相关申请的交叉引用本申请要求于2018年十月22日提交的美国临时申请号62/748,998的优先权，其通过引用合并于此。序列表归档于537958_seqlisting_st25.txt的序列表大小为18kb，创建于2019年9月24日，在此引用作为参考。
背景技术：
：人类多瘤病毒bk病毒(bkv)是多瘤病毒家族的成员。bk病毒类似于另一种称为jc病毒(jcv)的病毒，具有75％的基因组序列相似性。bkv具有约5000个碱基对的双链dna环状基因组。据认为，多达80％的人口包含这种病毒的潜伏形式，这种潜伏性直到身体经历某种形式的免疫抑制之前一直保持潜伏状态。病毒的检测对于肾脏和多器官移植患者尤其重要，其中临床表现包括肾功能不全。从1-10％的肾移植患者发展为bkv相关性肾病(bkvan)，其中多达80％的患者失去了移植物。bkv还与输尿管狭窄和间质性肾炎有关。在骨髓移植受者中，bkv可引起出血性膀胱炎。技术实现要素：描述了用于检测和/或定量样品中的人多瘤病毒bk病毒(bkv)或扩增bkv核酸序列的扩增寡核苷酸，核酸，方法，组合物和试剂盒。扩增寡核苷酸包括扩增引物(第一扩增引物和第二扩增引物或第一引物和第二引物)。扩增寡核苷酸还包括促进检测扩增序列的探针寡核苷酸。该方法包括扩增病毒核酸以检测样品中的bkv靶序列。该方法可以有利地提供对bkv的灵敏的检测。扩增寡核苷酸可使用本领域已知的各种核酸扩增方法用于bkv序列的扩增、检测和/或定量。核酸扩增方法可以使用热循环，或者可以是等温的。本领域已知的核酸扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(pcr)，逆转录酶pcr(rt-pcr)，实时pcr，基于核酸序列的扩增(nasba)，复制酶介导的扩增(包括qβ-复制酶介导的扩增)，连接酶链反应(lcr)和链置换扩增(sda)。所描述的扩增寡核苷酸可用于扩增和/或检测bkv序列。扩增的bkv序列，即扩增子，包括存在于seqidno:50中的序列和/或其互补序列。在一些实施例中，扩增的bkv序列，即扩增子，包括存在于seqidno:51中的序列和/或其互补序列。在一些实施例中，扩增的bkv序列，即扩增子，包括存在于seqidno:52中的序列和/或其互补序列。在一些实施例中，扩增寡核苷酸经配置以扩增并任选地检测包含seqidno:50的一部分和/或其互补序列的bkvvp2扩增子。在一些实施例中，扩增寡核苷酸经配置以扩增并任选地检测包含seqidno:51的一部分和/或其互补序列的bkvvp2扩增子。在一些实施例中，扩增寡核苷酸经配置以扩增并任选地检测包含seqidno:52的一部分和/或其互补序列的bkv扩增子。可以使用本领域中的各种方法来检测bkv扩增子。在一些实施例中，第一扩增引物包含18-30个连续碱基，其与seqidno:50或其互补序列、seqidno:51或其互补序列，和/或seqidno:52或其互补序列中存在的核苷酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施例中，第一扩增引物包含与选自以下的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:1，seqidno:4，seqidno:7，seqidno:10，seqidno:13，seqidno:16，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:25，seqidno:30，seqidno:31，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:38，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:43，seqidno:46或seqidno:47。第一扩增引物能够与seqidno:50，seqidno:51，和/或seqidno:52杂交并引发dna聚合。在一些实施例中，第二扩增引物包含19-30个连续碱基，其与seqidno:50或其互补序列、seqidno:51或其互补序列，和/或seqidno:52或其互补序列中存在的核苷酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施例中，第二扩增引物包含与选自以下的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:2，seqidno:5，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:14，seqidno:18，seqidno:19，seqidno:22，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:32，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:37，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:44，seqidno:45，seqidno:48或seqidno:49。第二扩增引物能够与seqidno:50或其互补序列，seqidno:51或其互补序列，和/或seqidno:52或其互补序列杂交并引发dna聚合。在一些实施例中，第一扩增引物包含与选自以下的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:1，seqidno:4，seqidno:7，seqidno:10，seqidno:13，seqidno:16，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:25，seqidno:30，seqidno:31，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:38，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:43，seqidno:46或seqidno:47。在一些实施例中，第二扩增引物包含与选自以下的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:2，seqidno:5，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:14，seqidno:18，seqidno:19，seqidno:22，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno：32，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:37，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:44，seqidno:45，seqidno:48，或seqidno:49。在一些实施例中，第一扩增引物与第一bkv核酸序列杂交，并且第二扩增引物与第二bkv核酸序列杂交。第一和第二bkv核酸序列包含存在于seqidno:50或其互补序列中的核苷酸序列。在一些实施例中，第一和第二bkv核酸序列包含存在于seqidno:51或其互补序列中的核苷酸序列。在一些实施例中，第一和第二bkv核酸序列包含存在于seqidno:52或其互补序列中的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物与第一bkv核酸序列80％至100％互补，并且第二扩增引物与第二bkv核酸序列80％至100％互补。在一些实施例中，第一扩增引物与第一bkv核酸序列90％至100％互补，并且第二扩增引物与第二bkv核酸序列90％至100％互补。在一些实施例中，第一扩增引物与第一bkv核酸序列＞90％且＜100％互补，第二扩增引物与第二bkv核酸序列＞90％且＜100％互补。所描述的探针寡核苷酸可用于检测bkv核酸，包括但不限于bkv扩增子。在一些实施例中，探针寡核苷酸包含21-30个连续碱基，这些碱基与seqidno:50或其互补序列、seqidno:51或其互补序列，和/或seqidno:52或其互补序列中存在的核苷酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施例中，探针寡核苷酸包含21-30个连续碱基，其与seqidno:50或其互补序列、seqidno:51或其互补序列，和/或seqidno:52或其互补序列杂交。在一些实施例中，探针寡核苷酸包含与选自以下的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:15，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:27。在一些实施例中，探针寡核苷酸包含与选自以下的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:15，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:27。在一些实施例中，探针寡核苷酸与第三bkv核酸序列杂交。第三bkv核酸序列包含存在于seqidno:50的核苷酸序列或其互补序列。在一些实施例中，第三bkv序列包含存在于seqidno:51或其互补序列中的核苷酸序列。在一些实施例中，第三bkv序列包含存在于seqidno:52或其互补序列中的核苷酸序列。在一些实施例中，探针寡核苷酸与第三bkv核酸序列80％至100％互补。在一些实施例中，探针寡核苷酸与第三bkv核酸序列90％至100％互补。在一些实施例中，探针寡核苷酸与第三bkv核酸序列＞90％且＜100％互补。探针寡核苷酸可包含一种或多种可检测的标志或标记。可检测的标志可以是但不限于荧光分子。标记可以附着在探针寡核苷酸的5'或3'端或沿着寡聚物的任何位置。在一些实施例中，探针寡核苷酸可以是分子信标或火炬。在一些实施例中，探针寡核苷酸可以是水解探针。探针寡核苷酸可包含附着于探针寡核苷酸的5'端的荧光分子和附着于探针寡核苷酸的3'端的猝灭剂，或者荧光分子可附着于探针寡核苷酸的3'端和猝灭剂附着于探针寡核苷酸的5'端。所描述的任何扩增寡核苷酸(例如，扩增引物或探针寡核苷酸)可包含至少一个修饰核苷酸。修饰寡核苷酸可以是但不限于2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰的寡核苷酸或5-甲基胞嘧啶。在一些实施例中，扩增寡核苷酸包含两个或更多个修饰核苷酸。两个或更多个修饰核苷酸可以具有相同或不同的修饰。在一些实施例中，任何所述扩增寡核苷酸可包含一个或多个5-甲基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶包括5-甲基-脱氧胞嘧啶(5-me-dc，5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶)。扩增寡核苷酸可以具有0、1、2、3、4、5、6、7、8或更多的2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰的寡核苷酸，5-甲基胞嘧啶或其组合。在一些实施例中，扩增寡核苷酸中的所有胞嘧啶核苷酸都是5-甲基胞嘧啶修饰核苷酸。在一些实施例中，相对于相应的非甲基化寡聚物，5-甲基-2′-脱氧胞嘧啶碱可用于通过将并入寡聚物中的每个5-甲基-2′-脱氧胞嘧啶的tm提高约0.5°-1.3℃来增加双链的稳定性。所描述的任何扩增引物或探针寡核苷酸可至少包含简并位置。简并位置是指可以有多种可供选择的碱基序列上的位置。在一些实施例中，第一扩增引物，第二扩增引物和/或探针寡核苷酸包含0、1、2、3、4或5个简并位置。简并位置可以是但不限于r(a或g)，w(a或t)，m(a或c)，y(c或t)，k(g或t)，b(a或g或t)，d(a或g或t)，h(a或c或t)，n(a或g或c或t)，s(g或c)或v(a或c或g))。对于具有两个或更多个简并位置的寡核苷酸，在任何给定位置的简并与在另一位置的简并无关。所述的扩增引物可用于扩增bkv序列。在一些实施例中，bkv序列包含vp2序列。在一些实施例中，bkv序列包含lt序列。在一些实施例中，所描述的扩增引物可用于使用热循环反应例如聚合酶链反应(pcr)来扩增bkv序列。在一些实施例中，所描述的扩增引物可用于使用等温反应例如转录介导的扩增(tma)来扩增bkv序列。可以利用所述扩增寡核苷酸的其他核酸扩增方法包括但不限于基于核酸序列的扩增(nasba)，复制酶介导的扩增，连接酶链反应(lcr)，链置换扩增(sda)，逆转录酶pcr(rt-pcr)和实时pcr。在一些实施例中，将第一扩增引物与第二扩增引物结合以形成扩增引物对。在一些实施例中，第一扩增引物和第二扩增引物被配置为扩增长度约100至约150个核苷酸(碱基对)的bkv核酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物和第二扩增引物被配置为扩增长度为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个核苷酸(碱基对)的bkv核酸序列(即，产生bkv扩增子)。描述了用于扩增，检测和/或定量bkv，bkv核酸或衍生自bkv核酸的核酸的组合物和试剂盒。在一些实施例中，所描述的组合物和试剂盒提供了对bkv的直接，快速，具体和/或灵敏检测。所述组合物和试剂盒可包含一种或多种所述扩增寡核苷酸和/或探针寡核苷酸。在一些实施例中，组合物或试剂盒包含至少一个第一扩增引物和至少一个第二扩增引物。组合物或试剂盒还可能包含至少一种探针寡核苷酸。组合物或试剂盒还可包含以下一种或多种：bkv阳性对照核酸，阴性对照核酸，核苷三磷酸，dna聚合酶，样品运输介质和使用说明。描述了用于扩增，检测和/或定量bkv靶序列的方法，该方法包括以下步骤：使含有或疑似含有bkv，bkv核酸或衍生自bkv的核酸的样品与至少两个用于扩增bkv的靶核酸的扩增引物接触，其中至少两个扩增引物包含如上所述的分别与bkv核酸序列杂交的第一扩增引物和第二扩增引物。进行体外核酸扩增反应，其中如果样品中存在任何bkv靶核酸，则将其用作产生扩增产物的模板。在一些实施例中，第一和第二扩增引物各自与seqidno:50或其互补序列杂交。在一些实施例中，第一和第二扩增引物各自与seqidno:51或其互补序列杂交。在一些实施例中，第一和第二扩增引物各自与seqidno:52或其互补序列杂交。在一些实施例中，该方法进一步包括检测扩增产物的存在或不存在，从而指示样品中bkv的存在或不存在。使用探针寡核苷酸检测扩增产物。所描述的探针寡核苷酸可用于扩增反应中以检测和/或定量样品中的bkv。在一些实施例中，样品中bkv的定量可用于帮助管理实体器官移植接受者。在接受抗bkv治疗的患者中，bkvdna测量可用于评估病毒对治疗的反应。病毒载量信息还可用于诊断移植患者中的bkv疾病。具体实施方式定义在详细描述本教导之前，应理解本发明不限于具体的组合物或工艺步骤，因为此类组合物或工艺步骤可以变化。应注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如在本说明书和所附加的权利要求中所使用的，单数形式“一(a/an)”以及“所述(the)”均包括复数指代。因此，例如，提及“寡聚物”包括多个寡聚物等。将以包含性的意义来解释连词“或”，即等同于“和/或”，除非包含性的意义在上下文中是不合理的。通常，术语“约”指示组合物的成分的量的非实质性变化，其对组合物的活性或稳定性没有任何显著影响。当说明书公开了参数的特定值时，说明书应被理解为相对在“大约”那个值处公开参数。在没有明确排除(例如“不包括端点”)的情况下，所有范围应解释为包括所示范围内的任何引用数字(分数或整数)以及范围的端点；因此，例如，“10-15”包括值10和15以及介于10和15之间的整数和小数，例如12.67。而且，“包括(comprise或comprises或comprising)”、“含有(contain或contains或containing)”和“包含(include或includes或including)”的使用不旨在是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，且并不是对本教导的约束。就通过引用并入的任何材料与本发明的明确内容不一致而言，以明确内容为准。除非特别指出，否则说明书中列举“包括”各种成分的实施例也被认为是“由...组成”或“基本上由...组成”所列举的成分。说明书中列举“基本上由...组成”各种成分的实施例也被认为是“由...组成”。“基本上由……组成”意指那些组合物或方法中可以包含不会实质性地改变本文所描述的组合物和方法的基本特征和新颖特征的一种或多种附加组成分、一种或多种组合物或一种或多种方法步骤。此类特征包括具有检测样本中存在的bkv核酸序列的能力，其特异性可将bkv核酸与其他已知病原体区分开来，选择性地在从扩增反应开始的大约45分钟内检测到大约1-100份病毒的拷贝的灵敏度，该扩增反应产生被检测到的扩增病毒序列。“样品”是含有或疑似含有bkv，bkv核酸和/或衍生自bkv或bkv核酸的核酸的任何样品。“样品”可以含有或疑似含有bkv或其成分，例如核酸或核酸片段。样品可能是成分的复杂混合物。样品包括生物样品或临床样品或标本，其中包括源于活的或死的哺乳动物或生物的任何组织或材料，包括例如下呼吸道标本，支气管肺泡灌洗标本，痰，气管吸出物，血液，血浆，血清，血液细胞，唾液和粘液，脑脊液(以诊断中枢神经系统的bkv感染)和来自或源自生殖器病变，肛门生殖器病变，口腔病变，粘膜皮肤病变，皮肤病变和眼部病变或其组合的样本(例如活检)。样品还可以包括体外细胞培养成分的样品，所述体外细胞培养成分包括例如由于培养基中细胞和组织的生长而产生的条件培养基。可以对样品进行处理来物理地或机械地破坏组织或细胞结构，从而将细胞内核酸释放到可以含有酶、缓冲液、盐类、洗涤剂等的溶液中，以制备用于分析的样品。在一些实施例中，样品可以包括处理后的样品，如通过将样品从过滤器上方或通过过滤器，离心后或通过粘附于介质、基质或支持物而获得的样品。“核酸”和“多核苷酸”是指多体化合物，其包含核苷或核苷类似物，所述核苷或核苷类似物具有连接在一起以形成多核苷酸的含氮杂环碱基或碱基类似物，包括常规rna、dna、混合rna-dna和其聚合物类似物。核酸“主链”可以由多种键构成，包含以下中的一个或多个：糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(“肽核酸”或pna；pct号：wo95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖或具有取代物(例如2'甲氧基或2'卤化物取代物)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(a、g、c、t、u)，其类似物(例如，肌苷或其它；参见《核酸的生物化学(thebiochemistryofthenucleicacids)》5-36,adams等人编辑,第11版,1992)，嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，n4-甲基脱氧鸟苷、脱氮杂-或氮杂-嘌呤、脱氮杂-或氮杂-嘧啶、在5或6位具有取代基的嘧啶碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、o6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和o4-烷基-嘧啶；美国专利号5,378,825和pct号wo93/13121)。核酸可以包含一个或多个“无碱基”残基，其中主链不包含聚合物的一个或多个位置的含氮碱基(美国专利号5,585,481)。核酸可以仅包含常规rna或dna糖、碱基和键，或可以包括常规成分和取代物(例如具有2'甲氧基键的常规碱基，或含有常规碱基和一种或多种碱基类似物的聚合物)。核酸包括“锁核酸”(lna)，一种含有一个或多个lna核苷酸单体的类似物，所述lna核苷酸单体具有锁闭在rna模拟糖构象中的双环呋喃糖单元，锁核酸增强对互补rna和dna序列的杂交亲和力(vester和wengel,2004,《生物化学(biochemistry)》43(42):13233-41)。核酸可以包含经修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如，添加3'-末端双脱氧核苷酸以阻止另外的核苷酸被添加到核酸中。可以影响杂交复合物的稳定性的寡聚物的实施例包括pna寡聚物、包括被2'-甲氧基或2'-氟取代的rna的寡聚物，或影响杂交复合物的整体电荷、电荷密度或空间缔合的寡聚物，包括含有带电键(例如硫代磷酸酯)或中性基团(例如甲基磷酸酯)的寡聚物。应理解，当提及寡核苷酸、扩增子或其它核酸的长度范围时，所述范围包括所有整数(例如，19-25个连续核苷酸长度包括19、20、21、22、23、24和25个)的连续核苷酸。“靶核酸”或“靶”是含有靶核酸序列的核酸。“靶核酸序列”，“靶序列”或“靶区域”是连续核苷酸序列(其扩增寡核苷酸退火)并包含要扩增和/或检测的靶生物，如bkv，的核苷酸序列。靶序列或其互补，包括与用于扩增和/或检测所述靶核酸的扩增引物和/或检测探针杂交的序列。除了可能不被扩增靶序列之外，靶核酸可以包含其它序列。靶核酸可以是本文所述的dna或rna，并且可以是单链的或双链的。靶核酸可以是但不限于基因组核酸，转录的核酸，例如rrna，或衍生自基因组或转录的核酸的核酸。正向和反向扩增引物之间的连续核苷酸序列定义了要扩增的多核苷酸。除非另有说明，“与bkv核酸杂交”包括与bkv核酸的正义或反义链或与从基因组序列转录的rna杂交。在一些实施例中，扩增寡核苷酸，扩增引物，探针寡核苷酸或靶标捕获寡聚物包含一个或多个修饰核苷酸。扩增寡核苷酸可具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个修饰核苷酸。修饰核苷酸包括具有修饰碱基的核苷酸。修饰的碱基包括但不限于合成和天然碱基，5-取代嘧啶，6-氮杂嘧啶和n-2，n-6和o-6取代的嘌呤。修饰核苷酸还包括具有修饰的碱基的核苷酸，包括但不限于2'-修饰核苷酸(包括但不限于2'-o-甲基核苷酸和2'-卤素核苷酸，例如2'-氟核苷酸)。除非上下文有说明，否则“c残基”包含甲基化(如5-甲基胞嘧啶)和未甲基化的胞嘧啶。“rna和dna等同物”是指具有基本相同的互补碱基对杂交特性的rna和dna分子。rna和dna等同物具有不同糖部分(即，核糖对比脱氧核糖)并且可以因rna中存在尿嘧啶和dna中存在胸腺嘧啶而不同。rna与dna等同物之间的差异不会促进同源性的差异，因为等效物对具体序列具有相同程度的互补性。rna和dna等同物是具有相同碱基序列的分子，只是dna中的t被rna中的u代替。“寡聚物”或“寡核苷酸”是指通常少于1,000个核苷酸(nt)的核酸，包括在下限为约2到5个nt且上限为约500到900个nt的尺寸范围内的核酸。在一些实施例中，寡聚物的大小范围的下限为约15、16、17、18、19或20nt，上限为约30-60nt。在一些实施例中，寡核苷酸具有至多30、35、40、45、50、55或60nt。寡聚物可以从天然来源中纯化，或者可以通过使用任何已知的酶或化学方法合成。寡聚物可以通过功能名称来提及(例如，第一扩增引物，第二扩增引物，启动子引物，探针寡核苷酸，辅助寡聚物，置换寡聚物和靶标捕获寡聚物)，但是本领域技术人员将理解此类术语是指寡聚物。关于两个核苷酸序列的比对，“错配”是两个序列之间的核苷酸差异。错配可以是取代(一个碱基被另一个碱基取代)，插入或缺失。关于杂交，“错配”是指非沃森-克里克碱基对。“扩增子”或“扩增产物”意指在核酸扩增反应中产生且来源于靶核酸的核酸分子。扩增子或扩增产物含有靶核酸序列，其可以与靶核酸同义或反义。扩增子可以是单链或双链的。“扩增引物”或“引物”是指与靶核酸或其补体杂交且参与核酸扩增反应的寡核苷酸。扩增引物与模板核酸杂交，并具有可通过聚合反应延伸的3'-oh(3'-羟基)基团。在一些实施例中，扩增引物是单链的。在一些实施例中，扩增引物是基本上单链的，包含不超过5个连续碱基对的自互补区。在一些实施例中，扩增引物是长度为15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30个碱基。在一些实施例中，扩增引物的长度为18-30个碱基。在一些实施例中，扩增引物的长度为18-60个碱基，并且包含与存在于靶核酸序列中的相应的18-30个核苷酸寡核苷酸杂交序列杂交的18-30个连续碱基(靶杂交区域)。在一些实施例中，18-30个连续的碱基在扩增引物的3′端。扩增引物可以是引物，第一扩增引物，正向扩增引物，第二扩增引物或反向扩增引物。在一些实施例中，特定的扩增引物含有至少约10个连续的碱基，以及任选地至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个连续的碱基，所述连续的碱基与靶核酸序列或其互补链的一个区域互补。连续的碱基可以与扩增引物结合的靶核酸序列至少约80％、至少约90％、至少约95％或完全互补。在一些实施例中，扩增寡聚物包含与靶核酸序列不互补的另外的3'或5'序列。所属领域的技术人员将理解，所列举的范围包括所述范围内的所有整数和有理数(例如92％或98.377％)。扩增引物可任选地包括修饰核苷酸和/或简并位置。在一些实施例中，扩增引物包含至少一个甲基化的胞嘧啶和/或至少一个2'-修饰核苷酸。在一些实施例中，扩增引物包含1、2、3、4、5、6、7或8个2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰核苷酸，5-甲基胞嘧啶或其组合。扩增引物可以任选地被修饰，例如通过包括与靶序列非靶互补的5'区域。这种修饰可以包含功能性添加，如标签、启动子或可用于或适用于操纵或扩增引物或靶寡核苷酸的其它序列。“核酸扩增”是指产生靶核酸序列，或其互补序列，或其片段(即，含有少于完整靶核酸的扩增序列)的多个拷贝的任何体外进行的程序。核酸扩增程序的实例包含转录相关的方法，如转录介导的扩增(tma)、基于核酸序列的扩增(nasba)和其它(例如，美国专利号5,399,491、5,554,516、5,437,990、5,130,238、4,868,105和5,124,246)、复制酶介导的扩增(例如，美国专利号4,786,600)、聚合酶链式反应(pcr)(例如，美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159)、连接酶链式反应(lcr)(例如，欧洲专利申请0320308)和链置换扩增(sda)(例如，美国专利号5,422,252)。复制酶介导的扩增使用自我复制的rna分子和复制酶(如qb复制酶)。pcr扩增使用dna聚合酶、引物和热循环步骤以合成dna或cdna的两条互补链的多个拷贝。lcr扩增使用至少四种单独的寡核苷酸，通过使用杂交、连接和变性的多个循环来扩增靶序列和其互补链。sda使用含有限制性内切酶的识别位点的引物，所述限制性内切酶将切割包含靶序列的半修饰dna双链的一条链，随后在一系列引物延伸和链置换步骤中扩增。特定的实施例使用pcr或tma，但是对于本领域的普通技术人员来说将显而易见的是，本发明的寡聚物可以容易地用作其它扩增方法中的引物。转录介导的扩增使用dna聚合酶、rna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、含有启动子的寡核苷酸，并且任选地可以包含其它寡核苷酸，以最终从核酸模板产生多个rna转录物(详细描述于美国专利号5,399,491和5,554,516；kacian等人，美国专利号5,437,990；burg等人，pct号wo88/01302和wo88/10315；gingeras等人，美国专利号5,130,238；malek等人，美国专利号4,868,105和5,124,246；urdea等人，pct号wo94/03472；mcdonough等人，pct号wo95/03430，和ryder等人)。先前详细地描述了使用tma的方法(美国专利号5,399,491和5,554,516，每一个都通过引用并入本文)。在实时检测扩增子的循环扩增方法中，术语“循环阈值”(ct)是与靶序列扩增相关联信号的出现时间的量度，并且通常是标准化报道分子信号约10倍的标准差。一旦扩增达到“循环阈值”，通常认为是探针寡核苷酸结合序列的阳性扩增产物。然后可以通过本领域技术人员已知的方法来确定扩增产物的身份，如凝胶电泳、核酸测序和其它此类已知的方法。术语“相对荧光单位”(“rfu”)是荧光强度的测量单位。rfu随用于测量的检测装置的特性而变化，并且可以用作比较样品和对照之间的相对强度的测量。分析灵敏度(检测极限或lod)由半数组织培养感染剂量(tcid50/ml)确定。tcid50/ml是在50％接种的细胞培养物中会引起病理变化的病原体的量。“探针寡核苷酸”，“检测探针”或“探针”是指在促进核酸杂交的条件下，为了检测靶核酸序列，与包括扩增序列的靶序列特异性杂交的寡聚物。检测可以是直接的(即，探针寡核苷酸直接与靶核酸序列杂交)或间接的(即，探针寡核苷酸与连接探针寡核苷酸与靶核酸序列的中间结构杂交)。探针寡核苷酸的靶序列通常是指探针寡核苷酸与之特异性杂交的较大序列中的特定序列。在一些实施例中，探针寡核苷酸的长度为15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35或15-30个碱基。在一些实施例中，探针寡核苷酸的长度为20-60个碱基，并且包含与存在于靶核酸序列中的相应的20-30个寡核苷酸杂交序列杂交的20-30个连续的碱基。探针寡核苷酸可包括靶标特异性序列和非靶标互补序列。此类非靶标互补序列可包括赋予期望的二级或三级结构(例如发夹结构)的序列，其可用于促进检测和/或扩增。(例如，美国专利号5,118,801；5,312,728；5,925,517；6,150,097；6,849,412；6,835,542；6,534,274；和6,361,945；以及美国专利申请公开号no.20060068417a1和20060194240a1)。已定义的序列的探针寡核苷酸可由所属领域的一般技术人员已知的技术产生，如通过化学合成，和通过重组核酸分子的体外或体内表达。术语“非靶标特异性序列”或“非靶标互补序列”是指寡聚物的区域，其中该区域在标准杂交条件下不会与靶核酸中的互补性寡聚物杂交序列退火。更具体地，非靶标特异性序列与靶核酸中的寡核苷酸杂交序列相邻的靶序列不互补。这样的非靶标特异性序列可以与寡核苷酸中的靶标特异性序列的一部分互补。在一些实施例中，非靶标互补序列的长度为4、5、6、7或8个碱基。具有非靶标特异性序列的寡聚物的实例包括但不限于分子信标。可以使用存在于靶标扩增过程中并与扩增子实时杂交的单链核酸探针寡核苷酸实现检测。在一些实施例中，实时检测包括实时pcr。示例性的探针寡核苷酸包括水解探针，火炬和分子信标。探针寡核苷酸可包含荧光团和猝灭剂。火炬在每个末端都包含互补区域。在一些实施例中，互补区之一是非靶标互补序列。互补区(例如，探针中的非靶标互补序列及其互补区)的长度可以是4、5、6、7或8个碱基。这些互补区域相互结合，形成“封闭”火炬。在封闭配置中，荧光团和猝灭剂非常接近，并且荧光团信号被猝灭。也就是说，当被光激发时，它不会发出可检测的信号。但是，当火炬与互补靶序列结合时，火炬内的互补区域被迫分开以形成“开放”火炬。在开放形式中，荧光团和猝灭剂靠得不是很近，并且当被激发时(即，不再被猝灭)，荧光团信号是可检测的。扩增子与火炬的结合导致猝灭剂与荧光团的分离。它可以响应特定波长的光刺激和信号发射而激发荧光团。火炬可以在扩增过程中出现，并与互补扩增子结合，因为它是实时生成的。随着创建更多的扩增子，将束缚更多的火炬并创建更多的信号。信号最终达到可以在背景以上检测到的水平，并最终达到所有可用火炬都绑定到扩增子且信号达到最大值的程度。在扩增开始时，且扩增序列的拷贝数低，大多数探针寡核苷酸是封闭的(3'和5'互补区域为碱基对，荧光信号被猝灭)。在扩增过程中，更多的探针寡核苷酸与靶序列结合，从而将探针寡核苷酸的3'和5'端(互补区)分开，从而导致荧光增强(荧光猝灭减少)。进一步放大后，荧光信号达到最大值。“水解探针”是可用于实时pcr的序列特异性化学试剂之一。水解探针的方法基于5'核酸酶测定。水解探针通常称为taqmantm(水解)探针。水解探针是双标记的寡核苷酸。寡核苷酸的5'端被荧光报道分子标记，而3'端被猝灭分子标记。水解探针的序列对扩增的靶序列中的目标区域具有特异性。设计水解探针，使得序列的长度将5'荧光团和3'猝灭剂放置在足够接近的位置，以抑制荧光。水解探针结合扩增引物的结合位点之间的目标区域。在pcr循环的延伸阶段，taqdna聚合酶在pcr扩增引物的下游合成互补链。当延伸到达结合的水解探针时，taqdna聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性使水解探针降解。水解探针的切割使荧光报道分子与探针的其余部分分离，从而使报告分子发出荧光。在随后的pcr循环中，释放的荧光报道分子的数量逐渐增加，因此荧光也逐渐增加。在一些实施例中，水解探针的长度为20-30个碱基，而没有任何茎环，自杂交或其他二级结构。水解探针不具有与扩增引物的序列互补性或与它们的结合位点重叠。在一些实施例中，水解探针的退火温度比第一和第二扩增引物的退火温度高约5-7℃。在一些实施例中，水解探针的退火温度比第一和第二扩增引物的退火温度高约5℃，约6℃或约7℃。术语“互补的”或“充分互补的”表示两个单链多核苷酸(例如，扩增寡核苷酸和靶核酸序列)之间特殊的核苷酸碱基配对关系或同一单链多核苷酸的两个不同区域(例如，分子信标)之间的特定核苷酸碱基配对关系。)，可以进行杂交(例如，形成稳定的双链杂交体)。互补序列不必完全互补(100％互补)来形成稳定的双链体。在一些实施例中，部分互补的序列(由于与标准核酸碱基配对的错配而少于100％互补)保持足够的互补，前提是它们允许多核苷酸序列退火。互补性百分比表示第一条核酸序列中连续链中碱基的百分比，该序列可以与第二条核酸序列形成氢键(例如watson-crick碱基对)，(例如5/10、6/10、7/10、8/10、9/10、10/10为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。互补性百分比的计算方法类似于识别百分比。在规范碱基对中，嘌呤碱基与嘧啶碱基氢键结合，腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶配对(a和t或u)，鸟嘌呤与胞嘧啶配对(c和g)。碱基配对也可以在不是这些规范对成员的碱基之间形成。非规范碱基配对是分子生物学领域的普通技术人员众所周知的(参见，例如，rlpadams等人，《核酸的生物化学》(第11版。1992))。合适的杂交条件对于本领域技术人员来说是众所周知的，可以基于序列组成来预测，或可以通过使用常规测试来凭经验来确定(例如，sambrook等人,《分子克隆：实验手册(molecularcloning,alaboratorymanual)》,第2版，§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57，尤其是§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57)。序列同一性可以通过使用算法对比序列来确定(如威斯康星州麦迪逊575科学博士geneticscomputergroup的威斯康星州遗传学软件包7.0版中的bestfit、fasta和tfasta)，使用默认空位参数或通过检查和最佳对齐来确定(即在比较窗口中导致最高的序列相似性百分比)。序列同一性百分比是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中出现相同残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，再将匹配位置的数目除以总数而得出的匹配和不匹配位置的数量不计算比较窗口中的空位(即窗口大小)，并将结果乘以100即可得出序列同一性的百分比。除非另有说明，否则两个序列之间的比较窗口是由两个序列中较短的一个的全长定义的。“自身互补性”是指含有可以互相杂交的内部互补序列，在寡核苷酸内产生双链结构或区域的寡核苷酸。根据寡核苷酸内互补序列的位置，序列的杂交可形成发夹环，连接，凸起或内部环。在一些实施例中，自身互补序列的长度可以各自为4-6个碱基。在一些实施例中，自身互补序列位于寡核苷酸的5'和3'端。在一些实施例中，可以将自身互补序列添加至寡核苷酸的5'或3'端，例如检测探针。“杂交(hybridization或hybridize)”意指两条完全或部分互补的核酸序列在特定的杂交试验条件下以平行或反平行的方向结合在一起，从而形成具有双链区的稳定结构的能力。这种双链结构的两条组成链(有时被称为杂交链)通过氢键结合在一起。尽管这些氢键最常见形成于单个核酸链上含有碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(a和t或u)或胞嘧啶和鸟嘌呤(c和g)的核苷酸之间，但碱基配对还可以在不是这些“经典”对的成员的碱基之间形成。非规范碱基配对在本领域中是众所周知的。(参见，例如，r.l.p.adams等人,《核酸的生物化学(thebiochemistryofthenucleicacids)》)(第11版,1992)。“优先杂交”是指在严格杂交条件下，扩增引物或探针寡核苷酸可以与其靶核酸杂交以形成稳定的寡聚物：靶杂种，但不能形成足够数量的稳定的寡聚物：非靶杂种。优先与靶核酸杂交的扩增引物和检测寡聚物可用于扩增和/或检测靶核酸而不是非靶核酸，特别是在系统发育上密切相关的生物中。因此，寡聚物与靶核酸杂交的程度充分大于与非靶核酸杂交的程度，使得本领域普通技术人员能够适当地精确扩增和/或检测来自特定靶核酸的核酸的存在(或不存在)。通常，减小寡核苷酸序列与其靶序列之间的互补程度将会降低寡核苷酸与其靶区域的杂交程度或速率。然而，包含一种或多种非互补核苷或碱基可以促进寡核苷酸区分非靶生物的能力。优先杂交可以使用本领域已知的和本文所描述的技术来测量，如在下面所提供的实例中。在一些实施例中，测试样品中的靶杂交信号与非靶杂交信号之间存在至少10倍的差异、至少20倍的差异、至少50倍的差异、至少100倍的差异、至少200倍的差异、至少500倍的差异或至少1,000倍的差异。在一些实施例中，测试样品中的非靶杂交信号不超过背景信号水平。“严格杂交条件”或“严格条件”意指允许寡核苷酸优先与靶核酸(例如bkv核酸)杂交而不是与衍生自密切相关的非靶核酸体的核酸杂交的条件。虽然严格杂交条件的定义没有变化，但可用于严格杂交的实际反应环境可以根据包含寡聚物的gc含量和寡聚物长度、寡聚物序列与测试样品中可能存在的靶核酸和非靶核酸序列之间的相似度等因素而变化。杂交条件包含杂交试剂或溶液的温度和组合物。当盐浓度在约0.6-0.9m的范围内时，用于用本发明的寡聚物扩增和/或检测来自一种或多种bkv菌株的靶核酸的示例性杂交测定条件对应于约60℃的温度。具体的杂交测定条件在下文的实施例部分中阐述。本领域普通技术人员可以容易地确定其它可接受的严格杂交条件。与参考寡聚物的“在严格条件下与bkv核酸杂交的竞争”是指寡聚物在严格条件下实质上降低了参考寡聚物与其bkv靶序列的结合，当过量供应时，竞争性寡聚物可将参考寡聚物在亚饱和浓度下的结合减少约20％、30％、40％、50％或更多，或者竞争低聚物的tm高于或在参考低聚物到靶的tm的约5、4、3、2或1℃范围内。合适的寡核苷酸竞争测定条件和程序是本领域已知的。“测定条件”是指允许寡核苷酸与靶核酸稳定杂交的条件。测定条件不需要寡核苷酸与靶核酸的优先杂交。“标记”或“可检测的标记”是指与可被检测或可产生检测信号的探针寡核苷酸直接或间接连接的部分或化合物。直接连接可以使用共价键或非共价相互作用(例如，氢键、疏水或离子相互作用，以及螯合物或配位复合物的形成)，而间接连接可以使用桥接部分或接头(例如，通过抗体或一种或多种额外的寡核苷酸，其放大了可检测的信号)。可以使用任何可检测部分，例如放射性核素、配位体(如生物素或抗生物素蛋白)、酶、酶底物、反应性基团、发色团(如赋予可检测的色彩的染料或颗粒(例如乳胶或金属珠粒))、发光化合物(例如生物发光、磷光或化学发光化合物)以及荧光化合物(即，荧光团)。荧光团的实施例包含吸收约495到650nm范围内的光并且发射约520到670nm范围内的光的那些荧光团，其包含那些已知的fam(荧光素)、tettm(四氯荧光素)、calfluortm(橙色或红色)、cy和quasartm化合物。荧光团可与猝灭分子组合使用，所述猝灭剂分子在紧邻荧光团时吸收光以减少背景荧光。这种猝灭剂在本领域中是众所周知的，并且包含例如黑洞猝灭剂tm(或bhqtm，包括但不限于，黑洞猝灭剂-2(bhq2))或tamratm化合物。特定的实施例包含“均相可检测标记”，所述标记在均相系统中是可检测的，其中混合物中结合的标记探针寡核苷酸与未结合的标记探针寡核苷酸相比显示出可检测的变化，这允许在没有从未杂交的标记探针寡核苷酸中物理去除杂交的情况下检测标记(例如，美国专利号5,283,174、5,656,207和5,658,737)。特定的均相可检测标记包含化学发光化合物，包含吖啶酯(“ae”)化合物，如众所周知的标准ae或ae衍生物(美国专利号5,656,207、5,658,737和5,639,604)。合成标记、将标记附着到核酸上以及检测来自标记的信号的方法都是众所周知的(例如，sambrook等人,《分子克隆：实验手册(molecularcloning,alaboratorymanual)》,第2版)。(冷泉港出版社(coldspringharborlaboratorypress),冷泉港,纽约,1989)第10章，并且美国专利号5,658,737、5,656,207、5,547,842、5,283,174和4,581,333，以及欧洲专利申请0747706)。将ae化合物与核酸连接的特定方法是已知的(例如，美国专利号5,585,481和美国专利号5,639,604，参见第10栏第6行到第11栏第3行，以及实例8)。特定的ae标记位置是探针寡核苷酸的中心区域和a/t碱基对的区域附近，在探针寡核苷酸的3’或5’端，或在与已知序列的错配位点处或其附近，与所期望的靶序列相比，探针寡核苷酸不应检测到所述错配位点。其他可检测标记的探针寡核苷酸包括taqmantm(水解)探针，分子火炬和分子信标。taqmantm(水解)探针包括供体(荧光团)和受体(猝灭剂)标记，其中在扩增期间，为了从存在猝灭剂中释放荧光团，在以酶促方式降解探针寡核苷酸时检测到荧光。分子火炬和信标以开放和封闭构型存在，其中所述封闭构型猝灭荧光团，并且所述开放位置将荧光团与猝灭剂分离以使其荧光。与目标的杂交打开了其他封闭的探针寡核苷酸。如果序列允许两个核酸序列的稳定杂交，例如探针寡核苷酸和靶序列的稳定杂交，则序列是“充分互补的”，但是所述序列不必是完全互补的。通过使用规范碱基配对(例如g：c，a：t或a：u)，通过互补核苷酸的子集系列之间的氢键，充分互补的序列与另一个序列杂交。两个序列可以包含一个或多个不互补的残基(包括脱碱基位置)，只要整个序列在适当的杂交条件下形成稳定的杂交复合物即可。在杂交在一起的序列中，充分互补的序列可以是至少约80％、至少约90％或完全互补的。合适的杂交条件对于本领域技术人员来说是众所周知的，可以基于序列组成来预测，或可以通过使用常规测试来凭经验来确定(例如，sambrook等人,《分子克隆：实验手册(molecularcloning,alaboratorymanual)》,第2版，§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57，尤其是§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57)。除非另有说明，否则特别是在权利要求中，“seqidno:x的序列”是指相应序列列表条目的碱基序列，并且不需要主链的身份(例如，rna、2’-o-merna或dna)或碱基修饰(例如，胞嘧啶残基的甲基化)。除非另有说明，否则特别是在权利要求中，“seqidno:x的核酸序列”是指出现在相应序列列表条目的碱基序列，并且不需要主链的身份(例如，rna、2’-o-merna或dna)或碱基修饰(例如，胞嘧啶残基的甲基化)。出现在相应序列中的碱基序列可以包括相应序列表条目的全部或部分整个的碱基序列。相应序列表条目的整个碱基序列的一部分可以出现在相应序列表条目内的任何地方。相应序列表条目的整个碱基序列的部分可以是任何长度，包括但不限于2-50个连续的碱基。寡核苷酸中的“简并”位置是指在寡核苷酸群体中存在一个以上碱基的位置。简并序列区域中的每个位置可具有两个或更多个可能的碱基替代物。简并位置上的核苷酸替代物可以等量或等概率存在。例如，核苷酸可以表示为y，代表c或t。简并位置可以是但不限于r(a或g)，w(a或t)，m(a或c)，y(c或t)，k(g或t)，b(a或g或t)，d(a或g或t)，h(a或c或t)，n(a或g或c或t))，s(g或c)或v(a或c或g)。具有简并位置的寡聚物可以通过在期望并入的简并位置的合成步骤中提供与期望的简并组合相对应的核苷酸前体的混合物来合成。寡核苷酸可以被合成为简并的。或者，寡核苷酸可以合成为单个物种，然后混合。寡聚物中的“非watsoncrick”(nwc)位置是指该寡聚物被配置为与至少一个具有非watsoncrick对(例如g-u，g-t或g-a)的bkv靶序列杂交的位置(g或u/t/a可以是寡聚体中的碱基)。在一些实施例中，nwc位置被配置为由摆动(g-u或g-t)或嘌呤-嘌呤(g-a)对杂交。术语“热稳定的”或“热稳定的聚合酶”是指热稳定或耐热的并且催化脱氧核糖核苷酸的聚合以形成与核酸链互补的引物延伸产物的酶。当在pcr扩增过程中，经受一段时间以使单链核酸失稳或使双链核酸变性的高温时，本文中有用的耐热dna聚合酶不会不可逆地失活。酶的不可逆变性是指酶活性的实质损失。更好的是，热稳定的dna聚合酶在诸如pcr扩增通常所的约90-100℃条件下不会不可逆地变性。术语“pcr扩增”或“pcr扩增”通常是指使用与互补链杂交的扩增引物循环核酸的聚合酶介导的指数扩增。已经开发出可以与包含荧光指示剂的组合物进行热循环反应的装置，所述荧光指示剂能够发射指定波长的光束，读取荧光染料的强度并在每个循环之后显示荧光强度。除非另外定义，在此使用的所有科学和技术术语具有如相关领域的那些技术人员通常理解的相同含义。一般定义可以在与分子生物学领域相关的技术书籍中找到，例如“微生物学和分子生物学词典，第2版”。(singleton等，1994，纽约，纽约的johnwiley&sons)或“哈珀·柯林斯生物学词典”(hale&marham，1991，哈珀·佩尔南特，纽约，纽约)。寡聚物在表1a中可以找到适合于扩增bkv靶序列的扩增引物。在表1b中可以找到适合于检测bkv扩增子的探针寡核苷酸。表1c中显示了包含要扩增区域的bkv靶标区域。表1a.扩增引物寡核苷酸序列。表1b.探针寡核苷酸序列。表1c.bkv基因靶区域序列。所描述的扩增寡核苷酸被配置为与bkv核酸或衍生自bkv的核酸特异性杂交。在一些实施例中，某些所述扩增引物经配置以与bkvvp2基因核酸或衍生自bkvvp2基因的核酸特异性杂交。在一些实施例中，扩增寡核苷酸具有靶杂交区域，其长度为约18-30个碱基或在其长度约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。在一些实施例中，扩增寡核苷酸包含表1a的任何序列。在一些实施例中，扩增引物的长度为18-30个碱基，并且包含与表1a.的任何序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，扩增引物的长度为18-30个碱基，并且包含与表1a.的任何序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列。在一些实施例中，扩增引物的长度为18-30个碱基，并且包含表1a的任何序列的核苷酸序列。在一些实施例中，扩增引物由表1a的任何序列组成。在一些实施例中，扩增引物包含在严格条件下与表1a中的任何序列竞争结合bkv核酸的寡聚物。bkv核酸可以是但不限于seqidno:50或其互补序列，seqidno:51或其互补序列，以及seqidno:52或其互补序列。在一些实施例中，扩增引物的长度为18-60个碱基，并且包含靶杂交的区域，其长度为18-30个碱基，其中所述靶杂交区域具有表1a的任何序列的核苷酸序列。在一些实施例中，第一和/或第二扩增引物包含能够与seqidno:1、2、4、5、7、9、10、12、13、14、16、18、19、21、22、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47，48和/或49中的任一个竞争的寡聚物以与seqidno:50或其互补序列杂交。在一些实施例中，第一扩增引物与第一bkv核酸序列杂交，并且第二扩增引物与第二bkv核酸序列杂交。在一些实施例中，第一扩增引物与第一bkv核酸序列90％至100％互补，并且第二扩增引物与第二bkv核酸序列90％至100％互补。在一些实施例中，第一扩增引物与第一bkv核酸序列＞90％且＜100％互补，第二扩增引物与第二bkv核酸序列＞90％且＜100％互补。在一些实施例中，第一扩增引物含有与第一bkv核酸序列的0、1或2个错配，而第二扩增引物含有与第二bkv核酸序列的0、1，或2个错配。在一些实施例中，第一扩增引物(第一引物)和第二扩增引物(第二引物)被配置为扩增bkv扩增子。在一些实施例中，第一扩增引物和第二扩增引物被配置为扩增bkvvp2扩增子。在一些实施例中，bkv扩增子的长度为约90至约150个核苷酸。在一些实施例中，第一扩增引物和第二扩增引物被配置为扩增bkv扩增子90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105，106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130，131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个核苷酸(或碱基对)的长度。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:13的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:14的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:1的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:2的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:4的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:5的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:7的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:9的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:10的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:12的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:16的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:18的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:21的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:19的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:24的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:22的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:25的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:26的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:13的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:36和/或seqidno:37的核苷酸序列。在一些实施例中，一个或多个第一扩增引物包含seqidno:35和/或seqidno:36的核苷酸序列，并且第二扩增引物包含seqidno:14的核苷酸序列。在一些实施例中，一个或多个第一扩增引物包含seqidno:35和/或seqidno:36的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:36和/或seqidno:37的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:1的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:28和/或seqidno:29的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:10的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:32和/或seqidno:33的核苷酸序列。在一些实施例中，一个或多个第一扩增引物包含seqidno:30和/或seqidno:31的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:12的核苷酸序列。在一些实施例中，或更多个第一扩增引物包含seqidno:30和/或seqidno:31的核苷酸序列，一个或更多个第二扩增引物包含seqidno:32和/或seqidno:33的核苷酸序列。在一些实施例中，一个或多个第一扩增引物包含seqidno:38和/或seqidno:39的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:18的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:21的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:40和/或seqidno:41的核苷酸序列。在一些实施例中，一个或多个第一扩增引物包含seqidno:42和/或seqidno:43的核苷酸序列，并且第二扩增引物包含seqidno:19的核苷酸序列。在一些实施例中，一个或多个第一扩增引物包含seqidno:42和/或seqidno:43的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:40和/或seqidno:41的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:24的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:44和/或seqidno:45的核苷酸序列。在一些实施例中，一个或多个第一扩增引物包含seqidno:46和/或seqidno:47的核苷酸序列，并且第二扩增引物包含seqidno:22的核苷酸序列。在一些实施例中，一个或多个第一扩增引物包含seqidno:46和/或seqidno:47的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:44和/或seqidno:45的核苷酸序列。在一些实施例中，第一扩增引物包含seqidno:25的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:48和/或seqidno:49的核苷酸序列。第一和第二扩增引物能够引发dna聚合。在一些实施例中，第一和第二扩增引物与热稳定的dna聚合酶相容。在一些实施例中，第一和第二扩增引物与得自水生嗜热菌(taq)的dna聚合酶相容。在一些实施例中，第一和第二扩增引物能够通过taq引发dna聚合。在一些实施例中，提供了包含可检测标记(标记)的扩增寡核苷酸。这样的扩增寡核苷酸可以用作探针寡核苷酸。在一些实施例中，探针寡核苷酸用于检测使用所述扩增引物制备的bkv扩增产物的存在或不存在。探针寡核苷酸可用于检测bkv扩增子，即，探针寡核苷酸与bkv扩增子杂交。可以使用任何所述的扩增引物产生bkv扩增子。在一些实施例中，探针寡核苷酸包含与bkv扩增子中的21-30个连续碱基互补90％-100％的21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续碱基。所描述的探针寡核苷酸被配置为与bkv核酸特异性杂交。在一些实施例中，探针寡核苷酸被配置为与bkvvp2基因核酸特异性杂交。在一些实施例中，探针寡核苷酸包含表1b的任何序列。在一些实施例中，探针寡核苷酸的长度为21-30个碱基，并且包含与表1b的任何序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，探针寡核苷酸的长度为21-30个碱基，并且包含与表1b的任何序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列。在一些实施例中，探针寡核苷酸的长度为21-30个碱基，并且包含表1b的任何序列的核苷酸序列。在一些实施例中，探针寡核苷酸由表1b的任何序列组成。在一些实施例中，探针寡核苷酸包含在严格条件下与表1b中的任何序列竞争结合bkv核酸的寡聚物。bkv核酸可以是但不限于seqidno:50或其互补序列，seqidno:51或其互补序列，以及seqidno:52或其互补序列。在一些实施例中，扩增引物的长度为21-60个碱基，并且包含靶杂交的区域，其长度为21-30个碱基，其中所述靶杂交区具有表1b中的任何序列的核苷酸序列。在一些实施例中，探针寡核苷酸包含能够与seqidno:3、6、8、11、15、17、20、23和27中的任一个竞争的寡聚物。用于与seqidno:50或其互补序列杂交。在一些实施例中，探针寡核苷酸与扩增的bkv核酸序列杂交。在一些实施例中，探针寡核苷酸与扩增的bkv核酸序列90％至100％互补。在一些实施例中，探针寡核苷酸与扩增的bkv核酸序列＞90％和＜100％互补。在一些实施例中，探针寡核苷酸含有与扩增的bkv核酸序列的0、1或2个错配。在一些实施例中，可检测标记是非核苷酸标记。合适的标记包含发射可检测光信号的化合物，例如可以在均相混合物中检测的荧光团或发光(例如，化学发光)化合物。特定探针寡核苷酸上可以存在多于一个标记以及多于一种类型的标记，或可以依赖使用探针寡核苷酸的混合物来进行检测，在该混合物中，每个探针均标记有产生可检测信号的化合物(参见，例如，美国专利号6,180,340和6,350,579，各自通过引用并入本文)。标记可以通过各种方式连接至探针寡核苷酸，包括共价键、螯合作用和离子相互作用，而在一些实施例中，标记是共价连接的。例如，在一些实施例中，探针寡核苷酸具有附着的化学发光标记，如吖啶酯(ae)化合物(参见，例如，美国专利号5,185,439；5,639,604；5,585,481；和5,656,744)。标记(如荧光或化学发光标记)可以通过非核苷酸接头附着到探针寡核苷酸上(参见，例如，美国专利号5,585,481；5,656,744；和5,639,604)。可检测标记的实例包括但不限于荧光素，四甲基罗丹明，iaedans，edans，dabcyl，香豆素，bodipyfl，荧光黄，曙红，赤藓红，四甲基罗丹明，德克萨斯红，cy5，荧光素/qsy7染料等。在一些实施例中，探针寡核苷酸(例如，包含荧光标记)还包括与第一标记相互作用的第二标记。例如，第二标记可以是猝灭剂。可以使用这样的探针探针寡核苷酸(例如，在taqmantm(水解探针)试验中)，其中探针寡核苷酸与靶序列或扩增子的杂交，随后通过包括5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶进行核溶解，导致释放荧光标记，并且从而增加荧光，或荧光与第二标记的相互作用无关。可结合本发明使用的相互作用供体/受体标签对的示例，不试图区分fret与非fret对，包括荧光素/四甲基罗丹明、iaedans/荧光素、edans/dabcyl、香豆素/dabcyl、荧光素/荧光素、bodipy-fl/bodipy-fl、荧光素/dabcyl、calred-610/bhq-2，荧光素黄/dabcyl，类星体750/bhq-2，bodipy/dabcyl，曙红/dabcyl，赤藓红/dabcyl，四甲基罗丹明/dabcyl，德克萨斯红/dabcyl，cy5/bhq1，cy5/bhq2，cy3/bhq1，cy3/bhq2和荧光素/qsy7染料。本领域普通技术人员将理解，当供体和受体染料不同时，能量转移可以通过受体的敏化荧光的出现或通过供体荧光的猝灭进行检测。在一些实施例中，非荧光受体(诸如dabcyl和qsy7染料)减少或消除了由直接(即非敏化的)受体激发引起的背景荧光的潜在问题。可用作供体-受体对的一个成员的示例性荧光团部分包括荧光素、rox和cy染料(诸如cy5)。可用作供体-受体对的另一个成员的示例性猝灭剂部分包括可从格伦研究公司(弗吉尼亚州斯特林)、贝瑞联合公司(密歇根州德克斯特)和生物研究技术公司(加利福尼亚州诺瓦托)获得的dabcyl，blackberry和黑洞猝灭剂部分。在一些实施例中，探针寡核苷酸是不可延伸的(即，它是封闭的)。例如，探针寡核苷酸可通过3′磷酸化而变得不可延伸，其具有3′-末端3′-脱氧核苷酸(例如，末端2′，3′-二脱氧核苷酸)，具有3′-末端倒位核苷酸(例如，其中最后一个核苷酸倒位以使其通过3′-二脱氧核苷酸连接到倒数第二个核苷酸)3′磷酸二酯键或其类似物，如硫代磷酸酯)，或具有附着的荧光团、猝灭剂或干扰延伸的其他标记(可能但不一定通过末端核苷酸的3′位置附着)。在一些实施例中，3’-端核苷酸未被甲基化。所描述的任何扩增寡核苷酸(例如，扩增引物和探针寡核苷酸)可包含至少一个修饰核苷酸。修饰的寡核苷酸可以是但不限于2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰的寡核苷酸或5-甲基胞嘧啶。在一些实施例中，扩增寡核苷酸包含两个或更多个修饰核苷酸。两个或更多个修饰核苷酸可以相同或不同。在一些实施例中，任何所述扩增寡核苷酸可包含一个或多个5-甲基胞嘧啶。扩增寡核苷酸可以具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多的2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰的寡核苷酸，5-甲基胞嘧啶或其组合。在一些实施例中，扩增寡核苷酸中的所有胞嘧啶核苷酸都是5-甲基胞嘧啶修饰核苷酸。在某些寡聚物中，可以通过将寡核苷酸中每个5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶的tm提高约0.5°-1.3℃来使用5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶碱基来增加双链体的稳定性(相对于相应的非甲基化寡聚物)。组合物和试剂盒本发明提供了可用于扩增，检测和/或定量样品中的bkv的扩增寡核苷酸，组合物和试剂盒。本发明还提供了用于确定样品中bkv靶核酸的存在与否或者定量其数量的反应混合物。根据本发明的反应混合物包括以下中的至少一种或多种：本文所描述的用于扩增bkv靶核酸序列的扩增引物对和本文所描述的用于确定bkv扩增产物存在与否的探针寡核苷酸。在一些实施例中，可以在试剂盒中提供本文所述的任何扩增引物对。组合物，试剂盒和/或反应混合物可能还包括许多任选的成分。对于扩增反应混合物，反应混合物将典型地包括适于进行体外扩增的其它试剂，诸如例如缓冲液、盐溶液、合适的核苷三磷酸(例如，datp、dctp、dgtp和dttp；和/或atp、ctp、gtp和utp)和/或酶(例如，耐热dna聚合酶、逆转录酶和/或rna聚合酶)，并且任一地包括测试样品成分，其中bkv靶核酸可以存在或不存在。反应混合物可以包括仅用于bkv基因组的一个靶区域的扩增寡核苷酸，或者可以包括用于多个bkv靶区域的扩增寡核苷酸。此外，对于包含探针寡核苷酸和扩增引物对的反应混合物，该反应混合物的扩增引物和探针寡核苷酸的选择由共同的靶区域连接(即，反应混合物将包括结合到可由反应混合物的扩增寡聚物组合扩增的序列上的探针)。在一些实施例中，试剂盒可包含用于扩增和/或检测bkv的扩增寡核苷酸和用于检测一种或多种其他，非bkv，生物的扩增寡核苷酸。在一些实施例中，试剂盒或反应混合物包含扩增引物对。该对中的第一扩增引物和第二扩增引物可以提供于单个容器或单独的容器中。在一些实施例中，试剂盒或反应混合物包含探针寡核苷酸。在一些实施例中，试剂盒或反应混合物包含扩增引物对和探针寡核苷酸。扩增引物和探针寡核苷酸可以在单个容器或分开的容器中提供。在一些实施例中，反应混合物包含kcl。在一些实施例中，kcl浓度为约50mm。在一些实施例中，kcl浓度大于约50mm，例如约60-150mm，约75-125mm，约80-120mm，约85-115mm或约90-110mm。在一些实施例中，kcl浓度为55-65、65-75、75-85、85-95、95-105、105-115、115-125、125-135或135-145，其中每个前述以mm为单位，并可选地用“约”修饰。在一些实施例中，根据本发明的组合物包含例如任何前述浓度的kcl。在一些实施例中，根据本发明的方法包括在kcl(例如在任何前述浓度下)的存在下进行扩增反应。在一些实施例中，提供了扩增寡核苷酸，例如在试剂盒或组合物中。扩增寡核苷酸通常包含靶杂交区，例如，配置为与bkv核酸特异性杂交。在一些实施例中，提供了一对扩增引物，其中一个扩增引物被配置成与bkv核酸的有义链杂交，并且另一个扩增引物被配置成与bkv核酸的反义链杂交。这样的扩增引物包括用于pcr，转录介导的扩增或本领域已知的其他形式的扩增的扩增引物对。在一些实施例中，一种或多种扩增寡核苷酸，例如扩增引物对，探针寡核苷酸或其组合，被配置为与bkv核酸序列杂交。在一些实施例中，一种或多种扩增寡核苷酸，例如扩增引物对，探针寡核苷酸或其组合，被配置为与bkvvp2基因杂交。在一些实施例中，一种或多种扩增寡核苷酸，例如扩增引物对，探针寡核苷酸或其组合，被配置为与由seqidno:50和/或其补体、seqidno:51和/或其补体、或seqidno:52和/或其补体代表的bkv序列杂交。在一些实施例中，还提供了一种或多种内标探针寡核苷酸。在一些实施例中，一种或多种扩增寡核苷酸包含简并位置。在一些实施例中，bkv扩增引物，bkv扩增引物对和/或bkv探针寡核苷酸包含简并位置。在一些实施例中，一种或多种扩增寡核苷酸包含非沃森克里克(nwc)位置。在一些实施例中，bkv扩增引物，bkv扩增引物对和/或bkv探针寡核苷酸包含nwc位置。在一些实施例中，一组中的一种或多种扩增寡核苷酸、试剂盒、组合物或反应混合物包括甲基化胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。在一些实施例中，扩增寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰的寡核苷酸，5-甲基胞嘧啶或其组合。在一些实施例中，扩增寡核苷酸中至少约一半胞嘧啶被甲基化。在一些实施例中，扩增寡核苷酸中的全部或基本上全部(例如，除了1-2之外的所有)胞嘧啶被甲基化。在一些实施例中，在3'端或在3'端的2、3、4或5个碱基内的胞嘧啶是非甲基化的。在一些实施例中，组合物或试剂盒包含探针寡核苷酸，该探针寡核苷酸包含可检测的标记。在一些实施例中，组合物或试剂盒包含探针寡核苷酸，该探针寡核苷酸包含荧光标记和猝灭剂。荧光标记和猝灭剂可以是但不限于：6'-羧基-x-罗丹明(rox)和吖啶猝灭剂，以及带有dabcyl猝灭剂的荧光素(fam)。在一些实施例中，组合物或试剂盒包含两种或更多种探针寡核苷酸。两种或更多种探针寡核苷酸可以检测不同扩增子的相同扩增子(即，扩增的靶序列)。不同的扩增子可以来自相同或不同的生物(包括病毒)。在一些实施例中，两个或更多个探针寡核苷酸包含可以彼此区分的不同可检测标记。在一些实施例中，不同的可检测标记是发射不同波长的光的荧光团。在一些实施例中，试剂盒，组合物或反应混合物还包含以下一种或多种：dna聚合酶，阳性对照核酸，阴性对照核酸，内标核酸，脱氧核糖核苷酸(即dntp(例如datp，dttp，dgtp和dctp))，kcl，mgcl2，乙酸钾，缓冲液，bsa，蔗糖，海藻糖，dmso，甜菜碱，甲酰胺，甘油，聚乙二醇，非离子型去污剂，铵离子，edta，以及其他适合pcr扩增的试剂或缓冲液。dna聚合酶可以是但不限于热稳定的dna聚合酶(例如，taq聚合酶)。缓冲液可以是但不限于tris-hcl和tris-乙酸盐。非离子型去污剂可以是但不限于tween-20和tritonx-100。在一些实施例中，试剂盒，组合物或反应混合物包含扩增和任选检测一个或多个靶核酸序列所必需的成分。在一些实施例中，试剂盒还包括用于根据本发明的实践方法的一组说明，其中该说明书可与包装插入物和/或试剂盒或其成分的包装相关联。本文所公开的任何方法也应理解为针对该方法的目的，公开了该方法中所涉及的材料的相应用途。包含bkv序列的任何扩增寡核苷酸和包含此类扩增寡核苷酸的任何组合(例如，试剂盒和组合物)应理解为还公开用于检测和/或定量bkv或扩增bkv核酸序列，以及用于制备用于检测和/或定量bkv的组合物，或用于扩增bkv核酸序列。扩增，检测或定量bkv的方法描述了使用一种或多种如上所述的扩增寡核苷酸，组合物或试剂盒检测和/或定量bkv或扩增bkv核酸序列的方法。在一些实施例中，所描述的扩增寡核苷酸可用于检测样品中存在小于或等于50个拷贝，小于或等于40个拷贝，小于或等于30个拷贝，小于或等于20个拷贝，或小于或等于10个拷贝的bkv。在一些实施例中，当bkv以每个样品10、20、30、40、50或更多拷贝存在时，使用所述寡核苷酸的检测率大于或等于95％。在一些实施例中，所描述的扩增引物和探针寡核苷酸可用于扩增和/或检测临床样品或人工临床样品中的bkv。在一些实施例中，所述扩增引物和探针寡核苷酸可用于扩增，检测和/或定量bkv的一种或多种菌株。在一些实施例中，所描述的扩增引物和探针寡核苷酸与血浆，血清或尿液中常见的生物几乎没有或没有交叉反应。在一些实施例中，所述的扩增引物和探针寡核苷酸可用于在血浆，血清或尿液中常见的生物体存在时检测bkv。在一些实施例中，所描述的用于bkv的扩增引物和探针寡核苷酸可用于在有其它扩增引物和探针寡核苷酸存在的情况下扩增和/或检测bkv，所述扩增引物和探针寡核苷酸用于检测来自bkv以外的一个或多个生物体或bvk中的不同区域的核酸。在一些实施例中，除bkv外的生物是cmv和ebv在一些实施例中，所述的用于bkv的扩增引物和探针寡核苷酸从生产日期算起具有至少3个月，至少6个月，至少9个月，至少12个月，至少15个月，至少18个月或至少24个月的保质期。广义上讲，该方法可以包括以下组件中的一个或多个：扩增，以及扩增子检测和/或定量，其可以通过扩增实时进行。某些实施例涉及前述中的每一个步骤。在一些实施例中，扩增包含(1)使样品与至少两种寡聚物接触以用于扩增对应于bkv靶核酸的bkv核酸靶区域，其中寡聚物包括至少两种如上所述的扩增引物(例如，一种或多种定向于有义方向，并且一种或多种定向于反义方向)；(2)其中，bkv靶核酸(如果存在于样品中)可用作产生扩增产物的模板；以及(3)检测扩增产物的存在与否，从而确定样品中是否存在bkv，或量化样品中bkv核酸的量。根据本发明的检测方法可以进一步包括获得待经受该方法的后续步骤的样品的步骤。在某些实施例中，“获得”要使用的样品包含，例如，在进行所述方法的一个或多个步骤的测试设施或其它位置接收样本，和/或从进行所述方法的一个或多个步骤的设施内的位置(例如，从存储或其他存放处)取回样品。在某些实施例中，该方法进一步包括例如在扩增之前，诸如在捕获步骤之前，从样品中的其他成分中纯化bkv靶核酸。这种纯化可以包括从其它样品组分中分离和/或浓缩样品中含有的生物体，或去除或降解非核酸样品成分(例如，蛋白质、碳水化合物、盐、脂质等)的方法。在一些实施例中，样品中的dna例如用dna酶降解，并且任选地去除或灭活dna酶或去除降解的dna。在一些实施例中，该方法包括样品制备。样品制备是指制备用于扩增和/或检测的样品所需的任何步骤或方法。样品制备可以包括从较大样品体积中纯化或浓缩成分(诸如多核苷酸)的任何已知方法，诸如通过从较大体积样品中过滤大气颗粒或水基颗粒或通过使用标准微生物学方法从样品中分离微生物。样品制备还可以包括物理破坏和/或机械破坏和/或化学裂解细胞组分以将细胞内成分释放到基本上水相或有机相中。样品制备还可以包括使用多核苷酸，该核酸寡核苷酸选择性地或非特异性地捕获靶核酸并将其与其他样品成分分离(例如，如美国专利号6,110,678和国际专利申请公开号wo2008/016988中所述，各自通过引用并入本文)。非特异性靶捕获方法可以涉及从基本上含水的混合物中选择性沉淀核酸，将核酸粘附到被洗涤以去除其它样品组分的载体上，或从含有bkv核酸和其它样品成分的混合物中物理分离核酸的其它手段。扩增bkv靶序列利用体外扩增反应，该反应使用至少两个位于待扩增靶区域两侧的扩增引物。在一些实施例中，至少如上所述的第一和第二扩增引物用于扩增靶序列。扩增反应可以是循环的或等温的。合适的扩增方法包括但不限于复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(pcr)、连接酶链反应(lcr)、链置换扩增(sda)以及转录介导的或转录相关的扩增(tma)。可以使用多种已知技术中的任何一种来执行检测步骤，以检测与扩增的靶序列特异性相关的信号，如通过将扩增产物与标记的探针寡核苷酸杂交并检测由探针寡核苷酸产生的信号(在一些实施例中包含来自杂交后从探针寡核苷酸中所释放的标记)。在一些实施例中，标记的探针寡核苷酸包括第二部分，如猝灭剂或与第一标记相互作用的其它部分，如上所述。检测步骤还可以提供关于扩增的序列的另外的信息，诸如，例如其核酸碱基序列的全部或部分。检测可以在扩增反应完成后进行，或可以与扩增靶区域同时进行，例如，实时。在一些实施例中，检测步骤允许均相检测(例如，检测杂交的探针寡核苷酸而没有从混合物中去除未杂交的探针寡核苷酸(参见，例如美国专利号5,639,604和5,283,174号))。在一些实施例中，核酸与导致物理变化(诸如可检测的电变化)的表面缔合。扩增的核酸可以通过将其浓缩在基质中或基质上并检测核酸或与其缔合的染料(例如嵌入剂，诸如溴化乙锭或cyber绿)或检测溶液相中与核酸缔合的染料的增加来检测。其它检测方法可以使用探针寡核苷酸，该探针寡核苷酸配置为与扩增产物中的序列特异性杂交并检测探针寡核苷酸：产物复合物的存在，或通过使用探针寡核苷酸的复合物，该探针寡核苷酸可以放大与扩增的产物相关的可检测信号(例如，美国专利号5,424,413；5,451,503；和5,849,481；各自通过引用并入本文)。与扩增产物特异性缔合的直接或间接标记的探针寡核苷酸提供了可检测的信号，该信号指示样品中靶核酸的存在。具体地，扩增产物将在bkv基因组的序列中含有靶序列或互补序列，并且探针寡核苷酸将直接或间接结合到扩增产物中含有的序列上，以指示测试样品中bkv核酸的存在。在于扩增步骤接近结束或结束时检测扩增产物的实施例中，线性探针寡核苷酸可用于提供信号以指示探针与扩增产物的杂交。这种检测的一个实例是使用与靶核酸杂交的发光标记的探针寡核苷酸。然后从未杂交探针寡核苷酸水解发光标记。使用发光计通过化学发光进行检测(参见，例如，国际专利申请公开号wo89/002476)。在使用实时检测的其它实施例中，探针寡核苷酸可以是发夹探针，例如，分子信标、分子火炬或杂交开关探针，该探针用报道分子部分标记，当探针寡核苷酸结合扩增产物时检测到报道分子部分。这样的探针寡核苷酸可以包含靶杂交序列和非靶杂交序列。实施例列表1.用于扩增bk多瘤病毒(bkv)核酸序列的扩增寡核苷酸，包括a)一个或多个第一扩增引物，其中每个第一扩增引物的长度为18-30个碱基，并且包含与选自以下组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:13，seqidno:1，seqidno:4，seqidno:7，seqidno:10，seqidno:16，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:25，seqidno:30，seqidno:31，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:38，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:43，seqidno:46和seqidno:47，并且b)一个或多个第二扩增引物，其中每个第二扩增引物的长度为19-30个碱基，并且包含与选自以下组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:14，seqidno:2，seqidno:5，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:18，seqidno:19，seqidno:22，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:32，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:37，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:44，seqidno:45，seqidno:48和seqidno:49。2.实施例1的扩增寡核苷酸，其中a)第一扩增引物包含与选自以下的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:13，seqidno:1，seqidno:4，seqidno:7，seqidno:10，seqidno:16，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:25，seqidno:30，seqidno:31，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:38，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:43，seqidno:46和seqidno:47，以及b)第二扩增引物包含与选自以下的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:14，seqidno:2，seqidno:5，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:18，seqidno:19，seqidno:22，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:32，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:37，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:44，seqidno:45，seqidno:48和seqidno:49。3.实施例2的扩增寡核苷酸，其中所述第一扩增引物与第一bkv核酸序列90％至100％互补，并且所述第二扩增引物与第二bkv核酸序列90％至100％互补。4.实施例3的扩增寡核苷酸，其中所述第一扩增引物与所述第一bkv核酸序列>90％且<100％互补，并且所述第二扩增引物与所述第二bkv核酸序列>90％且<100％互补。5.实施例1-4中任一项的扩增寡核苷酸，其中所述第一扩增引物和/或所述第二扩增引物包含至少一个修饰核苷酸。6.实施例1-5中任一项的扩增寡核苷酸，其中所述修饰核苷酸包括：2′-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰核苷酸或5'甲基-2'-脱氧胞嘧啶。7.实施例6的扩增寡核苷酸，其中第二扩增引物包含一个或多个5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。8.实施例7的扩增寡核苷酸，其中第二扩增引物中除了3'末端胞嘧啶(如果存在的话)之外的每个胞嘧啶是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。9.实施例6的扩增寡核苷酸，其中所述第一扩增引物包含一个或多个5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。10.实施例9的扩增寡核苷酸，其中第一扩增引物中除了3'末端胞嘧啶(如果存在的话)之外的每个胞嘧啶都是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。11.实施例1-10中任一项的扩增寡核苷酸，其中：a)一个或多个第一扩增引物的核苷酸序列由选自以下的核苷酸序列组成：seqidno:13，seqidno:1，seqidno:4，seqidno:7，seqidno:10，seqidno:16，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:25，seqidno:30，seqidno:31，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:38，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:43，seqidno:46和seqidno:47，以及b)一个或多个第二扩增引物的核苷酸序列由选自以下的核苷酸序列组成：seqidno:14，seqidno:2，seqidno:5，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:18，seqidno:19，seqidno:22，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:32，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:37，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:44，seqidno:45，seqidno:48和seqidno:49。12.实施例1-11中任一项的扩增寡核苷酸，其中a)第一扩增引物包含seqidno:13的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:14的核苷酸序列；b)第一扩增引物包含seqidno:1的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:2的核苷酸序列；c)第一扩增引物包含seqidno:4的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:5的核苷酸序列；d)第一扩增引物包含seqidno:7的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:9的核苷酸序列；e)第一扩增引物包含seqidno:10的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:12的核苷酸序列；f)第一扩增引物包含seqidno:16的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:18的核苷酸序列；g)第一扩增引物包含seqidno:21的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:19的核苷酸序列；h)第一扩增引物包含seqidno:24的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:22的核苷酸序；或者i)第一扩增引物包含seqidno:25的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:26的核苷酸序列。13.实施例1-12中任一项的扩增寡核苷酸，其中a)第一扩增引物包含seqidno:13的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:36和seqidno:37的核苷酸序列；b)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:35和seqidno:36的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:14的核苷酸序列；c)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:35和seqidno:36的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:36和seqidno:37的核苷酸序列；d)第一扩增引物包含seqidno:1的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:28和seqidno:29的核苷酸序列；e)第一扩增引物包含seqidno:10的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:32和seqidno:33的核苷酸序列；f)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:30和seqidno:31的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:12的核苷酸序列；g)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:30和seqidno:31的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:32和seqidno:33的核苷酸序列；h)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:38和seqidno:39的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:18的核苷酸序列；i)第一扩增引物包含seqidno:21的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:40和seqidno:41的核苷酸序列；j)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:42和seqidno:43的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:19的核苷酸序列；k)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:42和seqidno:43的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:40和seqidno:41的核苷酸序列；l)第一扩增引物包含seqidno:24的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:44和seqidno:45的核苷酸序列；m)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:46和seqidno:47的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:22的核苷酸序列；n)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:46和seqidno:47的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:44和seqidno:45的核苷酸序列；或者o)第一扩增引物包含seqidno:25的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:48和seqidno:49的核苷酸序列。14.一种用于检测扩增bkv核酸序列的探针寡核苷酸，其包含：长度为21-30个碱基的探针寡核苷酸，并且包含与选自以下组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:27。15.实施例15的探针寡核苷酸其中所述探针寡核苷酸包含与选自以下组的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:27。16.实施例15的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸与第三bkv核酸序列90％至100％互补。17.实施例16的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸与所述第三bkv核酸序列＞90％且＜100％互补。18.实施例15-17中任一项的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含至少一个修饰核苷酸。19.实施例20的探针寡核苷酸，其中所述修饰核苷酸包含2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰核苷酸或5'-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。20.实施例21的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含一种或多种5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。21.实施例22的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含2、3、4、5、6、7或8个5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。22.实施例23的探针寡核苷酸，其中探针寡核苷酸中的每个胞嘧啶是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。23.实施例14-24中任一项的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸的核苷酸序列由选自以下组的核苷酸序列组成：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:2724.实施例14-23中任一项的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含可检测标记。25.实施例24的探针寡核苷酸，其中所述可检测标记物包含荧光分子。26.实施例26的探针寡核苷酸，其中所述荧光分子附着在探针寡核苷酸的5'或3'端。27.实施例24-26中任一项的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含猝灭剂。28.实施例24的探针寡核苷酸，其中所述可检测标记附着在探针寡核苷酸的5'端，猝灭剂附着在探针寡核苷酸的3'端。29.实施例24-28中任一项的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸是水解探针。30.用于扩增bkv核酸序列的反应混合物，包括：a)一个或多个第一扩增引物，其中每个第一扩增引物的长度为20-30个碱基，并且包含与选自以下组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:13，seqidno:1，seqidno:4，seqidno:7，seqidno:10，seqidno:16，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:25，seqidno:30，seqidno:31，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:38，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:43，seqidno:46和seqidno:47和b)一个或多个第二扩增引物，其中每个第二扩增引物的长度为21-30个碱基，并且包含与选自以下组的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:14，seqidno:2，seqidno:5，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:18，seqidno:19，seqidno:22，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:32，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:37，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:44，seqidno:45，seqidno:48和seqidno:49。31.实施例30的反应混合物，其中a)第一扩增引物包含与选自以下的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:13，seqidno:1，seqidno:4，seqidno:7，seqidno:10，seqidno:16，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:25，seqidno:30，seqidno:31，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:38，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:43，seqidno:46和seqidno:47，以及b)第二扩增引物包含与选自以下的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:14，seqidno:2，seqidno:5，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:18，seqidno:19，seqidno:22，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:32，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:37，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:44，seqidno:45，seqidno:48和seqidno:49。32.实施例30或31的反应混合物，其中所述第一扩增引物与第一bkv核酸序列90％至100％互补，并且所述第二扩增引物与第二bkv核酸序列90％至100％互补。33.实施例30-32中任一项的反应混合物，其中所述第一扩增引物与所述第一bkv核酸序列>90％且<100％互补，所述第二扩增引物与所述第二bkv核酸序列>90％且<100％互补bkv核酸序列。34.实施例30-33中任一项的反应混合物，其中所述第一扩增引物和/或所述第二扩增引物包含至少一个修饰核苷酸。35.实施例34的反应混合物，其中所述修饰核苷酸包含：2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰核苷酸或5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。36.实施例35的反应混合物，其中第二扩增引物包含一个或多个5'甲基2'-脱氧胞嘧啶。37.实施例36的反应混合物，其中第二扩增引物中除3'末端胞嘧啶(如果存在的话)之外的每个胞嘧啶均为5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。38.实施例34的反应混合物，其中所述第一扩增引物包含一个或多个5'甲基2'脱氧胞嘧啶。39.实施例38的反应混合物，其中第一扩增引物中除了3'末端胞嘧啶(如果存在的话)之外的每个胞嘧啶都是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。40.实施例30-39中任一项的反应混合物，其中：a)一个或多个第一扩增引物的核苷酸序列由选自以下的核苷酸序列组成：seqidno:13，seqidno:1，seqidno:4，seqidno:7，seqidno:：10，seqidno:16，seqidno:21，seqidno:24，seqidno:25，seqidno:30，seqidno:31，seqidno:34，seqidno:35，seqidno:38，seqidno:39，seqidno:42，seqidno:43，seqidno:46和seqidno:47，以及b)一个或多个第二扩增引物的核苷酸序列由选自以下的核苷酸序列组成：seqidno:14，seqidno:2，seqidno:5，seqidno:9，seqidno:12，seqidno:18，seqidno:19，seqidno:22，seqidno:26，seqidno:28，seqidno:29，seqidno:32，seqidno:33，seqidno:36，seqidno:37，seqidno:40，seqidno:41，seqidno:44，seqidno:45，seqidno:48和seqidno:49。41.实施例30-40中任一项的反应混合物，其中a)第一扩增引物包含seqidno:13的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:14的核苷酸序列；b)第一扩增引物包含seqidno:1的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:2的核苷酸序列；c)第一扩增引物包含seqidno:4的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:5的核苷酸序列；d)第一扩增引物包含seqidno:7的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:9的核苷酸序列；e)第一扩增引物包含seqidno:10的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:12的核苷酸序列；f)第一扩增引物包含seqidno:16的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:18的核苷酸序列；g)第一扩增引物包含seqidno:21的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:19的核苷酸序列；h)第一扩增引物包含seqidno:24的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:22的核苷酸序；或者i)第一扩增引物包含seqidno:25的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:26的核苷酸序列。42.实施例30-41中任一项的反应混合物，其中a)第一扩增引物包含seqidno:13的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:36和seqidno:37的核苷酸序列；b)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:35和seqidno:36的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:14的核苷酸序列；c)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:35和seqidno:36的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:36和seqidno:37的核苷酸序列；d)第一扩增引物包含seqidno:1的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:28和seqidno:29的核苷酸序列；e)第一扩增引物包含seqidno:10的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:32和seqidno:33的核苷酸序列；f)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:30和seqidno:31的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:12的核苷酸序列；g)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:30和seqidno:31的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:32和seqidno:33的核苷酸序列；h)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:38和seqidno:39的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:18的核苷酸序列；i)第一扩增引物包含seqidno:21的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:40和seqidno:41的核苷酸序列；j)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:42和seqidno:43的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:19的核苷酸序列；k)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:42和seqidno:43的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:40和seqidno:41的核苷酸序列；l)第一扩增引物包含seqidno:24的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:44和seqidno:45的核苷酸序列；m)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:46和seqidno:47的核苷酸序列，第二扩增引物包含seqidno:22的核苷酸序列；n)一个或多个第一扩增引物包含seqidno:46和seqidno:47的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:44和seqidno:45的核苷酸序列；或者o)第一扩增引物包含seqidno:25的核苷酸序列，一个或多个第二扩增引物包含seqidno:48和seqidno:49的核苷酸序列。43.实施例30-42中任一项的反应混合物，进一步包含探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸的长度为21-30个碱基，并且包含与选自以下的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:27。44.实施例43的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸包含与选自以下的核苷酸序列具有0，1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:27。45.实施例44的反应混合物，其中探针寡核苷酸与第三bkv核酸序列90％至100％互补。46.实施例45的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸与所述第三bkv核酸序列>90％和<100％互补。47.实施例43-46中任一项的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸包含至少一个修饰核苷酸。48.实施例47的反应混合物，其中所述修饰核苷酸包含2'-o-甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰核苷酸或5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。49.实施例48的反应混合物，其中探针寡核苷酸包含一种或多种5'甲基-2'-脱氧胞嘧啶。50.实施例49的反应混合物，其中探针寡核苷酸中的每个胞嘧啶是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。51.实施例43-50中任一项的反应混合物，其中探针寡核苷酸的核苷酸序列由选自以下的核苷酸序列组成：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:2752.实施例43-51中任一项的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸包含可检测标记。53.实施例52的反应混合物，其中所述可检测标记物包含荧光分子。54.实施例43-53中任一项的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸还包含猝灭剂。55.实施例54的反应混合物，其中所述可检测标记附着在探针寡核苷酸的5'端，并且猝灭剂附着在探针寡核苷酸的3'端。56.实施例43-55中任一项的反应混合物，其中探针寡核苷酸是水解探针。57.反应混合物，其包含探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸的长度为21-30个碱基，并且包含与选自以下的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:27。58.实施例57的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸包含与选自以下的核苷酸序列具有0、1或2个错配的核苷酸序列：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:27。59.实施例57或58的反应混合物，其中探针寡核苷酸与第三bkv核酸序列90％至100％互补。60.实施例57-59中任一项的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸与所述第三bkv核酸序列>90％且<100％互补。61.实施例57-60中任一项的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸包含至少一个修饰核苷酸。62.实施例61的反应混合物，其中所述修饰核苷酸包含2'-o甲基修饰核苷酸，2'-氟修饰核苷酸或5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。63.实施例62的反应混合物，其中探针寡核苷酸包含一种或多种5'-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。64.实施例63的反应混合物，其中探针寡核苷酸中的每个胞嘧啶是5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶。65.实施例57-64中任一项的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸的核苷酸序列由选自以下的核苷酸序列组成：seqidno:15，seqidno:3，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:11，seqidno:17，seqidno:20，seqidno:23和seqidno:2766.实施例57-65中任一项的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸包含可检测标记。67.实施例66的反应混合物，其中所述可检测标记物包含荧光分子。68.实施例67中任一项的反应混合物，其中探针寡核苷酸还包含猝灭剂。69.实施例68的反应混合物，其中所述可检测标记附着在探针寡核苷酸的5'端，并且猝灭剂附着在探针寡核苷酸的3'端。70.实施例57-69中任一项的反应混合物，其中所述探针寡核苷酸是水解探针。71.试剂盒，其包含实施例1-13中任一项的任何扩增寡核苷酸，实施例14-29中任一项的任何探针寡核苷酸，和/或实施例30-70中任一项的任何反应混合物，以及使用说明书。72.实施例71的试剂盒，其进一步包含以下一种或多种：bkv阳性对照核酸和阴性对照核酸。73.一种扩增bkv核酸序列的方法，包括：使含有或疑似含有bkv核酸序列的样品与实施例1-13中任一项的扩增寡核苷酸接触，并进行核酸扩增反应。74.实施例73中任一项所述的方法，其中，所述核酸扩增反应包括聚合酶链反应(pcr)。75.一种检测bkv核酸序列的方法，其包括：使含有或疑似含有该bkv核酸序列的样品与实施例24-29中任一项的探针寡核苷酸接触，并且检测来自探针寡核苷酸的信号。76.一种检测bkv的方法，其包括：使含有或疑似含有bkv的样品与实施例1-13中任一项的扩增寡核苷酸和实施例24-29中任一项的探针寡核苷酸接触，并进行核酸扩增反应。77.实施例76的方法，其中所述核酸扩增反应包括pcr。78.实施例76或77的方法，其中所述探针寡核苷酸用于检测扩增的bkv扩增子的存在与否。79.实施例78的方法，其中扩增的bkv扩增子的存在与否包括定量的pcr。80.实施例79的方法，其中定量pct是实时分析的。81.实施例80的方法，其中所述定量pcr包括taqmantm(水解探针)pcr。82.实施例30-70中任一项的反应混合物，其中该反应混合物还包含以下一种或多种：dna聚合酶，脱氧核糖核苷酸，阳性对照核酸，阴性对照核酸，内标核酸，kcl，mgcl2，乙酸钾，缓冲液，bsa，蔗糖，海藻糖，dmso，甜菜碱，甲酰胺，甘油，聚乙二醇，非离子去污剂，铵离子，edta，对照扩增寡核苷酸。实例实例1.bkv扩增和检测。对bkv的盐和寡聚物的各种浓度组合进行了评估，以确定合适的条件扩增。通过混合扩增引物，探针寡核苷酸，kcl和mgcl2混合物来制备ppr(包含侦察缓冲液(reconbuffer)的引物探针)混合物。下列混合物用于bkv扩增和检测。表1-1.反应(ppr)混合物中的寡核苷酸和氯化镁。表1-2ppr混合物中的kcl和tris(三羟甲基氨基甲烷)。表1-3.最终ppr混合物，每个成分的体积。微升氯化钾/tris混合物28.83扩增引物混合物10探针寡核苷酸混合物5mgcl2混合物2表1-4.ppr最终混合物。pri＝扩增引物，pro＝探针寡核苷酸，mg＝mgcl2表1-5.扩增引物混合物lmh扩增引物浓度(μm)0.40.71扩增引物的1.25×浓度(μm)0.50.8751.25带有该引物浓度的条件数(ppr)454所需次数(#ofrepsneeded)488448超额要素(overagefactor)1.21.21.2需要次数*超额(repsneeded*overage)57.610157.6所需的总次数(次数的整数倍)5810158每次测试的ppr体积(μl)45.8345.8345.83成分体积(μl)101010所需总体积(μl)5801010580表1-6.扩增引物混合表1-7.探针寡核苷酸混合物表1-8.镁混合物。lmh最终pcr的氯化镁浓度(mm)246ppr里pcr中氯化镁的浓度(mm)1.923.925.92氯化镁(mm)的1.25x浓度2.44.97.4带有该引物浓度的条件数(ppr)454所需次数(#ofrepsneeded)488448超额要素(overagefactor)1.21.21.2所需次数*超额(#ofrepsneeded*overage)57.6100.857.6所需的总次数(次数的整数倍)5810158每次测试的ppr体积(μl)45.8345.8345.83成分体积(μl)222所需总体积(μl)116202116表1-9.镁混合物。lmh浓度(mm)体积(μl)体积(μl)体积(μl)mgcl2混合物1000.06.422.719.7水109.6179.396.3所需总体积(μl)116202116表1-10a.bkv质粒制备，初始稀释表1-10b.将bkv质粒稀释至1000cp/rxn以使用ppr混合物进行测试。表1-11.寡核苷酸描述表1-12a.结果，rox通道表1.12a.结果，red667通道结论：bkv扩增引物/探针寡核苷酸在各种引物，探针寡核苷酸和mgcl2浓度范围内均表现出对ct和rfu响应的鲁棒性。尽管在一系列测试浓度下均有效，但0.6μm扩增引物，0.4μm探针寡核苷酸和4mmmgcl2用于大多数后续测试。在所有测试条件下以及各种mgcl2浓度下，ct值都是一致的。如预期的那样，基线荧光和最终rfu受探针寡核苷酸浓度的影响。实例2.bkv扩增/检测寡核苷酸筛选。评价各种组合中的bvk寡核苷酸用于bkv的扩增和检测。将bk病毒或质粒以各种浓度掺入stm中。评估了结合了几种寡核苷酸组合的bkppr混合物。表2-1.ppr混合物。表2-2.按ppr混合物处理的样品(samplesprocessedperpprmix)每ppr总次数(totalrepsperppr)6质粒稀释液：表2-3.bk质粒稀释液，克隆1和6。表2-4.bk质粒稀释液，克隆2和5。pcr混合物：表2-5.内标(ic)核苷酸混合混合物(internalcontrol(ic)oligomix)seqidno.单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)53μm177.500.600.752.1154μm254.600.600.751.4755μm113.800.400.502.20全部的：500.00每ppr400μl的总体积应为425μl；ppr稍微混匀以进行浓缩表2-6.vp1ppr混合物试剂单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)seqidno:1μm143.530.600.752.09seqidno:2μm175.100.600.751.71seqidno:3μm83.380.400.502.40icoligo混合物x1.001.001.004.92mgcl2mm1000.004.005.002.00kclmm2000.0065.0081.2516.25水395.63全部的425.00表2-7.vp2-1ppr混合物试剂单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)seqidno:4μm193.800.600.751.55seqidno:5μm171.580.600.751.75seqidno:6μm0.400.505.72icoligo混合物x1.001.004.92mgcl2mm1000.004.005.002.00kclmm2000.0065.0081.2516.25水392.82全部的425.00表2-8.vp2-2ppr混合物表2-9.vp2-3ppr混合物试剂单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)seqidno:10μm157.340.600.751.91seqidno:11μm59.240.600.755.06seqidno:12μm148.550.400.501.35icoligo混合物x1.001.001.004.92mgcl2mm1000.004.005.002.00kclmm2000.0065.0081.2516.25水393.52全部的425.00表2-10.vp2-4ppr混合物试剂单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)seqidno:13μm139.700.600.752.19seqidno:15μm125.820.600.752.38seqidno:14μm191.070.400.501.05icoligo混合物x1.001.001.004.92mgcl2mm1000.004.005.002.00kclmm2000.0065.0081.2516.25水396.21全部的425.00表2-11.vp2-5ppr混合物试剂单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)seqidno:16μm180.350.600.751.66seqidno:17μm91.650.600.753.27seqidno:18μm170.070.400.501.18icoligo混合物x1.001.001.004.92mgcl2mm1000.004.005.002.00kclmm2000.0065.0081.2516.25水395.72全部的425.00表2-12.vp2-6ppr混合物试剂单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)seqidno:19μm163.040.600.751.84seqidno:20μm64.900.600.754.62seqidno:21μm160.880.400.501.24icoligo混合物x1.001.001.004.92mgcl2mm1000.004.005.002.00kclmm2000.0065.0081.2516.25水394.13全部的425.00表2-13.vp2-7ppr混合物试剂单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)seqidno:22μm170.910.600.751.76seqidno:23μm110.520.600.752.71seqidno:24μm223.080.400.500.90icoligo混合物x1.001.001.004.92mgcl2mm1000.004.005.002.00kclmm2000.0065.0081.2516.25水396.47全部的425.00表2-14.ltppr混合物试剂单位储液浓度最终浓缩x1.25微升(μl)seqidno:25μm167.30.600.751.79seqidno:26μm160.350.600.751.87seqidno:27μm85.370.400.502.34icoligo混合物x1.001.001.004.92mgcl2mm1000.004.005.002.00kclmm2000.0065.0081.2516.25水395.83全部的425.00表2-15.寡核苷酸信息描述(oligoinfo-description)表2-16.结果结论：所有扩增引物/探针寡核苷酸设计均扩增并检测了经测试的bkv质粒。在低至10份拷贝/反应(cpr)的所有测试浓度下，stm中的bk病毒和质粒检测率为100％。如线性图所示，r2值>0.99且斜率在-3.4或-3.5处时，pcr效率很高。内标具有100％的检测率。实例3.bkv扩增和检测特异性。通过测试器官移植样品中共有的其他生物体来评估扩增寡核苷酸以确定靶标的特异性。bk病毒培养液用作阳性对照。在10个面板中，通过尽可能接近(取决于可获得性)1e6cp/ml掺入stm，制备了血液或尿液中常见的42种生物。评估每个面板的特异性。表3-1.概述表3-2.样品.每ppr的总次数＝30表3-4.ppr混合物表3-5.寡核苷酸结论：bkv寡核苷酸与所有受测生物均无反应。寡核苷酸没有扩增或检测到任何挑战生物。因此，bkv寡核苷酸对bkv具有特异性。此外，thermoblasttm计算机分析预测了333个bkv参考基因组对靶向bkv区域的包容性。在几个病毒，细菌，环境，无脊椎动物和植物基因组以及人类基因组上进行了特异性分析。结果显示，bkv寡核苷酸未与非特异性基因组杂交，也未扩增非靶向扩增子。在所有测试中均检测到内标。bkv和ic的阳性对照为阳性，仅ic的阴性对照为阳性。在特异性研究中，在存在生物的情况下评估了bkv反应性。简而言之，将特异性研究的第2-8组板面在stm中按1:10稀释，并将bkv掺入1000cpr。板面1、9、10和11是在stm中新鲜制备的，并且bkv以相同的浓度掺入。ebv也掺入了每个面板，以评估ebv干扰。在4-5种常见生物的存在下，使用pcr制剂(包括表1和表2中列出的扩增引物和探针寡核苷酸)对每个面板的bkv性能进行评估。实验细节在sd-jyf-000019中进行了描述。面板组成和反应性结果可在表14和图12中找到。将结果与由stm中1000cpr的bkv组成的阳性对照进行比较。与阳性对照相比，在100％的面板中检测到bkv的偏移不超过0.5ct。在100％的面板中检测到内标。bkv和ic的阳性对照为阳性，仅ic的阴性对照为阳性。表3-6.bkv特异性结果。表3-7.bkv特异性结果。实例4.jc交叉反应性。评价寡核苷酸以确定所述bkv寡核苷酸与jc病毒dna或高滴度jc质粒是否有交叉反应。bkv与jcvirus有75％的同源性。电脑分析表明与jc病毒序列无交叉反应。表4-1.概述表4-2.样品.表4-3.设定值表4-4.面板准备：jc质粒表4-5.jc样品的制备。表4-6.jc病毒dna表4-7.表4-8.bk培养液。pcr混合物：表4-9.icoligo混合物。所需的总ic测试72ic混合量4950(<～9*12(550μl测试))每个多路ppr的ic混合物(icmixpermultiplexppr)50.53表4-10.vp1ppr混合物。表4-11.vp2-1ppr混合物。表4-12.vp2-2ppr混合物。表4-13.vp2-3ppr混合物表4-14.vp2-4ppr混合物。表4-15.vp2-5ppr混合物。表4-16.vp2-6ppr混合物。表4-17.vp2-7ppr混合物寡核苷酸如表2-15中所述。表4-18b.oligo信息-说明表4-19.结果(rox)。表4-20.bkv寡核苷酸与jcv序列错配表4-21.结果(quasar705)结论：所有bkv寡核苷酸均显示出jc病毒dna的一些扩增，尽管有些未超过设定的检测阈值。即使在不存在针对jc病毒存在缺失区或相关靶序列的扩增引物和探针寡核苷酸(seqidno:1-3、7)的情况下，也发生这种低水平检测。另外，高滴度的jc克隆没有显示出与bkv寡核苷酸的交叉反应性，除非在计算机分析中可以预测到一些(seqidno:4-5、16-17)。这表明在jc病毒样本中观察到的检测实际上是在购买的jc病毒dna中检测到bkv污染，而不是jc核酸序列的扩增。从扩增中纯化的扩增子的测序表明与bk基因组具有100％的同源性，进一步表明jc病毒样品受到bkv污染。为了进一步证实bkvasr的特异性，产生了编码jc病毒类似区的质粒克隆。以1×106拷贝/反应检测克隆，bkv扩增引物未观察到扩增。jc质粒对假定的jc特异性引物具有反应性。实例5.检测限。使用所述的扩增引物和探针寡核苷酸确定了血浆中的bk病毒的检测限。评价混合血浆中的bk病毒与pcr制剂的反应性。将培养液中的bk病毒以指定的浓度掺入每种基质中。用含有3mg/ml蛋白酶k(pk)和10xk18tco的pbs将血浆样品按1：0.2稀释。表5-1融合热循环条件温度时间周期数95°摄氏度2:00分钟95°摄氏度0:08分钟4560°摄氏度0:25分钟表5-2ppr混合物。表5-3样品.总次数：93表5-4设定表5-5.bk病毒培养液。(mfg#)制造商样本格式浓度(cp/ml)0810065cfzeptometrix培养液1.57×1010表5-6.bk病毒描述。ci(cp/ml)cf(cp/ml)vi(微升)te的微升vf(μl)1.00×1091.00×10810.090.0100.001.00×1081.00×10710.090.0100.001.00×1071.00×10610.090.0100.001.00×1061.00×10530.0270.0300.00表5-7bk病毒说明加850μl稀释液，孵育30'转移1500μl至三个单独的试管，每种浓度n＝21表5-8寡核苷酸和试剂浓度。表5-9.寡核苷酸描述表5-10.结果：ct，rfu，tslope和估计背景(eb)的平均和标准差。在血浆中bk病毒的每个反应中，在21次pcr重复中有20次被检测到10拷贝。表5-11.血浆中的bkv分析灵敏度表5-12.bk病毒和质粒线性结果*反应性定义为超过500rfu阈值的扩增曲线结论：结果评估bkv寡核苷酸可有效检测每个反应至少10个拷贝的bvk。观察到血浆中bkv的掺入量为10拷贝/反应的检出率为95％(277.8份/毫升)。两项研究均检测到100％的内标实例6.尿液中bk的检测限。确定了使用bkvp2扩增引物对尿液中bk病毒的检测限。根据表6-1制备用于bk和dnaic检测的ppr。评估尿液中的bk病毒与pcr制剂的反应性。将培养液中的bk病毒以指定的浓度掺入每种基质中。尿液中的样品用含有3mg/mlpk和10xk18tco的utm稀释1：1。所有样品均使用wave1序列文件进行处理。表6-1bk+dnaicppr3个ppr试管将向recon管中添加1100μl，并向顶部添加400μl油。制成bk阴性尿液，以将bk病毒裂解液掺入其中。通过合并每个3ml尿液样品ih_1，ih_6，ih_7，ih_8和ih_14制备12ml尿液。然后将不同水平的bk病毒裂解液加标到尿液样本中。准备连续稀释以使尿液中的病毒最终稀释度为100、31.62、10、3.16cp/rxn，相当于尿液中的病毒为55.6cp/μl。表6-2.将850μl最终稀释液加入到含有850μl稀释剂的样品试管中，每个稀释液3x最终的尿液浓度。将300μl的200cp/rxn加到装有稀释液的单个试管中作为阳性对照，得到3600cp/rxn。首先将utm+10xtco添加到每个试管中，然后添加样品(尿液或utm)。使用bk阳性对照管作为其他对照。表6-3一个3600cp/rxn(a3600cp/rxn)将样品试管加载到pantherfusion系统上，并使用默认的dna热循环程序进行测试。下表列出了每个样品的试管，提取液和重复样品的数量：表6-4.表6-5.bkv寡核苷酸信息。表6-6.dnaic寡核苷酸信息。表6-7.tco靶标表6-8.在utm中准备10xtco。表6-9.rox通道中的bk检测和red677中的id检测表6-10.red677通道中的内部对照(ic)检测表6-11.尿液中bkv分析灵敏度表6-12.在10cp/rxn处观察到95％的bk检测。结论：bkv寡核苷酸可有效检测每个反应中尿液中至少低至10拷贝的bvk(277.8拷贝/ml)，阳性率为95％。两项研究均检测到100％的内标。出于所有目的，将以上或以下引用的所有专利文件，网站，其他出版物，登录号等以其全文并入本文作为参考，其程度与具体地且单独地指示每个单独的项目以引用方式并入本文的程度相同。如果序列的不同版本在不同时间与登录号相关联，则意味着在本申请的有效提交日期与登录号相关联的版本。有效申请日期是指实际的申请日期或优先权申请的申请日期中较早的日期，如果有的话，请参考加入号。同样，如果出版物，网站等的不同版本在不同时间发布，则除非另有说明，否则是指在本申请的有效提交日期最近发布的版本。除非另外明确指出，否则本发明的任何特征，步骤，要素，实施例或方面可以与任何其他特征结合使用。序列表<110>简·探针公司<120>扩增，检测或定量bk病毒的组合物和方法<130>057516/521125<150>62/748,998<151>2018-10-22<160>55<170>专利版本3.5<210>1<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>1ctagaacttctactcctccttttatta27<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>2ggccccaacmaaaagaaaagg21<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>3ggctttttgggagctgcccctgga24<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>4gcagcaaacccagcaatagc20<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>5ccttgctactgtagagggcataac24<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>6agcaccagcaattacagcatatgtttgagg30<210>7<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>7gactctgtaaaagactcctaggtaag26<210>8<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>8atgggtgctgctctagcacttttggg26<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>9gcagcagcctcagatacactggc23<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>10ttagttcyttggctcaagtaggg23<210>11<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>11attgggatcacaaagtttccactgtaggc29<210>12<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>12gggttaaacaattccaawgccatgcc26<210>13<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>13ccctacttgagccaargaactaa23<210>14<211>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