微生物的检测方法与流程

1.本发明涉及生物试样中包含的微生物的检测方法。


背景技术：

2.在临床诊断等中，检测生物试样中包含的微生物是重要的，进行如下方法：利用pcr等扩增生物试样中的检测对象微生物的核酸，检测扩增而得的核酸，来鉴定是否存在微生物。然而，由于生物试样中除了核酸之外还包含各种源自生物体的物质，因此若在不对生物试样纯化的情况下执行核酸扩增，则会发生扩增抑制或检测抑制，在大多数情况下，无法获得正确的测定结果。因此，在检测生物试样中包含的微生物时，通常对生物试样进行预处理，而并非直接将生物试样供于检测。
3.作为预处理，进行能够将核酸以外的几乎全部成分去除的核酸纯化(专利文献1)。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本特开2016
‑
067291


技术实现要素：

7.发明要解决的问题
8.然而，核酸纯化存在操作非常复杂、操作时间长、使用有机溶剂、试剂成本高等课题。本发明的一个目的在于，提供在无需进行核酸纯化的情况下检测生物试样中的微生物的方法。另外，本发明的一个目的在于提供核酸扩增用的试样液。进而，本发明的一个目的在于，提供通过简便的预处理由生物试样制备核酸扩增用的试样液的方法。进而，本发明的一个目的在于，提供用于生物试样保存、生物试样运送或核酸扩增的含盐类的液体。另外，一个目的在于提供包含该液体的核酸扩增用试剂盒。
9.用于解决问题的方案
10.本发明人等鉴于上述课题而进行了深入研究，结果发现：将生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液混合而制备适合的碱浓度的混合液，在该混合液中扩增检测对象微生物的核酸，由此能够检测该核酸，并完成了本发明。代表性的本发明如下所述。
11.[项目1]
[0012]
一种检测生物试样中的微生物的方法，其包括以下的工序(a)和(c)：
[0013]
(a)将生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液混合而制备碱浓度为1～50mm的混合液的工序；及
[0014]
(c)在前述工序(a)中制备的混合液中扩增前述微生物的核酸的工序。
[0015]
[项目2]
[0016]
根据项目1所述的方法，其中，前述混合液的碱浓度为4～50mm。
[0017]
[项目3]
[0018]
根据项目1或2所述的方法，其中，前述生物试样或者其悬浮液或溶解液为选自由
口腔内擦拭物、咽拭液、鼻腔拭液、鼻咽拭液、鼻腔吸取液、痰、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、直肠拭液、阴道分泌物、宫颈管粘液、粪便悬浮液、和尿道擦拭物组成的组中的至少1种。
[0019]
[项目4]
[0020]
根据项目1～3中任一项所述的方法，其中，前述碱性溶液为选自由氢氧化钾水溶液、氢氧化钠水溶液、氢氧化锂水溶液、氢氧化镁水溶液、氢氧化钙水溶液、氢氧化钡水溶液、碳酸钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸镁水溶液、和碳酸钙水溶液组成的组中的至少1种液体。
[0021]
[项目5]
[0022]
根据项目1～4中任一项所述的方法，其中，前述生物试样的悬浮液或溶解液包含含盐类的液体。
[0023]
[项目6]
[0024]
根据项目1～5中任一项所述的方法，其中，前述微生物为呼吸系统感染症、腹泻、或性传播疾病的病原微生物。
[0025]
[项目7]
[0026]
根据项目6所述的方法，其中，前述病原微生物为选自由流感病毒、rs病毒、腺病毒、a群链球菌、肺炎支原体、百日咳杆菌、副百日咳博代氏杆菌、支气管败血性博代氏杆菌、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、诺如病毒、轮状病毒、札幌病毒、腹泻腺病毒、淋菌、衣原体、支原体、解脲支原体、hiv和hpv组成的组中的至少1种微生物。
[0027]
[项目8]
[0028]
根据项目1～7中任一项所述的方法，其还包括以下的工序(b)：
[0029]
(b)将前述工序(a)中制备的混合液过滤并回收滤液的工序，
[0030]
在前述工序(c)中，使用前述工序(b)中回收的滤液代替混合液。
[0031]
[项目9]
[0032]
一种核酸扩增用试样液，其包含：项目1～8中任一项所述的前述工序(a)中制备的混合液和/或项目8所述的前述工序(b)中回收的滤液。
[0033]
[项目10]
[0034]
一种核酸扩增用试样液的制备方法，其包括以下的工序(a)：
[0035]
(a)将生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液混合而制备碱浓度为1～50mm的混合液的工序。
[0036]
[项目11]
[0037]
根据项目10所述的方法，其还包括以下的工序(b)：
[0038]
(b)将前述工序(a)中制备的混合液过滤并回收滤液的工序。
[0039]
另外，本发明可以进一步包括下述所代表的方案。
[0040]
[项目a]
[0041]
根据项目8所述的方法，其中，前述工序(b)中的过滤中使用的过滤器的孔径为10μm～500μm。
[0042]
[项目b]
[0043]
根据项目1～8和项目a中任一项所述的方法，其中，前述工序(c)中的扩增核酸的工序为pcr法或等温扩增法。
[0044]
[项目c]
[0045]
根据项目9所述的试样液，其中，前述工序(b)中的过滤中使用的过滤器的孔径为10μm～500μm。
[0046]
[项目d]
[0047]
根据项目11所述的方法，其中，前述工序(b)中的过滤中使用的过滤器的孔径为10μm～500μm。
[0048]
[项目e]
[0049]
一种包含碱性溶液的核酸扩增用试样液，其含有生物试样或者其悬浮液或溶解液，碱浓度为1～50mm。
[0050]
[项目f]
[0051]
一种用于生物试样保存、生物试样运送或核酸扩增的含盐类的液体，其中，碱浓度为1～50mm。
[0052]
[项目g]
[0053]
一种核酸扩增用试剂盒，其包含前述项目f所述的液体。
[0054]
[项目h]
[0055]
根据项目g所述的试剂盒，其还包含生物试样采样工具。
[0056]
[项目i]
[0057]
一种核酸扩增用试剂盒，其包含：用于生物试样保存、生物试样运送或核酸扩增的含盐类的液体；和，按照与生物试样或者其悬浮液或溶解液混合时碱浓度达到1～50mm的方式制备的碱性溶液。
[0058]
[项目j]
[0059]
根据项目i所述的试剂盒，其还包含生物试样采样工具。
[0060]
发明的效果
[0061]
通过无需核酸提取和纯化所需的特殊设备、有机溶剂等试剂、提取和纯化时间的、简便的生物试样的预处理，能够制备适于核酸扩增的核酸扩增用试样液。通过使用该试样液进行核酸扩增而能够检测核酸。
附图说明
[0062]
图1是示出实施例1中的熔解曲线解析的结果的图。图的横轴表示温度(℃)，纵轴表示荧光信号的微分值(d/dt)。另外，图中，ct dna表示加入了沙眼衣原体dna的试样液，nc表示阴性对照试样液。
[0063]
图2是示出实施例2中的熔解曲线解析的结果的图。图的横轴表示温度(℃)，纵轴表示荧光信号的微分值(d/dt)。
具体实施方式
[0064]
以下，以上述的代表性的方案为中心进行说明。
[0065]
[微生物的检测方法]
[0066]
本发明的一实施方式为检测生物试样中的微生物的方法，该方法包括以下的工序(a)和(c)：
[0067]
(a)将生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液混合而制备碱浓度为1～50mm的混合液的工序；及
[0068]
(c)在前述工序(a)中制备的混合液中扩增前述微生物的核酸的工序。
[0069]
[生物试样]
[0070]
本说明书中，生物试样只要是可能包含成为检测对象的微生物(以下有时称为“检测对象微生物”。)的生物体来源的试样就没有特别限定。
[0071]
由生物体采集生物试样后生物试样立即劣化、采集后直至检测需要长时间等情况下，例如也可以出于稀释、保存生物体来源物(特别是，生物体来源物中的微生物或核酸)等目的，将采集的生物试样混合(例如溶解、悬浮等)到液体中而制成悬浮物、溶解物等液体形态。本说明书中，不仅可以使用生物试样、也可以使用该液体形态的悬浮液、溶解液等作为检测对象微生物源。
[0072]
作为生物试样或者其悬浮液或溶解液，没有特别限制，例如可列举出动植物组织、体液、排泄物、细胞、细菌、病毒等。更具体而言，可列举出口腔内擦拭物、咽拭液、鼻腔拭液、鼻咽拭液、鼻腔吸取液、痰、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、直肠拭液、阴道分泌物、宫颈管粘液、尿道擦拭物、粪便悬浮液、血液、血浆、血清、血液培养液、尿液、唾液、羊水、脓液、脑脊液、胸水、组织切片、皮肤、呕吐物、粪便、鼓膜切开液、胃灌洗液、肠灌洗液、脏器提取液、组织提取液分离培养菌落、导管清洗液等，可以单独使用1种或组合2种以上来使用。优选的生物试样或者其悬浮液或溶解液为选自由口腔内擦拭物、咽拭液、鼻腔拭液、鼻咽拭液、鼻腔吸取液、痰、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、直肠拭液、阴道分泌物、宫颈管粘液、粪便悬浮液、和尿道擦拭物组成的组中的至少1种，更优选为选自由口腔内擦拭物、咽拭液、鼻腔拭液、鼻咽拭液、鼻腔吸取液、痰、直肠拭液、阴道分泌物、宫颈管粘液、和尿道擦拭物组成的组中的至少1种。
[0073]
另外，生物试样例如为人或非人动物来源的试样。作为非人动物，可列举出非人哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猪、牛、绵羊、山羊等，优选为狗、猫等。优选为人来源的试样。
[0074]
来自生物体的试样的采集方法没有特别限制，可以根据试样的种类、大小、目的使用公知的方法。例如为使用了棉棒、拭子、白金环、滴管、压舌板、药匙等采样工具的采集方法。
[0075]
作为前述的液体形态、例如悬浮液或溶解液，可列举出将适于稀释或保存生物体来源物(特别是，生物体来源物中的微生物或核酸)的液体(例如水、含盐类的液体(为含有盐类的液体，例如生理盐水、生理性盐类溶液、缓冲液、液体运送培养基等)等，优选为含盐类的液体)混合于生物试样而得的液体。作为盐类，例如可列举出酸的碱金属盐或碱土金属盐等。作为该碱金属盐，例如可列举出氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫代乙醇酸钠等。作为该碱土金属盐，例如可列举出氯化钙、氯化镁、硫酸镁等。
[0076]
生物试样的悬浮液或溶解液例如可以通过将从生物体采集的试样悬浮或溶解于水、含盐类的液体等而制备，进而，在确认到较大杂质或异物等的情况下，也可以是通过离心分离等而去除者。
[0077]
作为适于稀释或保存生物体来源物的液体的例子，可列举灭菌水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、平衡盐类溶液(例如hanks液、达尔伯克磷酸缓冲液、厄尔平衡盐溶液、林格
氏液、台氏液、伊格尔氏溶液等)、tris
‑
缓冲液、te缓冲液、磷酸缓冲液、good’s缓冲液(例如hepes缓冲液、aces缓冲液、pipes缓冲液、bis
‑
tris缓冲液、mops缓冲液、hepps缓冲液、taps缓冲液等)、utm培养基(例如，已知utm 360c培养基包含hanks缓冲液盐类、l
‑
半胱氨酸、蔗糖、hepes缓冲液、两性霉素b、酚红、牛血清白蛋白、明胶、l
‑
谷氨酸、万古霉素和粘菌素)、eswab培养基(已知eswab培养基包含氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫代乙醇酸钠、和蒸馏水)、uriswab培养基、enat培养基(例如，已知enat培养基包含表面活性剂和蛋白质变性剂，具体而言，已知包含硫氰酸胍盐(guanidine thyocianate)、tris
‑
edta、hepes、表面活性剂)、unitrans
‑
rt培养基、卡
‑
布氏(cary blair)培养基、amies培养基、stuart培养基、这些的改良培养基等，但不限定于这些。优选为生理盐水、tris
‑
缓冲液或运送培养基，更优选为运送培养基，更进一步优选为utm培养基、eswab培养基或enat培养基。
[0078]
[碱性溶液]
[0079]
本说明书中，碱性溶液只要为碱性的溶液，就没有特别限定。作为碱性溶液，例如可列举出氢氧化钾水溶液、氢氧化钠水溶液、氢氧化锂水溶液、氢氧化镁水溶液、氢氧化钙水溶液、氢氧化钡水溶液、碳酸钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸镁水溶液、碳酸钙水溶液等，可以单独使用1种或组合使用2种以上。优选的碱性溶液为选自由氢氧化钾水溶液、氢氧化钠水溶液、和氢氧化锂水溶液组成的组中的至少1种液体。更优选的碱性溶液为氢氧化钾水溶液和/或氢氧化钠水溶液。
[0080]
本说明书中，碱浓度为体积摩尔浓度(m或mol/l)，可以以碱性溶液1l中包含的碱性物质(例如，上述那样的氢氧化钾和/或氢氧化钠等碱性物质的总量)的摩尔量限定。
[0081]
[工序(a)]
[0082]
工序(a)是将生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液混合而制备碱浓度为1～50mm的混合液的工序。
[0083]
对于生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液的混合中的、生物试样或者其悬浮液或溶解液的用量和碱性溶液的用量，只要是混合后的混合液中的碱浓度成为规定的浓度的量就没有特别限定。因此，使用生物试样的悬浮液或溶解液的情况下，也可以考虑它们的体积、碱性物质含量等，来确定碱性溶液的用量和浓度。
[0084]
工序(a)中的混合液的碱浓度例如可以为1mm以上、1.5mm以上、2mm以上、4mm以上、5mm以上、6mm以上、8mm以上或10mm以上，另外，例如可以为50mm以下、49mm以下、48mm以下、47mm以下、46mm以下、45mm以下、44mm以下、43mm以下、42mm以下、41mm以下、40mm以下、38mm以下、36mm以下、34mm以下、32mm以下、30mm以下、28mm以下或26mm以下。
[0085]
一实施方式中，碱浓度例如也可以为1～50mm、2～50mm、3～50mm、4～50mm、5～45mm、8～45mm、8～50mm、10～45mm、10～50mm、15～45mm、15～50mm、20～45mm、20～50mm等。在特定的实施方式中，例如为了检测沙眼衣原体等而将宫颈管粘液用作生物试样的情况下或为了检测肺炎支原体等而将咽拭液用作生物试样的情况下等，虽然没有特别限定，但通常优选使用碱浓度高的碱性溶液，例如也可以使用15～50mm左右、更优选为20～45mm左右的碱浓度的碱性液。
[0086]
将生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液混合的方法没有特别限制，例如可列举出如下方法：使附着有生物试样的采样工具、例如拭子与碱性溶液接触并悬浮的方法；
将预先准备的生物试样的悬浮液或溶解液与碱性溶液简单混合的方法等。
[0087]
通过将生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液混合而制备的碱浓度为1～50mm的混合液可以供于接下来的工序(c)中的核酸扩增，也可以任选供于工序(b)中的过滤。
[0088]
[工序(b)]
[0089]
工序(b)是将前述工序(a)中制备的混合液过滤并回收滤液的工序。工序(b)不是必须工序而是可以任选设定的工序，但根据生物试样的种类或状态、采样工具的状态等，工序(a)中制备的混合液中有时包含源自生物体或采样工具的可目视程度的较大杂质(例如拭子的纤维、生物体细胞的块、生物体组织片、尘埃)，在担心由此抑制之后的工序(c)或检测工序时，优选通过工序(b)去除较大的杂质。另外，此外的实施方式中优选不包括工序(b)。
[0090]
工序(a)中制备的混合液的过滤可以使用滤材、例如过滤器、优选烧结过滤器进行。过滤器的材料没有特别限定，可以列举出聚丙烯、聚乙烯(例如低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、超高分子量聚乙烯等)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、氧化铝、氧化锆、硅、四氟乙烯硅聚合物、不锈钢等。作为过滤器的材料，从成型容易的观点出发，优选选自由聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯组成的组中的至少1种，其中优选聚丙烯或聚乙烯。
[0091]
过滤器的孔径例如可以为5μm以上、10μm以上或15μm以上，另外可以为1000μm以下、800μm以下、500μm以下或400μm以下。一实施方式中，孔径为5μm～800μm、优选为10μm～500μm、更优选为15μm～400μm。一实施方式中，烧结过滤器可以将其孔径不同的多个过滤器重叠而构成，可以使用具有最小孔径的过滤器的孔径为1μm以上、具有最大孔径的过滤器的孔径为500μm以下的过滤器。一实施方式中，例如可以按照孔径100μm～200μm的烧结过滤器、孔径10μm～500μm的烧结过滤器的顺序进行过滤。
[0092]
从简便地实施的观点出发，过滤优选自然过滤，但也可以以减压过滤、加压过滤、离心过滤等实施。
[0093]
通过工序(b)的过滤而回收的滤液可以在接下来的工序(c)中供于核酸扩增。另外，也可以在通过工序(b)的过滤而回收的滤液中添加碱性溶液后，进行离心分离处理而得到上清液，将该上清液在接下来的工序(c)中供于核酸扩增。
[0094]
[溶菌或破碎工序]
[0095]
一实施方式中，在检测对象微生物为比病毒大的微生物(例如细菌、真菌等)的情况下，可以将前述工序(a)中制备的混合液或前述工序(b)中回收的滤液供于例如搅拌处理、超声波处理、加热处理、酶处理等、溶菌或破碎工序中。在工序(c)中，也可以将通过该溶菌或破碎工序而制备的溶菌或破碎液用作核酸扩增用试样液，来替代前述工序(a)中制备的混合液或前述工序(b)中回收的滤液。
[0096]
另外，通常，有时为了集菌而包括离心分离工序，但本发明的一实施方式中不包括离心分离工序。
[0097]
搅拌处理是对前述工序(a)中制备的混合液或前述工序(b)中回收的滤液进行搅拌而使微生物破碎的方法。搅拌处理可以利用颠倒混合、涡流混合器、搅拌机等来进行。
[0098]
超声波处理是通过对悬浮液前述工序(a)中制备的混合液或前述工序(b)中回收的滤液施加超声波而使微生物破碎的方法。例如，超声波均质机能够简便地破坏细胞壁，容
易使微生物破碎。处理时间例如为10秒～2分钟、优选为10秒～1分钟，可以仅1次或重复多次(例如2～6次、2～4次等)。
[0099]
加热处理是通过对悬浮液前述工序(a)中制备的混合液或前述工序(b)中回收的滤液施加热而使微生物溶菌的方法。加热温度没有特别限制，优选80℃以上，更优选85℃以上，进一步优选90℃以上。加热时间例如为10秒～5分钟、优选为20秒～4分钟。
[0100]
酶处理是在前述工序(a)中制备的混合液或前述工序(b)中回收的滤液中加入细胞壁溶解酶等而使微生物溶菌的方法。所使用的酶不包括能使目标微生物溶菌的酶，除此以外没有限制。另外，酶反应优选在酶活性大的温度等条件下进行。
[0101]
溶菌或破碎工序中，可以进行一种或连续进行多种处理，可能的情况下，可以组合多种处理并同时进行。通过组合多种处理，从而更容易溶菌或破碎，因此有时是有利的。
[0102]
[工序c]
[0103]
工序(c)是在前述工序(a)中制备的混合液中或前述工序(b)中回收的滤液中扩增前述微生物的核酸的工序。
[0104]
前述工序(a)中制备的混合液和/或前述工序(b)中回收的滤液可以直接用于核酸扩增。另外，工序(c)中，为了有利于核酸的扩增或检测，也可以在该混合液和/或该滤液中添加各种成分后再扩增核酸。需要说明的是，本说明书中，有时将供于核酸扩增的该混合液和/或该滤液称为“核酸扩增用试样液”。
[0105]
供于核酸扩增工序的核酸扩增用试样液包含成为核酸扩增的对象的微生物的核酸源。因此，在核酸扩增用试样液中根据微生物的种类、所使用的核酸扩增方法等适宜添加适合的试剂等(例如dna聚合酶、核酸引物对、核酸探针(例如qprobe、taqmanprobe)等)并用于核酸扩增。
[0106]
核酸扩增中使用的核酸扩增方法没有特别限定，可以使用pcr法、sda法、ican法、等温扩增法(例如，lamp法)等各种公知的方法。更优选为pcr法或等温扩增法，更进一步优选为实时pcr法或lamp法。核酸扩增的温度等条件根据核酸扩增的方法、检测对象微生物的种类等进行适宜设定即可。
[0107]
pcr法或等温扩增法的核酸扩增工序中使用的dna聚合酶没有特别限定，可以使用例如kod dna聚合酶、pfu dna聚合酶等α型dna聚合酶；taq dna聚合酶、tth dna聚合酶等pol i型dna聚合酶等，在特定的实施方式中，从准确性优异的方面考虑，优选使用α型dna聚合酶或属于家族b的dna聚合酶。作为α型dna聚合酶，没有特别限定，进一步优选使用kod dna聚合酶(东洋纺制)或pfu dna聚合酶(takara bio inc.制)。
[0108]
[检测工序]
[0109]
前述工序(c)中扩增出的检测对象微生物的核酸被供于检测工序中。检测中使用的方法没有特别限定，可以使用以往用于微生物检测的方法，例如可列举出如下方法：使用琼脂糖凝胶电泳法、sscp法、rflp法、嵌入剂来检测核酸的方法；使用与核酸的碱基序列特异性结合的核酸探针来检测核酸的方法等。更优选为使用核酸探针来检测核酸的方法。作为该核酸探针，例如可列举出taqman探针、消光探针(quenching probe；q探针)、molecularbeacon等。通过使核酸探针与核酸杂交并进行熔解曲线解析，从而能够对检测对象微生物进行检测。对于检测工序中的其它条件，考虑检测对象微生物的种类、探针的种类等来适宜设定即可。
[0110]
[检测对象微生物]
[0111]
对于检测对象微生物没有特别限定，例如可列举出呼吸系统感染症病原微生物、腹泻病原微生物、性传播疾病病原微生物、肠道传染病病原微生物等，但不限定于这些。检测对象微生物可以是单独1种，也可以是2种以上的微生物的组合。优选为呼吸系统感染症病原微生物、腹泻病原微生物或性传播疾病病原微生物。
[0112]
呼吸系统感染症病原微生物例如可以是流感病毒(例如甲型流感病毒、乙型流感病毒等)、rs病毒、腺病毒、a群链球菌、肺炎支原体、百日咳杆菌、副百日咳博代氏杆菌、支气管败血性博代氏杆菌、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体等。优选的呼吸系统感染症病原微生物为肺炎支原体或百日咳杆菌。
[0113]
腹泻病原微生物例如可以是诺如病毒、轮状病毒、札幌病毒、腹泻腺病毒等。优选的腹泻病原微生物为诺如病毒或轮状病毒。
[0114]
性传播疾病病原微生物可以是淋菌、衣原体、支原体、解脲支原体、hiv、hpv等。优选的性传播疾病病原微生物为衣原体或淋菌。
[0115]
作为支原体，例如可列举出精氨酸支原体(mycoplasma arginini)、口颊支原体(mycoplasma buccale)、咽支原体(mycoplasma faucium)、人型支原体(mycoplasma hominis)、口腔支原体(mycoplasma orale)、唾液支原体(mycoplasma salivarium)、发酵支原体(mycoplasma fermentans)、嗜脂支原体(mycoplasma lipophilum)、类人猿支原体(mycoplasma primatum)、猪鼻支原体(mycoplasma hyorhinis)、滑液囊支原体(mycoplasma synoviae)、生殖支原体(mycoplasma genitalium)、肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae；肺炎支原体)、鸡败血支原体(mycoplasma gallisepticum)等。
[0116]
[核酸扩增用试样液]
[0117]
本发明的一实施方式是包含前述工序(a)中制备的混合液和/或前述工序(b)中回收的滤液的核酸扩增用试样液。该试样液可通过前述的工序(a)和/或工序(b)而制备。
[0118]
另外，本发明的另一实施方式是含有生物试样或者其悬浮液或溶解液、且包含碱浓度为1～50mm的碱性溶液的核酸扩增用试样液。
[0119]
本发明的试样液适于利用pcr法、等温扩增法等的核酸扩增。即，可以在该试样液中扩增检测对象微生物的核酸。本发明中，优选将在工序(a)中混合生物试样的悬浮液或溶解液与碱性溶液而制备的混合液或将该混合液在工序(b)中过滤并回收而得的滤液作为核酸扩增用试样液。核酸扩增用试样液中的工序(a)、工序(b)等的详情，与检测生物试样中的微生物的方法中的工序(a)、工序(b)等相同。
[0120]
[核酸扩增用试样液的制备方法]
[0121]
本发明的一实施方式是核酸扩增用试样液的制备方法，该方法包括以下的工序(a)：
[0122]
(a)将生物试样或者其悬浮液或溶解液与碱性溶液混合而制备碱浓度为1～50mm的混合液的工序。
[0123]
另一实施方式中，核酸扩增用试样液的制备方法除了前述的工序(a)之外，还包括以下的工序(b)：
[0124]
(b)将前述工序(a)中制备的混合液过滤并回收滤液的工序。
[0125]
该制备方法适于核酸扩增用试样液的制备。该制备方法中的工序(a)、工序(b)等
的详情，与检测生物试样中的微生物的方法中的工序(a)、工序(b)等相同。
[0126]
[用于生物试样保存、生物试样运送或核酸扩增的含盐类的液体]
[0127]
本发明的一实施方式是碱浓度为1～50mm的用于生物试样保存、生物试样运送或核酸扩增的含盐类的液体。该液体可以通过如下方式制备：在检测生物试样中的微生物的方法中说明的前述含盐类的液体中根据需要添加前述碱性物质而使碱浓度为1～50mm，从而制备。可以通过在该液体中混合所采集的生物试样的简便的操作，来实施生物试样中的核酸扩增和检测。该液体的详情，可以适用检测生物试样中的微生物的方法中的说明。
[0128]
[核酸扩增用试剂盒]
[0129]
本发明的一实施方式是包含碱浓度为1～50mm的用于生物试样保存、生物试样运送或核酸扩增的含盐类的液体的核酸扩增用试剂盒。另外，本发明的另一实施方式为一种核酸扩增用试剂盒，其包含：用于生物试样保存、生物试样运送或核酸扩增的含盐类的液体；和，以与生物试样或者其悬浮液或溶解液混合时碱浓度达到1～50mm的方式制备的碱性溶液。这些试剂盒可以进一步包含生物试样采样工具(例如，棉棒、拭子等)。本试剂盒可以进一步包含有利于生物试样的保存、核酸的扩增或检测等的添加成分。本试剂盒的详情可以适用检测生物试样中的微生物的方法中的说明。
[0130]
实施例
[0131]
以下示出试验例对本发明进行具体地说明，但本发明不限定于试验例。试验例中使用的试剂如下。
[0132]
kod mix：包含α型聚合酶的pcr用试剂
[0133]
sct mix：包含沙眼衣原体检测用的引物和探针的试剂
[0134]
mpn mix：包含肺炎支原体检测用的引物和探针的试剂
[0135]
ic mix：包含内部对照(ic)的试剂
[0136]
〔试验例1：沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)的检测〕
[0137]
(1
‑
1)试样液的制备
[0138]
制备了以100拷贝/μl包含利用boom法从沙眼衣原体(检测对象微生物)中提取的dna试样的生理盐水。用拭子采集沙眼衣原体阴性者的宫颈管粘液，悬浮于该生理盐水中，作为模拟生物试样(1ml)。
[0139]
在制备的悬浮液中添加与悬浮液相同体积量的100mm的氢氧化钠水溶液，制备了含有dna试样、宫颈管粘液、生理盐水和氢氧化钠水溶液的混合液(碱浓度50mm；有时称为ct)。除此之外，除了不使用前述dna试样以外利用同样的方法制备了含有宫颈管粘液、生理盐水和氢氧化钠水溶液的混合液(碱浓度50mm；阴性对照(有时称为nc))。
[0140]
(1
‑
2)核酸扩增和检测
[0141]
取出所制备的ct和nt各一部分，直接作为核酸扩增用的试样液(3μl)，供于核酸扩增。即，在各3μl的试样液中添加核酸扩增和检测用的下述试剂，在下述条件下利用pcr进行核酸扩增，通过熔解曲线解析进行核酸检测。核酸扩增和熔解曲线解析使用东洋纺制genecube(注册商标)。
[0142]
(试剂)
[0143]
kod mix(genecube(r)sct、东洋纺制)3μl
[0144]
sct mix(genecube(r)sct、东洋纺制)4μl
[0145]
(核酸扩增和熔解曲线解析条件)
[0146]
94℃
·
2分钟、
[0147]
97℃
·
1秒
‑
60℃
·
3秒
‑
63℃
·
6秒(循环数60次)、
[0148]
94℃
·
30秒、
[0149]
39℃
·
30秒、
[0150]
39℃～75℃(升温速度0.09℃/秒)。
[0151]
(1
‑
3)结果
[0152]
将熔解曲线解析的结果示于图1。图1是示出在上述条件下进行核酸扩增、伴随之后的温度上升的荧光强度的变化的图。图的横轴为温度(℃)，纵轴为荧光信号的微分值(d/dt)。图中，ct dna表示加入了沙眼衣原体dna的试样液的解析结果，nc表示阴性对照试样液的解析结果。由图1所明确地那样，ct dna中检测出沙眼衣原体，nc中未检测出。
[0153]
〔试验例2：自沙眼衣原体阳性试样中检测该微生物的确认〕
[0154]
用拭子(头部由尼龙纤维形成的毛刷状棉棒(copan公司制、flock swab tr100))采集在其它检测试验中显示出沙眼衣原体阳性的对象者的宫颈管粘液(生物试样)，悬浮于生理盐水(1ml)中。在该悬浮液中添加与悬浮液相同体积量的100mm的氢氧化钠水溶液，制备了含有宫颈管粘液、生理盐水和氢氧化钠水溶液的混合液(碱浓度50mm)。取出该混合液的一部分，与试验例1同样地进行核酸扩增和检测。将结果示于图2。确认了沙眼衣原体的检测。
[0155]
〔试验例3：肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)的检测〕
[0156]
(3
‑
1)试样液的制备
[0157]
制备了以10拷贝/μl包含利用boom法从肺炎支原体(检测对象微生物)中提取的dna试样的生理盐水。用拭子采集肺炎支原体阴性者的咽拭液，将其悬浮于前述生理盐水中，作为模拟生物试样(1ml)。
[0158]
在制备的悬浮液中添加与悬浮液相同体积量的以下任意的液体，制备了混合液(5拷贝/μl)。
[0159]
·
生理盐水
[0160]
·
液体运送培养基(utm360c；copan公司制)
[0161]
·
10mm的氢氧化钾水溶液
[0162]
·
100mm的氢氧化钾水溶液
[0163]
(3
‑
2)核酸扩增和检测
[0164]
取出所制备的混合液的一部分，直接作为核酸扩增用的试样液(3μl)，将试剂和条件替换为下述，除此以外与试验例1同样地进行核酸扩增和检测。
[0165]
(试剂)
[0166]
kod mix(genecube(r)mpn、东洋纺制)3μl
[0167]
mpn mix(genecube(r)mpn、东洋纺制)3μl
[0168]
ic mix(genecube(r)mpn、东洋纺制)1μl
[0169]
(核酸扩增和熔解曲线解析条件)
[0170]
94℃
·
2分钟
[0171]
97℃
·
1秒
‑
58℃
·
3秒
‑
63℃
·
6秒(循环数60次)
[0172]
94℃
·
30秒
[0173]
39℃
·
30秒
[0174]
39℃～75℃(升温速度0.09℃/秒)
[0175]
肺炎支原体的截止值：7.5
[0176]
内部对照的截止值：1.5
[0177]
(3
‑
3)结果
[0178]
将结果示于表1。表中，将能够检测检测对象微生物的核酸的情况示为“+”，将不能检测检测对象微生物的核酸的情况示为
“‑”
。通过将生物试样与碱性溶液混合而能够进行肺炎支原体的核酸的扩增和检测。
[0179]
[表1]
[0180][0181]
〔试验例4：肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)的检测〕
[0182]
(4
‑
1)试样液的制备
[0183]
用拭子采集肺炎支原体阴性者的咽拭液，悬浮于10mm的tris
‑
hcl(ph7.5)中。在制备的悬浮液中，添加利用boom法从包含肺炎支原体(检测对象微生物)中提取的dna试样的10mm tris
‑
hcl(ph7.5)而制成5拷贝/μl的dna浓度，作为模拟生物试样(3ml)。
[0184]
在制备的液体中，添加与该液体相同体积量的以下任意的液体，制备了混合液。
[0185]
·
20mm的氢氧化钠水溶液
[0186]
·
100mm氢氧化钠水溶液
[0187]
(4
‑
2)核酸扩增和检测
[0188]
取出所制备的混合液的一部分，直接作为核酸扩增用的试样液(4μl)，将试剂替换为下述，除此以外与试验例3同样地进行核酸扩增和检测。
[0189]
(试剂)
[0190]
kod mix(genecube(r)mpn、东洋纺制)4μl
[0191]
mpn mix(genecube(r)mpn、东洋纺制)3μl
[0192]
ic mix(genecube(r)mpn、东洋纺制)1.3μl
[0193]
(4
‑
3)结果
[0194]
将结果示于表2。需要说明的是，样品数分别为8，n＝8。通过将生物试样与碱性溶液混合而在肺炎支原体的核酸检测中抑制了假阴性。
[0195]
[表2]
[0196][0197]
〔试验例5：肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)的检测〕
[0198]
(5
‑
1)试样液的制备
[0199]
用拭子采集肺炎支原体阴性者的咽拭液，悬浮于液体运送培养基(utm360c；copan
公司制；1ml)中。在制备的悬浮液中，添加包含利用boom法从肺炎支原体(检测对象微生物)中提取的dna试样的10mm tris
‑
hcl(ph7.5)而制成10拷贝/μl的dna浓度，作为模拟生物试样(1.01ml)。
[0200]
取出所制备的液体的200μl，与50μl的200mm的氢氧化钠水溶液混合(碱浓度40mm)。将该混合液用于接下来的核酸扩增工序。
[0201]
另外，将同样制备的混合液用烧结过滤器(聚乙烯制、孔径20μm)过滤并回收滤液，将所述滤液也用于核酸扩增工序。
[0202]
(5
‑
2)核酸扩增和检测
[0203]
取出所制备的混合液和滤液各一部分，直接作为核酸扩增用的试样液(4μl)，与试验例4同样地进行核酸扩增和检测。
[0204]
(5
‑
3)结果
[0205]
将结果示于表3。需要说明的是，样品数分别为4，n＝2。以百分率示出全部样品待检体中的能检测出检测对象微生物的核酸的待检体的比例。其结果，进行过滤而得到的试样液的检测率为100％。
[0206]
[表3]
[0207] 无过滤有过滤检测率87.5％100％
[0208]
〔试验例6：肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)的检测〕
[0209]
(6
‑
1)试样液的制备
[0210]
用拭子采集肺炎支原体阴性者的咽拭液，悬浮于10mm的tris
‑
hcl(ph7.5；1ml)中。在制备的悬浮液中，添加包含利用boom法由肺炎支原体(检测对象微生物)中提取的dna试样的10mm tris
‑
hcl(ph7.5)而制成25拷贝/μl的dna浓度，作为模拟生物试样(1.01ml)。
[0211]
将该试样用以下任意的液体稀释5倍。
[0212]
·
灭菌水
[0213]
·
液体运送培养基(utm360c；copan公司制)
[0214]
·
液体运送培养基(utm360c；copan公司制)与200mm的氢氧化钾水溶液的混合液(培养基∶koh液的体积比3∶1)
[0215]
·
液体运送培养基(eswab；copan公司制)与200mm的氢氧化钾水溶液的混合液(培养基∶koh液的体积比3∶1)
[0216]
用烧结过滤器(聚乙烯制、孔径20μm)过滤经稀释的各液体并回收滤液。
[0217]
(6
‑
2)核酸扩增和检测
[0218]
取出所回收的各滤液的一部分，直接作为核酸扩增用的试样液(4μl)，与试验例4同样地以n＝4测定进行核酸扩增和检测。
[0219]
(6
‑
3)结果
[0220]
将结果示于表4。使用了氢氧化钾水溶液的试样液的氢氧化钾浓度为40mm。使用了氢氧化钾水溶液的试样液能够有效地减少假阴性。通过使用运送培养基与氢氧化钾水溶液的混合液，能够良好地检测。
[0221]
[表4]
[0222] 水utmutm+koheswab+koh
检测率0％25％75％100％
[0223]
〔试验例7：百日咳杆菌(bordetella pertussis)的检测〕
[0224]
(7
‑
1)试样液的制备
[0225]
用拭子采集百日咳杆菌阴性者的鼻腔拭液，悬浮于生理盐水(1ml)中。在制备的悬浮液中，添加包含利用boom法从百日咳杆菌(检测对象微生物)中提取的dna试样的10mm tris
‑
hcl(ph7.5)而制成100拷贝/μl的dna浓度，作为模拟生物试样(1.01ml)。
[0226]
取出模拟生物试样的35μl，悬浮于180μl的液体运送培养基(eswab；copan公司制)中后，混合了45μl的200mm的氢氧化钠水溶液。用烧结过滤器(聚乙烯制、孔径20μm)将该液体(氢氧化钠浓度36mm)过滤并回收了滤液。
[0227]
除此之外还将180μl的液体运送培养基(eswab；copan公司制)与45μl的200mm的氢氧化钠水溶液混合来制备混合液，将模拟生物试样的35μl悬浮于该混合液中。用烧结过滤器(聚乙烯制、孔径20μm)将该液体(氢氧化钠浓度36mm)过滤并回收了滤液。
[0228]
(7
‑
2)核酸扩增和检测
[0229]
取出所回收的各滤液的一部分，直接作为核酸扩增用的试样液，供于核酸扩增(n＝4)。即，在各4μl的试样液中添加核酸扩增和检测用的下述试剂，在下述条件下利用pcr进行核酸扩增，通过熔解曲线解析进行核酸检测。核酸扩增和熔解曲线解析使用东洋纺制genecube(注册商标)。
[0230]
(试剂)
[0231]
kod mix(genecube(r)test basic、东洋纺制)4μl
[0232]
0.5μm borf引物(序列号1)
[0233]
1.5μm borr引物(序列号2)
[0234]
0.3μm杂交探针(将3’末端用bodipy
‑
fl标记；序列号3)
[0235]
ppd mix(genecube(r)test basic、东洋纺制)3μl
[0236]
ic mix(genecube(r)test basic、东洋纺制)1.3μl
[0237]
(核酸扩增和熔解曲线解析条件)
[0238]
94℃
·
2分钟、
[0239]
97℃
·
1秒
‑
58℃
·
3秒
‑
63℃
·
6秒(循环数60次)、
[0240]
94℃
·
30秒、
[0241]
39℃
·
30秒、
[0242]
39℃～75℃(升温速度0.09℃/秒)。
[0243]
百日咳杆菌的截止值：5
[0244]
内部对照的截止值：1.5
[0245]
(7
‑
3)结果
[0246]
在将dna悬浮于液体运送培养基后添加碱性溶液(氢氧化钾水溶液)的情况、及在液体运送培养基与碱性溶液的混合液中混合了dna的情况下，也能够良好地检测出百日咳杆菌(n＝4；检测率100％)。
[0247]
〔试验例8：肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)的检测〕
[0248]
(8
‑
1)试样液的制备
[0249]
用拭子采集肺炎支原体阴性者的鼻腔拭液，悬浮于液体运送培养基(eswab；copan
公司制；1ml)中。在制备的悬浮液的一部分(300μl)中，混合了体积比三分之一的量、即0.1ml的200mm或250mm氢氧化钾水溶液。混合液的氢氧化钾浓度为50mm或62.5mm。在该混合液中添加包含利用boom法从肺炎支原体(检测对象微生物)中提取的dna试样的10mm tris
‑
hcl(ph7.5)而制成15拷贝/μl的dna浓度，用烧结过滤器(聚乙烯制、孔径20μm)进行过滤并回收了滤液。
[0250]
(8
‑
2)核酸扩增和检测
[0251]
取出所回收的各种滤液的一部分，直接作为核酸扩增用的试样液(4μl)，与试验例4同样地进行核酸扩增和检测(n＝8)。
[0252]
(8
‑
3)结果
[0253]
试样液中的氢氧化钾浓度为50mm时，能够可靠地检测检测对象微生物，而该浓度为62.5mm时，出现了检测结果为阴性的情况(假阴性)(检测率62.5％)。由这样的结果明确了：混合液的碱浓度高于50mm时，检测精度降低。
[0254]
〔试验例9：诺如病毒的检测〕
[0255]
(9
‑
1)试样液的制备
[0256]
将以约10％悬浮诺如病毒阴性者的粪便于灭菌水中而成的液体0.06ml分别与灭菌水0.24ml或2、5、10、20、30或75mm的氢氧化钾水溶液0.24ml进行混合。将在该混合液中添加灭活的诺如病毒(nattrol
tm norovirus gi positive contorol和nattrol
tm norovirus gii positive contorol；3000拷贝/μl)2μl而得到的液体，用烧结过滤器(聚乙烯制、孔径250μm)将该液体过滤并回收了滤液。在各滤液200μl中混合上述任意浓度的氢氧化钾水溶液200μl，将得到的混合液离心分离(13000g，3分钟)并回收了上清液。该上清液中的碱浓度分别为0、1.8、4.5、9、18、27、67.5mm。
[0257]
(9
‑
2)核酸扩增和检测
[0258]
取出所回收的各上清液的一部分，直接作为核酸扩增用的试样液(4μl)，供于核酸扩增。即，在4μl的各试样液中添加核酸扩增和检测用的下述试剂，在下述条件下利用pcr进行核酸扩增，通过熔解曲线解析进行核酸检测。核酸扩增和熔解曲线解析使用东洋纺制genecube(注册商标)test basic。需要说明的是，东洋纺制revertraace是包含逆转录酶的试剂。此外本试验例中使用的序列号4～6所示的引物和探针是用于检测gi型诺如病毒的引物和探针的套装，序列号7～9所示的引物和探针是用于检测gii型的诺如病毒的引物和探针的套装。
[0259]
(试剂)
[0260]
0.2u/μl的revertraace(东洋纺公司)
[0261]
5μm的序列号4所示的引物
[0262]
1.5μm的序列号5所示的引物
[0263]
0.5μm的序列号6所示的寡核苷酸探针(将3’末端用bodipy
‑
fl标记)
[0264]
或
[0265]
0.2u/μl的revertraace(东洋纺公司)
[0266]
1.5μm的序列号7所示的引物
[0267]
5μm的序列号8所示的引物
[0268]
0.4μm的序列号9所示的寡核苷酸探针(将3’末端用bodipy
‑
fl标记)
[0269]
(核酸扩增和熔解曲线解析条件)
[0270]
42℃
·
2分钟、
[0271]
97℃
·
15秒、
[0272]
97℃
·
1秒
‑
52℃
·
6秒
‑
68℃
·
3秒(循环数60次)、
[0273]
94℃
·
30秒、
[0274]
39℃
·
30秒、
[0275]
40℃～75℃(升温速度0.09℃/秒)。
[0276]
g1或g2的截止值：10
[0277]
内部对照的截止值：1.5
[0278]
(9
‑
3)结果
[0279]
将该结果示于下述的表5。此处，g1型诺如病毒、g2型诺如病毒中仅检测出任意1个的情况为+，均检测出的情况为++。本试验例的诺如病毒检测中，氢氧化钾浓度为1.8～27mm时，能够检测出检测对象微生物，其中4.5～18mm的情况，能够进行良好的检测。另一方面，该浓度为0或67.5mm时，出现了检测结果为阴性的情况。由该结果也可知，重要的是以达到规定的碱浓度范围的方式制备混合液。
[0280]
[表5]
[0281][0282]
考察
[0283]
根据这些试验例，通过以规定的碱浓度将生物试样混合于碱性溶液中的简便的预处理，从而能够在无需分离核酸的情况下检测出核酸。因此，启示了如下可能性：适合的浓度的碱性溶液除了抑制由生物试样或运送培养基来源的其它成分所致的核酸扩增抑制、核酸检测抑制、和假阴性之外，不会给核酸带来抑制核酸扩增或检测的程度的变化。
[0284]
产业上的可利用性
[0285]
通过使用本发明的预处理方法，从而能够在无需分离核酸的情况下简便地检测试样中包含的微生物来源的核酸，因此可以对临床诊断的领域做出较大贡献。