基于载体VTvaf17的基因治疗的制作方法

文档序号：25541913发布日期：2021-06-18 20:38阅读：173来源：国知局

发明领域

本发明涉及基因工程，并可用于生物技术、医学、农业以制作基因治疗产品。也就是说，可以利用产生的含有治疗性基因的基因治疗dna载体将其递送到经历该基因表达减少或不足的人类和动物的细胞中，从而确保所期望的治疗效果。

发明背景

基因治疗是一种创新的医学方法，其旨在通过将新的遗传物质递送至患者的细胞、组织或器官，以补偿或抑制突变体基因的功能和/或治疗遗传病症来治疗遗传性和获得性疾病。基因治疗的目的，在大多数情况下，是用提供这些基因编码的蛋白质分子的转录和进一步翻译的基因注射生物体。在本发明的描述中，基因表达是指产生具有由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质分子。

选自基因组col1a1、col1a2、bmp2、bmp7基因组的基因在人和动物生物体中的骨和软骨组织的形成中起着重要作用。表明了某些情况下通过编码这些蛋白质的正常基因表达的紊乱所证实的这些蛋白质的低/不足的浓度与各种人类疾病的相关性。例如，col1a1和col1a2基因的突变导致遗传性结缔组织疾病，即成骨不全，伴随着频繁的骨折(yahyaevag.t.etal.,currentpediatrics.2016；15(2):175–179)。bmp2的基因缺陷导致骨脆性增加，软骨内成骨疾病和骨基质矿化(cheng.,dengc.,liy.p.int.j.biol.sci.2012；8(2):272–88)。因此，选自基因组col1a1、col1a2、bmp2、bmp7基因组并使用基因治疗方法引入生物体中的基因的表达增加对于校正与上述基因的作用缺陷相关的人和动物的状况具有重要意义。

为了达到基因治疗的目的，采用特定构建的基因治疗载体，其分为病毒性和非病毒性。最近，越来越多的关注于以质粒载体为首的非病毒基因递送系统的开发。这些载体没有病毒载体固有的限制：在靶细胞中它们以游离体存在而不会整合到基因组中；生产它们很便宜；施用质粒载体不导致免疫反应或副作用，这使其成为基因治疗和遗传疾病预防如dna疫苗的便捷工具(lil,petrovskyn.molecularmechanismsforenhanceddnavaccineimmunogenicity.expertrevvaccines.2016；15(3):313-29)。

然而，质粒载体用于基因治疗的限制为：1)在携带菌株中产生构建体的抗生素抗性基因的存在；2)以病毒基因组的序列表示的各种调控元件的存在；3)治疗性质粒载体的大小，其决定了载体递送至靶细胞的效率。

众所周知，欧洲药品管理局认为有必要避免将抗生素抗性标记加入新工程化的基因治疗的质粒载体中(关于开发过程中基因治疗医药产品设计修改的反思文件/2011年12月14日ema/cat/gtwp/44236/2009高级疗法委员会)。并且还建议避免在治疗质粒载体中存在调控元件，以增加作为各种病毒基因组一部分的治疗性基因(启动子、增强子、翻译后调控元件)的表达(基因治疗医药产品的质量、非临床和临床方面的指南/2015年3月23日，ema/cat/80183/2014，高级疗法委员会)。

基因治疗载体的大小也是至关重要的。众所周知，现代质粒载体常常具有非必要的非功能位点，其大大增加了其长度(mairhoferj,grabherrr.rationalvectordesignforefficientnon-viralgenedelivery:challengesfacingtheuseofplasmiddna.molbiotechnol.2008.39(2):97-104)，这有时阻止了将所需大小的治疗性基因插入载体。

已知一种方法在不使用抗生素的情况下在大肠杆菌菌株中积累质粒载体(cranenburghrm,hanakja,williamssg,sherrattdj.escherichiacolistrainsthatallowantibiotic-freeplasmidselectionandmaintenancebyrepressortitration.nucleicacidsres.2001.29(5):e26)。构建了大肠杆菌菌株dh1lacdapd和dh1lacp2dapd，其中编码参与l-赖氨酸生物合成的2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸-n-琥珀酰转移酶的基因dapd受lac启动子控制。在没有诱导剂iptg(异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)的情况下，这些菌株经受溶解。然而，施用含有lac操纵子的port多拷贝质粒载体诱导基因dapd的表达，从而可以选择和繁殖转化的克隆。但是，这些菌株的特点在于转化水平低且不稳定。

专利申请号ru2011152377a报道了一个发明，用于制备一种不含抗生素抗性的表达质粒载体，该载体含有编码阻遏蛋白的多核苷酸序列。所述阻遏蛋白的表达调节整合到大肠杆菌基因组的区域中的有毒基因产物的表达。但是，与任何其他基于使用阻遏蛋白的选择的方法一样，这种方法的特点在于转化不稳定且效率低。

专利号us9644211b2描述了产生最小长度载体的方法。该载体不含细菌基因组序列，并由para介导的重组在培养的大肠杆菌菌株中产生。这种产生最短载体的方法的缺点在于无法将其用于工业化规模。

已知基因治疗载体的产生，其包括编码与骨和软骨组织的修复有关的人结构蛋白质或生长因子的核苷酸序列。col1a1基因编码i型胶原α1链，且col1a2基因编码i型胶原α2链，其在暴露于断裂风险的骨质疏松症和易碎骨的遗传易感性的发展中潜在重要。这是由于如下事实，即i型胶原存在于骨、肌腱、韧带、皮肤和其他结缔组织。

申请wo2015035395描述了治疗性多核苷酸在个体关节中产生软骨细胞或软骨型细胞的用途，而基于病毒和非病毒载体构建多核苷酸，其中启动子控制下的col1a1和col1a2基因适合在非血管、非神经元或低氧环境中有活性。

骨形态发生蛋白(bmp)是骨和软骨修复的最重要因素。bmp家族的蛋白质影响细胞膜受体，并在不同类型的细胞(包括成骨细胞、成软骨细胞、神经元和上皮细胞)的生长调节、分化和凋亡中发挥重要作用。这些蛋白质刺激细胞数量的增加，还能使间充质干细胞加速分化为成软骨细胞和成骨细胞，增加胶原合成，提高碱性磷酸酶的活性，增加骨钙素的合成，刺激细胞外基质的合成及其随后的矿化作用(katagirit,watabet.bonemorphogeneticproteins.coldspringharbperspectbiol.2016,8(6))。

目前，bmp家族的一些成员已被用于医学。例如，改善骨植入物的骨诱导性的现代生物学方法集中于在不同类型的载体上递送显著浓度的bmp(lowerjw,rosenv.bonemorphogeneticprotein-basedtherapeuticapproaches.coldspringharbperspectbiol.2018,10(4))。临床上使用重组bmp以诱导骨发生受到这些蛋白质在注射部位和血液中的快速降解，以及异位骨化的风险的限制。

这组蛋白质中研究最充分的是bmp-2和bmp-7蛋白。专利ru2408727描述了包含在大肠杆菌菌株m15中并提供重组蛋白collbd-bmp-2的表达的3447bp重组质粒pcollbd-bmp-2，所述重组蛋白collbd-bmp-2由来自人sparc钙依赖性细胞外蛋白的collbd胶原结合域，来自甘氨酸和丝氨酸残基的间隔子以及bmp-2骨形态发生蛋白组成。构建的人工细菌融合蛋白操纵子在噬菌体t5早期启动子的启动子区域的控制下。所得的重组质粒包含细菌操纵子bla,其编码构成选择标记的beta-内酰胺酶，用于使用反选择法选择大肠杆菌转化体。

源ep2228071(a1)描述了基于商业化质粒vr1012的重组载体(j.hartikkaetal.humangenetherapy1996,7,1205-1217)，其在宿主细胞中表达bmp-7蛋白(与信号肽融合以促进bmp-7分泌到细胞外介质中)，以及此类重组载体的药物组合物，用于治疗哺乳动物中的肾病。所述载体含有编码哺乳动物或人类bmp-7蛋白的多核苷酸，其与启动子元件可操作性地连接。可用于本发明的启动子和增强子包括但不限于以下元件：劳斯肉瘤病毒的ltr启动子和增强子、tkhsv-1基因、sv40早期或晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子(mlp)、磷酸甘油酸激酶基因、金属硫蛋白基因,α-1-抗胰蛋白酶基因、白蛋白基因、胶原酶基因、弹性蛋白酶i基因、β-肌动蛋白基因、β-球蛋白基因、γ-球蛋白基因、α-甲胎蛋白基因和肌肉肌酸激酶基因。bmp-7蛋白基因表达的优选启动子是人或鼠源的巨细胞病毒(cmv-ie)早期启动子。因此，在本发明中，启动子具有病毒或细胞来源。本发明中的载体可以是任何合适的重组病毒或病毒载体，如痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒病毒、逆转录病毒等，或者载体也可以是质粒。

本发明用于基因治疗的重组dna载体的原型是专利号us9550998(b2)，它描述了一种用于基因免疫的重组载体的生产方法。由此产生的载体是一种超螺旋质粒dna载体，其用于在人和动物细胞中表达克隆基因。该载体含有复制起点(起点)、包括人巨细胞病毒启动子和增强子的调控元件和来自人t细胞淋巴病毒的调控元件。通过借助于噬菌体向该菌株中施用的sacb基因的反义互补，将载体积累在不含抗生素的专用大肠杆菌菌株中。该dna载体在基因治疗中的用途受限于病毒基因组调控序列的存在。

发明公开内容

本发明的目的在于基于特定构建的基因治疗dna载体来构建一种基因治疗dna载体，以增加选自下组的基因的表达，即i型胶原α1链的col1a1基因,i型胶原α2链的col1a2基因、骨形态发生蛋白bmp-2基因和骨形态发生蛋白bmp-7基因；以及构建携带这些基因治疗dna载体的菌株用于进行工业化规模生产。

同时，dna载体应以最佳方式组合以下特性：

i)由于基因治疗dna载体中不存在抗生素抗性基因，安全用于人类和动物的基因治疗的可能性，

ii)确保有效基因递送到靶细胞的长度，

iii)确保治疗性基因的有效表达，同时不由病毒基因组的核苷酸序列代表的调控元件的存在，

iv)工业化规模的可生产性和可构建性。

本文中根据国家监管机构对基因治疗药物的要求，尤其是欧洲药品管理局的要求，提供了项i和iii。

通过使用基于基因治疗dna载体vtvaf17产生的基因治疗dna载体来实现指定的目的，所述基因治疗dna载体用于治疗与骨发生，骨和软骨组织形成和再生的障碍相关的疾病，用于改善骨植入物的骨诱导，经由增加人和动物中的col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的表达来实现，所述疾病由如下引起：包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节，间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化，胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少，尤其包括在骨折的情况下，骨的脆性增加，骨矿化的减少。

该基因治疗dna载体具有克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的col1a1治疗性基因的编码区，从而产生具有核苷酸序列seqidno.1的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，

基因治疗dna载体具有克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的col1a2治疗性基因的编码区，从而产生具有核苷酸序列seqidno.2的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2，

基因治疗dna载体具有克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的bmp2治疗性基因的编码区，从而产生具有核苷酸序列seqidno.3的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2，

基因治疗dna载体具有克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的bmp7治疗性基因的编码区，从而产生具有核苷酸序列seqidno.4的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7。

所构建的携带col1a1、col1a2、bmp2或bmp7治疗性基因的基于基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体，即基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，或vtvaf17-col1a2，或vtvaf17-bmp2，或vtvaf17-bmp7的每一个由于不超过3200bp的vtvaf17载体部分的受限的大小，具有有效地穿透到人和动物细胞中并表达选自下组的治疗性基因的能力：col1a1、col1a2、bmp2或bmp7基因。同时，不是抗生素抗性基因、病毒基因或病毒基因组调控元件的核苷酸序列用作结构元件，其确保其安全用于人和动物中的基因治疗。

还开发了基于携带col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17生产基因治疗dna载体的方法，其涉及如下获得基因治疗dna载体，即vtvaf17-col1a1，或vtvaf17-col1a2，或vtvaf17-bmp2，或vtvaf17-bmp7的每一个：将col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17，并分别获得基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，seqidno.1，或vtvaf17-col1a2，seqidno.2，或vtvaf17-bmp2，seqidno.3，或vtvaf17-bmp7，seqidno.4。

使用基于携带col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体经由增加人和动物中的col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的表达来治疗与骨发生，骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病，用于改善骨植入物的骨诱导的方法，所述疾病由如下引起：包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节，间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化，胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少，尤其包括在骨折的情况下，骨的脆性增加，骨矿化的减少，所述方法是用选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或若干选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或构建的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体转染人或动物器官和组织的细胞，和/或将所述患者或动物的人或动物自体细胞注射到人或动物器官和组织中，所述细胞用选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或若干选择的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体或构建的基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带所述治疗性基因的基因治疗dna载体转染，或所示方法的组合。

生产用于构建基因治疗dna载体的方法，所述基因治疗dna载体经由增加人和动物中的col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的表达来治疗与骨发生，骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病，用于改善骨植入物的骨诱导，所述疾病由如下引起：包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节，间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化，胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少，尤其包括在骨折的情况下，骨的脆性增加，骨矿化的减少，所述方法涉及制备大肠杆菌菌株scs110-af的电感受态细胞，并对这些细胞进行构建的基因治疗dna载体的电穿孔以及随后施用选择性培养基进行菌株稳定克隆的选择。

要求保护分别携带vtvaf17-col1a1，或vtvaf17-col1a2，或vtvaf17-bmp2，或vtvaf17-bmp7的用于其生产的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7。

在工业规模上生产基于携带col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17的基因治疗dna载体方法，所述基因治疗dna载体经由增加人和动物中的col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的表达来治疗与骨发生，骨和软骨组织形成和再生障碍相关的疾病，用于改善骨植入物的骨诱导，所述疾病由如下引起：包括成骨细胞和成软骨细胞的多种类型细胞的生长、分化和凋亡的脱调节，间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞的较慢分化，胶原合成、碱性磷酸酶活性、骨钙素合成、细胞外基质的合成及其随后的矿化的减少，尤其包括在骨折的情况下，骨的脆性增加，骨矿化的减少，所述方法涉及在工业发酵罐中将菌株的细菌培养物放大至增加细菌生物质所需的量，其后使用所述生物质提取出级份，所述级份含有治疗dna产物，即基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，或vtvaf17-col1a2，或vtvaf17-bmp2，或vtvaf17-bmp7，然后进行多级过滤并通过层析方法进行纯化。

在附图中解释了本发明的实质，其中

图1

显示携带选自col1a1、col1a2、bmp2和bmp7基因组的治疗性人类基因的cdna的基因治疗dna载体vtvaf17的结构，其构成能在大肠杆菌细胞中自主复制的环状双链dna分子。

图1显示对应于以下的结构：

a-基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，

b-基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2，

c-基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2，

d-基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7。

在结构中标明了以下载体结构元素：

ef1a-包含在基因第一内含子中的人延伸因子ef1a的启动子区与其内在增强子。其确保大多数人组织中重组基因的有效转录。

分别对应col1a1基因(图1a)，或col1a2(图1b)，或bmp2(图1c)，或bmp7(图1d)编码区的治疗性基因的阅读框，

hgh-ta-人生长因子基因的转录终止子和多腺苷酸化位点，

(4)rna-out-转座子tn10的调控元件rna-out，其在使用大肠杆菌菌株scs110-af的情况下允许无抗生素阳性选择，

ori-复制起点，自主复制的位点，其具有单一核苷酸取代以提高大多数大肠杆菌菌株细胞中的质粒产量。

标记了大肠杆菌独特的限制性位点。

图2

显示用dna载体vtvaf17-col1a1转染前和转染后48小时，hdfa人原代真皮成纤维细胞(atccpcs-201-012)中治疗性基因即人col1a1基因的mrna积累的图，以证实携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率，其中：

21–用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染前的col1a1基因的cdna，

22–用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染后的col1a1基因的cdna，

23–用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染前的b2m基因的cdna，

24–用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染后的b2m基因的cdna。

将genbank数据库中编号为nm004048.2的b2m(β-2-微球蛋白)基因用作为参考基因。

图3

显示用dna载体vtvaf17-col1a2转染前和转染后48小时，人真皮成纤维细胞中治疗性基因即人col1a2基因的mrna积累的图，以证实携带col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的效率，其中：

31–用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染前的col1a2基因的cdna，

32–用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染后的col1a2基因的cdna，

33–用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染前的b2m基因的cdna，

34–用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染后的b2m基因的cdna。

将genbank数据库中编号为nm004048.2的b2m(β-2-微球蛋白)基因用作为参考基因，其中

图4

显示用dna载体vtvaf17-bmp2转染前和转染后48小时，mg-63人骨肉瘤细胞(atcccrl-1427)中治疗性基因即人bmp2基因的mrna积累的图，以证实携带bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率，其中：

41–用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染前的bmp2基因的cdna，

42–用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染后的bmp2基因的cdna，

43–用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染前的b2m基因的cdna，

44–用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染后的b2m基因的cdna。

将genbank数据库中编号为nm004048.2的b2m(β-2-微球蛋白)基因用作为参考基因。

图5

显示用dna载体vtvaf17-bmp7转染前和转染后48小时，hfob1.19人成骨细胞(atcccrl-11372)中治疗性基因即人bmp7基因的mrna积累的图，以证实携带bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率，其中：

51–用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染前的bmp7基因的cdna，

52–用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染后的bmp7基因的cdna，

53–用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染前的b2m基因的cdna，

54–用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染后的b2m基因的cdna。

将genbank数据库中编号为nm004048.7的b2m(β-2-微球蛋白)基因用作为参考基因。

图6

显示用dna载体vtvaf17-col1a1转染hdfa人原代真皮成纤维细胞(atccpcs-201-012)后，这些细胞的培养基中i型胶原α1链蛋白浓度的图，以评估用携带col1a1基因的dna载体vtvaf17-col1a1转染这些细胞后，hdfa人原代真皮成纤维细胞的培养基中i型胶原α1链蛋白浓度的变化，其中

培养物a6–用不含质粒dna的树枝状聚合物水溶液转染的hdfa人原代真皮成纤维细胞(参考)，

培养物b6-用dna载体vtvaf17转染的hdfa人原代真皮成纤维细胞，

培养物c6-用携带col1a1基因的dna载体vtvaf17-col1a1转染的hdfa人原代真皮成纤维细胞。

图7

显示用dna载体vtvaf17-col1a2转染人真皮成纤维细胞后，这些细胞的培养基中i型胶原α2链蛋白浓度的图，以评估用携带col1a2基因的dna载体vtvaf17-col1a2转染这些细胞后，原代人真皮成纤维细胞的培养基中i型胶原α2链蛋白浓度的变化，其中

培养物a7–用不含质粒dna的树枝状聚合物水溶液转染的人真皮成纤维细胞(参考)，

培养物b7-用dna载体vtvaf17转染的人真皮成纤维细胞，

培养物c7-用携带col1a2基因的dna载体vtvaf17-col1a2转染的人真皮成纤维细胞。

图8

显示用dna载体vtvaf17-bmp2转染mg-63人骨肉瘤细胞(atcccrl-1427)后，这些细胞的培养基中骨形态发生蛋白2浓度的图，以评估用携带bmp2基因的dna载体vtvaf17-bmp2转染mg-63人骨肉瘤细胞(atcccrl-1427)后，这些细胞的培养基中骨形态发生蛋白2浓度的变化，其中

培养物a8–用不含质粒dna的树枝状聚合物水溶液转染的mg-63人骨肉瘤细胞的培养物(参考)，

培养物b8-用dna载体vtvaf17转染的mg-63人骨肉瘤细胞的培养物，

培养物c8-用携带bmp2基因的dna载体vtvaf17-bmp2转染的mg-63人骨肉瘤细胞的培养物。

图9

显示用dna载体vtvaf17-bmp7转染hfob1.19人成骨细胞(atcccrl-11372)后，这些细胞的培养基中骨形态发生蛋白7浓度的图，以评估用携带bmp7基因的dna载体vtvaf17-bmp7转染hfob1.19人成骨细胞(atcccrl-11372)后，这些细胞的培养基中骨形态发生蛋白7浓度的变化，其中

培养物a9–用不含质粒dna的树枝状聚合物水溶液转染的hfob1.19人成骨细胞的培养物(参考)，

培养物b9-用dna载体vtvaf17转染的hfob1.19人成骨细胞的培养物，

培养物c9-用携带bmp7基因的dna载体vtvaf17-bmp7转染的hfob1.19人成骨细胞的培养物。

图10

显示在将基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2注射到三名患者的皮肤中后，这些患者的皮肤活检样品中col1a2蛋白浓度的图，以评估功能活性，即治疗性基因在蛋白质水平的表达，以及使用携带col1a2治疗性基因的基于基因治疗载体vtvaf17的基因治疗dna载体增加蛋白质表达水平的可能性。

在图10中指示了以下元素：

p1i–基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2注射区域中患者p1皮肤活检，

p1ii–基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)注射区域中患者p1皮肤活检，

p1iii–来自完整部位的患者p1皮肤活检，

p2i–基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2注射区域中患者p2皮肤活检，

p2ii–基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)注射区域中患者p2皮肤活检，

p2iii–来自完整部位的患者p2皮肤活检，

p3i–基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2注射区域中患者p3皮肤活检，

p3ii–基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)注射区域中患者p3皮肤活检，

p3iii–来自完整部位的患者p3皮肤活检。

图11

显示在将基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1注射到三名患者的软骨组织中后，这些患者的软骨活检样品中col1a1蛋白浓度的图，以评估功能活性，即治疗性基因在蛋白质水平的表达，以及使用携带col1a1治疗性基因的基于基因治疗载体vtvaf17的基因治疗dna载体增加蛋白质表达水平的可能性。

在图11中指示了以下元素：

p1i–基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1注射区域中患者p1软骨活检，

p1ii–基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)注射区域中患者p1软骨活检，

p1iii–来自完整部位的患者p1软骨活检，

p2i–基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1注射区域中患者p2软骨活检，

p2ii–基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)注射区域中患者p2软骨活检，

p2iii–来自完整部位的患者p2软骨活检，

p3i–基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1注射区域中患者p3软骨活检，

p3ii–基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)注射区域中患者p3软骨活检，

p3iii–来自完整部位的患者p3软骨活检。

图12

显示用经基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的自体成纤维细胞培养物注射皮肤后，人皮肤活检样品中col1a1蛋白浓度的图，以通过引入经基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的自体细胞来证明其使用方法，

在图12中指示了以下元素：

p1a–经基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的患者自体成纤维细胞培养物的注射区域中患者p1皮肤活检，

p1b–经基因治疗dna载体vtvaf17转染的患者自体成纤维细胞培养物的注射区域中患者p1皮肤活检，

p1c–来自完整部位的患者p1皮肤活检。

图13

图13a显示向大鼠损伤区域注射以下项后，手术模拟的损伤区域中大鼠骨活检样品中i型胶原α1链(col1a1)蛋白和i型胶原蛋白α2链(col1a2)蛋白的浓度变化的图：

第1组中-基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、vtvaf17-col1a2、vtvaf17-bmp2和vtvaf17-bmp7的混合物，

第2组中-基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、vtvaf17-col1a2、vtvaf17-bmp2和vtvaf17-bmp7的粗磷酸钙沉淀物，

第3组(对照组)中-生理盐水。

图例

图13b显示向大鼠损伤区域注射以下项后，手术模拟的损伤区域中大鼠骨活检样品中骨形态发生蛋白2(bmp2)和骨形态发生蛋白7(bmp7)的浓度变化的图：

第1组中-基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、vtvaf17-col1a2、vtvaf17-bmp2和vtvaf17-bmp7的混合物，

第2组中-基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、vtvaf17-col1a2、vtvaf17-bmp2和vtvaf17-bmp7的粗磷酸钙沉淀物，

第3组(对照组)中-生理盐水。

图例

图14

显示在用dna载体vtvaf17-bmp2转染前和转染cnob犬成骨细胞后48小时，这些细胞的培养基中bmp2治疗性基因的mrna积累的图，其中

141–dna载体vtvaf17-bmp2转染前，cnob犬成骨细胞中bmp2基因的cdna，

142–dna载体vtvaf17-bmp2转染后，cnob犬成骨细胞中bmp2基因的cdna，

143–dna载体vtvaf17-bmp2转染前，cnob犬成骨细胞中act基因的cdna，

144–dna载体vtvaf17-bmp2转染后，cnob犬成骨细胞中act基因的cdna。

genbank数据库中编号为dq131478.1的犬肌动蛋白基因(act)用作参考基因。

本发明的实施方案

基于3165-bp的基因治疗dna载体vtvaf17构建携带以下人基因的基因治疗dna载体-i型胶原α1链col1a1基因，或i型胶原α2链col1a2基因，或骨形态发生蛋白bmr-2基因，或骨形态发生蛋白bmr-7基因，所述载体经设计以增加这些治疗性基因在人和动物组织中的表达水平。产生每个携带人治疗性基因的基因治疗dna载体的方法涉及将选自以下基因组的治疗性基因的蛋白编码序列克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的多接头中：col1a1、col1a2、bmp2和bmp7。

基于携带选自基因组col1a1，col1a2，bmp2和bmp7的治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17产生基因治疗dna载体的方法如下进行：

1.如下获得col1a1基因的编码区(4422bp)，或col1a2基因的编码区(4128bp)，或bmp2基因的编码区(1219bp)，或bmp7基因的编码区(1322bp)：通过从正常组织的生物样品中分离总rna，然后进行逆转录反应和pcr扩增(使用通过出于此目的的化学合成方法获得的寡核苷酸)，随后用限制性内切核酸酶nhei和hindiii对扩增产物进行切割。

2.将col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的编码区通过nhei和hindiii位点克隆到基因治疗dna载体vtvaf17的多接头中，以产生基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，seqidno.1，或vtvaf17-col1a2，seqidno.2，或vtvaf17-bmp2，seqidno.3，或vtvaf17-bmp7，seqidno.4。获得的携带选自col1a1、col1a2、bmp2和bmp7基因组的治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17通过电穿孔转化大肠杆菌菌株scs110-af，以及对获得的克隆进行无抗生素选择。

3.为确认构建的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，seqidno.1，或vtvaf17-col1a2，seqidno.2，或vtvaf17-bmp2，seqidno.3，或vtvaf17-bmp7，seqidno.4的效率，对以下进行评估：

a)用基因治疗dna载体转染不同细胞系后，人细胞中治疗性基因mrna积累的变化(通过实时pcr-rt-pcr)，

b)用基因治疗dna载体转染不同细胞系后，人细胞培养基中治疗性蛋白定量水平的变化(使用酶联免疫吸附测定法elisa)，

c)将基因治疗dna载体注射入人和动物组织后，这些组织活检样品的上清液中治疗性蛋白定量水平的变化(使用elisa)，

d)将用基因治疗dna载体转染的人的自体细胞注射入人组织后，这些组织活检的上清液中治疗性蛋白定量水平的变化(使用elisa)。

为了确认应用构建的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，seqidno.1，或vtvaf17-col1a2，seqidno.2，或vtvaf17-bmp2，seqidno.3，或vtvaf17-bmp7，seqidno.4的可行性，进行如下项：

a)用基因治疗dna载体转染不同人细胞系，

b)将基因治疗dna载体注射入不同人类和动物组织，

c)将基因治疗dna载体的混合物注射到动物组织中，

d)将用基因治疗dna载体转染的自体细胞注射入人体组织。

为了确认大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7的生产，进行转化、选择及随后通过提取质粒dna进行生物量生长。

为了确认基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，seqidno.1，或vtvaf17-col1a2，seqidno.2或vtvaf17-bmp2，seqidno.3，或vtvaf17-bmp7，seqidno.4在工业规模上的可生产性和可构建性，进行如下项：

a)大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7的工业规模发酵，其每一个都包含基因治疗dna载体vtvaf17，该载体携带选自col1a1、col1a2、bmp2和bmp7基因组的治疗性基因的蛋白质编码序列。

实施例1.

产生携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1。

通过nhei和hindiii限制性位点将col1a1基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17中来构建基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1。col1a1基因的编码区(4422bp)如下获得：从人生物组织样品中分离总rna，然后用商业的试剂盒mint-2(evrogen，russia)和构建的寡核苷酸

col1a1_fccagctagcgtctagggtctagacatgttc，

col1a1_rtataagcttctacaggaagcagacagggccaac，

进行逆转录反应，

并使用市售的高保真dna聚合酶试剂盒(newenglandbiolabs，usa)和构建的寡核苷酸

col1a1_sftgacgagaccaagaactgcc，

col1a1_srgcaccatcatttccacgagc，

进行pcr扩增。

col1a1基因编码区和dna载体vtvaf17的扩增产物用nhei和hindiii限制性内切核酸酶(newenglandbiolabs，usa)进行切割。

这产生了含有核苷酸序列seqidno.1的dna载体vtvaf17-col1a1，其携带治疗性基因即4422bpcol1a1基因，从而允许以图1a所示的结构进行无抗生素选择。

通过将从不同来源衍生的6个dna片段合并来构建基因治疗dna载体vtvaf17。

(a)复制起点(ori)，其通过pcr扩增具有点突变的市售质粒pbr322的区域产生，

(b)ef1a启动子区域，其通过pcr扩增人类基因组dna的位点产生，

(c)hgh-ta转录终止子，其通过pcr扩增人类基因组dna的位点产生，

(d)转座子tn10的rna-out调控位点，其由寡核苷酸合成，

(e)卡那霉素抗性基因，其通过pcr扩增市售人质粒pet-28的位点产生，

(f)多接头，其通过对两种合成的寡核苷酸进行退火产生。

根据制造商的说明，使用市售的高保真dna聚合酶试剂盒(newenglandbiolabs)进行pcr扩增。片段有重叠的区域，从而允许它们用随后的pcr扩增来合并。使用寡核苷酸ori-f和ef1-r合并片段(a)和(b)，以及使用寡核苷酸hgh-f和kan-r合并片段(c)、(d)和(e)。之后，通过限制并随后通过位点bamhi和ncoi连接将产生的片段合并。这导致质粒仍然缺乏多接头。为了添加它，通过bamhi和ecori位点切割质粒，然后与片段(f)连接。因此，构建了一个3165bp的载体，其携带卡那霉素抗性基因，侧翼为spei限制性位点。然后，该基因被spei限制性位点切割，且剩余的片段与其自身连接。这产生了3165bp的基因治疗dna载体vtvaf17，该载体是重组的，并允许无抗生素选择。

实施例2.

产生携带col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2。

通过nhei和hindiii限制性位点将col1a2基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17中来构建基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2。col1a2基因的编码区(4128bp)如下获得：从人生物组织样品中分离总rna，然后用商业的试剂盒mint-2(evrogen，russia)和构建的寡核苷酸

col1a2_fccagctagcgtctaagtgctagacatgctc，

col1a2_rcgaagcttttatttgaaacagactgggcca，

进行逆转录反应，

并使用市售的高保真dna聚合酶试剂盒(newenglandbiolabs，usa)和构建的寡核苷酸

col1a2_sfctggtgaagctggtcgtgat，

col1a2_srcggatacaggtttcgccagt，

进行pcr扩增。

col1a1基因编码区和dna载体vtvaf17的扩增产物用nhei和hindiii限制性内切核酸酶(newenglandbiolabs，usa)进行切割。

这产生了含有核苷酸序列seqidno.2的7269bpdna载体vtvaf17-col1a2，其携带治疗性基因即4128bpcol1a2基因，从而允许以图1b所示的结构进行无抗生素选择。

根据实施例1中所述构建基因治疗dna载体vtvaf17。

实施例3.

产生携带人bmp2治疗性基因的dna载体vtvaf17-bmp2。

通过nhei和hindiii限制性位点将bmp2基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17中来构建基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2。bmp2基因的编码区(1219bp)如下获得：从人组织活检样品中分离总rna，然后用商业的试剂盒mint-2(evrogen，russia)和构建的寡核苷酸

bmp2_facagctagcctcctaaaggtccaccatggt，

bmp2_rtataagcttctagcgacacccacaaccct，

进行逆转录反应，

并使用市售的高保真dna聚合酶试剂盒(newenglandbiolabs，usa)和构建的寡核苷酸

bmp2_sfatgcaagcaggtgggaaagt，

bmp2_srgggagccacaatccagtcat，

进行pcr扩增。

col1a1基因编码区和dna载体vtvaf17的扩增产物用nhei和hindiii限制性内切核酸酶(newenglandbiolabs，usa)进行切割。

这产生了含有核苷酸序列seqidno.3的4360bp基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2，其携带1219bpbmp2治疗性基因，从而允许以图1c所示的结构进行无抗生素选择。

根据实施例1中所述构建基因治疗dna载体vtvaf17。

实施例4.

产生携带bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7。

通过nhei和hindiii限制性位点将bmp7基因的编码区克隆到dna载体vtvaf17中来构建基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7。bmp7基因的编码区(1322bp)如下获得：从人组织活检样品中分离总rna，然后用商业的试剂盒mint-2(evrogen，russia)和构建的寡核苷酸

bmp7_ftcagctagcgtagagccggcgcgatgca，

bmp7_rtataagcttctagtggcagccacaggc，

进行逆转录反应，

并使用市售的高保真dna聚合酶试剂盒(newenglandbiolabs，usa)和构建的寡核苷酸

bmp7_sfgctggctggtgtttgacatc，

bmp7_srtggtggcgttcatgtaggag，

进行pcr扩增。

col1a1基因编码区和dna载体vtvaf17的扩增产物用nhei和hindiii限制性内切核酸酶(newenglandbiolabs，usa)进行切割。

这产生了含有核苷酸序列seqidno.4的4463bpdna载体vtvaf17-bmp7，其携带治疗性基因即1322bpbmp7基因，从而允许以图1d所示的结构进行无抗生素选择。

根据实施例1中所述构建基因治疗dna载体vtvaf17。

实施例5.

证明携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率。该实施例还表明了使用携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体的可行性。

为了证实基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率，评估了用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染后48小时，hdfa人原代真皮成纤维细胞(atccpcs-201-012)中col1a1治疗性基因的mrna积累的变化。

在存在5％co2的情况下于37℃将hdfa人原代真皮成纤维细胞在成纤维细胞基础培养基(atccpcs-201-030)中生长，所述培养基添加有包括在成纤维细胞生长试剂盒-无血清(atccpcs-201-040)中的组分。为了实现90％的汇合，在转染规程前24小时将细胞以5×10⁴个细胞/孔的量接种在24孔板中。

lipofectamine3000(thermofisherscientific，usa)用作转染试剂。用基因dna载体vtvaf17-col1a1转染如下进行。在试管1中，将1μl的dna载体vtvaf17-col1a1溶液(浓度500ng/μl)和1μl的试剂p3000加入到25μl的培养基opti-mem(gibco)中。通过轻轻摇动混合制剂。在试管2中，将1μllipofectamine3000溶液加入到25μl的培养基opti-mem(gibco)。通过轻轻摇动混合制剂。将试管1的内容物加入到试管2的内容物中，并在室温下孵育混合物5分钟。将得到的溶液滴加到体积为40μl的细胞中。

将用缺乏插入的治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17转染的hdfa人原代真皮成纤维细胞(为了简化视图，图中未显示用缺乏插入的治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17转染前后的col1a1基因的cdna)用作参考。如上所述制备用于转染的参考载体vtvaf17。

如下进行从转染细胞中提取总rna。将1mltrizol试剂(thermofisherscientific)加入到具有细胞的孔中，均质化，并在65℃下加热5分钟。将样品在14,000g离心10分钟，并在65℃下再次加热10分钟。接着，加入200μl氯仿，轻轻搅拌混合物并在14,000g离心10分钟。然后分离水相，并与1/10体积的3m醋酸钠ph5.2和等体积的异丙醇混合。样品在-20℃下孵育10分钟，然后在14,000g下离心10分钟。沉淀的rna在1ml的70％乙醇中洗涤，空气干燥，并溶解在10μl无rnase的水中。为了测量转染后col1a1基因mrna的表达水平，使用实时pcr方法(sybrgreenrealtimepcr)。根据实施例1中所述的规程，使用col1a1_sf和col1a1_sr寡核苷酸用于扩增人col1a1特异性cdna。扩增产物的长度为756bp。β-2-微球蛋白(b2m)用作参考基因。

使用sybrgreenquantitectrt-pcr试剂盒(qiagen，usa)实时在20μl的扩增混合物中进行pcr扩增，所述扩增混合物含有：25μlquantitectsybrgreenrt-pcr预混液，2.5mm氯化镁，每个引物0.5μm和5μl的总rna。对于反应，在以下条件下使用cfx96扩增器(bio-rad，usa)：42℃30分钟进行1个循环的逆转录，在98℃变性15分钟，然后进行40个循环，包括在94℃变性15秒，引物在60℃退火30秒，和在72℃延伸120秒。阳性对照包括以已知浓度的质粒代表的基质上pcr的扩增子，该质粒含有col1a1和b2m基因的cdna序列。阴性对照包括去离子水。使用bio-radcfxmanager2.1软件进行pcr产物(即通过扩增获得的col1a1和b2m基因cdna)的实时定量。

为了证实经用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染hdfa人原代真皮成纤维细胞后，这些细胞中col1a1基因的表达增加，图2显示pcr产物的积累的图，其表明由于用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染hdfa人原代真皮成纤维细胞，人col1a1基因的特异性mrna水平大量增加。这证明了基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率。所呈现的结果也证实了使用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1来提高真核细胞中col1a1基因表达水平的可行性。

实施例6.

证明携带col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的效率。该实施例还表明了使用携带col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体的可行性。

为了证实携带col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的效率，评估了用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染后48小时，人真皮成纤维细胞中col1a2治疗性基因的mrna积累的变化。

如下培养人真皮成纤维细胞培养物。使用dermopunch皮肤活检设备(medax，usa)从患者耳垂后的取活检样品。用70％乙醇溶液对患者活检部位的皮肤进行初步消毒，用无菌盐水清洗，并用利多卡因溶液进行麻醉。活检样品大小约为10mm3，且重量约为11mg。将样品置于含有0.05％胰蛋白酶(gibco)和10mmedta的缓冲溶液中。在37℃的磁力搅拌器中搅拌孵育细胞。然后用100μm孔径的过滤器(nalgen，usa)过滤细胞悬浮液，130g离心10分钟，将沉淀的细胞重悬于15ml添加有包括在成纤维细胞生长试剂盒-无血清(atccpcs-201-040)中的组分的成纤维细胞基础培养基(atccpcs-201-030)中，置于75cm²烧瓶(eppendorf)中，并在5％со2存在下在37℃孵育36-72小时。为了达到90％的汇合，在转染规程前24小时，将细胞以4×10⁴个细胞/孔的量在相同组成的培养基中接种到24孔板中。lipofectamine3000(thermofisherscientific，usa)用作转染试剂。根据实施例5中所述的规程进行用表达人col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染。将用基因治疗dna载体vtvaf17转染的相同细胞(为了简化视图，图中未显示用缺乏插入的治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17转染前后的col1a2基因的cdna)用作参考。根据实施例5中所述的规程进行从转染细胞中提取总rna，并合成第一cdna链。为了测量转染后col1a2基因mrna的表达水平，使用实时pcr方法(sybrgreenrealtimepcr)。根据实施例2中所述的规程，使用col1a2_sf和col1a2_sr寡核苷酸用于扩增col1a2特异性cdna。扩增产物的长度为853bp。β-2-微球蛋白(b2m)用作参考基因。

使用sybrgreenquantitectrt-pcr试剂盒(qiagen，usa)实时在20μl的扩增混合物中进行pcr扩增，所述扩增混合物含有：25μlquantitectsybrgreenrt-pcr预混液，2.5mm氯化镁，每个引物0.5μm和5μl的总rna。对于反应，在以下条件下使用cfx96扩增器(bio-rad，usa)：42℃30分钟进行1个循环的逆转录，在98℃变性15分钟，然后进行40个循环，包括在94℃变性15秒，引物在60℃退火30秒，和在72℃延伸120秒。阳性对照包括以已知浓度的质粒代表的基质上pcr的扩增子，该质粒含有col1a2和b2m基因的cdna序列。阴性对照包括去离子水。使用bio-radcfxmanager2.1软件进行pcr产物(即通过扩增获得的col1a2和b2m基因cdna)的实时定量。

为了证实经用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染人真皮成纤维细胞后，这些细胞的培养物中col1a2基因的表达增加，图3显示pcr产物的积累的图，其表明由于用携带人col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染人真皮成纤维细胞，col1a2人基因的特异性mrna水平大量增加。这证明了基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的效率。所呈现的结果也证实了使用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2来提高真核细胞中col1a2基因表达水平的可行性。

实施例7.

证明携带bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率。该实施例还表明了使用携带bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体的可行性。

为了证实携带bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率，评估了用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染后48小时，mg-63人骨肉瘤细胞(atcccrl-1427)中bmp2治疗性基因的mrna积累的变化。

在5％co2存在下，在37℃，mg-63人骨肉瘤细胞在dmem(gibco)培养基中培养，所述培养基添加有10％胎牛血清(gibco)和10μg/ml庆大霉素。为了达到90％的汇合，在转染规程前24小时，以5×10⁴个细胞/孔的量将细胞接种在24孔板中。lipofectamine3000(thermofisherscientific，usa)用作转染试剂。根据实施例5中所述的规程进行用表达人bmp2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染。将用基因治疗dna载体vtvaf17转染的mg-63人骨肉瘤细胞(为了简化视图，图中未显示用缺乏插入的治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17转染前后的bmp2基因的cdna)用作参考。根据实施例5中所述的规程进行从转染细胞中提取总rna，并合成第一cdna链。为了测量转染后bmp2基因mrna的表达水平，使用实时pcr方法(sybrgreenrealtimepcr)。根据实施例3中所述的规程，使用bmp2_sf和bmp2_sr寡核苷酸用于扩增bmp2特异性cdna。扩增产物的长度为353bp。β-2-微球蛋白(b2m)用作参考基因。

使用sybrgreenquantitectrt-pcr试剂盒(qiagen，usa)实时在20μl的扩增混合物中进行pcr扩增，所述扩增混合物含有：25μlquantitectsybrgreenrt-pcr预混液，2.5mm氯化镁，每个引物0.5μm和5μl的总rna。对于反应，在以下条件下使用cfx96扩增器(bio-rad，usa)：42℃30分钟进行1个循环的逆转录，在98℃变性15分钟，然后进行40个循环，包括在94℃变性15秒，引物在60℃退火30秒，和在72℃延伸30秒。阳性对照包括以已知浓度的质粒代表的基质上pcr的扩增子，该质粒含有bmp2和b2m基因的cdna序列。阴性对照包括去离子水。使用bio-radcfxmanager2.1软件进行pcr产物(即通过扩增获得的bmp2和b2m基因cdna)的实时定量。

为了证实经用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染mg-63人骨肉瘤细胞后，这些细胞中bmp2基因的表达增加，图4显示pcr产物的积累的图，其表明由于用携带人bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染mg-63人骨肉瘤细胞，人bmp2基因的特异性mrna水平大量增加。这证明了基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率。所呈现的结果也证实了使用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2来提高真核细胞中bmp2基因表达水平的可行性。

实施例8.

证明携带治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率。该实施例还表明了使用携带bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体的可行性。

为了证实基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率，评估了用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染后48小时，hfob1.19人成骨细胞(atcccrl-11372)的原代培养物中bmp7治疗性基因的mrna积累的变化。

在5％co2存在下，在37℃，hfob1.19原代人成骨细胞系在f12(gibco，usa)和dmem(gibco，usa)(1:1)培养基的混合物中生长，该混合物含有2mml-谷氨酰胺、0.3mg/mlg418和10％胎牛血清(gibco，usa)。为了达到90％的汇合，在转染规程前24小时将细胞以5×10⁴个细胞/孔的量接种在24孔板中。

lipofectamine3000(thermofisherscientific，usa)用作转染试剂。根据实施例5中所述的规程进行用表达人bmp7基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染。将用基因治疗dna载体vtvaf17转染的hfob1.19人成骨细胞(为了简化视图，图中未显示用缺乏插入的治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17转染前后的bmp7基因的cdna)用作参考。根据实施例5中所述的规程进行从转染细胞中提取总rna，并合成第一cdna链。为了测量转染后bmp7基因mrna的表达水平，使用实时pcr方法(sybrgreenrealtimepcr)。根据实施例4中所述的规程，使用bmp7_sf和bmp7_sr寡核苷酸用于扩增bmp7特异性cdna。扩增产物的长度为459bp。β-2-微球蛋白(b2m)用作参考基因。

使用sybrgreenquantitectrt-pcr试剂盒(qiagen，usa)实时在20μl的扩增混合物中进行pcr扩增，所述扩增混合物含有：25μlquantitectsybrgreenrt-pcr预混液，2.5mm氯化镁，每个引物0.5μm和5μl的总rna。对于反应，在以下条件下使用cfx96扩增器(bio-rad，usa)：42℃30分钟进行1个循环的逆转录，在98℃变性15分钟，然后进行40个循环，包括在94℃变性15秒，引物在60℃退火30秒，和在72℃延伸30秒。阳性对照包括以已知浓度的质粒代表的基质上pcr的扩增子，该质粒含有bmp7和b2m基因的cdna序列。阴性对照包括去离子水。使用bio-radcfxmanager2.1软件进行pcr产物(即通过扩增获得的bmp7和b2m基因cdna)的实时定量。

为了证实经用携带bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染hfob1.19人成骨细胞后，这些细胞中bmp7基因的表达增加，图5显示pcr产物的积累的图，其表明由于用携带人bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染hfob1.19人成骨细胞，人bmp7基因的特异性mrna水平大量增加。这证明了基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率及其使用的可行性。所呈现的结果也证实了使用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7来提高真核细胞中bmp7基因表达水平的可行性。

实施例9.

证明携带治疗性基因即col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率及其使用的可行性。

为证实携带治疗性基因即col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率及其使用的可行性，对用携带人col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染hdfa人原代真皮成纤维细胞(atccpcs-201-012)后，这些细胞的细胞培养基中i型胶原α1链的蛋白浓度的变化进行评估。

将如实施例5中所述培养的hdfa人原代真皮成纤维细胞用于评估i型胶原α1链的蛋白浓度的变化。

将第6代superfect转染试剂的树枝状聚合物(qiagen，germany)用作运输分子，以不含dna载体的树枝状聚合物水溶液(a)和缺乏col1a1基因cdna的dna载体vtvaf17(b)作为参考，以及携带人col1a1基因seqidno.1区域的dna载体vtvaf17-col1a1(c)为转染试剂。根据制造商的规程(qiagen，superfecttransfectionreagenthandbook，2002)与一些修改制备dna-树枝状聚合物复合物。为在24孔板的一个孔中进行细胞转染，将无抗生素的dmem培养基加入到1μg溶解在te缓冲液中的dna载体中，最终体积为60μl，然后加入5μlsuperfect转染试剂，并通过吸移轻轻混合5次。复合物在室温下孵育10-15分钟。然后从孔中取出培养基，用1ml的pbs缓冲液洗涤孔。将350μl含有10μg/ml庆大霉素的dmem完全培养基添加到所得的复合物，轻轻混合，并加入到细胞中。将细胞与该复合物在37℃，5％co2的存在下孵育2-3小时。

然后，小心地取出培养基，并用1ml的pbs缓冲液洗涤活细胞阵列。然后，加入含有10μg/ml庆大霉素的dmem完整培养基，并在37℃，5％co2的存在下孵育24-48小时。

转染后，将0.1ml1nhcl加入到0.5ml液体培养基中，充分混匀，并在室温下孵育10分钟。然后通过加入0.1ml的1.2nnaoh/0.5mhepes(ph7-7.6)中并充分搅拌来中和混合物。收集上清液，并将其用于测定治疗性蛋白质。通过酶联免疫吸附测定法(elisa)测定col1a1蛋白，所述elisa使用人胶原i型，α1(col1a1)elisa试剂盒(mybiosource，usa)根据制造商的方法，使用chemwell自动化eia和化学分析仪(awarenesstechnologyinc.，usa)在450nm波长处进行光密度检测。

为了测定浓度的数值，使用利用试剂盒中已知浓度的i型胶原α1链蛋白的参考样品构建的校准曲线。r-3.0.2用于统计处理结果和数据可视化(https://www.r-project.org/)。

测定法得到的图如图6中所呈现，其表明用携带col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染hdfa人原代真皮成纤维细胞导致与参考样品相比，i型胶原α1链蛋白浓度的增加，这表明基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率，并证实了该载体穿透真核细胞并在蛋白质水平表达col1a1基因的能力。所呈现的结果也证实了使用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1来提高真核细胞中col1a1基因表达水平的可行性。

实施例10.

证明携带治疗性基因即col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的效率及其使用的可行性。

为证实携带治疗性基因即col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的效率及其使用的可行性，对用携带人col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染人真皮成纤维细胞后，这些细胞的细胞培养基中i型胶原α2链的蛋白浓度的变化进行评估。

将如实施例6中所述培养的hdfa人原代真皮成纤维细胞用于评估i型胶原α2链的蛋白浓度的变化。将第6代superfect转染试剂的树枝状聚合物(qiagen，germany)用作运输分子，以不含dna载体的树枝状聚合物水溶液(a)和缺乏col1a2基因cdna的dna载体vtvaf17(b)作为参考，以及携带人col1a2基因seqidno:2区域的dna载体vtvaf17-col1a2(c)为转染试剂。根据实施例9中所述的规程进行dna树枝状聚合物复合物的制备和人真皮成纤维细胞的转染。

转染后，用pbs洗涤细胞三次，然后将1mlpbs加入细胞中，并对细胞进行冷冻/解冻三次。接着，将悬浮液以15,000rpm离心15分钟，收集上清液，并将其用于定量和测定治疗性蛋白。

通过酶联免疫吸附测定法(elisa)测定col1a2基因产物，所述elisa使用人胶原，i型α2(col1a2)elisa试剂盒(mybiosource，usa)根据制造商的方法，使用chemwell自动化eia和化学分析仪(awarenesstechnologyinc.，usa)在450nm波长处进行光密度检测。

为了测定浓度的数值，使用利用试剂盒中已知浓度的i型胶原α2链蛋白的参考样品构建的校准曲线。

r-3.0.2用于统计处理结果和数据可视化(https://www.r-project.org/)。

测定法得到的图如图7中所呈现，其表明用携带col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2转染人成纤维细胞导致与参考样品相比，i型胶原α2链蛋白浓度的增加，这表明基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的效率，并证实了该载体穿透真核细胞并在蛋白质水平表达col1a2基因的能力。所呈现的结果也证实了使用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2来提高真核细胞中col1a2基因表达水平的可行性。

实施例11.

证明携带治疗性基因即bmp2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率及其使用的可行性。

为证实携带治疗性基因即bmp2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率及其使用的可行性，对用携带人bmp2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染mg-63人骨肉瘤细胞(atcccrl-1427)后，这些细胞的细胞培养基中骨形态发生蛋白2浓度的变化进行评估。

将如实施例7中所述培养的mg-63人骨肉瘤细胞用于评估骨形态发生蛋白2浓度的变化。将第6代superfect转染试剂的树枝状聚合物(qiagen，germany)用作运输分子，以不含dna载体的树枝状聚合物水溶液(a)和缺乏bmp2基因cdna的dna载体vtvaf17(b)作为参考，以及携带人bmp2基因seqidno:3的dna载体vtvaf17-bmp2(c)为转染试剂。根据实施例9中所述的规程进行dna树枝状聚合物复合物的制备和mg-63人骨肉瘤细胞的转染。

通过酶联免疫吸附测定法(elisa)测定bmp2基因产物，所述elisa使用人bmp2elisa试剂盒(mybiosource，usa)根据制造商的方法，使用chemwell自动化eia和化学分析仪(awarenesstechnologyinc.，usa)在450nm波长处进行光密度检测。

为了测定浓度的数值，使用利用试剂盒中已知浓度的骨形态发生蛋白2的参考样品构建的校准曲线。

测定法得到的图如图8中所呈现，其表明用携带bmp2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染mg-63人骨肉瘤细胞导致与参考样品相比，骨形态发生蛋白2浓度的增加，这表明基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率，并证实了该载体穿透真核细胞并在蛋白质水平表达bmp2基因的能力。所呈现的结果也证实了使用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2来提高真核细胞中bmp2基因表达水平的可行性。

实施例12.

证明携带治疗性基因即bmp7基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率及其使用的可行性。

为证实携带bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率及其使用的可行性，对用携带人bmp7基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染hfob1.19人成骨细胞(atcccrl-11372)后，这些细胞的细胞培养基中骨形态发生蛋白7浓度的变化进行评估。

将如实施例8中所述培养的hfob1.19人成骨细胞用于评估骨形态发生蛋白7浓度的变化。将第6代superfect转染试剂的树枝状聚合物(qiagen，germany)用作运输分子，以不含dna载体的树枝状聚合物水溶液(a)和缺乏bmp7基因cdna的dna载体vtvaf17(b)作为参考，以及携带人bmp7基因seqidno:4的dna载体vtvaf17-bmp7(c)为转染试剂。根据实施例9中所述的规程制备dna树枝状聚合物复合物和转染hfob1.19人成骨细胞。

通过酶联免疫吸附测定法(elisa)测定bmp-7基因产物，所述elisa使用人bmp-7elisa试剂盒(mybiosource，usa)根据制造商的方法，使用chemwell自动化eia和化学分析仪(awarenesstechnologyinc.，usa)在450nm波长处进行光密度检测。

为了测定浓度的数值，使用利用试剂盒中已知浓度的骨形态发生蛋白7的参考样品构建的校准曲线。

测定法得到的图如图9中所呈现，其表明用携带bmp7基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7转染hfob1.19人成骨细胞导致与参考样品相比，骨形态发生蛋白7浓度的增加，这表明基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率，并证实了该载体穿透真核细胞并在蛋白质水平表达bmp7基因的能力。所呈现的结果也证实了使用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7来提高真核细胞中bmp7基因表达水平的可行性。

实施例13.

证明使用携带col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2来增加人组织中col1a2蛋白表达的效率和可行性。

为了分析i型胶原α2链蛋白浓度的变化，将携带col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2注射到三名患者的前臂皮肤中，并同时注射安慰剂，所述安慰剂是缺乏col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17。

患者1，男，65岁，(p1)；患者2，女，67岁，(p2)；患者3，男，62岁，(p3)。将聚乙烯亚胺转染试剂cgmp级in-vivo-jetpei(polyplustransfection，france)用作运输系统。将含有col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2和用作安慰剂的基因治疗dna载体vtvaf17溶解在无菌无核酸酶净化级水中。根据制造商的建议，制备dna-cgmp级in-vivo-jetpei复合物。

将基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)和基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2以每个基因构建体1mg的量用30g针的隧道方法注射到3mm的深度。基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)和基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的注射液体积为每种基因构建体0.3ml。每种基因构建体的注射点以8至10cm间隔位于前臂区域。

在注射基因治疗dna载体的基因构建体后的第2天采集活检样品。使用皮肤活检设备epitheasy3.5(medaxsrl，italy)从注射入携带col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2(i)、基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)(ii)的区域中的患者皮肤，以及从完整的皮肤(iii)取活检样品。患者的皮肤用无菌盐水初步清洗，并用利多卡因溶液麻醉。活检样品体积约为10mm3，且重量约为11mg。将样品置于含有50mmtris-hcl，ph7.6、100mm氯化钠、1mmedta和1mm苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并均质化以获得均匀的悬浮液。然后将悬浮液在14,000g离心10分钟。收集上清液，并将其用于通过酶联免疫吸附测定法(elisa)测定i型胶原α2链治疗性蛋白，所述elisa根据制造商的方法使用人胶原i型，α2(col1a2)elisa试剂盒(mybiosource，usa)，使用chemwell自动化eia和化学分析仪(awarenesstechnologyinc.，usa)在450nm波长处进行光密度检测。

为了测量浓度的数值，使用利用试剂盒中已知浓度的i型胶原α2链蛋白的参考样品构建的校准曲线。测定法得到的图如图10中所示。

图10显示，与缺乏人col1a2基因的基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)的注射部位中i型胶原α2链蛋白的浓度相比，携带人col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的注射部位中，所有3名患者皮肤中胶原i型α2链蛋白的浓度均有所增加，这表明基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2的效率并证实了其使用的可行性，特别是将基因治疗dna载体注射入人组织/器官。

实施例14.

证明使用携带col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1来增加人组织中col1a1蛋白表达的效率和可行性。

为了分析i型胶原α1链蛋白浓度的变化，将携带col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1注射到三名患者的耳廓背面的软骨组织中，并同时注射安慰剂，所述安慰剂是缺乏col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17。

患者1，男，65岁，(p1)；患者2，女，67岁，(p2)；患者3，男，62岁，(p3)。将聚乙烯亚胺转染试剂cgmp级in-vivo-jetpei(polyplustransfection，france)用作运输系统。将含有col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1和用作安慰剂的基因治疗dna载体vtvaf17溶解在无菌无核酸酶净化级水中。根据制造商的建议，制备dna-cgmp级in-vivo-jetpei复合物。

将基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)和基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1以每个基因构建体1mg的量用30g针的隧道方法注射到耳廓背面的软骨组织中，至1-2mm的深度。基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)和基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的注射液体积为每种基因构建体0.2ml。具有生物活性的基因治疗物质和安慰剂的注射点间隔为2至3cm。

在注射基因治疗dna载体后的第3天采集活检样品。通过使用一次性手动活检针的经皮活检从携带col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1(i)，基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)(ii)的注射部位以及从完整皮肤(iii)处患者的皮肤取活检样本，然后如实施例13中所述进行规程。

通过酶联免疫吸附测定法(elisa)在患者软骨活检样品的上清液中测定i型胶原α1链蛋白，所述elisa根据制造商的方法使用人胶原，i型α1(col1a1)elisa试剂盒(mybiosource，usa)，使用chemwell自动化eia和化学分析仪(awarenesstechnologyinc.，usa)在450nm波长处进行光密度检测。

为了测量浓度的数值，使用利用试剂盒中已知浓度的i型胶原α1链蛋白的参考样品构建的校准曲线。测定法得到的图如图11中所示。

图11显示，与缺乏人col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17(安慰剂)的注射部位中i型胶原α1链蛋白的浓度相比，携带人col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的注射部位中，所有3名患者软骨组织中胶原i型α1链蛋白的浓度均有所增加，这表明基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率并证实了其使用的可行性，特别是将基因治疗dna载体注射入人软骨组织。

实施例15.

证明携带基因col1a1的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率，以及其用于通过引入经基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的自体成纤维细胞增加人组织中col1a1蛋白表达水平的可行性。

为了证实携带col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率及其使用的可行性，评估了用经基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的患者的自体成纤维细胞培养物注射入相同患者的皮肤后，人皮肤中col1a1蛋白水平的变化。

将用携带col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的适当自体成纤维细胞培养物注射入患者前臂皮肤，同时注射安慰剂，所述安慰剂的形式为用未携带col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17转染的自体成纤维细胞培养物。

从患者皮肤活检样品中分离出人原代成纤维细胞培养物。使用皮肤活检设备epitheasy3.5(medaxsrl，italy)从免受紫外线的区域(即耳后或肘部内侧)获取皮肤的活检样品。活检样品约为10mm和约11mg。用无菌盐水初步清洗患者的皮肤，并用利多卡因溶液麻醉。原代细胞培养物在37℃，在5％co2的存在下，在具有10％的胎牛血清和100u/ml氨苄西林的dmem培养基中进行培养。每2天进行一次传代和更换培养基。培养生长的总持续时间不超过25-30天。然后从细胞培养物中取含5×10⁴个细胞的等分试样。用携带col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1或安慰剂即不携带col1a1治疗性基因的载体vtvaf17转染患者的成纤维细胞培养物。

根据制造商的说明，使用阳离子聚合物如聚乙烯亚胺jetpei(polyplustransfection，france)进行转染。细胞培养72小时，然后注射入患者中。使用利用13mm长30g针的隧道方法在前臂中进行注射用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的患者的自体成纤维细胞培养物和未用基因治疗dna载体vtvaf17转染的患者的自体成纤维细胞培养物(作为安慰剂)，至约3mm的深度。引入悬液中经修饰的自体成纤维细胞的浓度约为每1ml悬浮液500万个细胞，注射细胞的剂量不超过1500万个。自体成纤维细胞培养的注点间隔8至10cm。

在注射用携带治疗性基因(即col1a1基因)的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的自体成纤维细胞培养物和安慰剂后第4天取活检样品。使用皮肤活检设备epitheasy3.5(medaxsrl，italy)从注射用携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的自体成纤维细胞培养物(c)、用不携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17未转染的字体成纤维细胞培养物(安慰剂)(b)的部位中的患者皮肤，以及从完整的皮肤部位(a)取活检，然后如实施例13中所述进行规程。

通过酶联免疫吸附测定法(elisa)在患者的皮肤活检样品的上清液中测定i型胶原α1链蛋白水平，所述elisa根据制造商的方法使用人胶原，i型α1(col1a1)elisa试剂盒(mybiosource，usa)，使用chemwell自动化eia和化学分析仪(awarenesstechnologyinc.，usa)在450nm波长处进行光密度检测。

为了测量浓度的数值，使用利用试剂盒中已知浓度的i型胶原α1链蛋白的参考样品构建的校准曲线。测定法得到的图如图12中所示。

图12显示，与用不携带人col1a1基因的基因治疗dna载体vtvaf17转染的自体成纤维细胞培养物(安慰剂)的注射部位中col1a1蛋白浓度相比，用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的自体成纤维细胞培养物的注射部位中，患者皮肤中区域中col1a1蛋白的浓度有所增加，这表明基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的效率并证实了其用于增加人组织/器官中col1a1表达水平的可行性，特别是在将用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1转染的自体成纤维细胞注射入皮肤中后。

实施例16.

证明携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、携带col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2、携带bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2、携带bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7联合应用以提高哺乳动物组织中col1a1、col1a2、bmp2和bmp7蛋白的表达水平的效率和可行性。

为了确认携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、携带col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2、携带bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2和携带bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率以及使用这些载体的可行性，分别在wistar大鼠(雄性，22-24周龄)胫骨的先前手术模拟的损伤中评估了i型胶原α1链蛋白，i型胶原α2链蛋白，骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7的浓度的变化。

组成3组，每组11只动物。

所有动物在麻醉下接受了用于胫骨缺损的手术。具体而言，在右小腿外表面做了一个长达3.0cm的皮肤切口。然后拉开肌肉，从而允许进入胫骨。在骨干区，使用2mm的钻头手动进行截骨术。然后使用特征为直径1.6mm的钢芯针向膝骨骺穿透缺损约10mm深。通过使用hamilton注射器的pe-50导管用如下项填充缺损：

在第1组中-用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、vtvaf17-col1a2、vtvaf17-bmp2和vtvaf17-bmp7的混合物，体积为20μl(50μg)，并由dna冻干物和盐水混合物制备溶液，

在第2组中-用基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、vtvaf17-col1a2、vtvaf17-bmp2和vtvaf17-bmp7的粗磷酸钙沉淀，体积为20μl(50μg)，

在第3组(对照)中-用体积为20μl的盐水。

在胫骨缺损建模并注入测试dna载体和盐水后，用手术蜡(boxwax)密封缺损。

注射基因治疗dna载体的混合物和安慰剂后72小时取活检样品。在动物的尸检后从注射4种携带治疗性基因col1a1、col1a2、bmp2和bmp7的基因治疗dna载体的混合物的区域中(第1组)，在注射4种携带col1a1、col1a2、bmp2和bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体的粗磷酸钙沉淀混合物的区域中(第2组)，在注射盐水的区域中(第3组)从损伤部位取活检。每个活检样品的质量约为20mg。接下来，按照实施例13中所述进行规程。

通过酶联免疫测定法(elisa)测定col1a1、col1a2、bmp2和bmp7基因产物，其使用人胶原i型α1(col1a1)elisa试剂盒(mybiosource，usa)、人胶原i型α2(col1a2)elisa试剂盒(mybiosource，usa)、人bmp-2，elisa试剂盒(mybiosource，usa)、人bmp-7，elisa试剂盒(mybiosource，usa)。试验样品的制备、测量和结果处理按实施例9、10、11和12中所述进行。

测定法得到的图如图13a和13b中所示，其表明在动物的损伤区域中第1组动物中四个基因治疗dna载体(携带人col1a1治疗性基因的vtvaf17-col1a1、携带人col1a2治疗性基因的vtvaf17-col1a2、携带人bmp2治疗性基因的vtvaf17-bmp2和携带人bmp7治疗性基因的vtvaf17-bmp7)的混合物的沉淀物的注射部位中，与对照组3中i型胶原α1链蛋白、i型胶原α2链蛋白、骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7的浓度相比，以下蛋白质的浓度明显增加：i型胶原α1链蛋白、i型胶原α2链蛋白、骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7。其还表明，在动物的损伤区域中第2组动物中四个基因治疗dna载体(携带人col1a1治疗性基因的vtvaf17-col1a1、携带人col1a2治疗性基因的vtvaf17-col1a2、携带人bmp2治疗性基因的vtvaf17-bmp2和携带人bmp7治疗性基因的vtvaf17-bmp7)的混合物的注射部位中，与对照组3中i型胶原α1链蛋白、i型胶原α2链蛋白、骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7的浓度相比，以下蛋白质的浓度分别适度增加：i型胶原α1链蛋白、i型胶原α2链蛋白、骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7。所呈现的结果证实了使用携带col1a1治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1、携带col1a2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2、携带bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2和携带bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7用于提高col1a1、col1a2、bmp2和bmp7蛋白在动物组织中的表达水平的可行性，特别是在将这些基因治疗dna载体注入哺乳动物骨组织中后，并表明基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，基因治疗dna载体vtvaf17-col1a2，基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2和基因治疗dna载体vtvaf17-bmp7的效率。

实施例17.

证明携带人类bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率及其用于提高哺乳动物细胞中骨形态发生蛋白2表达水平的可行性。

为了证实携带人bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率，对用基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染后48小时cnob犬成骨细胞(cellapplications，inc.，usa)中bmp2治疗性基因mrna积累的变化进行了评估。

根据制造商的方法(https://www.cellapplications.com/canine-osteoblasts-cnob)对犬成骨细胞系(cnob)进行培养。如实施例8中所述用携带人bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2和不携带人bmp2基因的dna载体vtvaf17(对照)进行转染。根据实施例5中所述的规程进行从转染细胞提取总rna并合成第一cdna链。为了测量转染后bmp2基因mrna的表达水平，如实施例3中所述采用实时pcr方法(sybrgreenrealtimepcr)。犬肌动蛋白基因(act)用作参考基因。

阳性对照包括以已知浓度的质粒代表的基质上pcr的扩增子，该质粒含有bmp2和act基因的cdna序列。阴性对照包括去离子水。使用bio-radcfxmanager2.1软件(bio-rad，usa)进行pcr产物(即通过扩增获得的bmp2和act基因cdna)的实时定量。

测定法得出的pcr产物积累的图如图14中所呈现，并表明由于用携带人bmp2治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2转染cnob犬成骨细胞，bmp2基因的特异性mrna水平大大提高，其表明基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2的效率。所呈现的结果也证实了基因治疗dna载体vtvaf17-bmp2用于提高哺乳动物细胞中bmp2基因表达水平的可行性。

实施例18.

携带基因治疗dna载体的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7，其生产方法。

基于携带col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7治疗性基因的基因治疗dna载体vtvaf17，构建用于工业规模生产基因治疗dna载体的菌株：即分别携带基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，或vtvaf17-col1a2，或vtvaf17-bmp2，或vtvaf17-bmp7的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7，其产生允许无抗生素选择，所述构建涉及制备大肠杆菌菌株scs110-af的电感受态细胞，并对这些细胞进行基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，或dna载体vtvaf17-col1a2，或dna载体vtvaf17-bmp2，或dna载体vtvaf17-bmp7的电穿孔。之后将所述细胞倒入具有选择性培养基的琼脂平板(培养皿)中，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素。同时，大肠杆菌菌株scs110-af以用于生产基因治疗dna载体vtvaf17或基于它允许无抗生素阳性选择的基因治疗dna载体的生产涉及构建64bp线性dna片段，其含有允许无抗生素阳性选择的转座子tn10的调控元件rna-in，1422bp的果聚糖蔗糖酶基因sacb，其产物确保在含蔗糖的培养基内的选择，对选择其中发生同源重组的菌株克隆所需的763bp的氯霉素抗性基因catr，以及确保基因reca的区域中的同源重组，同时基因失活的两个同源序列(329bp和233bp)，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并选择在含有10μg/ml氯霉素的培养基上选择存活的克隆。

实施例19.

在工业规模生产基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带选自col1a1，col1a2，bmp2和bmp7基因组的治疗性基因的基因治疗dna载体的方法。

为了证实各自携带治疗性基因即col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1(seqidno.1)，或vtvaf17-col1a2(seqidno.2)，或vtvaf17-bmp2(seqidno.3)，或vtvaf17-bmp7(seqidno.4)的可生产性和可构建性，对各自含有携带治疗性基因即col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7的基因治疗dna载体vtvaf17的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-col1a1(在俄罗斯国家工业微生物典藏中注册，编号b-13165，国际保存机构编号ncimb43033)，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-col1a2(在俄罗斯国家工业微生物典藏中注册，编号b-13164，国际保存机构编号ncimb43035)，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-bmp2(在俄罗斯国家工业微生物典藏中注册，编号b-13167，国际保存机构编号ncimb43034)，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-bmp7(在俄罗斯国家工业微生物典藏中注册，编号b-13166，国际保存机构编号ncimb43036)进行大规模发酵。如实施例18中所述基于大肠杆菌菌株scs110-af(cellandgenetherapyllc,pitltd)生产大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-col1a1，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-col1a2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-bmp2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-bmp7的每一个，通过用携带治疗性基因即col1a1，或col1a2，或bmp2，或bmp7的基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，或vtvaf17-col1a2，或vtvaf17-bmp2，或vtvaf17-bmp7对该菌株的感受态细胞电穿孔，以及进一步将转化的细胞接种到具有选择性培养基的琼脂平板(培养皿)中，，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨和6％蔗糖，并选择单个克隆。

携带基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1的发酵在10l的发酵罐中进行，随后提取出基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1。

为了发酵大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1，制备每10l体积含有以下成分的培养基：100g胰蛋白胨、50g酵母提取物(bectondickinson)，然后用水稀释至8800ml，并在121℃下高压灭菌20分钟，然后加入1200ml50％(w/v)的蔗糖。接着，将大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1的种子培养物以100ml的体积接种到培养瓶中。培养物在培养箱振荡器中30℃孵育16小时。将种子培养物转移到techforss生物反应器(inforsht，switzerland)并生长至静止阶段。通过测量600nm处培养物的光密度来控制过程。细胞在5,000-10,000g30分钟沉淀。去除上清液，并将细胞沉淀物重悬于10％(体积计)的磷酸盐缓冲盐水中。将细胞在5,000-10,000g下再次离心30分钟。去除上清液，将20mmtris-hcl、1mmedta、200g/l蔗糖，ph8.0的溶液以1000ml的体积加入到细胞沉淀物，并充分搅拌混合物至均匀的悬浮液。添加蛋溶菌酶溶液至终浓度为100μg/ml。在冰上孵育混合物20分钟，同时轻轻搅拌。接着，加入2500ml的0.2mnaoh，10g/l十二烷基硫酸钠(sds)，在冰上孵育混合物10分钟同时轻轻搅拌，然后加入3500ml的3m醋酸钠，2m醋酸，ph5-5.5，并将混合物在冰上孵育10分钟同时轻轻搅拌。所得样品在15,000g或更大的值离心20-30分钟。将溶液轻轻倾倒，通过粗滤器(滤纸)过滤除去残留的沉淀。然后加入rnasea(sigma)至终浓度为20μg/ml，并将溶液在室温下孵育16小时过夜。将溶液在15,000g下离心20-30分钟，然后通过0.45μm膜过滤器(millipore)。接下来，通过100kda的膜(millipore)进行超滤，并用25mmtris-hcl，ph7.0的缓冲溶液稀释到初始体积。该操作进行三到四次。将该溶液施加于具有250mldeaesepharosehp的柱(ge，usa)，用25mmtriscl，ph7.0平衡。样品施加后，用三个体积的相同溶液洗涤柱，然后用25mmtris-hcl、ph7.0线性梯度洗脱基因dna载体vtvaf17-col1a1以获得25mmtris-hcl，ph7.0、1mnacl的溶液(柱体积的5倍)。洗脱过程通过测量260nm处的径流溶液的光密度来控制。将含有基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的层析级分合并，并使用superdex200(ge，usa)进行凝胶过滤。用磷酸盐缓冲盐水平衡柱。通过测量260nm处的径流溶液的光密度控制洗脱过程，并通过琼脂糖凝胶电泳分析各级分。合并含有基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1的级分，并在-20℃下保存。为了评估该过程的可重复性，将所示处理操作重复五次。以相似方式进行大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-col1a2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-bmp2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf1-bmp7的所有处理操作。

过程的可重复性和最终产品产量的定量特征证实了基因治疗dna载体vtvaf17-col1a1，或vtvaf17-col1a2，或vtvaf17-bmp2，或vtvaf17-bmp7在工业规模上的可生产性和可构建性。

因此，本发明的目的，即构建基于基因治疗dna载体vtvaf17的携带治疗性人基因的基因治疗dna载体用于治疗与需要增加这些治疗性基因的表达水平相关的疾病，其将合理地组合：

i)由于基因治疗dna载体中不存在抗生素抗性基因，安全应用于人类和动物的基因治疗的可能性，

ii)确保有效基因递送至靶细胞的长度，

iii)存在确保有效表达治疗性基因同时不由病毒基因组的核苷酸序列所代表的调控元件，

iv)已实现了工业规模的可生产性和可构建性，以及构建携带这些基因治疗dna载体的菌株，以便以工业规模生产这些基因治疗dna载体的目的，其通过以下实施例得以支持：对于项i-实施例1、2、3、4、5；对于项ii-实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17；对于项iii-实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17；对于项iv-实施例18、19。

工业适用性

以上实施例均证实了所提出的基于基因治疗dna载体vtvaf17携带从col1a1、col1a2、bmp2和bmp7基因组中选取的治疗性基因的基因治疗dna载体提高这些治疗性基因的表达水平的工业适用性，其生产和使用方法，携带基因治疗dna载体的大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a1，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-col1a2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp2，或大肠杆菌菌株scs110-af/vtvaf17-bmp7，及其在工业规模上的生产方法。

寡核苷酸序列列表

(1)寡核苷酸bmp2_facagctagcctcctaaaggtccaccatggt

(2)寡核苷酸bmp2_rtataagcttctagcgacacccacaaccct

(3)寡核苷酸bmp2_sfatgcaagcaggtgggaaagt

(4)寡核苷酸bmp2_srgggagccacaatccagtcat

(5)寡核苷酸bmp7_ftcagctagcgtagagccggcgcgatgtgca

(6)寡核苷酸bmp7_rtataagcttctagtggcagccacaggc

(7)寡核苷酸bmp7_sfgctggctggtgtttgacatc

(8)寡核苷酸bmp7_srtggtggcgttcatgtaggag

(9)寡核苷酸col1a1_fccagctagcgtctagggtctagacatgttc

(10)寡核苷酸col1a1_rtataagcttctacaggaagcagacagggccaac

(11)寡核苷酸col1a1_sftgacgagaccaagaactgcc

(12)寡核苷酸col1a1_srgcaccatcatttccacgagc

(13)寡核苷酸col1a2_fccagctagcgtctaagtgctagacatgctc

(14)寡核苷酸col1a2_rcgaagcttttatttgaaacagactgggcca

(15)寡核苷酸col1a2_sfctggtgaagctggtcgtgat

(16)寡核苷酸col1a2_srcggatacaggtttcgccagt

缩略语清单

vtvaf17—缺乏病毒基因组序列和抗生素抗性标记的基因治疗载体(载体治疗性病毒-无抗生素)

dna—脱氧核糖核酸

cdna—互补性脱氧核糖核酸

rna—核糖核酸

mrna—信使核糖核酸

bp—碱基对

pcr—聚合酶链反应

rt-pcr—实时pcr

ml—毫升，μl—微升

mm3—立方毫米

l—升

μg—微克

mg—毫克

g—克

μm—微摩尔

mm—毫摩尔

min—分钟

s—秒

rpm—每分钟转数

nm—纳米

cm—厘米

mw—毫瓦

rfu—相对荧光单位

pbs—磷酸盐缓冲盐水

序列表

<110>阿莱尔特森特尔创新生物技术有限责任公司"alleltsentrinnovatsionnykhbiotekhnology",

普罗里夫涅创新技术有限责任公司"proryvnyeinnovatsionnyetekhnologii",细胞基因治疗有限公司

<120>基于载体vtvaf17的基因治疗

<150>pct/ru2019/000576

<151>2019-08-14

<160>20

<170>bissap1.3.6

<210>1

<211>4360

<212>dna

<213>智人

<400>1

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<210>2

<211>4463

<212>dna

<213>智人

<400>2