲酸酯基进行聚乙二醇化。用于对药物分子进行聚乙二醇化的多种其他方法公开于alconcel等人，polymerchem.2011,2,1442中，其公开内容以引用的方式并入本文中。

视需要，本文中所公开的tlr7激动剂可经由包含自我分解型部分的酶促可裂解接头来聚乙二醇化，从而允许未经聚乙二醇化的激动剂以设计的方式释放。此外，若含有peg的分子具有适用于附接至蛋白质的官能基(诸如胺)，则聚乙二醇化可与同蛋白质(诸如抗体)的偶联组合。蛋白质可提供额外治疗功能，或在抗体的情况下可提供靶向功能。在下方反应序列中示出这些概念，其中tlr7-nh-r通常表示tlr7激动剂：

在上述反应序列中，缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)二肽可通过组织蛋白酶b裂解，其中对氨基苯甲基氧基羰基(pabc)充当自我分解型间隔基。用于偶联的官能基为氨基，其暂时受fmoc基团保护。偶联由谷氨酰胺转氨酶实现，其中谷氨酰胺(gln)侧链充当酰基受体。视聚乙二醇化的目的而定，表示peg重复单元的数目的下标x可广泛变化，如下文所论述。出于一些目的，x可相对较小，诸如2、4、8、12或24。出于其他目的，x较大，例如在约45与约910之间。

本领域技术人员将了解，该序列为说明性的，且可使用如此项技术中所熟知的其他要素(肽、自我分解型基团、偶联方法、peg长度等)。本领域技术人员亦将了解，虽然上述序列组合聚乙二醇化与偶联，但聚乙二醇化不需要偶联，且反之亦然。

当化合物缺乏脂族羟基或脂族一级或二级胺时，其仍可在嘧啶环上的芳族胺处进行聚乙二醇化。在该位置处进行聚乙二醇化的方法由zarraga,us2017/0166384a1(2007)公开，其公开内容以引入的方式并入。

在一些实施方案中，可能需要单个分子中连接有多个聚乙二醇化激动剂。举例而言，可在季戊四醇(c(ch2oh)4)上构筑四个聚乙二醇化臂，且tlr7激动剂可附接至各聚乙二醇化臂。参见gao等人，us2013/0028857a1(2013)，其公开内容以引用的方式并入。

为了调节药物动力学，通常优选地，peg部分的分子量在约2kda(对应于约45个-(ch2ch2o)-重复单元)与约40kda(对应于约910个-(ch2ch2o)-重复单元)之间，更优选在约5kda与约20kda之间。亦即，上式中下标x的范围为约45至约910。应了解，peg组合物并非100％均质的，而是显示出分子量的分布。因此，提及例如“20kdapeg”是指peg具有20kda的平均分子量。

聚乙二醇化亦可用于提高激动剂的溶解性。在这些情况下，可使用较短peg链，例如包含2个、4个、8个、12个或24个重复单元。

药物组合物及给予

在另一方面中，提供一种药物组合物，其包含如本文所公开的化合物或其偶联物，该化合物或其偶联物与药学上可接受的载剂或赋形剂一起调配。其可任选含有一或多种额外药学上活性成分，诸如生物药物或小分子药物。药物组合物可呈与另一治疗剂、尤其抗癌剂的组合疗法形式给予。

药物组合物可包含一或多种赋形剂。可使用的赋形剂包括载剂、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体黏合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等张剂及其组合。适合赋形剂的选择及使用教示于gennaro编,remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第20版(lippincottwilliams&wilkins2003)中。

优选地，药物组合物适用于静脉内、肌肉内、皮下、非经肠、经脊椎或表皮给予(例如通过注射或输注)。视给予途径而定，活性化合物可包覆于材料中以使其免受酸及可使其不活化的其他天然条件的作用。词组“非经肠给予”是指除肠内及表面给予以外，通常通过注射进行的给予模式，且包括(但不限于)静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。或者，药物组合物可经由非经肠途径给予，诸如表面、表皮或黏膜给予途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、经舌下或局部。

药物组合物可呈无菌水溶液或分散液的形式。其亦可调配于微乳剂、脂质体或适合于实现高药物浓度的其他有序结构中。组合物亦可呈冻干物形式提供以在给予前于水中复原。

可与载剂材料组合产生单一剂型的活性成分的量视所治疗个体及特定给予模式而变化，且一般为组合物产生治疗作用的量。一般而言，以100％计，此量将在约0.01％至约99％活性成分，优选在约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％活性成分范围内，与药学上可接受的载剂组合。

剂量方案经调节以提供治疗反应。举例而言，可给予单次剂量，可随时间给予若干分次剂量，或可按情形的紧急状态所指示，按比例减少或增加剂量。就给予容易性及剂量均一性而言，尤其宜以单位剂型调配非经肠组合物。“单位剂型”为指适合作为单一剂量用于欲治疗个体的物理离散单位；各单位含有经计算以产生所要治疗反应的预定量的活性化合物以及所要药物载剂。

剂量在每千克主体体重约0.0001至100mg范围内，且更通常每千克0.01至5mg范围内。举例而言，剂量可为每千克体重0.3mg、每千克体重1mg、每千克体重3mg、每千克体重5mg或每千克体重10mg或在1-10mg/kg或者0.1-5mg/kg范围内。例示性治疗方案为每周给予一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一个月一次、每3个月一次或每三至6个月一次。优选剂量方案包括每千克体重1mg或每千克体重3mg，经由静脉内给予且使用一种以下给药时程：(i)每四周六次剂量，随后为每三个月；(ii)每三周；(iii)给予每千克体重3mg一次，继而每三周给予每千克体重1mg。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，且在一些方法中达到约25-300μg/ml。

“治疗有效量”的本发明化合物优选使得疾病症状的严重性降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防疾病病痛所致的损伤或失能。举例而言，为治疗身患肿瘤的个体，“治疗有效量”相对于未经治疗的个体优选抑制肿瘤生长达至少约20％，更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％且再更优选至少约80％。治疗有效量的治疗化合物可降低肿瘤大小或者改善个体的症状，该个体通常为人类但可为其他哺乳动物。在组合治疗中给予两种或两种以上治疗剂时，“治疗有效量”为指组合作为整体，而非单独各药剂的功效。

药物组合物可为控制释放或持续释放的调配物，包括植入物、经皮贴片及微胶囊化递送系统。可使用生物可降解的生物兼容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。参见例如sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,j.r.robinson编,marceldekker,inc.,newyork,1978。

治疗性组合物可经由医学装置给予，诸如(1)无针皮下注射装置；(2)微输注泵；(3)经皮装置；(4)输注装置；及(5)渗透装置。

在某些实施方案中，药物组合物可经调配以确保活体内适当分布。举例而言，为确保本发明的治疗化合物跨越血脑障壁，其可调配于脂质体中，脂质体可另外包含靶向部分以提高向特定细胞或器官的选择性传输。

工业应用性

本文所公开的tlr7激动剂化合物可用于治疗可通过tlr7活化来改善的疾病或病状。

在一个实施方案中，tlr7激动剂与抗癌免疫治疗剂(亦称为免疫肿瘤学药剂)组合使用。抗癌免疫治疗剂通过刺激身体免疫系统攻击及摧毁癌细胞，尤其经由活化t细胞起作用。免疫系统具有许多检查点(调节)分子，帮助维持其合理攻击目标细胞与防止其攻击健康正常细胞之间的平衡。一些为刺激剂(上调剂)，是指其加入促进t细胞活化且增强免疫反应。其他为抑制剂(下调剂或门)，是指其加入抑制t细胞活化且减少免疫反应。激动免疫治疗剂与刺激性检查点分子的结合可引起后者活化且增强针对癌细胞的免疫反应。相反地，拮抗性免疫治疗剂与抑制性检查点分子的结合可防止后者下调免疫系统且帮助维持对癌细胞的剧烈反应。刺激性检查点分子的实施例为b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、cd40、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27、cd40、dr3及cd28h。抑制性检查点分子的实施例为ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2、lag-3、tim-3、半乳糖凝集素9、ceacam-1、btla、cd69、半乳糖凝集素-1、cd113、gpr56、vista、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim-1、cd96及tim-4。

无论抗癌免疫治疗剂采用哪种作用模式，其有效性可通过免疫系统的总体上调，诸如通过tlr7的活化来提高。因此，在一个实施方案中，本说明书提供一种治疗癌症的方法，其包含向患有该癌症的患者给予治疗有效的抗癌免疫治疗剂与如本文中所公开的tlr7激动剂的组合。给予时序可为同时、依序或交替的。给予模式可为全身或局部的。tlr7激动剂可以靶向方式经由偶联物递送。

可通过如上文所描述的组合治疗的癌症包括急性骨髓白血病、肾上腺皮质癌、卡波西氏肉瘤(kaposisarcoma)、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳癌、支气管瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、子宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓增生性赘瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、敏感性神经胚细胞瘤、尤因氏肉瘤(ewingsarcoma)、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道基质肿瘤、生殖细胞肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、下咽癌(hypopharngealcancer)、胰脏癌、肾癌、喉癌、慢性骨髓性白血病、唇腔癌、肺癌、黑素瘤、梅克尔细胞(merkelcell)癌、间皮瘤、口腔癌、口部癌、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、睪丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌及外阴癌。

可用于如本文所公开的组合疗法中的抗癌免疫治疗剂包括：amg557、amp-224、阿特珠单抗(atezolizumab)、艾维路单抗(avelumab)、bms936559、赛咪单抗(cemiplimab)、cp-870893、达西珠单抗(dacetuzumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、伊诺贝利珠(enoblituzumab)、加利昔单抗(galiximab)、imp321、伊匹单抗(ipilimumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、medi-570、medi-6383、medi-6469、莫罗单抗(muromonab)-cd3、纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗、皮立珠单抗(pidilizumab)、斯帕塔利单抗(spartalizumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌图木单抗(utomilumab)、瓦力单抗(varlilumab)、万利珠单抗(vonlerolizumab)。下表a列举其替代名称(品牌名称、曾用名称、研究代码或同义词)及对应目标检查点分子。

在利用tlr7激动剂的组合治疗的一个实施方案中，抗癌免疫治疗剂为拮抗性抗ctla-4、抗pd-1或抗pd-l1抗体。癌症可为肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰脏癌、肾癌、头颈癌、淋巴瘤(包括霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin'slymphoma))、皮肤癌(包括黑素瘤及梅克尔皮肤癌(merkelskincancer))、尿道上皮癌(包括膀胱癌)、胃癌、肝细胞癌或结肠直肠癌。

在利用tlr7激动剂的组合治疗的另一实施方案中，抗癌免疫治疗剂为拮抗性抗ctla-4抗体，优选伊匹单抗。

在利用tlr7激动剂的组合治疗的另一实施方案中，抗癌免疫治疗剂为拮抗性抗pd-1抗体，优选纳武单抗(nivolumab)或帕博利珠单抗(pembrolizumab)

本文中所公开的tlr7激动剂亦适用作疫苗佐剂。

生物活性

本文所公开的作为tlr7激动剂的化合物的生物活性可通过以下程序分析。

人类tlr7激动剂活性分析

此程序描述一种用于分析本说明书中所公开的化合物的人类tlr7(htlr7)激动活性的方法。

将经工程改造的具有人类tlr7分泌性胚胎碱性磷酸酶(seap)报导转殖基因的人类胚胎肾蓝色细胞(hek-blue^tmtlr细胞；invivogen)悬浮于非选择性培养基(dmem高葡萄糖(invitrogen)，其补充有10％胎牛血清(sigma))中。将hek-blue^tmtlr7细胞添加至384孔组织培养盘的各孔(每孔15,000个细胞)中，且在37℃、5％co2下培育16-18小时。将化合物(100nl)施配至含有hek-blue^tmtlr细胞的孔中，且将经处理的细胞在37℃、5％co2下进行培育。在处理18小时之后，将十微升的新鲜制备的quanti-blue^tm试剂(invivogen)添加至各孔中，培育30分钟(37℃，5％co2)且使用envision盘式读取器(od＝620nm)测量seap含量。计算半数最大有效浓度值(ec50；诱导分析基线与最大值之间一半反应的化合物浓度)。

人类血液中i型干扰素基因(mx-1)及cd69的诱导

i型干扰素(ifn)mx-1基因及b细胞活化标记物cd69的诱导为在tlr7路径活化后发生的下游事件。以下为一种人类全血分析，测量其回应于tlr7激动剂的诱导。

自人类个体收集肝素化人类全血，且用1mm的测试tlr7激动剂化合物处理。用rpmi1640培养基稀释血液且使用echo每孔预点10nl，得到最终浓度1μm(10μl血液中10nl)。在振荡器上混合30秒之后，将盘覆盖且置放于37℃腔室中维持隔夜＝17小时。制备固定/溶解缓冲液(h2o中5×->1×，在37℃下加温；目录#bd558049)且保存perm缓冲液(在冰上)以备后续使用。

对于表面标记物染色(cd69)：制备的表面ab：0.045μlhcd14-fitc(thermofisher目录号mhcd1401)+0.6μlhcd19-ef450(thermofisher目录号48-0198-42)+1.5μlhcd69-pe(目录号bd555531)+0.855μlfacs缓冲液。添加3微升/孔，旋转1000rpm1分钟且在振荡器上混合30秒，置于冰上30分钟。在30分钟之后用70μl预先升温的1×固定/溶解缓冲液停止刺激且使用feliexmate再悬浮(15次，换掉各培养盘的尖端)且在37℃下培育10分钟。

以2000rpm离心5分钟，用hcs盘式洗涤器抽吸，在振荡器上混合30秒，接着用dpbs中70μl洗涤且粒化2次(2000rpm持续5分钟)且50μl于facs缓冲液中洗涤，粒化1次(2000rpm持续5分钟)。在振荡器上混合30秒。对于细胞内标记物染色(mx-1)：添加50μlbdperm缓冲液iii且在振荡器上混合30秒。在冰上培育30分钟(在黑暗中)。用50μlfacs缓冲液洗涤2次(在perm之后2300rpm旋转5分钟)，随后在振荡器上混合30秒。使其再悬浮于20μlfacs缓冲液中，该facs缓冲液含有mx1抗体()(4812)-alexa647:novusbiologicals#nbp2-43704af647)20μlfacsbf+0.8μlhigg+0.04μlmx-1。在1000rpm下旋转1分钟，在振荡器上混合30秒且在室温下在黑暗中培育样品45分钟，随后facs缓冲液洗涤2次(在perm之后2300rpm旋转5分钟)。再悬浮于20μl(每孔总共35μl)facs缓冲液中且用箔片覆盖且置放于4℃下以第二天读取。在iqueplus上读取盘。将结果加载工具集中且在曲线主控中产生ic50曲线。y轴100％设定成1μm瑞喹莫特(resiquimod)。

小鼠血液中的tnf-α及i型ifn反应基因的诱导

tnf-α及i型ifn反应基因的诱导为在tlr7路径活化后发生的下游事件。以下为测量小鼠全血中其回应于tlr7激动剂的诱导的分析。

用具有pen-strep的rpmi1640培养基以5:4(50μl全血及40μl培养基)的比率稀释肝素化小鼠全血。将90μl体积的经稀释血液转移至falcon平底96孔组织培养盘的孔中，且在4℃下培育盘1小时。在用于浓度反应分析的相同培养基中将含测试化合物的100％dmso储备液稀释20倍，且随后将10μl经稀释的测试化合物添加至孔中，以使得最终dmso浓度为0.5％。对照孔接受含有5％dmso的10μl培养基。随后在5％co2培育箱中在37℃下培育盘17小时。培育之后，向各孔中添加100μl培养基。将培养盘离心且移除130μl上清液，用于elisa(invitrogen，目录号88-7324，thermo-fisherscientific)对tnfa产生的分析中。将70μl体积的来自invitrogenmrnacatcherplus试剂盒(目录号k1570-02)的具有dtt的mrnacatcher溶解缓冲液(1×)添加至孔中的剩余70μl样品中，且通过上下吸液5次将其混合。随后在室温下振荡培养盘5-10分钟，随后向各孔中添加2μl蛋白酶k(20mg/ml)。接着在室温下振荡培养盘15-20分钟。随后将培养盘储存在80℃下直至进一步处理。

将冷冻样品解冻且根据制造商的说明使用invitrogenmrnacatcherplus试剂盒(目录号k1570-02)提取mrna。使用invitrogensuperscriptivvilomastermix(目录号11756500)用来自rna提取之一半产量mrna在20μl反转录酶反应中合成cdna。使用来自thermofisher(appliedbiosystems)的quantstudioreal-timepcr系统进行实时pcr。使用针对小鼠ifit1、ifit3、mx1及ppia基因表达及taqmanmastermix的商业预先设计的taqman分析法一式两份地操作所有实时pcr反应。ppia用作管家基因。遵循来自制造商的建议。通过平均管家基因(ct)标准化所有原始数据(ct)，且接着利用比较ct(δδct)方法定量相对基因表达(rq)用于实验分析。

一般程序

以下一般程序用于液相色谱(制备型或分析型)及核磁共振。

液相色谱法

除非另外指出，否则以下通用条件用于高压液相色谱(hplc)纯化或用于液相色谱-质谱分析(lc-ms)：

制备型hplc/ms条件a-1：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有0.05％三氟乙酸的5:95乙腈:水；流动相b：具有0.05％三氟乙酸的95:5乙腈:水；梯度：保持在0％b下0分钟，0-40％b经20分钟，接着在100％b下保持0分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。

制备型hplc/ms条件a-2：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有10mm乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相b：具有10mm乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：在7％b下保持0分钟，7-47％b经20分钟，接着在100％b下保持0分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。

制备型hplc/ms条件a-3：管柱：xbridgeshieldrp18obd管柱，19×150mm，5μm；流动相a：具有0.05％tfa的水；流动相b：具有0.05％tfa的乙腈；流动速率：18.9ml/min；梯度：0％b持续2分钟，0-35％b持续20分钟，100％b持续3分钟；检测器，uv254/210nm；管柱温度：25℃。

lc/ms条件b：管柱：aquityuplcbehc18，2.1mm×50mm，1.7μm粒子；流动相a：具有0.05％tfa的100％水；流动相b：具有0.05％tfa的100％乙腈；梯度：2％b至98％b经1分钟，接着98％b下保持0.50分钟；流速：0.8ml/min。

lc/ms条件c：管柱：watersxbridgec18，2.1mm×50mm，1.7μm粒子；流动相a：具有0.1％三氟乙酸的5:95乙腈:水；流动相b：具有0.1％三氟乙酸的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0％b至100％b经3分钟，接着100％b下保持0.50分钟；流速：1ml/min；检测：ms及uv(220nm)。

lc/ms条件d：lc/ms条件：管柱：aquityuplcbehc18，2.1mm×50mm，1.7μm粒子；流动相a：具有10mmnh4oh的95:5水:乙腈；流动相b：具有10mmnh4oh的95:5乙腈:水；梯度：5％b至95％b经1分钟，接着95％b下保持0.50分钟；流速：0.8ml/min至95％b，经1分钟，接着在95％b下保持0.50分钟；流速：0.8ml/min。

lc/ms条件e：lc/ms条件：管柱：watersxbridgec18，2.1mm×50mm，1.7μm粒子；流动相a：含0.1％tfa的水；流动相b：具有0.1％tfa的乙腈；温度：40℃；梯度：5％b至95％b经2.6分钟，接着在95％b下保持0.20分钟；流动速率：0.6ml/min。

nmr

以下条件用于获得质子核磁共振(nmr)谱：在400mz或500mhzbruker仪器中使用dmso-d6或cdcl3作为溶剂及内标获取nmr谱。通过adclabs或mestrenova软件使用2015-01版本acdspectrus分析粗nmr数据。

化学位移以自内部四甲基硅烷(tms)低场百万分率(ppm)或由氘化nmr溶剂推断的tms位置报导。表观多峰性报导如下：单峰-s、二重峰-d、三重峰-t、四重峰-q或多重峰-m。显示变宽的峰值进一步表示为br。积分为近似的。应注意，积分强度、峰形、化学位移及耦合常数可视溶剂、浓度、温度、ph值及其他因素而定。此外，在nmr谱中与水或溶剂峰重叠或与水或溶剂峰交换的峰无法提供可靠积分强度。在一些情况下，nmr谱可使用水峰抑制来获得，水峰抑制可引起重叠峰不可见或具有改变的形状及/或积分。

合成

可参考以下实施例进一步理解本发明的实践，其为以说明方式提供且不是指限制。

一般而言，本文所公开的程序制备区位异构体的混合物，所述区位异构体在吡唑并嘧啶环系统的1h或2h位置处烷基化(其亦分别称为n1及n2区位异构体，暗指烷基化的氮)。在图式中，为方便起见，有时未展示n2区位异构体，但应了解，其存在于初始产物混合物中且例如通过制备型hplc在稍后时间分离。

区位异构体的混合物可在合成的初期分离且剩余合成步骤用1h区位异构体进行，或者，可携带区位异构体的混合物进行合成且按需要在后期实现分离。

程序1-根据图1的化合物

此程序及随附图1说明制备本文所公开的化合物的方法，使用化合物800作为范例。

化合物3.用乙酸(8.11ml，142mmol)处理含4-氨基-1h-吡唑-5-甲酸甲酯2(4g，28.3mmol)及4-(2,3-双(甲氧羰基)胍基)-1h-吡唑-5-甲酸甲酯1的甲醇(50ml)，此时形成沉淀。将反应混合物搅拌隔夜。添加甲醇钠(64.8ml，283mmol)且继续搅拌隔夜。lcms显示反应完成。通过缓慢添加乙酸将ph值调节至5，由此形成沉淀，用水及随后乙腈洗涤且干燥，得到5.2g呈灰白色固体状的化合物3。lcmsesi:c7h7n5o3计算值＝210.16(m+h⁺),实测值210.0(m+h⁺)。

化合物4.用bop(5g，11mmol)缓慢处理含化合物3(2g，9.56mmol)、丁-1-胺(1.8ml，9mmol)及dbu(1.6ml，10mmol)的dmso(10ml)。在60℃下加热反应混合物2小时，此时lcms显示反应完成。在反相combiflash^tm设备上，使用80gc-18管柱，用0-100％乙腈/水(0.1％甲酸)洗脱来直接纯化反应物，得到呈白色固体状的化合物4。lcmsesi:c11h16n6o2计算值＝265.28(m+h⁺),实测值265.2(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.02(s,1h),3.97(s,3h),1.74-1.66(m,2h),1.49-1.38(m,2h),1.25(s,1h),0.95(t,j＝7.4hz,3h)。

化合物6.将4-(溴甲基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯5(1g，3.86mmol)及环丁胺5a(0.659ml，7.72mmol)于dmf(2ml)中的混合物在70℃下加热30分钟，此时lcms显示形成胺产物。蒸发过量碱且添加休尼格氏碱(hunig'sbase)(1.348ml，7.72mmol)，随后添加boc-酐(0.896ml，3.86mmol)。lcms显示反应完成。蒸发溶剂且粗产物通过combiflas^tm设备使用etoac/己烷纯化，得到0.82g呈无色油状的所要产物6。lcmsesi:c19h27no5计算值＝350.42(m+h⁺),实测值350.1(m+h⁺)。

化合物7.在0℃下将化合物6(0.82g，2.347mmol)于thf(5ml)中的溶液用lialh4(2m于thf中，1.173ml，2.347mmol)缓慢处理且搅拌30分钟，此时lcms显示反应完成。通过缓慢添加甲醇淬灭反应且与罗谢尔盐(rochellesalt)溶液一起搅拌2小时。分离有机层且粗产物7在combiflas^tm设备上使用etoac/己烷、硅胶管柱纯化。lcmsesi:c18h27no4计算值＝322.41(m+h⁺),实测值322.1(m+h⁺)。

化合物8及9.化合物4(100mg，0.378mmol)、化合物7(182mg，0.568mmol)及三苯基膦(248mg，0.946mmol)于thf(3ml)中的混合物经5分钟用diad(0.110ml，0.568mmol)缓慢处理且在室温下在n2下搅拌30分钟，此时lcms显示反应完成。蒸发溶剂且在反相combiflash^tm设备上使用80gc-18管柱用0-100％乙腈/水(1mmteaa)洗脱来纯化粗产物，得到呈白色固体状的化合物8与9的混合物。lcmsesi:c29h41n7o5计算值:566.69(m-h⁺),实测值566.3(m-h⁺)。

异构体通过手性超临界流体色谱使用以下条件进行分离：管柱：kromasil5-cellucoat，21×250mm，5微米，流动相：15％meoh-dea/85％co2，流动条件：45ml/min，150巴，40℃，检测器波长：230nm，注射细节：0.5ml，于meoh中约25mg/ml，得到17mg化合物8及25mg化合物9。

化合物8的分析数据：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.61(s,2h),7.86(s,2h),6.94(s,2h),6.83(s,2h),6.63(d,j＝7.9hz,2h),6.51(d,j＝7.5hz,2h),5.69(s,4h),4.39(s,4h),3.79(s,6h),3.63(s,6h),3.48(d,j＝6.2hz,4h),3.33(s,20h),3.18(d,j＝5.3hz,1h),2.05-1.95(m,8h),1.53(t,j＝7.5hz,7h),1.35(s,11h),1.23(q,j＝7.2hz,6h),0.86(t,j＝7.4hz,6h)。

化合物9的分析数据：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.37(s,1h),8.08(s,1h),6.90(s,1h),6.84(s,1h),6.71(d,j＝7.7hz,1h),5.48(s,2h),4.42(s,3h),3.78(d,j＝18.0hz,4h),3.69(s,1h),3.61(s,3h),3.51-3.42(m,3h),2.06-1.97(m,6h),1.61-1.47(m,6h),1.36(s,8h),1.34-1.26(m,6h),0.99(t,j＝7.1hz,3h),0.94-0.85(m,4h)。

化合物800.使化合物8(13mg，0.023mmol)的溶液溶解于thf(0.5ml)中且用tfa(0.018ml，0.229mmol)处理。30分钟内lcms展示boc保护基脱除。蒸发tfa且用氢氧化钠(9.16mg，0.229mmol)处理此混合物且在60℃下加热2小时，此时lcms显示反应完成。通过缓慢添加6mhcl来中和碱且用etoac/水处理。在hplc/ms条件a-2下经由制备型hplc纯化粗物质。

细节上作必要修改后，本发明的其他化合物可通过使用另一胺代替环丁胺5a类似地制备。

程序2-根据图2a-2b的化合物

此程序及随附图2a-2b说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物801及818作为范例。

化合物12及化合物13.用k2co3(2.90g，21.02mmol)及4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲酯11(5g，19.30mmol)处理4-硝基-1-吡唑-5-甲酸甲酯10(3.27g，19.11mmol)于dmf(20ml)中的溶液。在0℃下开始反应且可进行1小时，此时lcms显示反应完成，产物混合物约1:5。过滤碱且反应物用etoac稀释且用水洗涤2次。蒸发溶剂且使粗产物原样用于下一步骤。lcmsesi:c15h15n3o7计算值＝350.2(m-h⁺),实测值350.0(m-h⁺)。

出于表征目的，使用硅胶管柱色谱使用0-50％etoac/己烷分离少量产物混合物。

化合物12的分析数据：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.40(s,1h),7.57(dd,j＝7.8,1.5hz,1h),7.50(d,j＝1.6hz,1h),7.27(d,j＝7.9hz,1h),5.53(s,2h),3.96(s,3h),3.84(d,j＝16.2hz,6h)。

化合物13的分析数据：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.05(s,1h),7.62-7.51(m,2h),7.28(d,j＝7.9hz,1h),5.47(s,2h),3.87(s,8h),3.31(s,1h)。

化合物14及15.在室温下搅拌化合物12及13(2g，5.73mmol)、甲酸锌及甲酸铵的溶液2小时，其后lcms显示反应完成。过滤及浓缩得到化合物14及15的粗混合物。lcmsesi:c15h17n3o5计算值＝320.3(m+h⁺),实测值320.2(m+h⁺)。

化合物16及17.用乙酸(1.640ml，28.7mmol)处理化合物14及15(1.830g，5.73mmol)及化合物1于meoh(20ml)中的混合物且搅拌隔夜。将溶液用甲醇钠(13.11ml，57.3mmol)处理且搅拌隔夜。lcms显示转化为产物。将ph值调节至5且用水洗涤所得沉淀物。干燥残余物，得到化合物16及17的混合物。lcmsesi:c17h17n5o6计算值＝388.3(m+h⁺),实测值388.1(m+h⁺)。

化合物18及19.将化合物16及17(1g，2.58mmol)于dmso(10ml)中的混合物用丁-1-胺(0.510ml，5.16mmol)、dbu(0.428ml，2.84mmol)处理，随后缓慢用bop(1.370g，3.10mmol)处理。在70℃下加热反应2小时，此时lcms显示反应完成。用水稀释反应物且用etoac萃取。合并的有机相经na2so4干燥且原样用于下一步骤。lcmsesi:c21h26n6o5计算值＝443.4(m+h⁺),实测值:443.2(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.41(s,1h),8.20(s,1h),8.08(s,1h),7.57-7.42(m,3h),6.93(d,j＝8.1hz,1h),5.80(s,1h),5.60(s,2h),4.04(q,j＝7.1hz,1h),3.95-3.82(m,10h),3.62(d,j＝6.1hz,4h),3.45(q,j＝7.0hz,3h),2.68(d,j＝9.9hz,1h),2.57-2.50(m,6h),2.00(s,1h),1.59(p,j＝7.3hz,3h),1.54-1.48(m,1h),1.39-1.26(m,3h),1.18(t,j＝7.1hz,2h),0.86(dt,j＝29.5,7.3hz,5h)。

化合物818.在0℃下用lialh4(thf，2.58ml，5.16mmol)处理化合物18及19(1.142g，2.58mmol)于thf(2.58ml，5.16mmol)中的溶液且搅拌1小时，其后lcms显示反应完成。用meoh淬灭反应物且与罗谢尔盐溶液一起搅拌隔夜。产物用etoac萃取且以粗化合物经还原的中间物的混合物形式用于下一步骤中。lcmsesi:c20h26n6o4计算值＝415.4(m+h⁺),实测值415.2(m+h⁺)。

用氢氧化钠水溶液(2.58ml，25.8mmol)处理经还原的中间物(1069mg，2.58mmol)于1,4-二噁烷(10ml)中的混合物且在80℃下加热5小时，其后lcms显示产物形成。用6mhcl中和碱且蒸发溶剂。将残余物溶解于5mldmf中且针筒过滤。蒸发溶剂，得到化合物818与其区位异构体19a的3:1混合物。

化合物801及19b.用亚硫酰氯(0.172ml，2.357mmol)处理化合物818及19a(420mg，1.178mmol)于thf(1ml)中的溶液且搅拌30分钟，其后lcms显示反应完成。蒸发溶剂且粗苯甲基氯中间物原样用于下一步骤。lcmsesi:c18h23cln6o计算值＝375.8(m+h⁺),实测值375.2(m+h⁺)。

在70℃下加热前述粗产物混合物(20mg，0.053mmol)与四氢-2h-吡喃-4-胺22(5.40mg，0.053mmol)于dmf(1ml)中的混合物1小时，其后lcms显示反应完成。将反应物针筒过滤且纯化粗产物且经由制备型lc/ms在以下条件下分离：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有0.1％三氟乙酸的5:95乙腈:水；流动相b：具有0.1％三氟乙酸的95:5乙腈:水；梯度：在6％b下保持2分钟，6-27％b下经25分钟，接着在100％b下保持2分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥。

必要时，可在合成过程中，例如在化合物12及13的混合物中较早实现1h及2h区位异构体的分离且仅利用1h区位异构体进行合成步骤。

细节上作必要修改后，本发明的其他化合物可例如通过使用另一种胺代替四氢-2h-吡喃-4-胺22类似地制备。

程序3-根据图3a-3b的化合物

此程序及随附图3a-3b说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物844、817及861作为范例。

化合物24.向化合物16(400mg，1.033mmol)及(s)-3-氨基己-1-醇23(242mg，2.065mmol)于dmso(5ml)中的混合物中添加dbu(0.463ml，3.10mmol)，随后缓慢添加bop(502mg，1.136mmol)。在70℃下加热反应混合物2小时，此时lcms显示反应完成。反应混合物用etoac稀释且用水洗涤。浓缩有机层，留下粗产物，其用于下一步骤中。

用含叔丁基氯二苯硅烷(0.295ml，1.136mmol)及咪唑(141mg，2.065mmol)的dmf(5ml)处理粗产物。将反应混合物搅拌隔夜。用水稀释反应混合物且用etoac处理。使用etoac/己烷用combiflas^tm设备进行纯化，得到化合物24。lcmsesi:c38h48n6o6si计算值＝725.9(m+h⁺),实测值:725.3(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.53(s,1h),7.94(s,1h),7.57-7.50(m,2h),7.50-7.30(m,7h),7.25-7.14(m,3h),6.31(d,j＝7.9hz,1h),6.24(d,j＝8.4hz,1h),5.78(d,j＝17.2hz,2h),4.56(s,1h),3.92-3.82(m,4h),3.78(s,3h),3.59(s,3h),3.55-3.43(m,2h),3.31(s,2h),1.86-1.68(m,2h),1.47(q,j＝8.7,7.9hz,2h),1.18(t,j＝7.1hz,5h),0.91(s,9h)。

化合物25.化合物24(408mg，0.563mmol)于thf(5ml)中的溶液用lialh4(0.563ml，1.126mmol)缓慢处理且在0℃下搅拌反应物1小时，此时lcms显示反应完成。用meoh淬灭反应物且与罗谢尔盐溶液一起搅拌隔夜。用etoac萃取且用combiflas^tm设备、含0-50％meoh的dcm梯度纯化，得到化合物25。lcmsesi:c38h48n6o5si计算值:697.9(m+h+),实测值679.4(m+h+)。

化合物26.用亚硫酰氯(0.031ml，0.430mmol)缓慢处理化合物25(150mg，0.215mmol)于thf(0.5ml)中的溶液且搅拌1小时。lcms显示反应完成。蒸发溶剂且使粗产物26原样用于下一步骤。lcmsesi:c38h47cln6o4si计算值＝715.3(m+h⁺),实测值715.4(m+h⁺)。

化合物844.将化合物26(15mg)溶解于dmf(0.5ml)中且用1,2,3,4-四氢-2,6-啶27(5.78mg，0.043mmol)处理且在70℃下加热2小时，其后lcms显示反应完成。将中间产物的溶液(0.018g，0.022mmol)溶解于二噁烷(0.5ml)中且用三乙胺三氢氟酸盐(0.018ml，0.110mmol)处理。在室温下搅拌隔夜之后，lcms显示移除tbdps保护基。中和至ph7，蒸发溶剂且在反相isco上使用teaa作为改质剂纯化，得到脱除保护基的中间物产物。

将来自上文的脱除保护基的中间物产物溶解于二噁烷(0.5ml)中，用氢氧化钠(0.220ml，0.220mmol)处理且在80℃下加热2小时。lcms显示反应完成。用hcl水溶液将反应混合物中和至ph7且蒸发溶剂。将残余物溶解于dmf中且进行针筒过滤且通过制备型lc/ms使用以下条件纯化：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有10mm乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相b：具有10mm乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：保持在15％b下0分钟，15-55％b下经20分钟，接着在100％b下保持4分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所要产物的洗脱份，且经由离心蒸发干燥，得到化合物844(4.7mg，40％产率)。

化合物817.一般遵循以上程序用三甲胺三氢氟酸盐及随后氢氧化钠处理化合物25，得到化合物817。

图3b展示图3a的流程的变化形式，其中在制备化合物26之后的步骤变化。图3b的流程通过特定提及化合物861来说明。

化合物26b.在室温下将化合物26(22mg，0.031mmol)溶解于dmf(0.6ml)中且用diea(27μl，0.15mmol)及呈盐酸盐形式的3-甲氧基氮杂环丁烷(26a)(11mg，0.093mmol)处理。在70℃下搅拌2小时之后，在真空中浓缩反应混合物，得到化合物26b，其未经进一步纯化即使用。lc/ms条件b:lcrt:0.88min。lcms(m+h)＝766.9。

化合物861.在室温下用naoh(10m水溶液，0.1ml，1.0mmol)处理化合物26a(24mg，0.031mmol)于二噁烷(0.3ml)中的溶液且反应物在70℃下加热60分钟，随后添加另一份naoh(10m水溶液，0.1ml，1.0mmol)。在2小时之后，在真空中浓缩反应混合物。用meoh(0.3ml)及hcl(37％水溶液，0.3ml，3.7mmol)处理残余物，在室温下搅拌30分钟且浓缩。将粗产物溶解于dmf中，经由ptfe玻璃料过滤，且经由制备型hplc条件a-1纯化。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到呈其tfa盐形式的化合物861(8.4mg，46％)。lc/ms条件c:lcrt:0.82min。lcms(m+h)＝470.3。

细节上作必要修改后，本发明的其他化合物可例如通过使用除图3a-3b中所示的胺以外的胺类似地制备。

程序4-根据图4a-4b的化合物

此程序及随附图4a-4b说明制造本文所公开的化合物的另一方法。

化合物30.将化合物4(400mg，1.513mmol)于二噁烷(5ml)中的悬浮液用氢氧化钠(10n于水中，1.513ml，15.13mmol)处理且在60℃下搅拌45分钟。将反应混合物浓缩。将粗产物溶解于水中且通过在combiflash^tm单元上使用150gc-18管柱的反相色谱法，用含10mmteaa的乙腈:10mm于水中、0-70％梯度洗脱来纯化。冷冻且冻干所需洗脱份，得到化合物30(150mg，0.727mmol，48.1％产率)。lcmsesi:c9h15n6计算值＝207.1(m+h⁺),实测值207.2(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.56(brs,1h),5.53(brs,2h),3.43(brd,j＝6.2hz,2h),1.57(t,j＝7.2hz,2h),1.44-1.29(m,2h),0.95-0.76(m,3h)。

化合物33.将6-氟烟碱醛31(1.809g，14.46mmol)、4-羟基苯甲酸甲酯32(2g，13.15mmol)及k2co3(1.998g，14.46mmol)于dmf(26.3ml)中的悬浮液在110℃下搅拌4小时。lcms指示反应完成。冷却后，用水淬灭反应物。通过过滤收集所得固体且用水冲洗且真空干燥，得到化合物33(3.30g，12.84mmol，95.1％产率)。lcmsesi:c14h11no4计算值＝258.1(m+h⁺),实测值258.0(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,氯仿-d)δ10.01(s,1h),8.63(d,j＝2.4hz,1h),8.23(dd,j＝8.6,2.4hz,1h),8.17-7.97(m,2h),7.27-7.22(m,2h),7.10(d,j＝8.6hz,1h),3.93(s,3h)。

化合物34.在0℃下用nabh4(0.553g，14.62mmol)逐份处理化合物33(3.76g，14.62mmol)于meoh(100ml)中的溶液，且随后在继续冷却下搅拌10分钟。lcms指示反应完成。通过缓慢添加半饱和nh4cl来淬灭反应。在室温下继续搅拌30分钟。用乙酸乙酯萃取反应混合物。有机萃取物经na2so4干燥，过滤且浓缩。将粗制固体加入水中制成浆液，且通过过滤来收集且在真空中干燥，得到化合物34(3.37g，13.00mmol，89％产率)。lcmsesi:c14h13no4计算值＝260.1(m+h⁺),实测值260.0(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,氯仿-d)δ8.21(d,j＝2.2hz,1h),8.12-8.04(m,2h),7.81(dd,j＝8.4,2.4hz,1h),7.21-7.13(m,2h),6.99(d,j＝8.4hz,1h),4.71(s,2h),3.91(s,3h)。

化合物35.在0℃下用mscl(2.61ml，33.5mmol)处理含化合物34(7.9g，30.5mmol)的dcm(75ml)。在室温下搅拌16小时之后反应完成。用水淬灭反应物。在用dcm(3×20ml)萃取之后，合并的有机萃取物经na2so4干燥，过滤且浓缩。在isco二氧化硅管柱(80g)上，用乙酸乙酯:己烷、0-70％梯度洗脱来纯化粗产物。浓缩所需洗脱份，得到化合物35(7.47g，26.9mmol，产率88％)。lcmsesi:c14h13clno3计算值＝278.1(m+h⁺),实测值278.0(m+h⁺)。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ8.19(d,j＝2.2hz,1h),8.13-8.02(m,2h),7.79(dd,j＝8.5,2.5hz,1h),7.22-7.14(m,2h),6.99(d,j＝8.6hz,1h),4.57(s,2h),3.92(s,3h)。

化合物36及化合物37.将含化合物30(70mg，0.339mmol)的dmf(1ml)相继用碳酸铯(332mg，1.018mmol)及化合物35(94mg，0.339mmol)处理。在室温下搅拌5小时之后，反应完成。在用水淬灭且用乙酸乙酯(3×10ml)萃取之后，合并的有机萃取物经na2so4干燥，过滤且浓缩。在isco二氧化硅管柱(24g)上，用含20％meoh的dcm:dcm、0-60％梯度洗脱来纯化粗产物。浓缩所需洗脱份，得到1:4比率的化合物36及37的混合物(120mg，0.080mmol，79％产率)。lcmsesi:c23h26n7o3计算值＝448.2(m+h⁺),实测值448.3(m+h⁺)。

化合物37a及37b.在0℃下在n2下用lialh4(1.0m于thf中，0.22ml，0.22mmol)缓慢处理化合物36及37(60mg，0.114mmol)于thf(2ml)中的混合物。在0℃下搅拌反应混合物1小时，此时lcms显示反应完成。通过缓慢添加na2so4·10h2o，随后添加meoh且在室温下搅拌3小时来淬灭反应物。滤出固体。浓缩滤液。将残余物溶解于dmf中且经由制备型lc/ms在以下条件下纯化产物：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有0.1％三氟乙酸的5:95乙腈:水；流动相b：具有0.1％三氟乙酸的95:5乙腈:水；梯度：在10％b下保持0分钟，10-45％b下经20分钟，接着在100％b下保持4分钟；流动速率：20ml/min。通过ms及uv信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥。

化合物38a及38b.用亚硫酰氯(0.14ml，1.9mmol)处理化合物37a及化合物37b(40mg，0.095mmol)于thf(1ml)中的混合物。在室温下搅拌3小时后，lcms显示反应完成。蒸发溶剂且用dcm共沸移除过量亚硫酰氯。粗氯化物物质未经进一步纯化即直接用于下一步骤。lcmsesi:c22h25n7o计算值＝438.2(m+h⁺),实测值438.1(m+h⁺)。

将先前段落之前述氯化物(40mg，0.091mmol)的混合物溶解于dmf(1.0ml)中且用2-氨基乙-1-醇(55.0μl，0.91mmol)处理，随后在室温下搅拌16小时。lcms显示反应完成。混合物经由制备型lc/ms以如下条件纯化：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有10mm乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相b：具有10mm乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：在8％b下保持0分钟，8-48％b经25分钟，接着在100％b下保持4分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥。

在图4a-4b的流程中用4-氟-2-甲氧基苯甲醛替换6-氟烟碱醛31且一般遵循以上程序，可制备本发明的其他化合物，例如：802、803、808、809及810。

程序5-根据图5的化合物

此程序及随附图5涉及(s)-n-(3-氨基己基)乙酰胺54的合成，其可用作合成本文所公开的化合物的中间物。

化合物51.将(s)-3-氨基己-1-醇50(1g，8.53mmol)于dcm(10ml)中的溶液用休尼格氏碱(4.47ml，25.6mmol)及boc酐(2.377ml，10.24mmol)处理且搅拌3小时，其后lcms显示反应完成。在真空中脱去溶剂及碱。粗产物在具有n2检测器的isco机上使用80g硅胶金管柱，使用0-100％etoac/己烷纯化，得到具有所需产物的洗脱份，将其合并且浓缩，得到化合物51(1.05g，56.6％产率)。lcmsesi:c11h23no3计算值＝218.3(m+h⁺),实测值218.2。¹hnmr(400mhz,氯仿-d)δ3.76(s,1h),3.63(dd,j＝7.6,3.0hz,2h),1.90-1.77(m,1h),1.46-1.44(m,10h),1.44-1.17(m,4h),1.00-0.81(m,5h)。

化合物52.向化合物51(1050mg，4.83mmol)、三苯膦(1648mg，6.28mmol)及异吲哚啉1,3-二酮(924mg，6.28mmol)于thf(10ml)中的溶液中缓慢添加diad(1.221ml，6.28mmol)。在室温下搅拌隔夜之后，lcms显示反应完成。在旋转式蒸发器中脱去溶剂且在isco机上使用80g金硅质管柱用0-50％etoac/己烷洗脱来纯化，得到具有干燥产物的洗脱份，其经浓缩，提供呈淡黄色固体状的化合物52(1.6g，96％产率)。lcmsesi:c19h26no4计算值＝347.4(m+h⁺),实测值247.2(m-boc+h⁺)。δ7.83(dd,j＝5.4,3.1hz,2h),7.70(dd,j＝5.5,3.0hz,2h),4.40(s,1h),3.75(dd,j＝8.4,7.0hz,2h),3.64(s,1h),1.69(dq,j＝15.8,7.9hz,1h),1.52-1.44(m,2h),1.42(s,9h),1.39-1.28(m,3h),0.91(t,j＝7.1hz,3h)。

化合物53.用含甲胺的meoh(15.59g，92mmol)处理化合物52(1.6g，4.62mmol)。搅拌反应混合物1小时，其后lcms显示脱除邻苯二甲酰亚胺保护基。蒸发溶剂及碱且将残余物溶解于thf(5ml)中且相继用休尼格氏碱(1.613ml，9.24mmol)及乙酰氯(0.394ml，5.54mmol)处理。反应混合物在室温下搅拌1小时且蒸发溶剂。粗产物在反相isco上使用80gc-18管柱用0-95％乙腈/水(0.05％甲酸)洗脱来纯化，得到具有所要产物的洗脱份，其经冻干，得到呈淡黄色糊状的化合物53(0.8g)。lcmsesi:c13h26n2o3计算值＝259.3(m+h⁺),实测值159.1(m-boc+h⁺)。δ6.65(s,2h),4.30(d,j＝9.4hz,2h),3.75-3.67(m,2h),3.60(s,2h),2.84(t,j＝12.7hz,2h),2.00(s,3h),1.75(dddd,j＝14.1,10.7,5.3,3.6hz,1h),1.44-1.24(m,9h),0.91(t,j＝6.8hz,3h)。

化合物54.用tfa(4.7ml，61.9mmol)处理化合物53(0.8g，3.10mmol)。30分钟后的lcms显示反应完成。蒸发tfa。在冻干器中干燥残余物隔夜，得到呈淡黄色糊状的化合物54(322mg，65.7％产率)。lcmsesi:c8h18n2o计算值:159.2(m+h⁺),实测值159.1(m+h⁺)。δ8.08(s,2h),6.71(s,1h),3.49(s,1h),3.38-3.32(m,2h),3.30(s,1h),3.18(d,j＝9.7hz,1h),2.04(s,3h),1.96-1.83(m,2h),1.67(ddq,j＝36.7,14.4,7.5,7.0hz,1h),1.40(dq,j＝15.6,7.7hz,1h),0.94(t,j＝7.3hz,3h)。

化合物54可用于制备诸如846及847的化合物，通常根据程序3及图3a-3b，使用化合物16。

程序6-根据图6a-6b的化合物

此程序及随附图6a-6b说明制备本文中所公开的化合物的另一方法，使用化合物857作为范例。

化合物55.向化合物30(1.50g，7.27mmol)于dmf(25ml)中的悬浮液中分三部分添加nbs(1.29g，7.27mmol)(颜色自红色变成淡黄色)。在室温下搅拌10分钟后，lcms指示反应完成。将混合物倒于少部分冰上且搅拌16小时。通过过滤收集所得固体且在高真空中干燥，得到化合物55(1.96g，6.9mmol，95％产率)。

化合物57.在105℃下搅拌4-氟-2-甲氧基苯甲醛56(1.5g，9.73mmol)、4-羟基苯甲酸甲酯32(1.777g，11.68mmol)及k2co3(2.69g，19.46mmol)于dmf(19.46ml)中的悬浮液三天，lcms指示反应完成。其用水淬灭。通过过滤收集所得乳脂状有色固体的沉淀且在真空中干燥，得到化合物57(2.6g，9.08mmol，产率93％)。lcmsesi:c16h15o5计算值＝287.1(m+h⁺),实测值287.1(m+h⁺-18)。

化合物58.向化合物57(2.6g，9.08mmol)于meoh(25ml)中的搅拌悬浮液中逐份添加nabh4(0.344g，9.08mmol)。反应混合物变得澄清。在1小时之后，反应完成。将反应混合物浓缩至一半体积。添加水，随后搅拌30分钟。通过过滤收集所得固体且风干，得到呈白色固体状的化合物58(2.50g，8.67mmol，产率95％)，其纯度足够用于下一步骤中。lcmsesi:c16h17o5计算值＝289.1(m+h⁺),实测值271.1(m+h⁺-18)。

化合物59.在搅拌下，用socl2(0.924ml，12.66mmol)处理含化合物58(730mg，2.53mmol)的thf(10ml)。在室温下继续搅拌16小时。在旋转式蒸发器上浓缩，得到化合物59。用dcm(3×)共沸移除额外socl2。所得固体纯度足够用于进行下一步骤而无需进一步纯化。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.07-7.83(m,2h),7.46(d,j＝8.1hz,1h),7.16-7.01(m,2h),6.87(d,j＝2.2hz,1h),6.66(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),4.73(s,2h),3.84(d,j＝5.3hz,6h)。

化合物60.向化合物55(300mg，1.052mmol)于dmf(1ml)中的搅拌混合物中添加化合物59(323mg，1.052mmol)。在室温下搅拌3小时后，未检测到起始物质59。反应混合物用盐水淬灭，用dcm(3×20ml)萃取。合并的有机萃取物经na2so4干燥且浓缩。浓缩滤液。粗混合物通过isco二氧化硅管柱(40g)，用etoac/己烷＝0-100％洗脱来纯化。浓缩所需洗脱份，得到化合物60(166mg，0.299mmol，28.4％产率)。lcmsesi:c22h28brn6o4计算值＝555.1、557.1(m+h⁺),实测值555.2、557.2(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.96(d,j＝8.8hz,2h),7.55-7.55(m,1h),7.12-6.98(m,2h),6.87(d,j＝2.2hz,1h),6.76(t,j＝5.4hz,1h),6.71(d,j＝8.1hz,1h),6.62(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),5.97(s,2h),5.62(s,2h),3.83(s,3h),3.79(s,3h),3.50-3.39(m,2h),1.59-1.46(m,2h),1.31-1.21(m,2h),0.87(t,j＝7.4hz,3h)。

化合物61.在室温下在氮气下向经搅拌的化合物60(160mg，0.288mmol)于thf(10ml)中的混合物中添加lialh4(2.5m于thf中)(10.93mg，0.288mmol)。10分钟后，lcms指示反应完成。反应混合物小心地用罗谢尔盐溶液淬灭，且在室温下搅拌18小时。分离有机层且进一步用乙酸乙酯(2×50ml)萃取水层。合并的有机萃取物经na2so4干燥且浓缩。浓缩滤液，得到化合物61(140mg，0.265mmol，92.2％产率)。lcmsesi:c24h28brn6o3计算值:527.1、529.1(m+h⁺),实测值527.2、529.2(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.32(d,j＝8.6hz,2h),6.96(d,j＝8.6hz,2h),6.77-6.65(m,3h),6.43(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),5.95(s,2h),5.57(s,2h),5.15(t,j＝5.6hz,1h),4.47(d,j＝5.7hz,2h),3.76(s,3h),3.45(brd,j＝5.7hz,2h),1.53(t,j＝7.2hz,2h),1.31-1.20(m,2h),0.88(t,j＝7.4hz,3h)。

化合物62.用n2吹扫化合物61(165mg，0.313mmol)于meoh(10ml)及乙酸乙酯(3ml)中的悬浮液。添加pd-c5％(40mg，0.019mmol)，用h2吹扫，且在h2气球下搅拌18小时。随后通过经垫过滤来移除催化剂。浓缩滤液，得到化合物62(157mg，0.350mmol，112％产率)。lcmsesi:c24h29n6o3计算值＝449.2(m+h⁺),实测值449.3(m+h⁺)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.13(brd,j＝4.0hz,1h),7.75(s,1h),7.61(brs,2h),7.33(d,j＝8.6hz,2h),6.97(d,j＝8.6hz,2h),6.83(d,j＝8.6hz,1h),6.74(d,j＝2.2hz,1h),6.42(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),5.68(s,2h),5.26-5.03(m,1h),4.48(d,j＝5.3hz,2h),3.73(s,3h),3.58(brd,j＝6.2hz,2h),1.59(brt,j＝7.3hz,2h),1.35-1.18(m,2h),0.90(t,j＝7.4hz,3h)。

化合物857.用socl2(0.081ml，1.115mmol)处理化合物62(100mg，0.223mmol)于thf(4ml)中的悬浮液，随后在室温下搅拌1小时。反应混合物接着经旋转式蒸发器浓缩。用dcm共沸移除过量socl2(3×)，所得固体纯度足够用于下一步骤中。lcmsesi:c24h28cln6o2计算值＝467.2(m+h⁺),实测值467.2(m+h⁺)。将所得固体(20mg，0.043mmol)溶解于dmf(0.5ml)中。将1-氨基-2-甲基丙-2-醇(19.09mg，0.214mmol)添加至反应混合物中且在室温下搅拌溶液16小时。反应混合物经针筒过滤且粗物质经由制备型lc/ms用以下条件纯化：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有0.1％三氟乙酸的5:95乙腈:水；流动相b：具有0.1％三氟乙酸的95:5乙腈:水；梯度：在19％b下保持0分钟，在19-59％下经20分钟，接着在100％b下保持0分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。通过ms及uv信号触发洗脱份收集。合并含有所要产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到呈tfa盐形式的化合物857(6.9mg，10.63μmol，24.81％产率)。

可使用此程序6及先前程序4来制造类似化合物。已观测到，3-溴化合物55的烷基化相较于程序4中的对应化合物36的烷基化产生更高比例的1h区位异构体(图6a中未展示2h区位异构体)。因此，在1h区位异构体为更需要的区位异构体的情况下，此程序6可为优选的程序，即使其需要额外溴化及去溴化步骤。下表b列举通过程序4或6制得之一些化合物。此外，3-溴化合物55可为其他合成路径中的中间物，如下文中的程序中所显示。

程序7-根据图7的化合物

此程序及随附图7说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物864作为范例。

化合物64.使化合物16(48.5mg，0.125mmol)于thf(1.8ml)中的溶液冷却至0℃且用lialh4(1m于thf中，219μl，0.219mmol)处理。在10分钟之后，添加另一份lialh4(1m于thf中，200μl，0.200mmol)且在0℃下再搅拌反应物20分钟。将反应混合物用meoh及罗谢尔盐(饱和水溶液)淬灭，且在室温下搅拌30分钟。用etoac(3×)萃取混合物。合并的有机层用h2o洗涤，经na2so4干燥，过滤且真空浓缩，得到化合物64(38mg，84％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.60-11.12(m,2h),7.85-7.83(m,1h),6.97(s,1h),6.77(d,j＝8.0hz,1h),6.59(d,j＝7.7hz,1h),5.66(s,2h),5.15(t,j＝5.7hz,1h),4.44(d,j＝5.6hz,2h),3.79(s,3h),3.74(s,3h)。lc/ms条件b：lcrt：0.61min。lcms(m+h)＝360.1。

化合物65.用亚硫酰氯(1.6ml，22mmol)处理化合物64(402mg，1.12mmol)于dcm(15ml)中的溶液。15分钟后，在真空中浓缩反应混合物。将残余物再溶解于dcm中且再次真空浓缩，得到化合物65(422mg，100％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.25-11.02(m,1h),7.89-7.88(m,1h),7.11(d,j＝1.5hz,1h),6.92(dd,j＝7.8,1.5hz,1h),6.62(d,j＝7.7hz,1h),5.69(s,2h),4.72(s,2h),3.82(s,3h),3.75(s,3h)。有一个质子不可见，可能归因于与水峰或质子交换重叠。lc/ms条件b：lcrt：0.80min。lcms(m+h)＝378.0。

化合物66.用化合物65(249mg，0.659mmol)于thf(8ml)中的溶液处理环丁胺5a(0.84ml，9.9mmol)于thf(11ml)中的溶液。反应混合物在60℃下搅拌16小时，且随后在真空中浓缩。将残余物溶解于dcm/meoh中，吸收于上且经由管柱色谱(50gc18金管柱；流动相a：具有0.1％三氟乙酸的10:90甲醇:水；流动相b：具有0.1％三氟乙酸的90:10甲醇:水；流动速率：40ml/min)纯化，得到呈tfa盐形式的化合物66(168mg，48％产率)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.55(brs,1h),11.18-11.12(m,1h),9.04-8.93(m,2h),7.91-7.89(m,1h),7.19(d,j＝1.4hz,1h),6.95(dd,j＝7.7,1.3hz,1h),6.68(d,j＝7.7hz,1h),5.71(s,2h),4.02-3.97(m,2h),3.85(s,3h),3.76(s,3h),3.72-3.63(m,1h),2.20-2.10(m,4h),1.85-1.72(m,2h)。lc/ms条件b：lcrt：0.63min。lcms(m+h)＝413.3。

化合物864.化合物66(15mg，0.036mmol)于dmf(1ml)中的溶液用bop(161mg，0.364mmol)、2-乙氧基乙-1-胺6a(32.4mg，0.364mmol)及dbu(73μl，0.49mmol)处理且在室温下搅拌18小时。在氮气流下浓缩反应混合物。粗产物67于二噁烷(0.5ml)中的溶液用naoh(10m水溶液，0.05ml，0.5mmol)处理且加热至75℃。在1小时之后，用hoac(0.03ml，0.5mmol)中和反应混合物且在氮气流下浓缩。将残余物溶解于dmf中，经由ptfe玻璃料过滤，且粗物质经由制备型lc/ms用以下条件纯化：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有10mm乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相b：具有10mm乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：在3％b下保持0分钟，3-43％b下经25分钟，接着在100％b下保持0分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到化合物864(7.3mg，48％产率)。lc/ms条件c：lcrt：0.8min。lcms(m+h)＝426.17。

根据此程序，在细节上作必要修改后，可制得其他根据本发明化合物。

程序8-根据图8的化合物

此程序及随附图8说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物866作为范例。

化合物70.用化合物69(321mg，1.01mmol)处理化合物68(307mg，0.922mmol)于乙腈(0.9ml)中的溶液且在室温下搅拌72小时。接着将反应混合物加热至60℃，持续4小时，再冷却至室温且过滤。用乙腈冲洗所收集的固体且在真空中干燥。真空浓缩滤液且通过管柱色谱(12gsio2，0-30％etoac-己烷，梯度洗脱)纯化残余物，得到白色固体，将其与通过过滤分离的固体组合，得到化合物70(392mg，74％)。lc/ms条件b：lcrt：1.21min。lcms(m+h)＝576.9。

化合物71.化合物70(144mg，0.251mmol)于meoh(1.2ml)中的溶液用naome(81mg，1.5mmol)处理且在室温下搅拌。96小时后，将反应混合物用h2o稀释且用etoac(3×)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，过滤且真空浓缩，得到化合物71(108mg，100％产率)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.62-11.59(m,1h),10.85-10.82(m,1h),7.91(s,1h),7.51(d,j＝1.4hz,1h),7.47(dd,j＝7.9,1.4hz,1h),6.69(d,j＝7.9hz,1h),5.75(s,2h),3.89(s,3h),3.84(s,3h),1.50(s,9h)。lc/ms条件b：lcrt：0.89min。lcms(m+h)＝430.6。

化合物72.化合物71(294mg，0.685mmol)于dmso(3.4ml)中的溶液用(s)-1-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)己-3-胺(71a)盐酸盐(322mg，0.822mmol)、bop(364mg，0.822mmol)及dbu(516μl，3.43mmol)处理且在室温下搅拌。3小时后，将反应混合物用etoac稀释且用h2o洗涤。真空浓缩有机层且经由管柱色谱(24gsio2；0-25％etoac-dcm，梯度洗脱)纯化残余物，得到化合物72(227.8mg，43％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.00-8.93(m,1h),7.92(s,1h),7.53(dd,j＝8.0,1.4hz,2h),7.46(s,2h),7.44(d,j＝1.3hz,1h),7.42-7.37(m,1h),7.37-7.31(m,3h),7.24-7.20(m,2h),7.20-7.16(m,1h),6.28(d,j＝7.9hz,1h),6.20(d,j＝8.5hz,1h),5.83-5.72(m,2h),4.60-4.46(m,1h),3.85(s,3h),3.76(s,3h),3.55-3.43(m,2h),1.83-1.73(m,1h),1.73-1.65(m,1h),1.46(brd,j＝13.6hz,2h),1.41(s,9h),1.15-1.04(m,2h),0.91(s,9h),0.74(t,j＝7.3hz,3h)。lc/ms条件b：lcrt：1.07min。lcms(m+h)＝767.4。

化合物73.使甲酯72(227mg，0.297mmol)于thf(4.2ml)中的溶液冷却至0℃且用lialh4(1m于thf中，327μl，0.327mmol)处理。在10分钟之后，添加额外lialh4(1m于thf中，150μl，0.150mmol)。在30分钟之后，用meoh及罗谢尔盐(饱和水溶液)淬灭反应物且在室温下搅拌30分钟。用etoac(3×)萃取混合物。经合并的有机层用h2o洗涤且真空浓缩。经由管柱色谱(12gsio2；0-100％uetoac-己烷，梯度洗脱)纯化残余物，得到化合物73(91.5mg，42％)。lc/ms条件b：lcrt：1.02min。lcms(m+h)＝739.7。

化合物74.用亚硫酰氯(45μl，0.61mmol)处理化合物73(91.5mg，0.124mmol)于thf(1.2ml)中的溶液且在室温下搅拌。在15分钟之后，真空浓缩反应混合物，将残余物再溶解于dcm中且真空浓缩，得到化合物74(94mg，100％)。lc/ms条件b：lcrt：1.09min。lcms(m+h)＝757.3。

化合物75.化合物74(20mg，0.027mmol)于dmf(0.5ml)中的溶液用diea(70μl，0.40mmol)及3-(叔丁基)环丁-1-胺74a(34.1mg，0.268mmol)处理且加热至70℃，持续1小时。使反应混合物冷却至室温且在真空中浓缩。将残余物溶解于etoac中且用nahco3饱和水溶液洗涤。在真空中浓缩有机层，得到化合物75(22mg，97％)，其未经进一步纯化即使用。lc/ms条件b：lcrt：0.95min。lcms(m+h)＝848.6。

化合物866.用hcl(37％水溶液，0.3ml，3.7mmol)处理化合物75(25mg，0.029mmol)于meoh(0.6ml)中的溶液且在室温下搅拌6小时。反应混合物用nahco3中和且用dcm(3×)萃取。真空浓缩经合并的有机层。将残余物再溶解于dmf中且经由ptfe过滤器过滤。经由制备型hplc/ms条件a-1纯化粗产物：通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到化合物866(3.3mg，产率22％)。lc/ms条件c：lcrt＝1.23min。lcms(m+h)＝510.23。

细节上作必要修改后，根据本发明的额外化合物可根据此程序制得。

程序9-根据图9的化合物

此程序及随附图9说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物853及870作为范例。

化合物76.在冰浴中冷却化合物55(400mg，1.40mmol)及碳酸铯(914mg，2.8mmol)于dmf/乙腈(5ml/5ml)中的溶液。添加4-(溴甲基)-3-氟苯甲酸甲酯55a(277mg，1.12mmol)于乙腈(5ml)中的溶液，且在0℃下搅拌反应物30分钟，随后在室温下再搅拌一小时。自反应混合物蒸发乙腈且使用反相快速色谱(100g管柱，10％至60％mecn/含有0.05％tfa的水)纯化，得到呈固体状的化合物76(482mg，1.07mmol，35％纯度(混杂有n2区位异构体，27％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]⁺＝451.1,453.2。

化合物77.将化合物76(470mg，1.04mmol，35％纯度(混杂有n2区位异构体)溶解于乙醇(50ml)中。添加10％pd/c(20mg)，且抽空反应物且用氢气吹扫六次，随后在氢气氛围下搅拌90分钟。反应混合物经过滤，用etoh(100ml)洗涤且蒸发至干燥，得到呈固体状的化合物77(370mg，0.99mmol，35％纯度(混杂有n2区位异构体)，95％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]⁺＝373.3。

化合物78.在冰浴中冷却经搅拌的化合物77(370mg，0.99mmol，35％纯度，混杂有n2区位异构体)于thf(100ml)中的悬浮液。历经5分钟逐份添加lialh4(754mg，1.98mmol)，且在0℃下搅拌反应物20分钟。添加naoh(1n，50ml)，且在室温下搅拌反应物10分钟，转移至分液漏斗中且用etoac(3×40ml)萃取。合并的有机相用盐水(3×30ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤且浓缩。快速色谱(40g管柱，0-25％meoh/dcm)产生呈固体状的化合物78(74mg，0.215mmol，21.63％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]⁺＝345.3。

化合物853.向20ml闪烁瓶中装入化合物78(25mg，0.073mmol)及thf(4ml)。添加3滴亚硫酰氯，且搅拌反应混合物1小时。将反应混合物蒸发至干燥且将残余物溶解于乙腈(5ml)中且蒸发两次。将残余物溶解于dmf(1.5ml)中。添加环丁胺(20.7mg，0.29mmol)，且在室温下搅拌反应混合物隔夜。过滤反应混合物且经由制备型hplc/ms条件a-1纯化：通过ms及uv信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到化合物853(19.5mg，0.03mmol，42％产率)。

化合物870.向20ml闪烁瓶中装入化合物78(50mg，0.15mmol)及thf(4ml)。添加3滴亚硫酰氯，且搅拌反应混合物1小时。将反应混合物蒸发至干燥。将残余物溶解于乙腈(5ml)中且蒸发两次。将残余物溶解于dmf(2ml)中。添加2-(哌嗪-1-基)乙-1-醇(38mg，0.29mmol)，随后添加dipea(0.10ml，0.58mmol)，且在50℃下搅拌反应混合物1小时。冷却后，过滤反应混合物且经由制备型hplc/ms条件a-1纯化：通过ms及uv信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到化合物870(41mg，0.06mmol，产率42％)。

细节上作必要修改后，根据本发明的额外化合物可根据此程序制得。

程序10-根据图10的化合物

此程序及随附图10说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物873作为范例。

化合物80.向40ml闪烁瓶中装入化合物79(250mg，1.55mmol)、nbs(331mg，1.86mmol)、aibn(50.9mg，0.31mmol)及ccl4(5ml)。在70℃下搅拌反应混合物2小时。在冷却之后，将反应混合物蒸发至干燥。快速色谱(24g管柱，0-40％etoac/己烷)得到呈固体状的化合物80(189mg，0.787mmol，51％产率)。lc-ms(es，m/z):未检测到离子。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.33(d,j＝7.7hz,1h),6.88(d,j＝7.7hz,1h),6.84(s,1h),4.53(s,2h),3.92(s,3h),3.74(s,2h)。

化合物81.向经搅拌的(7-(丁氨基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯(6g，22.7mmol)于dmf(10ml)中的悬浮液中添加nbs(4.44g，25.0mmol)于乙腈(20ml)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物1小时。添加水(50ml)。过滤反应混合物。用水(3×30ml)洗涤残余物且风干隔夜，得到呈固体状的化合物81(5.112g，14.9mmol，66％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]⁺＝343.0,345.0。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.87(brs,1h),9.80(s,1h),7.56(brs,1h),3.62(s,3h),3.54(q,j＝6.6hz,2h),1.62(quin,j＝7.2hz,2h),1.40(dq,j＝14.8,7.4hz,2h),0.94(t,j＝7.4hz,3h)。

化合物82.将化合物81(1g，2.91mmol)溶解于dmf(10ml)中且在冰浴中冷却。添加碳酸铯(1.899g，5.83mmol)，随后添加化合物80(0.560g，2.33mmol)。在室温下搅拌反应混合物5小时且接着倒入饱和nahco3溶液(50ml)中且用etoac(3×40ml)萃取。合并的有机相用盐水(4×40ml)洗涤，干燥(mgso4)，过滤且浓缩。快速色谱(40g管柱，0至85％etoac/己烷)得到呈固体状的化合物82(219mg，0.44mmol，15％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]⁺502.2,504.2。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.25-7.19(m,1h),6.98(s,1h),6.97-6.91(m,1h),5.70(s,2h),5.28(s,1h),3.98(s,3h),3.84(s,3h),3.78-3.60(m,4h),1.72-1.41(m,2h),1.41-1.20(m,2h),0.94(t,j＝7.3hz,3h)。

化合物83.将化合物82(219mg，0.44mmol)溶解于etoh(10ml)中且添加10％pd/c(20mg)。将反应容器抽空且用h2吹扫六次，随后在h2氛围下搅拌2小时。过滤反应混合物且蒸发至干燥，得到呈固体状的化合物83(188mg，0.44mmol，100％产率)。lc-ms(es,m/z):[m+h]⁺424.4。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.71(brs,1h),8.67(brs,1h),8.04(s,1h),7.05(s,1h),6.89(s,2h),5.77(s,2h),4.01(s,2h),3.83(s,3h),3.76(s,3h),3.69-3.58(m,2h),1.72-1.48(m,2h),1.41-1.17(m,2h),0.90(t,j＝7.4hz,3h)。

化合物873.将化合物83(25mg，0.059mmol)溶解于二噁烷(2ml)中；添加氢氧化钠(0.354ml，1.77mmol)。在80℃下搅拌反应混合物3小时。在冷却之后，反应物用5nhcl中和，随后蒸发至干燥。将残余物溶解于dmf(2ml)中，过滤且经由制备型hplc/ms条件a-2纯化：通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到化合物873(6.2mg，0.013mmol，22％)。

细节上作必要修改后，根据本发明的额外化合物可根据此程序制得。

程序11-根据图11的化合物

此程序及随附图11说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物855作为范例。

化合物85.向5-甲氧基-6-甲基烟碱酸甲酯84(300mg，1656μmol)及nbs(413mg，2318μmol)于ccl4(3ml)中的溶液中添加aibn(54.4mg，331μmol)。在80℃下搅拌反应混合物30分钟。lcms分析显示反应完成。冷却反应混合物且用dcm(2ml)稀释。在40grediseprf金硅石管柱上纯化所得溶液。流动相a：己烷；流动相b：乙酸乙酯；梯度：在0％b下1分钟，在0-50％b下15分钟；流动速率：40ml/min；管柱温度：25℃。通过254nm下的uv信号触发洗脱份收集。合并含有预期产物的洗脱份，浓缩且在高真空下干燥，得到化合物85(215mg，50％)。lc/ms条件e：lcrt：1.57min。[m+h]+/z＝260.0

化合物86.向化合物30(427mg，2070μmol)于dmf(2ml)中的溶液中添加cs2co(701mg，2152μmol)。在室温下搅拌反应混合物10分钟。将化合物85(215mg，0.827mmol)于乙腈(2ml)中的溶液缓慢添加至反应混合物中。在室温下搅拌反应混合物30分钟。lcms分析显示3个峰对应产物m/z。反应混合物用乙酸(0.3ml)中和，用水稀释且通过制备型hplc/ms条件a-3纯化：通过uv信号触发洗脱份收集。分别冷冻干燥对应于三个峰的洗脱份。nmr分析证实对应于最后峰的化合物为所需化合物86(76mg，119％)。lc/ms条件e：lc-rt：1.89min。[m+h]+/z＝386.2。¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ8.57(t,j＝5.7hz,1h),8.50(d,j＝1.6hz,1h),7.88(d,j＝1.6hz,1h),7.83(s,1h),7.76(s,1h),5.95(s,2h),4.00(s,3h),3.89(s,3h),3.55(q,j＝6.8hz,2h),1.59-1.48(m,2h),1.30-1.14(m,2h),0.86(t,j＝7.4hz,3h)。

化合物87.向化合物86(38mg，0.099mmol)于thf(1ml)中的溶液中添加含lialh4的thf(0.079ml，0.197mmol)。在室温下搅拌反应混合物10分钟。lcms分析显示反应完成。反应混合物用乙酸(0.2ml)中和，用水(3ml)稀释且根据hplc/ms条件a3纯化：通过uv信号触发洗脱份收集。合并含有预期产物的洗脱份且冷冻干燥，得到化合物87(28mg，79％)。lc/ms条件e：lc-rt：1.26min。[m+h]+/z＝357.2。

化合物855.向化合物87(28mg，0.078mmol)于dcm(1ml)中的溶液中添加socl2(0.144ml，1.972mmol)。在室温下搅拌反应混合物隔夜。浓缩反应混合物且与dcm(3×20ml)共蒸发以形成粗n7-丁基-1-((5-(氯甲基)-3-甲氧基吡啶-2-基)甲基)-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7-二胺(41mg)，其未经纯化即立即用于下一步骤。

向前述化合物(41mg，0.109mmol，粗物质)于dmf(1ml)中的溶液中添加环丁胺(388mg，5.45mmol)。在室温下搅拌反应混合物3小时。lcms分析显示反应完成。用乙腈及水冷冻干燥反应混合物。粗物质经由制备型hplc用以下条件纯化：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有10mm乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相b：具有10mm乙酸铵的95:5乙腈:水；梯度：保持在8％b下的0分钟，8至48％b下保持20分钟，接着在100％b下保持0分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。通过ms及uv信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到6.6mg(14.8％)化合物855(6.6mg，14.8％)。lc/ms条件：管柱：watersacquitybehc18，2.1mm×50mm，1.7μm粒子；流动相a：具有10mm乙酸铵的5:95乙腈:水；流动相b：具有10mm乙酸铵的95:5乙腈:水；温度：50℃；梯度：0％b至100％b经3分钟，接着在100％b下保持0.50分钟；流动速率：1ml/min；检测:ms及uv(220nm)。lcrt＝1.36min。(m+h)＝411.1

细节上作必要修改后，根据本发明的额外化合物可根据此程序制得。

步骤12-根据图12的化合物

此步骤及随附图12说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物867作为范例。

化合物90.在-78℃下向化合物89(300mg，0.722mmol)溶解于dcm(3ml)中的溶液中添加溴化乙基镁(0.633ml，2.165mmol)。将2-甲基四氢呋喃缓慢添加至反应混合物中且在-78℃下搅拌1小时且随后在0℃下搅拌1小时。反应混合物用饱和氯化铵溶液(1ml)淬灭且达到室温，接着用dcm(10ml)稀释，用水(5ml)洗涤，接着用盐水溶液(5ml)洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用乙酸乙酯/己烷在硅胶上纯化。浓缩含有产物的洗脱份，得到呈稠油状的化合物90(204mg，63.4％产率)。¹hnmr(400mhz,氯仿-d)δ7.58(m,4h),7.42-7.26(m,6h),3.75-3.57(m,2h),3.31(d,j＝7.8hz,1h),2.93(d,j＝7.5hz,1h),1.75(m,1h),1.68-1.47(m,3h),1.06(s,9h),0.98(s,9h),0.87(t,j＝7.4hz,3h).lcms:m/z＝446.2。

化合物91.将盐酸(194μl，0.774mmol，4m于二噁烷中)添加至化合物90(203mg，0.455mmol)于乙醚(4554μl)及meoh(55.3μl，1.366mmol)中的溶液中。在室温下将混合物搅拌1小时。将溶液浓缩至稠油状物。接着将20ml己烷添加至油状物中且将烧瓶保持于冷冻器中-20℃下1小时。收集白色固体且用冷己烷洗涤，随后在真空下干燥，得到呈白色固体状的化合物91(116mg，0.307mmol，67.4％产率)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.85(s,3h),7.63(ddd,j＝7.7,3.0,1.7hz,4h),7.56-7.40(m,6h),3.92-3.65(m,2h),3.18(p,j＝6.3hz,1h),1.86(dq,j＝13.0,6.5hz,1h),1.76(dq,j＝13.4,6.4hz,1h),1.64-1.47(m,2h),1.01(s,9h),0.89(t,j＝7.5hz,3h)。lcms:m/z＝342.2。

化合物867.化合物88(30mg，0.068mmol)于dmso(0.75ml)中的溶液用化合物91(51.3mg，0.136mmol)、dbu(51.1μl，0.339mmol)、随后bop(60.0mg，0.136mmol)处理且在70℃下加热2小时，得到化合物92，其未分离。将10m氢氧化钠水溶液(250μl，2.500mmol)添加至化合物92的反应混合物中且在75℃下搅拌隔夜。真空浓缩反应混合物且用meoh(0.3ml)及hcl(37％水溶液，0.3ml，3.7mmol)处理残余物，在室温下搅拌30分钟且浓缩。将粗产物溶解于dmf中，经由ptfe玻璃料过滤，且经由制备型hplc条件a-1纯化。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到呈白色固体状的化合物867(13mg，产率40％)。

细节上作必要修改后，根据本发明的额外化合物可根据此程序制得。

程序13-根据图13的化合物

此程序及随附图13说明制备本文所公开的化合物的另一方法，使用化合物851作为范例。

在细节上作必要修改后，遵循上文针对各种步骤所述的反应条件，使6-(羟基甲基)烟碱酸甲酯94与化合物55偶合且随后用于化合物851。

细节上作必要修改后，根据本发明的额外化合物可根据此程序制得。

程序14-根据图14的化合物

此程序及随附图14说明制备本文所公开的化合物的另一方法,使用化合物877作为范例。

化合物102.将4-硝基-1h-吡唑-5-二甲酸甲酯100(1.00g，5.61mmol)及k2co3(0.93g，6.73mmol)于dmf(5.9ml)中的溶液冷却至0℃且逐份添加4-(溴甲基)苯甲酸甲酯101(1.29g，5.61mmol)。使反应混合物升温至室温且搅拌4小时。在真空中浓缩反应混合物。将残余物溶解于etoac中且用饱和nahco3及h2o(2×)洗涤。在真空中浓缩有机层。将残余物溶解于dcm中且经由管柱色谱(80gsio2，0-50％etoac-己烷梯度)纯化，得到化合物102(0.37g，21％)。¹hnmr(400mhz,氯仿-d)δ8.10-8.08(m,1h),8.06-8.01(m,2h),7.32(d,j＝8.6hz,2h),5.55(s,2h),3.93(s,3h),3.92-3.92(m,3h)。lc/ms条件b。lcrt:0.95min。lcms(m+h)＝320.1。

在前述反应中，产生一些n2区位异构体，其在sio2色谱期间移除：

化合物103.在室温下将甲酸铵(292mg，4.64mmol)及锌(189mg，2.9mmol)添加至化合物102(370mg，1.16mmol)于thf(1.5ml)/meoh(1.5ml)中的溶液中。在室温下搅拌反应物3小时且添加额外部分的甲酸铵(100mg，1.59mmol)及锌(100mg，2.04mmol)。在30分钟之后，反应混合物经celite^tm垫过滤，且在真空中浓缩滤液，获得白色固体。将固体悬浮于etoac中，搅拌30分钟且过滤。随后在真空中浓缩有机滤液，得到化合物103(335mg，100％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.93-7.86(m,2h),7.19-7.15(m,3h),5.59(s,2h),5.13(s,2h),3.83(s,3h),3.73(s,3h)。lc/ms条件b：lcrt：0.78min。lcms(m+h)＝290.1。

化合物104.在室温下将1,3-双(甲氧基羰基)-2-甲基-硫代异脲1(271mg，1.27mmol)及乙酸(0.994ml，17.37mmol)添加至化合物103(335mg，1.16mmol)于meoh(14ml)中的溶液中。在室温下搅拌反应混合物3小时且添加额外部分hoac(0.5ml，8.7mmol)。在16小时之后，在室温下再添加一份hoac(0.3ml，5.2mmol)。在72小时后，将甲醇钠溶液(7.94ml，34.7mmol，25％于meoh中)添加至反应混合物中。搅拌2小时后，用hoac(3ml)酸化反应混合物且过滤所得浆料。所得固体用h2o及meoh洗涤，且干燥隔夜，得到化合物104(383mg，93％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.52-11.22(m,1h),7.94-7.88(m,3h),7.33(d,j＝8.3hz,2h),5.79(s,2h),3.83(s,3h),3.74(s,3h)。一个质子不可见，可能归因于质子交换。lc/ms条件b：lcrt：0.80min。lcms(m+h)＝358.2。

化合物105.依序将(s)-1-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)己-3-胺(71a)盐酸盐(840mg，2.14mmol)、bop(711mg，1.61mmol)及dbu(808μl，5.36mmol)添加至化合物104(383mg，1.07mmol)于dmf(5.4ml)中的室温溶液中。搅拌反应混合物16小时。在反应结束时，混合物用etoac稀释且用h2o(2×)洗涤。在真空中浓缩有机层。将残余物溶解于dcm中且经由管柱色谱(40gsio2，0-80％etoac-己烷梯度)纯化，得到化合物105(424mg，57％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.53-9.49(m,1h),7.97(s,1h),7.66(d,j＝8.4hz,2h),7.64-7.59(m,1h),7.54-7.50(m,2h),7.47-7.44(m,1h),7.42-7.39(m,2h),7.36-7.31(m,2h),7.31(brt,j＝1.4hz,1h),7.19-7.12(m,2h),6.94(d,j＝8.4hz,2h),6.32(d,j＝8.6hz,1h),6.03-5.84(m,2h),4.56(td,j＝8.4,4.4hz,1h),3.72(s,3h),3.56(s,3h),3.49-3.38(m,1h),1.84-1.68(m,2h),1.55-1.39(m,2h),1.36-1.21(m,1h),1.18-1.07(m,1h),0.91-0.86(m,9h),0.74(t,j＝7.3hz,3h)。lc/ms条件b：lcrt：1.08min。lcms(m+h)＝695.6。

化合物106.将化合物105(424mg，0.610mmol)于thf(8.7ml)中的溶液冷却至15℃且添加lialh4(1m于thf中，1.1ml，1.1mmol)。在15分钟之后，添加另一份lialh4(1m于thf中，0.3ml，0.3mmol)。在10分钟之后，用meoh及罗谢尔盐(饱和溶液)淬灭反应且在室温下搅拌30分钟。用etoac(3×)萃取混合物。经合并的有机层用h2o洗涤且真空浓缩。将残余物溶解于dcm/meoh中，吸收于celite^tm上，且经由管柱色谱(24gsio2；0-100％etoac-己烷梯度洗脱)纯化，得到化合物106(181mg，44％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.47(s,1h),7.91(s,1h),7.62(ddt,j＝5.7,3.6,1.8hz,1h),7.56(dd,j＝7.9,1.5hz,2h),7.48-7.43(m,3h),7.39-7.32(m,3h),7.24-7.20(m,2h),7.08(d,j＝8.1hz,2h),6.91(d,j＝8.1hz,2h),6.29(d,j＝8.6hz,1h),5.78(d,j＝1.9hz,2h),5.06(t,j＝5.6hz,1h),4.63-4.54(m,1h),4.32(d,j＝5.4hz,2h),3.57(s,3h),3.55-3.49(m,1h),1.85-1.76(m,2h),1.55-1.40(m,2h),1.20-1.02(m,2h),0.91(s,9h),0.78(t,j＝7.3hz,3h)。lc/ms条件b：lcrt：0.95min。lcms(m+h)＝667.6。

化合物107.将亚硫酰氯(99μl，1.4mmol)添加至甲基化合物106(181mg，0.224mmol)于thf(2.7ml)中的室温溶液中。在搅拌10分钟之后，在真空中浓缩反应混合物。将残余物再溶解于dcm中且真空浓缩，得到化合物107(172.2mg，93％)。lc/ms条件b：lcrt：1.11min。lcms(m+h)＝685.6。

化合物108.在室温下将化合物107(23mg，0.034mmol)溶解于dmf(0.7ml)中且用diea(88μl，0.50mmol)及3-甲氧基氮杂环丁烷(26a)盐酸盐(21mg，0.17mmol)处理。在70℃下搅拌2小时之后，在真空中浓缩反应混合物，得到粗化合物108，其未经进一步纯化即使用。lc/ms条件b：lcrt：0.89min。lcms(m+h)＝736.7。

化合物877.在室温下用naoh(10m水溶液，0.1ml，1.0mmol)处理化合物108(25mg，0.034mmol)于二噁烷(0.7ml)中的溶液。将反应物加热至75℃，持续2小时，随后添加另一份naoh(10m水溶液，0.15ml，1.5mmol)。在80℃下加热4小时之后，在真空中浓缩反应混合物。残余物用meoh(0.5ml)处理，添加hcl(37％水溶液，0.4ml，4.9mmol)，在室温下搅拌60分钟且浓缩。将粗产物溶解于dmf中，经由ptfe玻璃料过滤，且经由制备型lc/ms条件a-2纯化。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到残余物，其经由制备型lc/ms条件a-1进一步纯化。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到呈tfa盐形式的化合物877(5.7mg，38％)。lc/ms条件c：lcrt：1.0min。lcms(m+h)＝440.2。

化合物874.在室温下用naoh(10m水溶液，0.2ml，2.0mmol)处理化合物106(20mg，0.030mmol)于二噁烷(0.15ml)中的溶液且加热反应物至75℃，持续1小时，随后添加另一份naoh(10m水溶液，0.2ml，2.0mmol)。在75℃下加热3小时后，在真空中浓缩反应混合物。残余物用meoh(0.5ml)及hcl(37％水溶液，0.4ml，4.9mmol)处理，在室温下搅拌30分钟且浓缩。将粗产物溶解于dmf中，经由ptfe玻璃料过滤，且经由制备型lc/ms条件a-2纯化。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥，得到化合物874。lc/ms条件c：lcrt：1.07min。lcms(m+h)＝371.2。

细节上作必要修改后，根据本发明的额外化合物可根据此程序制得。

程序15-化合物829

此程序涉及化合物829及其区位异构体的制备方法。这些化合物通过使化合物36及37与memgcl格林纳试剂(grignardreagent)反应来制备。

在0℃下向化合物36及37(60mg，0.134mmol)于thf(1ml)中的混合物中添加memgcl(0.171ml，0.513mmol)。1小时后，lcms显示反应完成。混合物经由制备型lc/ms以如下条件纯化：管柱：xbridgec18，200mm×19mm，5μm粒子；流动相a：具有0.1％tfa的5:95乙腈:水；流动相b：具有0.1％tfa的95:5乙腈:水；梯度：在10％b下保持0分钟，10-45％b经20分钟，接着在100％b下保持4分钟；流动速率：20ml/min；管柱温度：25℃。通过ms信号触发洗脱份收集。合并含有所需产物的洗脱份且经由离心蒸发干燥。

特性

本发明化合物的分析数据提供于下表b中，以及其人类tlr7(htlr7)激动作用资料。在一些实施例中，所报导的活性激动作用值为复数个分析的平均值。特定化合物与特定程序的关联系说明性且非穷尽性的。化合物可通过其他程序之一来制造，且相反地，相同程序可用于制造本发明的其他化合物。保留时间(retentiontime，rt)列适用时为指根据上文lcms程序b/c/d/e的保留时间。

本发明的前述详细描述包括主要或仅仅涉及本发明的特定部分或方面的章节。应了解，出于明晰及便利的目的，特定特征可不仅仅在公开该特征的章节中相关，且本文的公开内容包括不同段落中存在的信息的所有适当组合。类似地，尽管本文的各种图式及描述涉及本发明的特定实施方案，但应了解，若特定特征于特定图式或实施方案的情形下公开，则此类特征亦可在适当程度上与另一特征组合用于另一图式或实施方案的情形下或通常本发明中。

此外，尽管本发明尤其关于某些优选实施方案进行描述，但本发明并不限于此类优选实施方案。确切言之，本发明的范畴通过所附权利要求书界定。

前缀语及缩写

表c提供本说明书中所用之前缀语及缩写以及其含义的清单。

参考文献

下文提供在本说明书中较早部分以缩写方式通过第一作者(或发明者)及年份引用的以下参考文献的完整引用。这些参考文献各以引用的方式并入本文中以用于所有目的。

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