CD86变体免疫调节蛋白及其用途的制作方法

cd86变体免疫调节蛋白及其用途
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2018年11月30日提交的标题为“cd86变体免疫调节蛋白及其用途(cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof)”的美国临时申请号62/774,131和2019年6月14日提交的标题为“cd86变体免疫调节蛋白及其用途(cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof)”的美国临时申请号62/862,001的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。通过引用并入序列表
2.本技术是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2019年11月27日创建的名为761612002840seqlist.txt的文件提供，其大小为599,034字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
3.本公开文本涉及用于在癌症和免疫疾病的治疗中调节免疫应答的治疗组合物。在一些方面，本公开文本涉及cd86的特定变体及其免疫调节蛋白，所述cd86的特定变体及其免疫调节蛋白展现对同源结合配偶体改变的结合亲和力，如对cd28的增加的亲和力。还提供了此类免疫调节蛋白的方法和用途。


背景技术：

4.通过干预由抗原呈递细胞(apc)或靶细胞与淋巴细胞形成的并且在所述抗原呈递细胞或靶细胞与淋巴细胞之间的免疫突触(is)中发生的过程来调节免疫应答在医学上越来越受关注。从机理而言，is中的细胞表面蛋白可以涉及多个蛋白质靶标与它们所结合的单一蛋白质的协调且通常同时的相互作用。is相互作用的发生与两个细胞的接合密切相关，并且这种结构中的单一蛋白质可以与同一细胞上的蛋白质(顺式)以及相关细胞上的蛋白质(反式)很可能同时地相互作用。虽然可以调节is的治疗剂是已知的，但是需要改进的治疗剂。提供了满足此类需要的免疫调节蛋白，包括能够在细胞上表达的可溶性蛋白质或跨膜免疫调节蛋白。


技术实现要素：

5.本文提供了变体cd86多肽，所述变体cd86多肽含有细胞外结构域或igv结构域或其特异性结合片段，其中所述变体cd86多肽含有在未经修饰的cd86多肽或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰对应于选自以下的关于seq id no:29中所示位置的一个或多个位置：13、18、25、28、33、38、39、40、43、45、52、53、60、68、71、77、79、80、82、86、88、89、90、92、93、97、102、104、113、114、123、128、129、132、133、137、141、143、144、148、153、154、158、170、172、175、178、180、181、183、185、192、193、196、197、198、205、206、207、212、215、216、222、223、或224。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰含有氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86多肽是哺乳动物cd86多肽或
其特异性结合片段。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86多肽是人cd86多肽或其特异性结合片段。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有人cd86的细胞外结构域，其中所述一个或多个氨基酸修饰是在所述未经修饰的cd86多肽的细胞外结构域的一个或多个残基中。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86多肽含有(i)seq id no:29中所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:29具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)其部分，所述其部分含有igv结构域或所述igv结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86含有seq id no:29中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述其部分包含所述igv结构域的氨基酸残基33
‑
131或24
‑
134或所述igv结构域的特异性结合片段。
6.在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86多肽含有(i)seq id no:123中所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:123具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)其部分，所述其部分含有igv结构域或所述igv结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86含有seq id no:123中所示的氨基酸序列。
7.在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86多肽含有(i)seq id no:122中所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:122具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)或其特异性结合片段。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86含有seq id no:122中所示的氨基酸序列。
8.在一些实施方案中，所述特异性结合片段具有至少50、60、70、80、90、95个或更多个氨基酸的长度。在一些实施方案中，所述特异性结合片段包含如下长度，所述长度为如seq id no:2的残基33
‑
131所示的igv结构域的长度的至少80％。在一些实施方案中，所述变体cd86包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地氨基酸取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是插入。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是缺失。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是选自以下的一个或多个氨基酸取代：a13v、q18k、q25l、s28g、f33i、e38v、n39d、l40m、l40s、n43k、v45i、f52l、d53g、m60k、d68n、t71a、l77p、i79n、k80e、k80m、k80r、k82t、q86k、q86r、i88f、i88t、i89v、h90l、h90y、k92i、k93t、m97l、q102h、n104s、f113s、s114g、n123d、v128a、y129n、l132m、t133a、i137t、p141a、p143h、k144e、v148d、k153e、k153r、n154d、e158g、v170d、e172g、d175e、i178t、l180s、s181p、s183p、p185s、t192n、i193v、i196v、l197m、e198d、l205s、s206t、s207p、e212v、d215v、p216h、h222t或i223f、或其保守氨基酸取代。
9.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有选自以下的一个或多个氨基酸修饰：q25l/t71a/h90y、q25l/d53g/e212v、q25l/h90l、n43k/i79n/h90l/i178t/e198d、a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t、q25l/q86r/h90l/k93t/l132m/v148d/s181p/p216h、q25l/f33i/h90y/v128a/p141a/e158g/s181p、q25l/n39d/k80r/q86r/i88f/h90l/k93t/n123d/n154d、q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v、q25l/q86r/h90l/n104s、q25l/l40m/h90l/l180s/s183p、q18k/q25l/f33i/l40s/h90l、q25l/q86k/h90l/i137t/s181p、q25l/l77p/h90y/k153r/v170d/s181p、q25l/s28g/f33i/f52l/h90l/q102h/i178t、q25l/f33i/h90l/k144e/l180s、q25l/f33i/h90l/k153e/e172g/t192n、q25l/f33i/q86r/h90y/d175e/i196v/e198d、q25l/v45i/d68n/h90l/s183p/l205s、e38v/s114g/p143h、h90y/l180s、h90y/y129n、i89v/h90l/i193v、k80e/h90y/h222t/i223f/p224l、k80m/i88t、k92i/f113s、m60k/
h90l、q25l/f33i/h90l、q25l/f33i/q86r/h90l/k93t、q25l/h90l、q25l/h90l/p185s、q25l/h90l/p185s/p224l、q25l/h90l/s179r、q25l/h90y/s181p/i193v、q25l/k82t/h90l/t152s/s207p、q25l/q86r/h90l/k93t或s28g/h90y。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是在位置25和/或位置90处。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有q25l、h90y或h90l。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有q25l。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有h90y。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有h90l。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有在位置25和位置90处的修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰选自q25l/h90y或q25l/h90l。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有q25l/h90y或q25l/h90l和另外的氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰包含q25l/h90y或q25l/h90l和选自以下的一个或多个氨基酸修饰：a13v、q18k、s28g、f33i、e38v、n39d、l40m、l40s、n43k、v45i、f52l、d53g、m60k、d68n、t71a、l77p、i79n、k80e、k80m、k80r、k82t、q86k、q86r、i88f、i88t、i89v、k92i、k93t、m97l、q102h、n104s,f113s、s114g、n123d、v128a、y129n、l132m、t133a、i137t、p141a、p143h、k144e、v148d、k153e、k153r、n154d、e158g、v170d、e172g、d175e、i178t、l180s、s181p、s183p、p185s、t192n、i193v、i196v、l197m、e198d、l205s、s206t、s207p、e212v、d215v、p216h、h222t或i223f、或其保守氨基酸取代。
10.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有选自以下的一个或多个氨基酸修饰：q25l/t71a/h90y、q25l/d53g/e212v、q25l/h90l、n43k/i79n/h90l/i178t/e198d、a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t、q25l/q86r/h90l/k93t/l132m/v148d/s181p/p216h、q25l/f33i/h90y/v128a/p141a/e158g/s181p、q25l/n39d/k80r/q86r/i88f/h90l/k93t/n123d/n154d、q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v、q25l/q86r/h90l/n104s、q25l/l40m/h90l/l180s/s183p、q18k/q25l/f33i/l40s/h90l、q25l/q86k/h90l/i137t/s181p、q25l/l77p/h90y/k153r/v170d/s181p、q25l/s28g/f33i/f52l/h90l/q102h/i178t、q25l/f33i/h90l/k144e/l180s、q25l/f33i/h90l/k153e/e172g/t192n、q25l/f33i/q86r/h90y/d175e/i196v/e198d、q25l/v45i/d68n/h90l/s183p/l205s、h90y/l180s、h90y/y129n、i89v/h90l/i193v、k80e/h90y/h222t/i223f/p224l、m60k/h90l、q25l/f33i/h90l、q25l/f33i/q86r/h90l/k93t、q25l/h90l、q25l/h90l/p185s、q25l/h90l/p185s/p224l、q25l/h90l/s179r、q25l/h90y/s181p/i193v、q25l/k82t/h90l/t152s/s207p、q25l/q86r/h90l/k93t、s28g/h90y、a13v/q25l/h90l、q25l/h90l/k93t/m97l、q25l/q86r/h90l或i89v/h90l。
11.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰a13v/q25l/h90l。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰q25l/h90l/k93t/m97l。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰q25l/q86r/h90l。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰q25l/q86r/h90l/n104s。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰i89v/h90l。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰i89v/h90l/i193v。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰m60k/h90l。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰q25l/
f33i/h90l。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰q25l/h90l/p185s。
12.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含展现与seq id no:29或其特异性结合片段至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
13.在一些实施方案中，与所述未经修饰的cd86对cd28的胞外结构域的结合相比，所述变体cd86多肽以增加的亲和力特异性地结合至相同胞外结构域。在一些实施方案中，所述结合亲和力增加至少或至少约1.5倍、至少或至少约2.0倍、至少或至少约5.0倍、至少或至少约10倍、至少或至少约20倍、至少或至少约30倍、至少或至少约40倍、至少或至少约50倍、至少或至少约60倍、至少或至少约70倍、至少或至少约80倍、至少或至少约90倍、至少或至少约100倍、或至少或至少约125倍。
14.在一些实施方案中，与所述未经修饰的cd86对ctla
‑
4的胞外结构域的结合相比，所述变体cd86多肽以降低的亲和力特异性地结合至相同胞外结构域。在一些实施方案中，所述降低的结合亲和力是降低至少或至少约1.2倍、至少或至少约1.4倍、至少或至少约1.5倍、至少或至少约1.75倍、至少或至少约2.0倍、至少或至少约2.5倍、至少或至少约3.0倍、至少或至少约4.0倍、或至少或至少约5.0倍。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽以与所述未经修饰的cd86对ctla
‑
4的胞外结构域的结合相同或相似的结合亲和力特异性地结合至相同胞外结构域，任选地其中所述相同或相似的结合亲和力是所述未经修饰的cd86的结合亲和力的从为或约90％至120％。
15.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有全细胞外结构域。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有seq id no:85
‑
121中任一个中所示的氨基酸序列或其特异性结合片段、展现与seq id no:85
‑
121中任一个或其特异性结合片段至少95％序列同一性并且含有seq id no:85
‑
121中任一个中所示的相应seq id no的所述氨基酸修饰中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有seq id no:141
‑
177中任一个中所示的氨基酸序列或其特异性结合片段、展现与seq id no:141
‑
177中任一个或其特异性结合片段至少95％序列同一性并且含有seq id no:141
‑
177中任一个中所示的相应seq id no的所述氨基酸修饰中的一个或多个的氨基酸序列。
16.在一些实施方案中，所述cd28是人cd28。在一些实施方案中，所述ctla
‑
4是人ctla
‑
4。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是可溶性蛋白。
17.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽缺乏cd86跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和/或所述变体cd86多肽不能在细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽与多聚化结构域连接。在一些实施方案中，所述多聚化结构域是fc结构域或其具有降低的效应子功能的变体。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽与fc结构域或其具有降低的效应子功能的变体连接。在一些实施方案中，所述fc结构域是人igg1或者是其具有降低的效应子功能的变体。在一些实施方案中，所述fc结构域含有seq id no:229中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:229至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述fc结构域是或含有seq id no:229中所示的氨基酸序列。
18.在一些实施方案中，所述fc结构域是含有选自以下的一个或多个氨基酸修饰的变
体igg1 fc结构域：e233p、l234a、l234v、l235a、l235e、g236del、g237a、s267k、n297g、v302c和k447del，其每一个均依据eu编号。在一些实施方案中，所述fc结构域含有氨基酸修饰l234a/l235e/g237a。在一些实施方案中，所述fc结构域含有依据eu编号的氨基酸修饰c220s。在一些实施方案中，所述fc结构域包含依据eu编号的氨基酸修饰k447del。在一些实施方案中，所述fc结构域含有seq id no:230中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:230至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且与人igg1相比含有seq id no:230中所示的相应氨基酸修饰中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述fc结构域是或含有seq id no:230中所示的氨基酸序列。
19.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽经由接头、任选地g4s接头与所述多聚化结构域或fc间接连接。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是还含有跨膜结构域的跨膜免疫调节蛋白，任选地其中所述跨膜结构域与所述变体cd86多肽的细胞外结构域(ecd)或其特异性结合片段直接或间接连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含如seq id no:2的残基248
‑
268所示的氨基酸序列或其功能变体，所述其功能变体展现与seq id no:2的残基248
‑
268至少85％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽还含有胞质结构域，任选地其中所述胞质结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。在一些实施方案中，所述胞质结构域是或含有天然cd86胞质结构域。在一些实施方案中，所述胞质结构域含有如seq id no:2的残基269
‑
329所示的氨基酸序列或其功能变体，所述其功能变体展现与seq id no:2的残基269
‑
329至少85％的序列同一性。在一些实施方案中，所述胞质结构域含有itam信号传导基序和/或是或含有cd3ζ的细胞内信号传导结构域。
20.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽不含有胞质信号传导结构域和/或当在细胞上表达时不能介导或调节细胞内信号。
21.本文提供了免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白含有本文所述的任何变体cd86多肽的第一变体cd86多肽和本文所述的任何变体cd86多肽的第二变体cd86多肽。在一些实施方案中，所述第一和第二变体cd86多肽经由接头间接连接。在一些实施方案中，所述第一和第二变体cd86多肽各自与多聚化结构域连接，由此所述免疫调节蛋白是含有所述第一和第二变体cd86多肽的多聚体。在一些实施方案中，所述多聚体是二聚体、任选地同二聚体。在一些实施方案中，所述多聚体是同二聚体。在一些实施方案中，所述第一变体cd86多肽和所述第二变体cd86多肽是相同的。
22.本文提供了免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白含有本文所述的任何变体cd86多肽中的任一种，所述变体cd86多肽直接或经由接头间接与含有免疫球蛋白超家族(igsf)家族成员的igsf结构域的第二多肽连接。在一些实施方案中，所述igsf结构域是亲和力修饰的igsf结构域，所述亲和力修饰的igsf结构域与所述igsf家族成员的未经修饰的或野生型igsf结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述igsf结构域是亲和力修饰的igsf结构域，相比于所述igsf家族成员的未经修饰的或野生型igsf结构域与其一个或多个同源结合配偶体的结合，所述亲和力修饰的igsf结构域展现与相同的一个或多个同源结合配偶体中的一个或多个的改变的结合。在一些实施方案中，相比于所述igsf家族成员的未经修饰的或野生型igsf结构域与其一个或多个同源结合配偶体的结合，所述igsf结构域展现与相同的一个或多个同源结合配偶体中的一个或多个的增加的结合。
23.在一些实施方案中，所述第二多肽的igsf结构域是与在肿瘤上表达的配体结合的肿瘤定位部分，或者是与和炎性环境相关的细胞或组织结合的炎性定位部分。在一些实施方案中，所述配体是b7h6。在一些实施方案中，所述igsf结构域来自nkp30。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白还含有与所述变体cd86多肽或所述第二多肽中的至少一种连接的多聚化结构域。在一些实施方案中，本文所述的免疫调节蛋白还含有包含igsf家族成员的igsf结构域或其亲和力修饰的igsf结构域的第三多肽，所述亲和力修饰的igsf结构域与所述igsf家族成员的未经修饰的或野生型igsf结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述第三多肽与所述第一和/或第二多肽相同；或者所述第三多肽与所述第一和/或第二多肽不同。
24.在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白还含有与所述变体cd86多肽、所述第二多肽和/或所述第三多肽中的至少一种连接的多聚化结构域。在一些实施方案中，所述多聚化结构域是免疫球蛋白的fc结构域，任选地其中所述免疫球蛋白蛋白质是人的和/或所述fc区是人的。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白蛋白质是人的和/或所述fc区是人的。在一些实施方案中，所述fc结构域是igg1、igg2或igg4，或者是其具有降低的效应子功能的变体。在一些实施方案中，所述fc结构域是igg1 fc结构域、任选地人igg1，或者是其具有降低的效应子功能的变体。在一些实施方案中，所述fc结构域是人igg1 fc结构域。在一些实施方案中，所述fc结构域含有seq id no:229中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:229至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述fc结构域是或含有seq id no:229中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述fc结构域是含有一个或多个氨基酸取代的变体igg1，并且所述一个或多个氨基酸取代选自e233p、l234a、l234v、l235a、l235e、g236del、g237a、s267k或n297g，其每一个均按照依据kabat的eu索引编号。在一些实施方案中，所述fc结构域含有氨基酸取代n297g、氨基酸取代r292c/n297g/v302c或氨基酸取代l234a/l235e/g237a，其每一个均按照kabat的eu索引编号。在一些实施方案中，所述变体fc区还含有氨基酸取代c220s，其中所述残基是按照kabat的eu索引来编号。在一些实施方案中，所述fc区含有k447del，其中所述残基是按照kabat的eu索引来编号。所述fc区在本文中也可以称为fc结构域。
25.在一些实施方案中，所述fc结构域含有seq id no:230中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:230至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且与人igg1相比含有seq id no:230中所示的相应氨基酸修饰中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述fc结构域是或含有seq id no:230中所示的氨基酸序列。
26.本文提供了一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中：所述第一多肽包含通过接头与第一fc结构域连接的至少一个igsf结构域，其中所述至少一个igsf结构域包含本文提供的任何变体cd86多肽中的一种或两种变体cd86多肽，或者是pd1多肽或其变体的igsf结构域；并且所述第二多肽包含通过接头与第二fc结构域连接的至少一个igsf，其中所述至少一个igsf结构域包含本文提供的任何变体cd86多肽中的一种或两种变体cd86多肽，或者是pd1多肽或其变体的igsf结构域，其中所述免疫调节蛋白包含cd86的至少一个igsf结构域和pd
‑
1或其变体的至少一个igsf结构域。
27.在任何所提供实施方案中的一些中，所述第一多肽的所述至少一个igsf结构域包含作为本文提供的任何变体cd86多肽的变体cd86多肽。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第二多肽的所述至少一个igsf结构域包含变体pd1多肽。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第一多肽的所述至少一个igsf结构域是第一igsf结构域，其中所述第一igsf结构域是作为本文提供的任何变体cd86多肽的变体cd86多肽，并且所述第一多肽包含通过接头与所述第一fc结构域连接的第二igsf结构域。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第一多肽的所述第二igsf结构域包含变体pd1多肽。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第二多肽的所述至少一个igsf结构域是第一igsf结构域，其中所述第一igsf结构域是作为本文提供的任何变体cd86多肽的变体cd86多肽，并且所述第二多肽包含通过接头与所述第二fc结构域连接的第二igsf结构域。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第二多肽的所述第二igsf结构域包含变体pd1多肽。
28.在任何所提供实施方案中的一些中，所述第一多肽的所述至少一个igsf结构域通过接头与所述第一fc结构域的n或c末端连接；并且所述第二多肽的所述至少一个igsf结构域通过接头与所述第二fc结构域的n或c末端连接。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第一多肽的所述第二igsf结构域连接至与所述第一igsf结构域所连接的末端相对的所述第一fc结构域末端。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第二多肽的所述第二igsf结构域连接至与所述第一igsf结构域所连接的末端相对的所述第二fc结构域末端。在任何所提供实施方案中的一些中，其中所述接头独立地包含seq id no:222或224的序列，任选地其中所述接头包含seq id no:222或224的序列的1至4个重复序列。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第一fc结构域和所述第二fc结构域是相同的，任选地，其中所述第一fc结构域和所述第二fc结构域包含seq id no:230的序列。
29.在任何所提供实施方案中的一些中，其中所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一和第二fc结构域二聚以形成同二聚体。在任何所提供实施方案中的一些中，所述同二聚体的所述第一和第二多肽从左到右包含变体pd1多肽
‑
接头
‑
fc
‑
接头
‑
变体cd86多肽。
30.在任何所提供实施方案中的一些中，所述变体pd1多肽包含seq id no:315的序列。在任何所提供实施方案中的一些中，所述变体cd86多肽包含seq id no:94或150的序列。在任何所提供实施方案中的一些中，所述第一fc结构域和所述第二fc结构域是不同的，任选地其中所述第一和第二fc结构域包含杵臼结构(knob
‑
into
‑
hole)突变，任选地其中所述第一fc结构域或所述第二fc结构域包含seq id no:346的序列，并且所述第一fc结构域或所述第二fc结构域中的另一个包含seq id no:347的序列。
31.在任何所提供实施方案中的一些中，所述第一多肽和所述第二多肽通过所述第一和第二fc结构域二聚以形成异二聚体。在任何所提供实施方案中的一些中，所述异二聚体的所述第一多肽从左到右包含变体pd1多肽
‑
接头
‑
fc，并且所述异二聚体的所述第二多肽从左到右包含变体cd86多肽
‑
接头
‑
fc、fc
‑
接头
‑
变体cd86多肽或变体pd1
‑
接头
‑
fc
‑
接头
‑
变体cd86。
32.在任何所提供实施方案中的一些中，所述变体pd1多肽包含seq id no:315的序列。在任何所提供实施方案中的一些中，所述变体cd86多肽包含seq id no:94或150的序列。在任何所提供实施方案中的一些中，所述异二聚体的所述第一多肽包含seq id no:350的序列；并且所述异二聚体的所述第二多肽包含seq id no:351、352或353的序列。
33.本文提供了缀合物，所述缀合物含有与靶向部分连接的本文所述的变体cd86多肽中的任一种，所述靶向部分特异性地结合至细胞表面上的分子。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞或者是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。在一些实施方案中，所述部分是抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的缀合物是融合蛋白。
34.在任何所提供实施方案中的一些中，所述变体cd86多肽与所述抗体的v
h
或v
l
的n或c末端连接。在一些实施方案中，与所述抗体的v
h
或v
l
的n或c末端连接的所述变体cd86多肽是本文提供的任何变体cd86多肽。在任何所提供实施方案中的一些中，所述抗体是抗her2抗体或抗egfr抗体。在任何所提供实施方案中的一些中，所述抗her2抗体是帕妥珠单抗(pertuzumab)。在任何所提供实施方案中的一些中，所述变体cd86多肽与帕妥珠单抗的v
h
的n末端、帕妥珠单抗的v
h
的c末端、帕妥珠单抗的v
l
的n末端或帕妥珠单抗的v
l
的c末端连接，任选地分别包含seq id no:342、344、343或345的序列。在任何所提供实施方案中的一些中，所述抗egfr抗体是帕尼单抗(panitumumab)。在任何所提供实施方案中的一些中，所述变体cd86多肽与帕尼单抗或抗egfr抗体的vh的n末端、帕尼单抗或抗egfr抗体的vh的c末端、帕尼单抗或抗egfr抗体的vl的n末端或帕尼单抗或抗egfr抗体的vl的c末端连接，任选地分别包含seq id no:348、350、349或351的序列。
35.本文提供了核酸分子，所述核酸分子编码本文所述的变体cd86多肽、本文所述的免疫调节蛋白或作为本文所述的融合蛋白的缀合物中的任一种。在一些实施方案中，所述核酸分子是合成核酸。在一些实施方案中，所述核酸分子是cdna。
36.本文提供了载体，所述载体含有本文所述的核酸分子。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。在一些实施方案中，所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。
37.本文提供了细胞，所述细胞含有本文所述的载体。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。
38.本文提供了产生含有变体cd86多肽的蛋白质的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将本文所述的核酸分子或本文所述的载体引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述蛋白质。
39.本文提供了工程化表达变体cd86多肽的细胞的方法，所述方法包括在所述多肽在宿主细胞中表达的条件下将编码本文所述的变体cd86多肽、本文所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的本文所述的缀合物的核酸分子引入所述细胞中。
40.本文提供了工程化细胞，所述工程化细胞含有本文所述的变体cd86多肽、本文所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的如本文所述的缀合物、本文所述的核酸分子或本文所述的载体。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有跨膜结构域或者是本文所述的跨膜免疫调节蛋白；和/或含有所述变体cd86多肽的所述蛋白质在所述细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽不含有跨膜结构域和/或不在所述细胞表面上表达；和/或所述变体cd86多肽能够从所述工程化细胞分泌。在一些实施方案中，所述蛋白质不含有胞质信号传导结构域或跨膜结构域和/或不在所述细胞表面上表达；和/或所述蛋白质在表达时能够从所述工程化细胞分泌。
41.在一些实施方案中，所述工程化细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是t细胞。在一些实施方案中，所述t细胞
是cd4+和/或cd8+ t细胞。在一些实施方案中，所述t细胞是调节性t细胞(treg)。在一些实施方案中，所述工程化细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞还含有嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，所述工程化细胞还含有工程化t细胞受体(tcr)。
42.本文提供了感染原，所述感染原含有本文所述的变体cd86多肽、本文所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的本文所述的缀合物、本文所述的核酸分子或本文所述的载体。在一些实施方案中，所述感染原是细菌或病毒。在一些实施方案中，所述感染原是病毒，并且所述病毒是溶瘤病毒。
43.本文提供了药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的变体cd86多肽、本文所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的本文所述的缀合物、本文所述的工程化细胞或本文所述的感染原。在一些实施方案中，所述药物组合物含有药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物是无菌的。
44.本文提供了制品，所述制品包括在小瓶或容器中的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述小瓶或容器是密封的。
45.本文提供了试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的药物组合物或本文所述的制品和使用说明书。
46.本文提供了调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括施用本文所述的变体cd86多肽、本文所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的本文所述的缀合物、本文所述的工程化细胞、本文所述的感染原或本文所述的药物组合物。
47.本文提供了调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括施用本文所述的工程化细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞对于所述受试者是自体的。在一些实施方案中，所述工程化细胞对于所述受试者是同种异体的。在一些实施方案中，调节所述免疫应答治疗所述受试者的疾病或病症。
48.本文提供了治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用本文所述的变体cd86多肽、本文所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的本文所述的缀合物、本文所述的工程化细胞、本文所述的感染原或本文所述的药物组合物。
49.本文提供了治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用本文所述的工程化细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞对于所述受试者是自体的。在一些实施方案中，所述工程化细胞对于所述受试者是同种异体的。
50.在一些实施方案中，所述免疫应答在所述受试者中增加。在一些实施方案中，向所述受试者施用含有与肿瘤定位部分连接的变体cd86多肽的免疫调节蛋白或缀合物。在一些实施方案中，所述肿瘤定位部分是或含有识别肿瘤抗原的结合分子。在一些实施方案中，所述结合分子含有抗体或其抗原结合片段或含有野生型igsf结构域或其变体。
51.在一些实施方案中，向所述受试者施用含有本文所述的免疫调节蛋白或本文所述的缀合物的药物组合物。在一些实施方案中，向所述受试者施用含有作为跨膜免疫调节蛋白的变体cd86多肽的工程化细胞，任选地，其中本文所述的工程化细胞。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白是如本文所述的。
52.在一些实施方案中，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述疾病
或病症选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。
53.在一些实施方案中，所述免疫应答降低。在一些实施方案中，向所述受试者施用可溶性变体cd86多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，所述可溶性多肽或免疫调节蛋白是fc融合蛋白。
54.在一些实施方案中，向所述受试者施用含有本文所述的变体cd86多肽或本文所述的免疫调节蛋白的药物组合物。在一些实施方案中，向所述受试者施用含有可分泌性变体cd86多肽的工程化细胞，任选地其中所述工程化细胞是本文所述的任一种。
55.在一些实施方案中，所述疾病或病症是炎性或自身免疫性疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是抗中性粒细胞胞质抗体(anca)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自炎性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎或银屑病。
附图说明
56.图1a示出了在与不同数量的hla
‑
a2+hpv+靶细胞(scc152)共培养24小时后，上清液中来自模拟物转导的t细胞和表达单独tcr或共表达所指示的cd86 ecd tip的e6 tcr转导的t细胞的ifn
‑
γ(ifnγ；左上)、il2(右上)和tnfα(底部)释放。
57.图1b和图1c分别示出了在模拟物转导的t细胞或表达单独tcr或共表达所指示的cd86 ecd tip的e6 tcr转导的t细胞与不同数量的hla
‑
a2+hpv+靶细胞(scc152)的共培养开始后3天的cd4+和cd8+ t细胞增殖。
58.图1d示出了在不同的效应子与靶标比率(e:t)下，在与hla
‑
a2+hpv+靶细胞(scc152)共培养4天后，模拟物转导的t细胞和表达单独tcr或共表达所指示的cd86 ecd tip的e6 tcr转导的t细胞的杀伤活性。
59.图2a描绘了cem
‑
t2、scc152和nci
‑
n87细胞系上的her2表达水平。
60.图2b示出了在不同的效应子与靶标比率(e:t)下，在与nci
‑
n87共培养24小时后，模拟物转导的t细胞和表达单独car或共表达所指示的cd86 ecd tip的抗her2 car转导的t细胞的杀伤活性。
61.图2c示出了在不同的效应子与靶标比率(e:t)下，在与scc152共培养24小时后，模拟物转导的t细胞和表达单独car或共表达所指示的cd86 ecd tip的抗her2 car转导的t细胞的杀伤活性。
62.图3描绘了seq id no:29中所示的野生型cd86细胞外结构域(ecd)序列(含有命名为“cd86(b7
‑
2)”(seq id no:2)的cd86残基24
‑
247)与seq id no:122中所示的野生型igv序列(含有命名为“cd86(b7
‑
2)”(seq id no:2)的cd86残基33
‑
131)的示例性比对。符号“*”指示两个比对的残基相同。两个比对的残基之间没有“*”指示所比对的氨基酸不相同。符号
“‑”
指示比对中的空位。seq id no:122中对应于具有seq id no:29中所示的编号的位置的示例性非限制性位置用框指示。
63.图4a和图4b描绘了通过由流式细胞术评估的平均荧光强度(mfi)确定的不同浓度
(0.1nm至100nm)下的示例性pd1
‑
cd86堆叠构建体与同源结合配偶体ctla
‑
4的结合。
64.图5a和图5b描绘了通过由流式细胞术评估的平均荧光强度(mfi)确定的不同浓度(0.1nm至100nm)下的示例性pd1
‑
cd86堆叠构建体与同源结合配偶体cd28的结合。
65.图6a和图6b描绘了通过由流式细胞术评估的平均荧光强度(mfi)确定的不同浓度(0.1nm至100nm)下的示例性pd1
‑
cd86堆叠构建体与同源结合配偶体pd
‑
l1的结合。
66.图7a和图7b描绘了如通过il
‑
2荧光相对荧光单位(rlu)测量的示例性变体pd1
‑
cd86堆叠构建体使用jurkat/il
‑
2报告细胞(图7a)或表达pd
‑
l1的jurkat/il
‑
2报告细胞(图7b)递送cd28的pd
‑
l1依赖性共刺激的能力。
67.图8和图9描绘了来自巨细胞病毒(cmv)抗原特异性功能测定的t细胞上清液的细胞因子浓度(pg/ml)。如通过elisa评估的，确定上清液中的il
‑
2(图8)和ifng(图9)。
68.图10描绘了不同浓度(100至100,000pm)下的示例性nkp30
‑
cd86堆叠构建体与cd28和ctla
‑
4的结合，所述结合测定为中值higg pe。
69.图11a描绘了通过由流式细胞术评估的平均荧光强度(mfi)确定的示例性nkp30
‑
cd86堆叠构建体与原代t细胞的结合能力。图11b示出了使用cfse染料通过流式细胞术评估的t细胞增殖百分比。
70.图12描绘了如通过elisa评估的从t细胞上清液收获的il
‑
2的浓度(pg/ml)。
71.图13描绘了在存在(左)和不存在(右)b7h6的情况下的示例性nkp30
‑
cd86堆叠构建体共刺激。通过流式细胞术评估t细胞增殖百分比。
72.图14a至图14d描绘了示例性格式化堆叠构建体的结构。
73.图15a和图15b描绘了如通过流式细胞术评估并通过平均荧光强度(mfi)测量的不同浓度(100nm系列稀释8次至1:4)下的示例性格式化堆叠构建体与同源结合配偶体pd
‑
l1(左)和cd28(右)的结合。
74.图16a和图16b描绘了在萤光素酶报告细胞系统中测试并且使用相对发光单位(rlu)确定的示例性格式化堆叠构建体的共刺激能力。
75.图17a描绘了如通过ifng、il2和tnfa的浓度(pg/ml)测量的示例性cd86
‑
pd
‑
1堆叠构建体促进t细胞中细胞因子产生的能力。
76.图17b描绘了通过相对发光单位(rlu)评估的在孵育后24小时、48小时和72小时示例性cd86
‑
pd
‑
1堆叠构建体促进针对hla
‑
a2+hpv+靶细胞的t细胞的细胞毒性活性的能力。
77.图18a、图18b和图18c描绘了示例性变体cd86 igv分子与her2和egfr靶向抗体的缀合物的示例性构型。
78.图19描绘了如通过平均荧光强度确定的示例性帕妥珠单抗
‑
cd86缀合物与her2的结合(图19a)和示例性帕尼单抗
‑
cd86缀合物与egfr的结合(图19b)。
79.图20描绘了如以相对荧光单位(rlu)测量的帕妥珠单抗
‑
cd86缀合物(图20a)和示例性帕尼单抗
‑
cd86缀合物(图20b)在il
‑
2萤光素酶报告测定中向t细胞提供共刺激的能力。
80.图21描绘了通过scc
‑
152靶细胞的杀伤百分比测量的示例性帕妥珠单抗
‑
cd86缀合物(图21a)和示例性帕尼单抗
‑
cd86缀合物(图21b)促进原代人t细胞的如以不同效应子与靶标比率(e:t)测试的t细胞的细胞毒性活性的能力。
81.图22描绘了通过测定细胞上清液中ifng、il2和tnfa(nm蛋白)的浓度所得的帕妥
珠单抗
‑
cd86缀合物(图22a)和示例性帕尼单抗
‑
cd86缀合物(图22b)促进t细胞中细胞因子产生的能力。
82.图23a描绘了含有第一变体igsf结构域(第一vigd)和第二igsf结构域如第二变体igsf结构域(第二vigd)的堆叠分子的各种示例性构型。图23b描绘了含有第一变体igsf结构域(第一vigd)、第二igsf结构域如第二变体igsf结构域(第二vigd)和第三igsf结构域如第三变体igsf结构域(第三vigd)的堆叠分子的各种示例性构型。
83.图24描绘了所提供的变体igsf结构域分子的各种形式。图24a描绘了可溶性分子，并且图24b描绘了在细胞表面上表达的含有变体igsf结构域(vigd)的跨膜免疫调节蛋白(tip)。
84.图25描绘了分泌的免疫调节蛋白(sip)，其中变体igsf结构域(vigd)是从细胞(如第一t细胞(例如，car t细胞))分泌。
具体实施方式
85.本文提供免疫调节蛋白，其是或含有cd86及其特异性结合片段的变体或突变体，所述变体或突变体展现对至少一种靶配体同源结合配偶体(也称为反结构配体蛋白)改变的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，与未经修饰的或野生型cd86多肽相比，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代、缺失或添加)。在一些实施方案中，与未经修饰的或野生型cd86多肽相比，所述变体cd86多肽含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在未经修饰的或野生型cd86多肽的细胞外结构域中，如在igsf结构域(例如igc的igv)中。在一些实施方案中，与不含有所述一个或多个修饰的未经修饰的或野生型cd86相比，所述变体cd86多肽展现对cd28或ctla
‑
4中的一种或多种改变(如增加或降低)的结合活性或亲和力。
86.在一些实施方案中，与不含有所述一个或多个修饰的未经修饰的或野生型cd86相比，所述变体cd86多肽展现与cd28增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与不含有所述一个或多个修饰的未经修饰的或野生型cd86相比，所述变体cd86多肽展现与至少cd28增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与不含有所述一个或多个修饰的未经修饰的或野生型cd86相比，所述结合亲和力改变(例如增加)至少1.2倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍、20.0倍、30.0倍、40.0倍、50.0倍、60.0倍、70.0倍、80.0倍、90.0倍、100.0倍、124.0倍或更多倍。
87.在一些实施方案中，与不含有所述一个或多个修饰的未经修饰的或野生型cd86相比，所述变体cd86多肽展现降低的、无变化的或未更大的与ctla
‑
4的结合亲和力。在一些实施方案中，与ctla
‑
4的结合亲和力降低。在一些实施方案中，与不含有所述一个或多个修饰的未经修饰的或野生型cd86相比，所述结合亲和力改变(例如降低)至少1.2倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍或更多倍。
88.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽和免疫调节蛋白调节免疫应答，如增加或降低免疫应答。特定调节可以基于所述变体cd86多肽的形式，这取决于特定形式是否提供拮抗剂或阻断活性或激动剂活性。还提供了所提供的变体多肽的各种免疫调节蛋白形式。如本文所示，替代形式可以促进免疫应答的操纵，且因此促进治疗应用。以各种构型格式化变体多肽以根据背景拮抗或激动免疫应答的能力基于变体cd86对结合配偶体的同样增加
的结合和活性在治疗性应用中提供灵活性。例如，将变体cd86蛋白拴系到表面可以递送局部共刺激信号，而在其他情况下，以非局部可溶性形式呈递cd86可以赋予拮抗活性。在一些实施方案中，本文提供的变体cd86多肽和免疫调节蛋白可用于治疗与失调的免疫应答相关的疾病或病症。
89.在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白是可溶性的。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白是能够在细胞表面表达的跨膜免疫调节蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白是能够从表达它的细胞分泌的可分泌性免疫调节蛋白。在一些实施方案中，本文还提供了一种或多种其他免疫调节蛋白，其是含有本文提供的变体cd86多肽和一种或多种其他部分或多肽的缀合物或融合物。在一些方面，提供了工程化细胞，其含有跨膜免疫调节蛋白或可分泌性免疫调节蛋白。在一些方面，提供了感染原，其能够将跨膜免疫调节蛋白或可分泌性免疫调节蛋白递送至感染原感染的细胞中以用于表达。在一些实施方案中，本文还提供了一种或多种其他免疫调节蛋白，其是含有本文提供的变体cd86多肽和一种或多种其他部分或多肽的缀合物或融合物。
90.在一些实施方案中，变体cd86多肽以展现其同源结合配偶体cd28的激动剂活性和/或经由cd28刺激或启动共刺激信号传导的形式提供。此类免疫调节蛋白形式包括表达作为跨膜免疫调节蛋白的变体cd86多肽的工程化细胞。在其他情况下，所述免疫调节形式可以包括与另一分子的融合物，如由具有其他igsf结构域(包括肿瘤定位结构域)的某些“堆叠分子”提供的融合物(例如vcd86
‑
nkp30构建体)，以及具有抗体缀合物形式的融合物(例如vcd86
‑
抗her2或vcd86
‑
抗her1构建体)。此类变体cd86免疫调节蛋白及其形式(例如工程化细胞或融合构建体)可用于治疗癌症、病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86对照，所述变体cd86免疫调节蛋白及其形式(例如，工程化细胞或融合构建体)展现增强的共刺激活性，从而导致增加的t细胞活性(例如，在体内或体外)，如在原代t细胞测定中。在一些方面，t细胞活性可以通过评估细胞因子(如il
‑
2、ifn
‑
γ或tnfα)的产生来评估。在一些方面，与不含有所述一个或多个修饰的未经修饰的或野生型cd86相比，增加(如ifn
‑
γ、il
‑
2或tnfα的增加)是大于或大于约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0或更多倍。
91.在一些实施方案中，所述变体cd86多肽以展现其同源结合配偶体cd28的拮抗活性和/或经由cd28阻断或抑制共刺激信号传导的形式提供。此类免疫调节蛋白形式包括可溶性变体cd86多肽(例如变体cd86
‑
fc融合蛋白)。此类变体cd86免疫调节蛋白可用于治疗炎性或自身免疫性障碍。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86对照，所述变体cd86免疫调节蛋白及其形式(例如可溶性变体cd86
‑
fc融合蛋白)抑制或阻断共刺激信号传导，从而导致降低的t细胞活性(例如在体内或体外)，如在原代t细胞测定中。在一些方面，t细胞活性可以通过评估细胞因子(如il
‑
2、ifn
‑
γ或tnfα)的产生来评估。在一些方面，与不含有所述一个或多个修饰的未经修饰的或野生型cd86相比，降低(如ifn
‑
γ、il
‑
2、tnfα的降低)是大于或大于约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍或更多倍。
92.在一些实施方案中，所提供的变体cd86多肽通过与共刺激信号传导分子的相互作用来调节t细胞激活、扩增、分化和存活。通常，抗原特异性t细胞激活通常需要两种不同信
号。第一信号通过t细胞受体(tcr)与抗原呈递细胞(apc)上存在的主要组织相容性复合物(mhc)缔合的抗原的相互作用来提供。第二信号是针对tcr接合的共刺激(例如，cd28共刺激)信号，并且是避免t细胞凋亡或失能所必需的。
93.在一些实施方案中，在正常生理条件下，t细胞介导的免疫应答通过t细胞受体(tcr)的抗原识别起始，并通过共刺激和抑制信号(例如免疫检查点蛋白)的平衡来调节。免疫系统依靠免疫检查点来预防自身免疫(即自身耐受)，并在免疫应答期间(例如在攻击病原体感染期间)保护组织免受过度损伤。然而，在一些情况下，这些免疫调节蛋白可能在包括肿瘤在内的疾病和病症中失调，这是一种逃避免疫系统的机制。
94.在一些实施方案中，已知的t细胞共刺激受体包括cd28，它是配体b7
‑
1(cd80)和b7
‑
2(cd86)的t细胞共刺激受体，所述两种配体存在于apc上。与对cd28的亲和力相比，这些相同的配体也可以以更大的亲和力与抑制性t细胞受体ctla4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)结合；与ctla4的结合起到下调免疫应答的作用。
95.增强或抑制cd28和ctla
‑
4受体的活性对于治疗炎性和自身免疫性疾病、癌症和病毒感染具有临床意义。然而，在一些情况下，干预和改变两种受体的共刺激作用的疗法受制于空间定向要求以及免疫突触界限所施加的大小限制。在一些方面，现有的治疗药物(包括抗体药物)可能不能与参与调节这些相互作用的多种靶蛋白同时相互作用。此外，在一些情况下，现有的治疗药物可能仅具有拮抗而非激动免疫应答的能力。另外，单独地靶向这两种受体中的一种或另一种的药物之间的药代动力学差异可能在整个治疗过程中难以适当地维持这种药物组合的所需血液浓度。所提供的变体cd86多肽和免疫调节蛋白以及如所述的其他形式解决此类问题。还提供了制备和使用这些cd86多肽的变体和免疫调节蛋白的方法。
96.本说明书中提及的所有出版物(包括专利、专利申请、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入本文，其程度如同具体地和单独地指出每个单独的出版物(包括专利、专利申请、科学文章或数据库)通过引用并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
97.本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。i.定义
98.除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
99.除非在特殊情况中另有限制，否则在本说明书中通篇使用的术语定义如下。除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语、缩略词和缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。除非另有指示，否则用于化学和生物化学名称的缩写和符号符合iupac
‑
iub命名法。除非另有说明，否则所有数值范围都包括定义所述范围的值以及中间的所有整数值。
100.如在免疫球蛋白超家族结构域的上下文中使用的术语“亲和力修饰的”意指具有
改变的氨基酸序列(相对于相应的野生型亲代或未经修饰的igsf结构域)的哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，使得与亲代野生型或未经修饰的(即，未亲和力修饰的)igsf对照结构域相比，所述哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)结构域具有对至少一种其同源结合配偶体(可替代地“反结构”)增加或降低的结合亲和力或亲合力。这种情况中包括亲和力修饰的cd86 igsf结构域。在一些实施方案中，所述亲和力修饰的igsf结构域可以含有野生型或未经修饰的igsf结构域中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸差异，如氨基酸取代。结合亲和力或亲合力的增加或降低可以使用熟知的结合测定(如流式细胞术)来确定。larsen等人,american journal of transplantation,第5卷:443
‑
453(2005)。还参见，linsley等人,immunity,第1卷(9:793
‑
801(1994)。蛋白质与其一个或多个同源结合配偶体的结合亲和力或亲合力的增加是达到比野生型igsf结构域对照的结合亲和力或亲合力高至少10％的值，并且在一些实施方案中，比野生型igsf结构域对照值高至少20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％或10000％。蛋白质对其同源结合配偶体中的至少一个的结合亲和力或亲合力的降低是不大于对照的90％但不小于野生型igsf结构域对照值的10％的值，并且在一些实施方案中，不大于野生型igsf结构域对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％但不小于野生型igsf结构域对照值的10％。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变亲和力修饰的蛋白质的一级氨基酸序列。术语“亲和力修饰的igsf结构域”被认为不会对通过其产生亲和力修饰的igsf结构域的任何特定起始组合物或方法强加任何条件。因此，本发明的亲和力修饰的igsf结构域并不限于随后通过亲和力修饰的任何特定过程转化为亲和力修饰的igsf结构域的野生型igsf结构域。亲和力修饰的igsf结构域多肽可以例如从野生型哺乳动物igsf结构域序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与其同源结合配偶体的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生亲和力修饰的igsf结构域组合物。在一个替代例子中，亲和力修饰的igsf结构域可以通过野生型igsf结构域的定点诱变产生。因此，亲和力修饰的igsf结构域表示产物，而不必是由任何给定方法产生的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
101.如本文所用的术语“同种异体的”意指从一种生物体取出并随后输注或过继转移至相同物种的遗传上不同的生物体中的细胞或组织。在本发明的一些实施方案中，所述物种是鼠或人。
102.如本文所用的术语“自体的”意指从生物体中取出并且之后输注或过继转移的同一生物体中的细胞或组织。自体细胞或组织可通过例如重组dna方法改变，使得其在遗传上不再与从所述生物体取出的天然细胞或天然组织相同。例如，天然自体t细胞可以通过重组dna技术进行遗传工程化，以成为表达跨膜免疫调节蛋白和/或嵌合抗原受体(car)的自体工程化细胞，所述自体工程化细胞在一些情况下涉及将t细胞或til工程化(肿瘤浸润淋巴细胞)。然后将工程化细胞输注到患者中，所述患者是从其中分离天然t细胞的患者。在一些实施方案中，所述生物体是人类或鼠类。
103.本文所用的术语“结合亲和力”和“结合亲合力”分别意指蛋白质在特定结合条件下对其反结构的特异性结合亲和力和特异性结合亲合力。在生物化学动力学中，亲合力是指单独非共价结合相互作用(如cd86与其反结构cd28和/或ctla
‑
4之间)的多个亲和力的累积强度。因此，亲合力不同于亲和力，亲和力描述单个相互作用的强度。测定了含有亲和力
修饰的cd86 igsf结构域的变体cd86与其反结构的结合亲和力相对于未经修饰的cd86(如含有天然或野生型igsf结构域如igv结构域的未经修饰的cd86)的结合亲和力的增加或降低。测定结合亲和力或亲合力的方法是本领域已知的。参见例如，larsen等人,american journal of transplantation,第5卷:443
‑
453(2005)。在一些实施方案中，变体cd86(如含有亲和力修饰的igsf结构域)以一定的结合亲和力(通过流式细胞术测量的)特异性地结合至cd28和/或ctla
‑
4，所述结合亲和力在结合测定中产生比未经修饰的cd86对照大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(mfi)值。在一些实施方案中，变体cd86(如含有亲和力修饰的igsf结构域)以一定的结合亲和力(通过流式细胞术测量的)特异性地结合至cd28，所述结合亲和力在结合测定中产生比未经修饰的cd86对照大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(mfi)值。在一些实施方案中，变体cd86(如含有亲和力修饰的igsf结构域)以一定的结合亲和力(通过流式细胞术测量的)特异性地结合至ctla
‑
4，所述结合亲和力在结合测定中产生比未经修饰的cd86对照小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(mfi)值。在一些实施方案中，变体cd86(如含有亲和力修饰的igsf结构域)以一定的结合亲和力(通过流式细胞术测量的)特异性地结合至ctla
‑
4，所述结合亲和力在结合测定中产生不显著不同于或不大于未经修饰的cd86对照的结合亲和力的平均荧光强度(mfi)值。在一些实施方案中，变体cd86(如含有亲和力修饰的igsf结构域)以一定的结合亲和力(通过流式细胞术测量的)特异性地结合至cd28，所述结合亲和力在结合测定中产生比未经修饰的cd86对照大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(mfi)值，并且在结合测定中与未经修饰的cd86对照相比展现对于ctla
‑
4无变化的结合亲和力或未更大的结合亲和力。在一些实施方案中，变体cd86(如含有亲和力修饰的igsf结构域)以一定的结合亲和力(通过流式细胞术测量的)特异性地结合至cd28，所述结合亲和力在结合测定中产生比未经修饰的cd86对照大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(mfi)值，并且展现对于ctla
‑
4降低的结合亲和力(通过流式细胞术测量的)，其中在结合测定中与未经修饰的cd86对照相比，结合亲和力在结合测定中产生比未经修饰的cd86对照小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(mfi)值。
104.术语“生物半衰期”是指物质(如含有本发明的变体cd86多肽的免疫调节多肽)丧失其药理学或生理学活性或浓度的一半所花费的时间。生物半衰期可受到物质的消除、排泄、降解(例如，酶促)或在身体的某些器官或组织中的吸收和浓缩的影响。在一些实施方案中，生物半衰期可以通过确定物质的血浆浓度达到其稳态水平的一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估。可用于衍生化和增加本发明多肽的生物半衰期的缀合物是本领域已知的，并且该缀合物包括但不限于聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、xten(延伸的重组肽；参见，wo 2013130683、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、脂质(酰化)、聚pro
‑
ala
‑
ser(pas)和聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
105.如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“car”是指在哺乳动物细胞上表达的人工(即人造)跨膜蛋白，其至少含有细胞外结构域、跨膜和胞内结构域。任选地，car蛋白包括“间隔子”，其将胞外结构域与跨膜结构域共价连接。间隔子通常是通过肽键将细胞外结构域连接至跨膜结构域的多肽。car通常在哺乳动物淋巴细胞上表达。在一些实施方案中，car
在哺乳动物细胞，如t细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)上表达。t细胞上表达的car在本文中称为“car t细胞”或“car
‑
t”。在一些实施方案中，car
‑
t是t辅助细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、记忆t细胞、调节t细胞或γδt细胞。当在临床上用于例如过继细胞转移时，具有对患者肿瘤的抗原结合特异性的car
‑
t通常被工程化为在从患者获得的天然t细胞上表达。然后将表达car的工程化t细胞输注回患者体内。car
‑
t因此通常是自体car
‑
t，但在本发明的范围内包括同种异体car
‑
t。car的胞外结构域含有在生理条件下特异性地结合至靶抗原(如肿瘤特异性抗原)的抗原结合区，如抗体或其抗原结合片段(例如scfv)。特异性结合后，事件的生化链(即信号转导)导致对car
‑
t的免疫活性的调节。因此，例如，car
‑
t的抗原结合区与其靶抗原的特异性结合可以导致如细胞毒性、增殖或细胞因子产生的变化所反映的t细胞活性的免疫活性的变化。在一些实施方案中，通过参与天然哺乳动物t细胞中的信号转导的cd3
‑
ζ链(“cd3
‑
z”)实现car
‑
t活化后的信号转导。car
‑
t还可以含有多个信号传导结构域，如cd28、4
‑
1bb或ox40，以进一步调节t细胞的免疫调节应答。cd3
‑
z含有保守基序，所述保守基序被称为免疫受体酪氨酸激活基序(itam)，其参与t细胞受体信号转导。
106.当在体外测定中关于由两种或更多种变体cd86多肽的存在诱导的细胞因子产生使用时，术语“共同地”或“共同的”意指总体细胞因子表达水平，与由单独变体cd86多肽诱导的细胞因子产生无关。在一些实施方案中，在体外原代t细胞测定中，所测定的细胞因子是的ifn
‑
γ或il
‑
2。
107.关于多肽，如关于变体cd86的igsf结构域的术语“同源结合配偶体”(可与“反结构”互换使用)是指在特异性结合条件下与所提及多肽特异性结合的至少一种分子(通常是天然哺乳动物蛋白质)。在一些方面，含有亲和力修饰的igsf结构域的变体cd86与相应天然或野生型cd86的反结构特异性结合，但其亲和力增加或减弱。在特异性结合条件下识别并特异性地结合至其同源受体的配体种类是该受体的反结构或同源结合配偶体的例子。“同源细胞表面结合配偶体”是在哺乳动物细胞表面上表达的同源结合配偶体。“细胞表面分子种类”是免疫突触(is)的配体的同源结合配偶体，其在细胞(如哺乳动物细胞)上且由细胞表达，从而形成免疫突触。
108.如本文所用，“缀合物”、“缀合”或其语法变型是指通过本领域已知的任何接合或连接方法将两种或更多种化合物接合或连接在一起，从而导致另一种化合物的形成。它还可以指通过将两种或更多种化合物接合或连接在一起而产生的化合物。例如，与一个或多个化学部分或多肽直接或间接连接的变体cd86多肽是示例性缀合物。这种缀合物包括融合蛋白、由化学缀合物产生的那些融合蛋白和通过任何其他方法产生的那些融合蛋白。
109.如本文所用的术语“竞争性结合”意指，蛋白质能够与至少两个同源结合配偶体特异性结合，但是一个同源结合配偶体的特异性结合抑制(如阻止或妨碍)第二同源结合配偶体的同时结合。因此，在一些情况下，蛋白质不可能同时结合两个同源结合配偶体。通常，竞争性结合物含有用于特异性结合的相同或重叠的结合位点，但所述结合位点不是所需的。在一些实施方案中，由于第二同源结合配偶体的特异性结合，竞争性结合引起对蛋白质与其一种同源结合配偶体的特异性结合的可测量的抑制(部分或完全)。已知多种方法用于对竞争性结合进行定量，如elisa(酶联免疫吸附测定)测定。
110.如本文所用的术语“保守氨基酸取代”意指如下氨基酸取代，其中氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，所述另一氨基酸残基具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链r
基。具有化学特性相似的侧链的氨基酸基团的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族
‑
羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基团为：缬氨酸
‑
亮氨酸
‑
异亮氨酸、苯丙氨酸
‑
酪氨酸、赖氨酸
‑
精氨酸、丙氨酸
‑
缬氨酸、谷氨酸盐
‑
天冬氨酸盐和天冬酰胺
‑
谷氨酰胺。
111.关于蛋白质位置的术语“对应于”，如以下叙述：核苷酸或氨基酸位置“对应于”公开序列中的核苷酸或氨基酸位置，如序列表中所述，是指基于结构序列比对或使用标准比对算法(如gap算法)在与公开序列比对时鉴定的核苷酸或氨基酸位置。例如，相应的残基可以通过如本文所述的结构比对方法将参考序列与seq id no:29(ecd结构域)中所示的野生型cd86的序列进行比对来确定。通过比对序列，本领域技术人员可例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴别相应残基。图3例示了序列与seq id no:29中所示的参考序列的比对，以鉴定相应残基。例如，在图3所示的示例性比对中，seq id no:29的残基13对应于seq id no:122的残基4。
112.如本文所用的术语“降低”或“减弱”或“抑制”意指统计学上显著的量的降低。降低可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
113.术语“衍生物”或“衍生化的”是指通过将蛋白质与组合物直接或间接共价连接来修饰蛋白质，以在保持或增强其治疗益处的同时改变生物半衰期、生物利用度、免疫原性、溶解性、毒性、效力、功效等特征。本发明的免疫调节多肽的衍生物在本发明的范围内，并且可以通过例如糖基化、peg化、脂化或fc融合来制备。
114.如本文所用，检测包括允许将蛋白质可视化(目测或用设备)的方法。可以使用对蛋白质具有特异性的抗体来将蛋白质可视化。蛋白质的检测也可以通过将蛋白质与包括可检测标记的标签融合或通过与包括可检测标记的对蛋白质具有特异性的第二试剂(如二抗)接触来促进。
115.如本文所用，结构域(通常为三个或更多个，通常为5或7个或更多个氨基酸的序列，如10至200个氨基酸残基)是指分子(如蛋白质或编码核酸)的一部分，所述部分在结构上和/或功能上与分子的其他部分不同并且是可鉴定的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，所述部分可以在蛋白质内形成由一个或多个结构基序构成的独立折叠结构，和/或借助功能活性(如结合活性)来识别。蛋白质可以具有一个或超过一个独特结构域。例如，可以通过与相关家族成员的一级序列或结构的同源性(如与基序的同源性)来鉴定、定义或区分结构域。在另一个例子中，结构域可以通过其功能进行区分，如与生物分子(如同源结合配偶体)相互作用的能力。结构域可独立地展现生物学功能或活性，使得结构域可独立地或与另一份子融合后发挥活性，例如结合。结构域可以是线性氨基酸序列或非线性氨基酸序列。多种多肽含有多个结构域。此类结构域是已知的，并且可由本领域技术人员来鉴定。对于本文中的示例，提供定义，但应理解，通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要，可采用适当软件来鉴别结构域。
116.如本文所用的术语“胞外结构域”是指膜蛋白(如跨膜蛋白)中位于囊泡膜外的区域。胞外结构域通常含有与配体或细胞表面受体特异性结合的结合结构域，如通过与所述配体或细胞表面受体特异性结合的结合结构域来结合。细胞跨膜蛋白的胞外结构域可替代
地称为细胞外结构域(ecd)。
117.术语“有效量”或“治疗有效量”是指本发明的治疗组合物(包括蛋白质组合物或细胞组合物)当单独(即，作为单一疗法)或与另外的治疗剂组合离体(通过与来自患者的细胞接触)或体内(通过施用至患者)施用时，使疾病进展产生统计学上显著的降低(例如通过改善或消除疾病的症状和/或病因)的量和/或浓度。有效量可以是缓解、减轻或缓和与疾病或障碍相关的至少一种症状或生物反应或影响，防止疾病或障碍进展，或改进患者的身体功能的量。在细胞疗法的情况下，有效量是通过过继细胞疗法向患者施用的有效剂量或细胞数。在一些实施方案中，患者是哺乳动物，如非人灵长类动物或人患者。
118.如本文所用术语“胞内结构域”是指在一些膜蛋白(如跨膜蛋白)中发现的延伸至由细胞表面膜界定的内部空间中的区域。在哺乳动物细胞中，胞内结构域是膜蛋白的胞质区域。在细胞中，胞内结构域与细胞内成分相互作用，并且可在信号转导中发挥作用，并且因此在一些情况下可以是细胞内信号传导结构域。细胞跨膜蛋白的胞内结构域可替代地称为胞质结构域，其在一些情况下可以是胞质信号传导结构域。
119.如本文中在增加哺乳动物淋巴细胞的免疫活性的情况下使用的术语“增强的”或“增加的”意指增加淋巴细胞的一种或多种活性。增加的活性可以是增加的细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生或t细胞的细胞毒性中的一种或多种，如增加统计学上显著的量。在一些实施方案中，提及增加的免疫活性意指增加干扰素γ(ifn
‑
γ)、il
‑
2或tnfα产生，如增加统计学上显著的量。在一些实施方案中，免疫活性可以在混合淋巴细胞反应(mlr)测定中评估。进行mlr测定的方法是本领域中已知的。wang等人,cancer immunol res.2014年9月:2(9):846
‑
56。评估淋巴细胞的活性的其他方法是本领域中已知的，包括如本文所述的任何测定。在一些实施方案中，增强可以是比非零对照值大至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％的增加。
120.如本文所用术语“工程化细胞”是指已经通过人为干预(如通过重组dna方法或病毒转导)进行遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，如淋巴细胞(例如，t细胞、b细胞、nk细胞)或抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。所述细胞可以是来自患者的原代细胞或者可以是细胞系。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞含有本发明的变体cd86，其被工程化为调节表达cd28或ctla
‑
4的t细胞的免疫活性，所述变体cd86多肽与cd28或ctla
‑
4特异性地结合。在一些实施方案中，变体cd86是含有细胞外结构域或其部分的跨膜免疫调节蛋白(下文称为“tip”)，所述细胞外结构域或其部分含有与跨膜结构域(例如cd86跨膜结构域)以及任选细胞内信号传导结构域连接的igv结构域。在一些情况下，tip被格式化为含有异源胞质信号传导结构域或胞内结构域的嵌合受体。在一些实施方案中，工程化细胞能表达并分泌如本文所述的免疫调节蛋白。在提供的工程化细胞中，还有进一步含有工程化t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)的细胞。
121.如本文所用的术语“工程化t细胞”是指t细胞，如t辅助细胞、细胞毒性t细胞(或者，细胞毒性t淋巴细胞或ctl)、自然杀伤t细胞、调节t细胞、记忆t细胞或γδt细胞，所述t细胞已经通过人为干预(如通过重组dna方法或病毒转导方法)进行遗传修饰。工程化t细胞含有本发明的变体cd86跨膜免疫调节蛋白(tip)或分泌性免疫调节蛋白(sip)，其在t细胞上表达并且被工程化为调节工程化t细胞自身或哺乳动物细胞的免疫活性，所述哺乳动物细胞与在t细胞上表达的cd86特异性地结合。
122.术语“工程化t细胞受体”或“工程化tcr”是指被工程化为与被选择、克隆和/或随后引入t细胞群中的主要组织相容性复合物(mhc)/肽靶抗原以所需的亲和力特异性地结合的t细胞受体(tcr)，其通常用于过继免疫疗法。
123.如本文所用的术语“在
……
上表达”是关于在细胞(如哺乳动物细胞)的表面上表达的蛋白质来使用。因此，蛋白质被表达为膜蛋白。在一些实施方案中，所表达蛋白质是跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质与小分子部分(如药物或可检测标记)缀合。在细胞表面上表达的蛋白质可以包括细胞表面蛋白，如在哺乳动物细胞上表达的细胞表面受体。
124.术语“半衰期延长部分”是指多肽融合物或化学缀合物的部分，与未与所述部分如此缀合的蛋白质的半衰期相比，所述部分延长蛋白质在哺乳动物血清中循环的半衰期。在一些实施方案中，半衰期延长大于或大于约1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或6.0倍。在一些实施方案中，与不含半衰期延长部分的蛋白质相比，在体内施用后，半衰期延长超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过96小时或超过1周。半衰期是指蛋白质丧失其浓度、量或活性的一半所耗时间长度。半衰期可例如通过使用elisa测定或活性测定来确定。示例性半衰期延长部分包括fc结构域、多聚化结构域、聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、xten(延伸的重组肽；参见，wo 2013130683)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、脂质(酰化)、聚pro
‑
ala
‑
ser(pas)和聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
125.如本文所用的术语“免疫突触”(“immunological synapse”或“immune synapse”)意指表达mhc i(主要组织相容性复合物)或mhc ii的哺乳动物细胞(如抗原呈递细胞或肿瘤细胞)与哺乳动物淋巴细胞(如效应t细胞或自然杀伤(nk)细胞)之间的界面。
126.免疫球蛋白分子的fc(可结晶片段)区域或结构域(也称为fc多肽)主要对应于免疫球蛋白重链的恒定区，并且负责多种功能，包括抗体的一种或多种效应子功能。fc结构域含有免疫球蛋白分子的部分或全部的铰链结构域以及ch2和ch3结构域。fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。在一些实施方案中，fc是变体fc，其展现降低(例如降低大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的活性以促进效应子功能。在一些实施方案中，除非参考特定的seq id no进行描述，否则提及fc区中的氨基酸取代是通过eu编号系统。eu编号是已知的，并且按照最新更新的imgt scientific chart(国际immunogenetic s信息系统，http://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/hu_ighgn ber.html(创建：2001年5月17日，最后更新：2013年1月10日)和如kabat,e.a.等人sequences of proteins of immunological interest.第5版us depart ment of health and human services,nih公开号91
‑
3242(1991)中报告的e u索引。
127.免疫球蛋白fc融合物(“fc
‑
融合物”)，如免疫调节性fc融合蛋白，是包含与免疫球蛋白的fc区可操作地连接的一种或多种多肽(或一种或多种小分子)的分子。fc融合物可以包含例如抗体的fc区(其在一些情况下，促进药代动力学)和变体cd86多肽。免疫球蛋白fc区可以与一种或多种变体cd86多肽或小分子(融合配偶体)间接或直接连接。各种接头是本领域已知的，并且可任选地用于将fc与融合配偶体连接以产生fc融合物。可以将相同种类的fc融合物二聚化以形成fc融合同二聚体，或使用不同种类形成fc融合异二聚体。在一些实施方案中，fc是哺乳动物fc，如鼠、兔或人fc。
128.术语“宿主细胞”是指可以用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的细胞。宿主细
胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物，如veggie cho、dg44、expi cho或chozn以及在无血清培养基中生长的相关细胞系，或者缺乏dhfr的cho菌株dx
‑
b11。在一些实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)。
129.如本文所用的术语“免疫球蛋白”(缩写为“ig”)是指哺乳动物免疫球蛋白蛋白质，包括五种人抗体类别中的任一种：iga(其包括iga1和iga2亚类)、igd、ige、igg(其包括亚类igg1、igg2、igg3和igg4)和igm。所述术语还包括小于全长的免疫球蛋白，无论是完全或部分合成(例如，重组或化学合成)还是天然产生的，如抗原结合片段(fab)、含有v
h
和v
l
的可变片段(fv)、含有在一条链中连接在一起的v
h
和v
l
的单链可变片段(scfv)，以及其他抗体v区域片段，如fab'、f(ab)2、f(ab')2、dsfv双抗体、fc和fd多肽片段。双特异性抗体(同双特异性和异双特异性)包括在所述术语的含义内。
130.如本文所用的术语“免疫球蛋白超家族”或“igsf”意指参与细胞的识别、结合或粘附过程的细胞表面蛋白和可溶蛋白的组。基于与免疫球蛋白(即抗体)共有的结构特征将分子归类为此超家族的成员；其都具有称为免疫球蛋白结构域或折叠的结构域。igsf的成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共受体和共刺激分子、参与将抗原呈递给淋巴细胞的分子、细胞粘附分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白。其一般与免疫系统中的作用相关。免疫突触中的蛋白质通常是所述igsf的成员。还可以基于共有特性(如功能)将igsf分类为“亚家族”。所述亚家族通常由4至30个igsf成员组成。
131.如本文所用术语“igsf结构域”或“免疫球蛋白结构域”或“ig结构域”是指igsf蛋白的结构性结构域。ig结构域是根据免疫球蛋白分子来命名。其含有约70
‑
110个氨基酸并根据其大小和功能来归类。ig结构域具有特征性ig
‑
折叠，其具有由两条反平行β链形成的夹心样结构。在夹心结构内侧上的疏水氨基酸之间的相互作用和在b链和f链中的半胱氨酸残基之间形成的高度保守的二硫键稳定ig折叠。ig结构域的一个末端具有称为互补决定区的部分，它对抗体对其配体的特异性非常重要。可以将ig样结构域分类(为多个类别)为：igv、igc1、igc2或igi。大多数ig结构域是可变的(igv)或恒定的(igc)。具有9个β链的igv结构域通常长于具有7个β链的igc结构域。一些igsf成员的ig结构域的氨基酸序列与igv结构域相似，而大小与igc结构域相似。这些ig结构域称为igc2结构域，而标准igc结构域称为igc1结构域。t细胞受体(tcr)链含有细胞外部分中的两个ig结构域、n末端的一个igv结构域和与细胞膜相邻的一个igc1结构域。cd86含有两个ig结构域：igv和igc。
132.如本文所用术语“igsf种类”意指具有相同或基本上相同的一级氨基酸序列的igsf成员蛋白质的系综。每一哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)成员定义属于所述igsf成员的所有igsf种类的唯一身份。因此，每个igsf家族成员相对于其他igsf家族成员是唯一的，并且因此特定igsf家族成员的每一种类相对于另一igsf家族成员的种类是唯一的。然而，由于翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)中的差异，属于相同igsf种类的分子之间可能存在变异。另外，单一igsf种类内由于基因多态性所致的微小序列差异构成单一igsf种类内的另一变异形式，如由于例如蛋白水解切割所致的igsf种类的野生型截短形式。“细胞表面igsf种类”是在细胞(通常是哺乳动物细胞)的表
面上表达的igsf种类。
133.如本文在哺乳动物淋巴细胞(如t细胞)的情况下使用的术语“免疫活性”是指一种或多种细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生(例如，干扰素
‑
γ)或t细胞的细胞毒性活性。在一些情况下，免疫活性可以意指它们的细胞因子(如趋化因子或白介素)的表达。用于确定免疫活性的增强或抑制的测定包括测量培养上清液中的细胞因子水平(如干扰素
‑
γ或il
‑
2)的mlr(混合淋巴细胞反应)测定(wang等人,cancer immunol res.2014年9月2(9):846
‑
56)、seb(葡萄球菌肠毒素b)t细胞刺激测定(wang等人,cancer immunol res.2014年9月:2(9):846
‑
56)和抗cd3 t细胞刺激测定(li和kurlander,j transl med.2010:8:104)。由于t细胞激活与细胞因子(如ifn
‑
γ或il
‑
2细胞因子)的分泌相关，因此检测来自这些体外人t细胞测定的培养上清液中的ifn
‑
γ水平可以使用商业elisa试剂盒来测定(wu等人,immunol lett 2008年4月15日；117(1):57
‑
62)。免疫应答的诱导导致免疫活性相对于静止淋巴细胞增加。如本文提供的免疫调节蛋白，如含有亲和力修饰的igsf结构域的变体cd86多肽在一些实施方案中可以在原代t细胞测定中相对于野生型igsf成员或igsf结构域对照增加，或者在替代实施方案中减少ifn
‑
γ(干扰素
‑
γ)或il
‑
2表达。本领域技术人员将认识到，用于确定ifn
‑
γ或il
‑
2表达增加的原代t细胞测定的形式将不同于用于测定ifn
‑
γ或il
‑
2表达减少的形式。在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的igsf结构域在原代t细胞测定中减少ifn
‑
γ或il
‑
2表达的能力时，可以使用混合淋巴细胞反应(mlr)测定。方便地，本发明的可溶形式的亲和力修饰的igsf结构域可以同样用于在mlr中确定其拮抗并从而减少ifn
‑
γ或il
‑
2表达的能力。可替代地，在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的igsf结构域在原代t细胞测定中增加ifn
‑
γ或il
‑
2表达的能力时，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中通过抗cd3抗体提供的t细胞受体信号与共固定化亲和力修饰的igsf结构域(如变体cd86)联合使用，以测定相对于野生型igsf结构域对照增加ifn
‑
γ或il
‑
2表达的能力。测定工程化细胞的免疫活性的方法，包括评估变体cd86跨膜免疫调节蛋白的活性的方法，是本领域已知的，并且该活性包括但不限于在抗原刺激后扩增t细胞的能力，在不存在再刺激的情况下维持t细胞扩增的能力，以及在适当的动物模型中维持抗癌活性的能力。测定还包括用于评估细胞毒性的测定，包括标准
51
cr释放测定(参见例如，milone等人,(2009)molecular therapy 17:1453
‑
1464)或基于流动的细胞毒性测定，或者基于阻抗的细胞毒性测定(peper等人(2014)journal of immunological methods,405:192
‑
198)。
[0134]“免疫调节多肽”或“免疫调节蛋白”是调节免疫活性的多肽或蛋白质分子。“调节(modulation)”或“调节(modulating)”免疫应答意味着增加或降低免疫活性。免疫调节蛋白可以是单一多肽链或通过例如链间二硫键相互共价键合的至少两条多肽链的多聚体(二聚体或更高级多聚体)。因此，单体、二聚和更高级多聚多肽在所定义的术语范围内。多聚体多肽可以是同型多聚体(相同多肽链)或异多聚体(非相同多肽链)。本文的免疫调节蛋白包含变体cd86多肽。
[0135]
如本文所用术语“增加”意指增加统计学上显著的量。增加可以是比非零对照值大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更大。
[0136]
cd86的“同种型”是氨基酸序列不同的多种天然存在的cd86多肽之一。同种型可以是由单一基因表达的rna转录物的剪接变体的产物，或高度相似但不同的基因的表达产物，
从而产生功能相似的蛋白质，如在基因重复中可能发生的。如本文所用术语cd86的“同种型”也指代cd86基因的不同等位基因的产物。
[0137]
术语“标记”是指化合物或组合物，其可以直接或间接地附接或连接以提供可检测信号，或者可以与第二标记相互作用以修饰可检测信号。标记可以与多肽直接或间接缀合以生成标记的多肽。标记可以是自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化底物化合物组合物的化学改变，所述化学改变是可检测的。标记的非限制性例子包括荧光部分、绿色荧光蛋白或萤光素酶。
[0138]
如本文所用术语“淋巴细胞”意指哺乳动物免疫系统中白细胞的三种亚型中的任一种。其包括自然杀伤细胞(nk细胞)(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)、t细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和b细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。t细胞包括：t辅助细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、记忆t细胞、调节t细胞或γδt细胞。先天淋巴样细胞(ilc)也包括在淋巴细胞的定义中。
[0139]
术语“哺乳动物”或“患者”具体包括提及以下中的至少一种：人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、犬、猫、小鼠或大鼠。
[0140]
如本文所用术语“膜蛋白”意指在生理条件下直接或间接附接至脂质双层的蛋白质。形成膜的脂质双层可以是生物膜，例如真核(例如哺乳动物)细胞膜或人工(即人造)膜，例如在脂质体上发现的膜。膜蛋白附接至脂质双层可借助共价附接或借助非共价相互作用(例如疏水或静电相互作用)来实现。膜蛋白可以是膜内在蛋白或外周膜蛋白。是外周膜蛋白的膜蛋白非共价附接至脂质双层或非共价附接至膜内在蛋白。外周膜蛋白形成与脂质双层的临时附接，使得在哺乳动物生理条件的范围内，外周膜蛋白可以与脂质双层缔合和/或解离。与外周膜蛋白相反，整合膜蛋白形成与膜脂质双层基本永久性附接，使得在哺乳动物生理条件的范围内，整合膜蛋白不从它们与脂质双层的附接中解离。膜蛋白可借助脂质双层的一层形成与膜的附接(单面)，或借助膜的两层附接(多面)。仅与一个脂质双层相互作用的膜内在蛋白是“内在单面蛋白”。与两个脂质双层相互作用的膜内在蛋白是“内在多面蛋白”，可替代地在本文中称为“跨膜蛋白”。
[0141]
本文在免疫应答(如哺乳动物免疫应答)的上下文中使用的术语“调节”(“modulating”或“modulate”)是指由于施用包含本发明的变体cd86的免疫调节多肽或由于施用表达免疫调节蛋白(如本发明的变体cd86跨膜免疫调节蛋白)的工程化细胞而发生的现有或潜在的免疫应答的任何改变，如增加或减少。因此，它指的是与在不施用包含变体cd86的免疫调节蛋白的情况下发生或存在的免疫应答相比，免疫应答的改变，如增加或减少。这种调节包括免疫细胞免疫活性的程度或范围的任何诱导、激活、抑制或改变。免疫细胞包括b细胞、t细胞、nk(自然杀伤)细胞、nk t细胞、专职性抗原呈递细胞(apc)、非专职性抗原呈递细胞，以及炎性细胞(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。调节包括赋予现有免疫应答、发展中的免疫应答、潜在免疫应答或诱导、调节、影响或响应免疫应答的能力的任何变化。调节包括作为免疫应答的一部分的免疫细胞中基因、蛋白质和/或其他分子的表达和/或功能的任何改变。免疫应答的调节或免疫活性的调节包括例如以下内容：免疫细胞的消除、缺失或隔离；可调节其他细胞如自身反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞或炎性细胞的功能能力的免疫细胞的诱导或生成；在免疫细胞中诱导无反应状态(即无反应性)；增强或抑制免疫细胞的活性或功能，包括但不限于改变由这些细
胞表达的蛋白质的模式。例子包括某些类别的分子如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子或其他细胞表面受体的改变的产生和/或分泌，或这些调节事件的任何组合。可以例如通过相对于原代t细胞测定中的野生型或未经修饰的cd86对照的ifn
‑
γ(干扰素γ)或il
‑
2表达的改变来评估调节(参见，zhao和ji,exp cell res.2016年1月1日340(1)132
‑
138)。例如，可以通过工程化细胞的免疫活性的改变来评估调节，如相对于用野生型cd86跨膜蛋白工程化的细胞，工程化细胞的细胞毒性活性的改变或工程化细胞的细胞因子分泌的改变。
[0142]
术语“多聚化结构域”是指促进多肽分子与一种或多种另外的多肽分子的稳定相互作用的氨基酸序列，所述多肽分子各自含有互补多聚化结构域(例如，第一多聚化结构域和第二多聚化结构域)，所述多聚化结构域可以是相同的或不同的多聚化结构域。互补多聚化结构域之间的相互作用(例如，第一多聚化结构域与第二多聚化结构域之间的相互作用)形成稳定的蛋白质
‑
蛋白质相互作用，以产生多肽分子与另外的多肽分子的多聚体。在一些情况下，多聚化结构域是相同的并且与自身相互作用，以在两条多肽链之间形成稳定的蛋白质
‑
蛋白质相互作用。通常，多肽直接或间接地与多聚化结构域接合。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区和相容的蛋白质间相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，例如来自igg(包括igg1、igg2、igg3或igg4亚型)、iga、ige、igd、igm及其修饰形式的fc结构域或其部分。
[0143]
术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用，是指呈单链或双链形式的核酸残基(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，并且所述类似物具有与天然核苷酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有指示，否则特定核酸序列还暗示涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补核苷酸序列以及明确指示的序列(“参考序列”)。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。术语核酸或多核苷酸涵盖基因编码的cdna或mrna。
[0144]
如本文所用的术语“分子种类”意指具有相同或基本相同的一级氨基酸序列的蛋白质的系综。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)成员定义相同或基本相同的分子种类的集合。因此，例如，人cd86是igsf成员并且每个人cd86分子是cd86的分子种类。属于相同分子种类的分子之间的变异可以由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)中的差异而发生。另外，由于基因多态性导致的单个分子种类内的微小序列差异构成单个分子种类内的另一种变异形式，如由于例如蛋白水解切割导致的野生型截短形式的单个分子种类。“细胞表面分子种类”是在哺乳动物细胞上表达的分子种类。将两个或更多个不同种类的蛋白质称为彼此呈“顺式”或“顺式构型”，其中每一种类仅存在于形成is的两个哺乳动物细胞的一个细胞上或仅存在于另一(但不是两个)细胞上。如果两个不同种类的蛋白质中的第一种类仅存在于形成is的两个哺乳动物细胞的一个细胞上，并且其中的第二种类仅存在于形成is的两个哺乳动物细胞的第二个细胞上，那么将所述种类的蛋白质称为彼此呈“反式”或“反式构型”。在形成is的两个哺乳动物细胞上存在的两个不同种类的蛋白质在这些细胞上同时呈顺式和反式构型。
[0145]
如本文所用术语“非竞争性结合”意指蛋白质同时与至少两种同源结合配偶体特
异性结合的能力。因此，蛋白质能够同时与至少两种不同的同源结合配偶体结合，但结合相互作用不需要持续相同的持续时间，使得在一些情况下，所述蛋白质仅与所述同源结合配偶体中的一种特异性结合。在一些实施方案中，结合发生在特定结合条件下。在一些实施方案中，同时结合使得一种同源结合配偶体的结合不会显著抑制与第二同源结合配偶体的同时结合。在一些实施方案中，非竞争性结合意指将第二同源结合配偶体与其在蛋白质上的结合位点结合不会取代第一同源结合配偶体与其在蛋白质上的结合位点的结合。评估非竞争性结合的方法是本领域公知的，如perez de la lastra等人,immunology,1999年4月:96(4):663
‑
670中描述的方法。在一些情况下，在非竞争性相互作用中，第一同源结合配偶体在不与第二同源结合配偶体的相互作用位点重叠的相互作用位点处特异性地结合，使得第二同源结合配偶体的结合不直接干扰第一同源结合配偶体的结合。因此，第二同源结合配偶体的结合对同源结合配偶体的结合的任何影响是通过除了直接干扰第一同源结合配偶体的结合以外的机制来实现。例如，在酶
‑
底物相互作用的情况下，非竞争性抑制剂与酶的活性位点以外的位点结合。非竞争性结合涵盖非竞争性结合相互作用，其中第二同源结合配偶体在与第一同源结合配偶体的结合不重叠的相互作用位点处特异性地结合，但仅在第一相互作用位点被第一同源结合配偶体占据时才与第二相互作用位点结合。
[0146]
术语“药物组合物”是指适用于哺乳动物受试者(通常为人)中的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，包含变体cd86的免疫调节多肽或表达变体cd86跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0147]
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的分子链。所述术语并非是指特定长度的产物。因此，“肽”和“寡肽”包括于多肽的定义内。所述术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。所述术语还包括这样的分子，其中一种或多种氨基酸是可以合成或使用已知蛋白质工程化技术重组表达的氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸。此外，可以对蛋白质进行衍生化。
[0148]
如本文所用的术语“原代t细胞测定”是指测量t细胞活性，如细胞因子(例如干扰素
‑
γ(“ifn
‑
γ”)、il
‑
2)产生或肿瘤坏死因子α(tnfα)表达的体外测定。多种此类原代t细胞测定是本领域已知的。在一些实施方案中，使用的测定是抗cd3共固定化测定。在此测定中，原代t细胞是通过用或不用其他重组蛋白固定的抗cd3刺激。在通常24
‑
72小时的时间点收获培养上清液。在另一实施方案中，所用测定是混合淋巴细胞反应(mlr)。在此测定中，原代t细胞是用同种异体apc模拟。在通常24
‑
72小时的时间点收获培养上清液。通过标准elisa技术在培养上清液中测量细胞因子水平，如ifn
‑
γ、il
‑
2或tnfα的水平。商业试剂盒可从供应商获得，并且根据制造商的推荐进行所述测定。
[0149]
如应用于核酸(如编码本发明的免疫调节蛋白的核酸)的术语“纯化的”通常表示如通过本领域熟知的分析技术所确定基本上不含其他组分的核酸或多肽(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散谱带)。例如，在电泳凝胶中基本上产生一个条带的核酸或多肽是“纯化的”。本发明的纯化的核酸或蛋白质纯度为至少约50％纯，通常至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％或更高的纯度(例如，重量或摩尔百分比)。
[0150]
术语“重组”表明，材料(例如，核酸或多肽)已通过人为干预发生人工(即非天然)
改变。可以对在其自然环境或状态内的材料进行改变或从其自然环境或状态取出的材料进行改变。例如，“重组核酸”通过例如在克隆、亲和力修饰、dna改组或其他公知的分子生物学过程中重组核酸来制备。“重组dna分子”是由借助此类分子生物学技术接合在一起的dna区段构成。如本文所用术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组dna分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸或通过基因工程化以其他方式改变的细胞，如通过向细胞中引入编码重组蛋白(如本文提供的跨膜免疫调节蛋白)的核酸分子。真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由dna序列的短阵列组成，所述序列与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用。已经从多种真核来源分离出启动子和增强子元件，所述来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞以及病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达所关注蛋白质的细胞类型。如本文所用的术语“可操作组合”、“以可操作顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列以产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子的方式或定向来连接核酸序列。
[0151]
如本文所用的术语“重组表达载体”是指dna分子，其含有所需编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所需的适当核酸序列。在原核生物中表达所需的核酸序列包括启动子、任选地操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由重组表达载体编码，所述重组表达载体与重组蛋白如重组融合蛋白的编码序列可操作地连接，使得表达的融合蛋白可以由重组宿主细胞分泌，以更容易地从细胞中分离融合蛋白(如果需要的话)。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。所述载体包括病毒载体，如慢病毒载体。
[0152]
术语“选择性”是指与对另一种底物(如主题蛋白质的不同同源结合配偶体)的特异性结合相比，主题蛋白质或多肽对一种底物(如一种同源结合配偶体)的特异性结合的偏好。选择性可以反映为主题蛋白质对第一底物(如第一同源结合配偶体)的结合活性(例如，结合亲和力)(例如，k
d1
)与相同主题蛋白质对第二同源结合配偶体的结合活性(例如，结合亲和力)(例如，k
d2
)的比率。
[0153]
如本文所用术语“序列同一性”是指基因或蛋白质之间分别在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。“序列同一性”是在氨基酸水平上的蛋白质之间的同一性的量度和在核苷酸水平上的核酸之间的同一性的量度。蛋白质序列同一性可通过比较在比对序列时每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定。类似地，核酸序列同一性可通过比较在比对序列时每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定。用于比对序列以供比较的方法是本领域所熟知的，此类方法包括gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。blast算法计算序列同一性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计学分析。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)网站公开获得。
[0154]
如本文关于蛋白质使用的术语“可溶的”意指所述蛋白质不是膜蛋白。通常，可溶蛋白质仅含有igsf家族成员受体的细胞外结构域或其含有一个或多个igsf结构域或其特异性结合片段的部分，但不含跨膜结构域。在一些情况下，蛋白质的溶解性可以通过直接或间接地经由接头与fc结构域连接或附接来改善，在一些情况下，fc结构域也可以改善蛋白质的稳定性和/或半衰期。在一些方面，可溶蛋白质是fc融合蛋白。
[0155]
如本文关于多肽或核酸使用的术语“种类”意指具有相同或基本相同的序列的分子的系综。由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异，可能发生具有相同种类的多肽之间的变异。在氨基末端或羧基末端与全长种类相差(或编码相差)不超过1、2或3个氨基酸残基的略微截短的多肽序列被认为是单一种类。此类微观不均一性是制造蛋白质的共有特征。
[0156]
如本文所用的关于全长野生型哺乳动物cd86多肽或其ecd、igv或igc结构域的术语“特异性结合片段”意指具有ecd、igv和/或igc结构域的子序列，并且在体外和/或体内与哺乳动物cd28和/或哺乳动物ctla
‑
4(如人或鼠cd28和/或ctla
‑
4)特异性结合的多肽。在一些实施方案中，cd86 ecd、cd86 igv或cd86 igc的特异性结合片段为全长野生型ecd、igv或igc序列的序列长度的至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。特异性结合片段的序列可以改变以形成变体cd86。
[0157]
本文所用的术语“特异性结合”意指蛋白质的如下的能力：在特定结合条件下与靶蛋白结合，使得其亲和力或亲合力是相同蛋白质对足够统计学大小的随机肽或多肽的集合的平均亲和力或亲合力的至少5倍，但任选地至少10、20、30、40、50、100、250或500倍，或甚至至少1000倍。特异性结合蛋白不需要专一地与单个靶分子结合，但由于靶标与非靶标(例如，旁系同源物或直系同源物)之间的结构构象的相似性，可以特异性结合非靶分子。本领域技术人员将认识到，与在不同动物物种中具有相同功能的分子(即直系同源物)特异性结合或与具有与靶分子基本相似的表位的非靶分子(例如，旁系同源物)的特异性结合是可能的，并且不会降低相对于统计学上有效的一系列独特非靶标(例如随机多肽)确定的结合特异性。由于交叉反应性，因此本发明的多肽可以与多于一种的不同种类的靶分子特异性结合。可以使用固相elisa免疫测定或表面等离子共振(例如，biacore)测量来确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常，两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数(k
d
)小于1x10
‑5m，并且通常低至1x10
‑
12
m。在本公开文本的某些实施方案中，两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数为1x10
‑6m、1x10
‑7m、1x10
‑8m、1x10
‑9m、1x10
‑
10
m或1x10
‑
11
m。
[0158]
关于表达多肽的哺乳动物细胞的术语“表面表达(surface expresses)”或“表面表达(surface expression)”意指多肽作为膜蛋白来表达。在一些实施方案中，膜蛋白是跨膜蛋白。
[0159]
如本文所用，关于例如合成核酸分子或合成基因或合成肽的“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
[0160]
如本文所用的术语“靶向部分”是指共价或非共价附接至或物理包封包含变体cd86的多肽的组合物。所述靶向部分对所需的反结构(如细胞表面受体(例如cd28)或肿瘤抗原如肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)如b7
‑
h6)具有特异性结合亲和力。通常，所需的反结构位于特定组织或细胞类型上。靶向部分包括：抗体、抗原结合片段(fab)、含有v
h
和v
l
的可变片段(fv)、含有在一条链中连接在一起的v
h
和v
l
的单链可变片段(scfv)，以及其他抗体v区域片段，如fab'、f(ab)2、f(ab')2、dsfv双抗体、纳米抗体、可溶性受体、受体配体、亲和力成熟受体或配体，以及小分子(<500道尔顿)组合物(例如，特异性结合受体组合物)。靶向部分也可以共价或非共价附接至包封本发明多肽的脂质体的脂质膜。
[0161]
如本文所用的术语“跨膜蛋白”意指基本上或完全跨越脂质双层的膜蛋白，所述脂质双层如在生物膜(如哺乳动物细胞)中或在人工构建体(如脂质体)中发现的那些脂质双
id no:123中所示的序列的相应野生型或未经修饰的cd86的至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
[0165]
非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸包括在可允许的取代或添加的范围内。变体cd86不限于任何特定的制备方法，并且包括例如从头化学合成、从头重组dna技术或其组合。本发明的变体cd86特异性地结合至哺乳动物物种的cd28和/或ctla
‑
4中的至少一种或多种。在一些实施方案中，与未经修饰的或野生型cd86蛋白相比，改变的氨基酸序列导致对cd28和/或ctla
‑
4的结合亲和力或亲合力改变(即，增加或降低)。结合亲和力或亲合力的增加或降低可以使用熟知的结合测定(如流式细胞术)来确定。larsen等人,american journal of transplantation,第5卷:443
‑
453(2005)。还参见，linsley等人,immunity,第1卷(9):793
‑
801(1994)。变体cd86对cd28和/或ctla
‑
4的结合亲和力或亲合力的增加可以是比未经修饰的或野生型cd86的结合亲和力或亲合力大至少5％的值，并且在一些实施方案中，比未经修饰的或野生型cd86对照值的结合亲和力或亲合力大至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、100％。cd86对cd28和/或ctla
‑
4的结合亲和力或亲合力的降低是到不大于未经修饰的或野生型cd86对照值的95％的值，并且在一些实施方案中，不大于未经修饰的或野生型cd86对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或不可检测的结合亲和力或亲合力。在一些实施方案中，结合亲和力或亲合力无变化被视为在变体cd86的结合亲和力或亲合力与未经修饰的或野生型cd86的结合亲和力或亲合力之间缺乏显著差异。在一些实施方案中，结合亲和力或亲合力可以针对一种同源结合配偶体而改变，且针对另一同源结合配偶体不变。例如，与野生型或未经修饰的cd86分子的结合亲和力或亲合力相比，变体cd86可以展现对cd28增加的结合亲和力或亲合力，显示出对ctla
‑
4无变化的结合亲和力或亲合力。在一些实施方案中，结合亲和力或亲合力可以针对两种同源结合配偶体而改变。在一些实施方案中，所述改变是在相同的方向上(例如，二者都增加或降低)。在一些实施方案中，所述改变是在不同的方向上(例如，对于一种同源结合配偶体增加，而对于另一种同源结合配偶体降低)。例如，与野生型或未经修饰的cd86分子的结合亲和力或亲合力相比，变体cd86可以展现对cd28增加的结合亲和力或亲合力，显示出对ctla
‑
4降低的结合亲和力或亲合力。在一些实施方案中，cd86变体或野生型或未经修饰的多肽结合至cd28和/或ctla
‑
4的胞外结构域。因此，在一些实施方案中，亲和力和亲合力是基于cd86变体或野生型或未经修饰的多肽与cd28和/或ctla
‑
4的胞外结构域的结合来确定。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变变体cd86多肽的一级氨基酸序列。在变体cd86多肽的情况下，术语“变体”被认为不会对产生变体cd86的任何特定的起始组合物或方法强加任何条件。例如，变体cd86可以从野生型哺乳动物cd86序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与cd28和/或ctla
‑
4的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生变体cd86。在一个替代例子中，变体cd86可以通过未经修饰的或野生型cd86的定点诱变产生。因此，变体cd86表示组合物，并且不必是由任何给定方法产生的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
[0166]
如本文所用的术语“野生型”或“天然的(natural)”或“天然的(native)”是与生物材料(如核酸分子、蛋白质(例如，cd86)、igsf成员、宿主细胞等)结合使用，是指在自然界中发现的并且没有被人为干预修饰的那些生物材料。
ii.变体cd86多肽
[0167]
本文提供了变体cd86多肽，其展现对一种或多种cd86同源结合配偶体改变(增加或降低)的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，所述cd86同源结合配偶体是cd28或ctla
‑
4。在一些实施方案中，所述cd86同源结合配偶体是cd28。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽或含有igd或其特异性结合片段的野生型或未经修饰的cd86的一部分，变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰，如免疫球蛋白超家族(igsf)结构域(igd)中的一个或多个取代(或者，“突变”或“替代”)、缺失或添加。因此，所提供的变体cd86多肽是或包含变体igd(下文称为“vigd”)，其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于igd中。
[0168]
在一些实施方案中，相对于未经修饰的cd86序列的序列，在一个或多个igsf结构域中修饰变体。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86序列是野生型cd86。在一些实施方案中，所述未经修饰的或野生型cd86具有天然cd86或其直系同源物的序列。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86是或包含cd86的细胞外结构域(ecd)或其含有igv结构域的部分(参见表2)。在一些实施方案中，所述变体cd86是或含有cd86的细胞外结构域(ecd)或其包含igv结构域的部分。在一些实施方案中，所述未经修饰的或野生型cd86多肽含有igv结构域或其特异性结合片段。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有igv结构域或其特异性结合片段。在一些实施方案中，所述变体cd86是可溶的并且缺少跨膜结构域。在一些实施方案中，所述变体cd86还包含跨膜结构域，并且在一些情况下，还包含胞质结构域。
[0169]
在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86序列是哺乳动物cd86序列。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86序列可以是哺乳动物cd86，所述哺乳动物包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86序列是人的。
[0170]
在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86序列具有(i)seq id no:2所示的氨基酸序列或其缺乏信号序列的成熟形式，(ii)展现与seq id no:2至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列或其成熟形式，或(iii)是(i)或(ii)的含有igv结构域或其特异性结合片段的一部分。
[0171]
在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86序列是或包含细胞外结构域或其含有cd86的igv或其特异性结合片段的部分。在一些实施方案中，所述未经修饰的或野生型cd86多肽包含seq id no:29、122或123中所示的氨基酸序列或其直系同源物。在一些情况下，所述未经修饰的或野生型cd86多肽可以包含(i)seq id no:29、122或123中所示的氨基酸序列；(ii)具有与seq id no:29、122或123至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的序列的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86多肽包含seq id no:29中所示的氨基酸序列(对应于seq id no:2的氨基酸残基24
‑
247)或其直系同源物。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86多肽包含seq id no:122中所示的氨基酸序列(对应于seq id no:2的氨基酸残基33
‑
131)或其直系同源物。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86多肽包含seq id no:123中所示的氨基酸序列(对应于seq id no:2的氨基酸残基24
‑
134)或其直系同源物。在一些实施方案中，含有igv
结构域或其特异性结合片段的野生型或未经修饰的cd86能够结合一种或多种cd86同源结合蛋白，如cd28或ctla
‑
4中的一种或多种。
[0172]
在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86多肽含有cd86的特异性结合片段，如igv结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述特异性结合片段可以结合cd28和/或ctla
‑
4。在一些实施方案中，所述特异性结合片段可以结合cd28和/或ctla
‑
4的胞外结构域。所述特异性结合片段可以具有至少50个氨基酸，如至少60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210或220个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，所述igv结构域的特异性结合片段含有如下氨基酸序列，其为seq id no:2的氨基酸33
‑
131所示的igv结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
[0173]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含细胞外结构域或其包含一个或多个亲和力修饰的igsf结构域的部分。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽可以包含igv结构域或igv结构域的特异性结合片段，其中igsf结构域含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含全长igv结构域。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含igv结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含全长细胞外结构域(ecd)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含ecd结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含ecd结构域的特异性结合片段，所述特异性结合片段包含全长igv结构域。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含ecd结构域的特异性结合片段，所述特异性结合片段包含igv结构域的特异性结合片段。
[0174]
通常，多肽的各种属性中的每一种在下面单独公开(例如，可溶性且膜结合的多肽，cd86对cd28和ctla
‑
4的亲和力，每条多肽链的变异数，连接的多肽链的数量，每种变体cd86的氨基酸改变的数量和性质等)。然而，如本领域技术人员所清楚的，任何特定多肽可包含这些独立属性的组合。应理解，提及氨基酸，包括提及用于描述igsf结构域的结构域组织的如seq id no所示的具体序列，是出于说明性目的，并不欲限制所提供实施方案的范围。应理解，多肽和对其结构域的描述在理论上是基于与相似分子的同源性分析和比对而导出的。因此，确切基因座可变，并且每一种蛋白质不一定相同。因此，特定igsf结构域(如特定igv结构域)可以更长或更短，相差若干个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。
[0175]
此外，如下文所讨论的本发明的各个实施方案通常在如上文所公开的定义术语的含义内提供。因此，当使用所定义的术语讨论本文所述的各个方面和属性时，以特定定义描述的实施方案将被解释为通过引用并入。因此，标题、描述各个方面和实施方案的顺序以及每个独立属性的单独公开不意味着限制本公开的范围。a.示例性修饰
[0176]
本文提供了相对于野生型或未经修饰的cd86多肽中包含的igsf结构域而言含有至少一个亲和力修饰的igsf结构域(例如igv)或其特异性结合片段的变体cd86多肽，使得与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，变体cd86多肽展现对一种或多种配体cd28或ctla
‑
4改变(增加或降低)的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，变体cd86多肽对cd28和/或ctla
‑
4的结合亲和力不同于野生型或未经修饰的cd86多肽对照序列的结合亲和力，如通过例如固相elisa免疫测定、流式细胞术、fortebio octet或biacore测定所测定的。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，所述变体cd86多肽具有对cd28增加的结
合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，所述变体cd86多肽具有对ctla
‑
4降低的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，所述变体cd86多肽展现对ctla
‑
4无变化的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，所述变体cd86多肽展现对ctla
‑
4没有增加的结合亲和力。所述cd28和/或ctla
‑
4可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。在一些实施方案中，所述变体、野生型和未经修饰的cd86多肽结合至cd28和/或ctla
‑
4的胞外结构域。因此，在一些实施方案中，关于所述变体、野生型和未经修饰的cd86多肽与cd28和/或ctla
‑
4的胞外结构域的结合，确定亲和力或结合活性。
[0177]
对每种同源结合配偶体的结合亲和力是独立的；也就是说，在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，变体cd86多肽具有对cd28而非ctla
‑
4增加的结合亲和力。
[0178]
在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，所述变体cd86多肽具有对cd28增加的结合亲和力，并且相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，具有对ctla
‑
4降低的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，所述变体cd86多肽具有对cd28增加的结合亲和力，并且相对于野生型或未经修饰的cd86多肽，具有对ctla
‑
4无变化的结合亲和力。
[0179]
在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽对照，对cd28具有增加或更高的结合亲和力的变体cd86多肽将具有对cd28的结合亲和力的至少约5％(如至少约10％、15％、20％、25％、35％或50％)增加。在一些实施方案中，结合亲和力相对于野生型或未经修饰的cd86多肽的增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、225倍、250倍、275倍、300倍、325倍、350倍、375倍或400倍。在此类例子中，所述野生型或未经修饰的cd86多肽具有与变体cd86多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
[0180]
在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽对照，对ctla
‑
4具有减小或降低的结合亲和力的变体cd86多肽将具有对ctla
‑
4的结合亲和力的至少5％(如至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)降低。在一些实施方案中，结合亲和力相对于野生型或未经修饰的cd86多肽的降低超过1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽对照，所述变体cd86多肽未显示出对ctla
‑
4的结合亲和力的变化。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86多肽对照，所述变体cd86多肽未显示出对ctla
‑
4的结合亲和力的增加。在此类例子中，所述野生型或未经修饰的cd86多肽具有与变体cd86多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
[0181]
在一些实施方案中，任何前述实施方案的对cd28和/或ctla
‑
4的平衡解离常数(k
d
)可以小于1x10
‑5m、1x10
‑6m、1x10
‑7m、1x10
‑8m、1x10
‑9m、1x10
‑
10
m或1x10
‑
11
m或1x10
‑
12
m或更小。
[0182]
所述野生型或未经修饰的cd86序列不一定必须用作起始组合物以产生本文所述的变体cd86多肽。因此，术语“修饰”，如“取代”的使用并不意味着所提供的实施方案限于制
备变体cd86多肽的特定方法。变体cd86多肽可以例如通过从头肽合成来制备，因此不一定需要在改变密码子来为修饰例如取代进行编码的意义上进行修饰，如“取代”。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定制备方法。设计或产生变体cd86多肽的手段并不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，由野生型或未经修饰的cd86遗传物质诱变野生型或未经修饰的cd86编码核酸，并针对所希望的特异性结合亲和力和/或ifn
‑
γ表达的诱导或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中，使用可在很多公共可获得的数据库中获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体cd86多肽，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息，并且其网站可经由互联网公开访问，uniprotkb数据库也是如此。
[0183]
除非另外陈述，否则如本公开文本通篇所指示，一个或多个氨基酸修饰是依据对应于如下的seq id no:29中所示的未经修饰的ecd序列的位置编号的氨基酸位置编号来命名：aplkiqayfnetadlpcqfansqnqslselvvfwqdqenlvlnevylgkekfdsvhskymgrtsfdsdswtlrlhnlqikdkglyqciihhkkptgmirihqmnselsvlanfsqpeivpisnitenvyinltcssihgypepkkmsvllrtknstieydgvmqksqdnvtelydvsislsvsfpdvtsnmtifciletdktrllsspfsieledpqpppdhip(seq id no:29)
[0184]
本文提供的修饰可以位于seq id no:29中所示的野生型或未经修饰的cd86多肽中或其含有igv结构域或其特异性结合片段的部分中。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的cd86多肽含有如seq id no:122中所示的cd86的igv。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86多肽含有这样的igv，所述igv可以是长于或短于seq id no:122中所示的igv序列，相差若干个氨基酸，如1
‑
20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86多肽与seq id no:29、122或123或其特异性结合片段具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。在一些实施方案中，所述未经修饰的cd86多肽具有seq id no:29、122和123中任一个中所示的序列。netadlpcqfansqnqslselvvfwqdqenlvlnevylgkekfdsvhskymgrtsfdsdswtlrlhnlqikdkglyqciihhkkptgmirihqmnsels(seq id no:122)aplkiqayfnetadlpcqfansqnqslselvvfwqdqenlvlnevylgkekfdsvhskymgrtsfdsdswtlrlhnlqikdkglyqciihhkkptgmirihqmnselsvla(seq id no:123)
[0185]
如通过参考序列与seq id no:29的比对来鉴定cd86多肽(包括其含有igv结构域的部分)中修饰(例如，氨基酸取代)的相应位置在技术人员的水平内。含有野生型cd86的残基24
‑
247的seq id no:29与含有野生型cd86的残基33
‑
131的seq id no:122的示例性比对在图3中示出。在整个本公开文本的修饰列表中，氨基酸位置在中间表示，在编号之前列出相应的未经修饰的(例如野生型)氨基酸，并且在编号后列出所鉴定的变体氨基酸取代。如果修饰是位置的缺失，那么指示“del”，并且如果修饰是在位置的插入，那么指示“ins”。在一些情况下，插入与在中间指示的氨基酸位置一起列示，且相应的未经修饰(例如，野生型)的氨基酸列示于编号之前和之后，并且所鉴别的变体氨基酸插入列示于未经修饰(例如，野生型)的氨基酸之后。
[0186]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽在野生型或未经修饰的cd86序列中具有一
个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)可以在野生型或未经修饰的cd86序列的胞外结构域(细胞外结构域；ecd)中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于igv结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于igc结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于ecd或其特异性结合片段中。
[0187]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如取代)。所述修饰(例如取代)可以位于igv结构域中。在一些实施方案中，所述修饰位于ecd中。在一些实施方案中，所述修饰位于ecd和igv结构域中。在一些实施方案中，所述修饰位于igv结构域中。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽在igv结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽在ecd或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽与野生型或未经修饰的cd86多肽或其特异性结合片段(如与seq id no:29、122或123的氨基酸序列)具有少于100％序列同一性以及至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0188]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽在未经修饰的cd86或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，所述一个或多个氨基酸修饰对应于以下中的关于seq id no:29中所示位置的一个或多个位置：13、18、25、28、33、38、39、40、43、45、52、53、60、68、71、77、79、80、82、86、88、89、90、92、93、97、102、104、113、114、123、128、129、132、133、137、141、143、144、148、153、154、158、170、172、175、178、180、181、183、185、192、193、196、197、198、205、206、207、212、215、216、222、223或224。在一些实施方案中，位置224处的修饰是缺失。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，此类变体cd86多肽展现对cd28和/或ctla
‑
4中的一种或多种的改变的结合亲和力。例如，在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，所述变体cd86多肽展现对cd28增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，所述变体cd86多肽展现对ctla
‑
4降低的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，所述变体cd86多肽未展现对ctla
‑
4的结合亲和力的任何变化。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，所述变体cd86多肽未展现对ctla
‑
4结合亲和力的增加。
[0189]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：a13v、q18k、q25l、s28g、f33i、e38v、n39d、l40m、l40s、n43k、v45i、f52l、d53g、m60k、d68n、t71a、l77p、i79n、k80e、k80m、k80r、k82t、q86k、q86r、i88f、i88t、i89v、h90 l、h90y、k92i、k93t、m97l、q102h、n104s,f113s、s114g、n123d、v128a、y129n、l132m、t133a、i137t、p141a、p143h、k144e、v148d、k153e、k153r、n154d、e158g、v170d、e172g、d175e、i178t、l180s、s181p、s183p、p185s、t192n、i193v、i196v、l197m、e198d、l205s、s206t、s207p、e212v、d215v、p216h、h222t或i223f、或其保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是与取代的氨基酸(而不是野生型或未经修饰的氨基酸)属于同一类氨基酸的任何氨基酸。氨基酸的种类是脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、羟基或含硫(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)、环状(脯氨酸)、芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性(组氨酸、赖氨酸和精氨
酸)和酸性/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。
[0190]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽具有选自以下的两个或更多个氨基酸取代：a13v、q18k、q25l、s28g、f33i、e38v、n39d、l40m、l40s、n43k、v45i、f52l、d53g、m60k、d68n、t71a、l77p、i79n、k80e、k80m、k80r、k82t、q86k、q86r、i88f、i88t、i89v、h90 l、h90y、k92i、k93t、m97l、q102h、n104s,f113s、s114g、n123d、v128a、y129n、l132m、t133a、i137t、p141a、p143h、k144e、v148d、k153e、k153r、n154d、e158g、v170d、e172g、d175e、i178t、l180s、s181p、s183p、p185s、t192n、i193v、i196v、l197m、e198d、l205s、s206t、s207p、e212v、d215v、p216h、h222t或i223f、或其保守氨基酸取代。
[0191]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽在对应于选自以下的关于seq id no:29中所示位置的一个或多个位置的位置处含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：13、18、25、28、33、38、39、40、43、45、52、53、60、68、71、77、79、80、82、86、88、89、90、92、93、97、102、104、113、114、123、128、129、132、133、137、141、143、144、148、153、154、158、170、172、175、178、180、181、183、185、192、193、196、197、198、205、206、207、212、215、216、222、223或224。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰是选自以下的一个或多个氨基酸取代：a13v、q18k、q25l、s28g、f33i、e38v、n39d、l40m、l40s、n43k、v45i、f52l、d53g、m60k、d68n、t71a、l77p、i79n、k80e、k80m、k80r、k82t、q86k、q86r、i88f、i88t、i89v、h90 l、h90y、k92i、k93t、m97l、q102h、n104s,f113s、s114g、n123d、v128a、y129n、l132m、t133a、i137t、p141a、p143h、k144e、v148d、k153e、k153r、n154d、e158g、v170d、e172g、d175e、i178t、l180s、s181p、s183p、p185s、t192n、i193v、i196v、l197m、e198d、l205s、s206t、s207p、e212v、d215v、p216h、h222t或i223f、或其保守氨基酸取代。
[0192]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有对应于以下的一个或多个氨基酸取代：a13v、q18k、q25l、s28g、f33i、e38v、n39d、l40m、l40s、n43k、v45i、f52l、d53g、m60k、d68n、t71a、l77p、i79n、k80e、k80m、k80r、k82t、q86k、q86r、i88f、i88t、i89v、h90 l、h90y、k92i、k93t、m97l、q102h、n104s,f113s、s114g、n123d、v128a、y129n、l132m、t133a、i137t、p141a、p143h、k144e、v148d、k153e、k153r、n154d、e158g、v170d、e172g、d175e、i178t、l180s、s181p、s183p、p185s、t192n、i193v、i196v、l197m、e198d、l205s、s206t、s207p、e212v、d215v、p216h、h222t或i223f、或其保守取代。
[0193]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽在选自25或90的位置处含有至少一个修饰(例如取代)。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代是q25l、h90y或h90l。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代是q25l。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代是h90y或h90l。
[0194]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有选自以下的氨基酸取代：q25l/t71a/h90y、q25l/d53g/e212v、q25l/h90l、n43k/i79n/h90l/i178t/e198d、a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t、q25l/q86r/h90l/k93t/l132m/v148d/s181p/p216h、q25l/f33i/h90y/v128a/p141a/e158g/s181p、q25l/n39d/k80r/q86r/i88f/h90l/k93t/n123d/n154d、q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v、q25l/q86r/h90l/n104s、q25l/l40m/h90l/l180s/s183p、q18k/q25l/f33i/l40s/h90l、q25l/q86k/h90l/i137t/s181p、q25l/l77p/h90y/k153r/v170d/s181p、q25l/s28g/f33i/f52l/h90l/q102h/i178t、q25l/f33i/h90l/k144e/l180s、q25l/f33i/h90l/k153e/e172g/t192n、q25l/f33i/q86r/h90y/d175e/i196v/e198d、
q25l/v45i/d68n/h90l/s183p/l205s、e38v/s114g/p143h、h90y/l180s、h90y/y129n、i89v/h90l/i193v、k80e/h90y/h222t/i223f/p224l、k80m/i88t、k92i/f113s、m60k/h90l、q25l/f33i/h90l、q25l/f33i/q86r/h90l/k93t、q25l/h90l、q25l/h90l/p185s、q25l/h90l/p185s/p224l、q25l/h90l/s179r、q25l/h90y/s181p/i193v、q25l/k82t/h90l/t152s/s207p、q25l/q86r/h90l/k93t或s28g/h90y。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有选自以下的氨基酸取代：q25l/t71a/h90y、q25l/d53g/e212v、q25l/h90l、n43k/i79n/h90l/i178t/e198d、a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t、q25l/q86r/h90l/k93t/l132m/v148d/s181p/p216h、q25l/f33i/h90y/v128a/p141a/e158g/s181p、q25l/n39d/k80r/q86r/i88f/h90l/k93t/n123d/n154d、q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v、q25l/q86r/h90l/n104s、q25l/l40m/h90l/l180s/s183p、q18k/q25l/f33i/l40s/h90l、q25l/q86k/h90l/i137t/s181p、q25l/l77p/h90y/k153r/v170d/s181p、q25l/s28g/f33i/f52l/h90l/q102h/i178t、q25l/f33i/h90l/k144e/l180s、q25l/f33i/h90l/k153e/e172g/t192n、q25l/f33i/q86r/h90y/d175e/i196v/e198d、q25l/v45i/d68n/h90l/s183p/l205s/e212x、h90y/l180s、h90y/y129n、i89v/h90l/i193v、k80e/h90y/h222t/i223f/p224l、m60k/h90l、q25l/f33i/h90l、q25l/f33i/q86r/h90l/k93t、q25l/h90l、q25l/h90l/p185s、q25l/h90l/p185s/p224l、q25l/h90l/s179r、q25l/h90y/s181p/i193v、q25l/k82t/h90l/t152s/s207p、q25l/q86r/h90l/k93t、s28g/h90y、a13v/q25l/h90l、q25l/h90l/k93t/m97l、q25l/q86r/h90l或i89v/h90l。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽含有氨基酸取代q25l/h90y或q25l/h90l。
[0195]
在一些实施方案中，所提供的变体cd86多肽中任一种还可以含有来自以下的一个或多个氨基酸取代：a13v、q18k、q25l、s28g、f33i、e38v、n39d、l40m、l40s、n43k、v45i、f52l、d53g、m60k、d68n、t71a、l77p、i79n、k80e、k80m、k80r、k82t、q86k、q86r、i88f、i88t、i89v、h90 l、h90y、k92i、k93t、m97l、q102h、n104s,f113s、s114g、n123d、v128a、y129n、l132m、t133a、i137t、p141a、p143h、k144e、v148d、k153e、k153r、n154d、e158g、v170d、e172g、d175e、i178t、l180s、s181p、s183p、p185s、t192n、i193v、i196v、l197m、e198d、l205s、s206t、s207p、e212v、d215v、p216h、h222t或i223f。
[0196]
在一些实施方案中，所提供的变体cd86多肽包括具有以下氨基酸取代的cd86多肽：q25l/t71a/h90y、q25l/d53g/e212v、q25l/h90l、n43k/i79n/h90l/i178t/e198d、a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t、q25l/q86r/h90l/k93t/l132m/v148d/s181p/p216h、q25l/f33i/h90y/v128a/p141a/e158g/s181p、q25l/n39d/k80r/q86r/i88f/h90l/k93t/n123d/n154d、q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v、q25l/q86r/h90l/n104s、q25l/l40m/h90l/l180s/s183p、q18k/q25l/f33i/l40s/h90l、q25l/q86k/h90l/i137t/s181p、q25l/l77p/h90y/k153r/v170d/s181p、q25l/s28g/f33i/f52l/h90l/q102h/i178t、q25l/f33i/h90l/k144e/l180s、q25l/f33i/h90l/k153e/e172g/t192n、q25l/f33i/q86r/h90y/d175e/i196v/e198d、q25l/v45i/d68n/h90l/s183p/l205s、e38v/s114g/p143h、h90y/l180s、h90y/y129n、i89v/h90l/i193v、k80e/h90y/h222t/i223f/p224l、k80m/i88t、k92i/f113s、m60k/h90l、q25l/f33i/h90l、q25l/f33i/q86r/h90l/k93t、q25l/h90l、q25l/h90l/p185s、q25l/h90l/p185s/p224l、q25l/h90l/s179r、q25l/h90y/s181p/i193v、q25l/k82t/h90l/t152s/s207p、q25l/q86r/h90l/k93t或s28g/h90y。在一些实施方案中，所提供的变体cd86多肽是具有以下氨基酸取代的cd86多肽：q25l/t71a/h90y、q25l/d53g/e212v、q25l/h90l、n43k/
i79n/h90l/i178t/e198d、a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t、q25l/q86r/h90l/k93t/l132m/v148d/s181p/p216h、q25l/f33i/h90y/v128a/p141a/e158g/s181p、q25l/n39d/k80r/q86r/i88f/h90l/k93t/n123d/n154d、q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v、q25l/q86r/h90l/n104s、q25l/l40m/h90l/l180s/s183p、q18k/q25l/f33i/l40s/h90l、q25l/q86k/h90l/i137t/s181p、q25l/l77p/h90y/k153r/v170d/s181p、q25l/s28g/f33i/f52l/h90l/q102h/i178t、q25l/f33i/h90l/k144e/l180s、q25l/f33i/h90l/k153e/e172g/t192n、q25l/f33i/q86r/h90y/d175e/i196v/e198d、q25l/v45i/d68n/h90l/s183p/l205s/e212x、h90y/l180s、h90y/y129n、i89v/h90l/i193v、k80e/h90y/h222t/i223f/p224l、m60k/h90l、q25l/f33i/h90l、q25l/f33i/q86r/h90l/k93t、q25l/h90l、q25l/h90l/p185s、q25l/h90l/p185s/p224l、q25l/h90l/s179r、q25l/h90y/s181p/i193v、q25l/k82t/h90l/t152s/s207p、q25l/q86r/h90l/k93t、s28g/h90y、a13v/q25l/h90l、q25l/h90l/k93t/m97l、q25l/q86r/h90l或i89v/h90l。
[0197]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽包含表1中列出的任何取代(突变)。表1还提供野生型cd86或示例性变体cd86多肽的细胞外结构域(ecd)或igv结构域参考seq id no的示例性序列。在一些情况下，如表1中指出的igv比ecd短，因此可能不包括如表1中所列的所有氨基酸取代，例如在igv结构域之外的氨基酸取代。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情况下，给定结构域(例如ecd或igv)的相邻n和/或c末端氨基酸也可以包括在变体igsf多肽的序列中，如以确保表达时结构域的适当折叠。因此，应理解，表1中的seq id no的示例不应被视为具有限制性。例如，变体cd86多肽的特定结构域如ecd或igv结构域可以长于或短于相应seq id no中所示的氨基酸序列，相差若干个氨基酸，如1
‑
20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
[0198]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是或包含seq id no:85
‑
121、124
‑
134、141
‑
221和314中所示的任何序列。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是或包含这样的多肽序列，所述多肽序列展现与seq id no:85
‑
121、124
‑
134、141
‑
221和314中任一个中所示的任何序列的至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，并且其中含有不存在于野生型或未经修饰的cd86中的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是或包含seq id no:85
‑
121、124
‑
134、314和141
‑
221中任一个的特异性结合片段，并且其中含有不存在于野生型或未经修饰的cd86中的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，所述变体cd86是或包含由seq id no:89、93、94、107、111、112、115、117、124
‑
134、145、149、150、163、167、168、171、173、182、186、187、200、204、205、208、210、215
‑
221或314所示的序列。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是或包含这样的多肽序列，所述多肽序列展现与seq id no:89、93、94、107、111、112、115、117、124
‑
134、145、149、150、163、167、168、171、173、182、186、187、200、204、205、208、210、215
‑
221或314中任一个所示的任何序列的至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，并且其中含有不存在于野生型或未经修饰的cd86中的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
[0199]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是或包含seq id no:85
‑
121、124
‑
134、141
‑
221或314中任一个的特异性结合片段，并且其中含有不存在于野生型或未经修饰的cd86中的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是或包含seq id no:89、93、94、107、111、112、115、117、124
‑
134、145、149、150、163、167、168、171、173、182、186、187、200、204、205、208、210、215
‑
221或314中任一个的特异性结合片段，并且其中含有不存在于野生型或未经修饰的cd86中的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。
[0200]
在一些实施方案中，所提供的cd86变体中的任一种可以作为这样的多肽被包括在内，所述多肽长于或短于表1中列出的氨基酸序列，如描述为相差1
‑
20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸，只要cd86多肽与cd28结合(包括与野生型或未经修饰的cd86多肽相比以增加的亲和力结合)即可。
[0201]
在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，如与seq id no:29、122或123中所示的序列相比，所述变体cd86多肽展现对cd28的胞外结构域增加的亲和力。
[0202]
在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，如与seq id no:29、122或123中所示的序列相比，所述变体cd86多肽展现对于cd28的胞外结构域的结合增加的结合亲和力，并且展现对于ctla
‑
4的结合降低的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的cd86多肽相比，如与seq id no:29、122或123中所示的序列相比，所述变体cd86多肽展现对于cd28的胞外结构域增加的亲和力和对于ctla
‑
4的胞外结构域无变化的亲和力。
[0203]
在一些实施方案中，对于结合cd28相比于ctla
‑
4，与未经修饰的cd86多肽(例如seq id no:29、122或123中所示的)相比，所述变体cd86多肽展现cd86相比于ctla
‑
4的增加的选择性，如通过cd28结合与ctla
‑
4结合的比率(cd28:ctla
‑
4结合比率)指示的。在一些实施方案中，结合的比率大于1。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽展现的结合cd28相比于ctla
‑
4的比率大于或大于约或1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70或更多。iii.变体多肽的形式
[0204]
包含本文提供的变体cd86(其中含有vigd)的免疫调节多肽可以以多种方式，包括以可溶性蛋白质、膜结合蛋白、分泌蛋白的形式格式化。在一些实施方案中，可以选择特定形式用于所需的治疗应用。在一些情况下，包含变体cd86多肽的免疫调节多肽以某一种形式提供，以拮抗或阻断其结合配偶体例如ctla
‑
4和/或cd28的活性。在一些情况下，包含变体cd86多肽的免疫调节多肽以某一种形式提供，以激动或刺激其结合配偶体例如cd28的活性。在一些实施方案中，对cd28的激动作用可以用于促进肿瘤中的免疫。技术人员可以容易地确定特定形式如用于拮抗或激动一种或多种特异性结合配偶体的活性。本文(包括在实施例中)提供了用于评估此类活性的示例性方法。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白的模块形式提供了工程化或产生免疫调节蛋白的灵活性，以用于调节多个反结构(多个同源结合配偶体)的活性。
[0205]
在一些方面，提供了免疫调节蛋白，其包含cd86的vigd，其中此类蛋白质是可溶的，例如与fc链融合。在一些方面，一个或多个另外的igsf结构域，如一个或多个另外的vigd，可以与本文提供的cd86的vigd连接(下文称为“堆叠”或“堆叠的”免疫调节蛋白)。在一些实施方案中，此类“堆叠”分子可以以可溶形式提供，或者在一些情况下，可以以膜结合或分泌蛋白的形式提供。在一些实施方案中，变体cd86免疫调节蛋白以缀合物的形式提供，
其中含有与靶向剂或部分直接或间接连接(例如，与特异性地结合至配体(例如抗原)的抗体或其他结合分子连接)的cd86的vigd，例如，以用于如当向受试者施用时将vigd靶向或定位于特定环境或细胞。在一些实施方案中，所述靶向剂例如抗体或其他结合分子与肿瘤抗原结合，从而将含有vigd的变体cd86定位于肿瘤微环境，例如，以调节对肿瘤微环境特异的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的活性。
[0206]
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白在细胞中表达并且作为工程化细胞疗法(ect)的一部分提供。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽以膜结合形式在细胞(如免疫细胞(例如t细胞或抗原呈递细胞))中表达，从而提供跨膜免疫调节蛋白(下文中也称为“tip”)。在一些实施方案中，根据tip识别的一种或多种同源结合配偶体，表达tip的工程化细胞可以通过向其他工程化细胞和/或内源性t细胞提供呈阳性或阴性的共刺激信号来激动同源结合配偶体。在一些实施方案中，表达tip的工程化细胞与不同细胞上的同源结合配偶体结合。在一些实施方案中，当表达tip的工程化细胞与不同细胞上的同源结合配偶体结合时，共刺激被称为反式共刺激。在一些实施方案中，表达tip的工程化细胞与自身上的同源结合配偶体结合，从而诱导自身共刺激。在一些实施方案中，当细胞上的tip与自身上的同源结合配偶体结合时，共刺激被称为顺式共刺激。在一些方面，变体cd86多肽以可分泌形式在细胞(如免疫细胞(例如t细胞或抗原呈递细胞))中表达，从而如当将细胞施用至受试者时产生分泌的或可溶形式的变体cd86多肽(下文中也称为“sip”)。在一些方面，根据sip识别的一种或多种同源结合配偶体，表达sip的工程化细胞可以拮抗或激动其所分泌的环境(例如，肿瘤微环境)中的同源结合配偶体。在一些实施方案中，变体cd86多肽在感染原(例如，病毒或细菌剂)中表达，所述感染原在施用至受试者后能够感染体内细胞，如免疫细胞(例如t细胞或抗原呈递细胞)，以用于在细胞中以tip或sip的形式递送或表达变体多肽。
[0207]
在一些实施方案中，可溶性免疫调节多肽，如含有vigd的变体cd86，可以包封在脂质体内，所述脂质体本身可以与所提供的缀合物(例如，靶向部分)中的任何一种或任何组合缀合。在一些实施方案中，本发明的可溶性或膜结合的免疫调节多肽是去糖基化的。在更具体的实施方案中，所述变体cd86序列是去糖基化的。在甚至更具体的实施方案中，所述变体cd86的一个或多个igv和/或igc(例如igc2)结构域是去糖基化的。
[0208]
所提供形式的非限制性例子在下文进一步描述。b.可溶性蛋白
[0209]
在一些实施方案中，含有变体cd86多肽的免疫调节蛋白是可溶蛋白质。本领域技术人员将理解，细胞表面蛋白通常具有细胞内、跨膜和细胞外结构域(ecd)，并且可以使用细胞外结构域或其免疫活性子序列制备可溶形式的此类蛋白质。因此，在一些实施方案中，含有变体cd86多肽的免疫调节蛋白缺少跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体cd86的免疫调节蛋白缺少细胞内(胞质)结构域或细胞内结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体cd86多肽的免疫调节蛋白仅含有vigd部分，所述vigd部分含有ecd结构域或其部分，所述部分含有一个或多个igv结构域和/或igc(例如，igc2)结构域或其特异性结合片段，所述特异性结合片段含有一个或多个氨基酸修饰。
[0210]
在一些实施方案中，包含变体cd86的免疫调节多肽可以包括本发明的一种或多种变体cd86多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽将恰好包含1、2、3、4、5个变体cd86序列。在一些实施方案中，至少两个变体cd86序列是相同的变体cd86序列。
[0211]
在一些实施方案中，所提供的免疫调节多肽包含两个或更多个cd86的vigd序列。多肽链内的多个变体cd86多肽可以是彼此相同(即，相同的种类)，或者彼此不同(即，不同的种类)的变体cd86序列。除了单一多肽链实施方案之外，在一些实施方案中，本发明的两个、三个、四个或更多个多肽可以彼此共价或非共价连接。因此，本文提供了单体、二聚体和更高级(例如，3、4、5个或更多个)多聚体蛋白质。例如，在一些实施方案中，本发明的两个多肽恰好可以彼此共价或非共价附接以形成二聚体。在一些实施方案中，经由链间半胱氨酸二硫键进行附接。包含两个或更多个本发明多肽的组合物可以属于相同多肽种类或基本上相同的多肽种类(例如，同二聚体)，或者属于不同多肽种类(例如，异二聚体)。如上所述，具有多个连接的本发明多肽的组合物可以在每条多肽链中具有一个或多个相同或不同的本发明的变体cd86多肽。
[0212]
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白是或含有变体cd86多肽，其呈单体形式和/或展现与其结合配偶体的单价结合。在一些方面，如所述的变体cd86多肽，如可溶性的和/或缺乏跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的变体cd86与另外的部分直接或间接连接。在一些实施方案中，所述另外的部分是蛋白质、肽、小分子或核酸。在一些实施方案中，所述单价免疫调节蛋白是融合蛋白。在一些实施方案中，所述部分是半衰期延长分子。此类半衰期延长分子的例子包括但不限于白蛋白、白蛋白结合多肽、pro/ala/ser(pas)、人绒毛膜促性腺激素β亚基的c末端肽(ctp)、聚乙二醇(peg)、长而非结构化亲水性氨基酸序列(xten)、羟乙基淀粉(hes)、白蛋白结合小分子或其组合。
[0213]
在一些实施方案中，包含变体cd86的免疫调节多肽可以与包含由氨基酸pro、ala和ser构成的构象无序多肽序列(参见例如wo2008/155134，seq id no:242)的部分连接。在一些情况下，所述氨基酸重复序列是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸残基，其中每个重复序列包含(一个)ala、ser和pro残基。因此，本发明提供了一种为pas化蛋白质的免疫调节蛋白，其中变体cd86多肽直接或经由接头间接与pro/ala/ser(pas)连接。在一些实施方案中，可以使用一个或多个另外的接头结构。
[0214]
在一些实施方案中，所述部分促进变体cd86多肽的检测或纯化。在一些情况下，所述免疫调节多肽包含与cd86多肽的n和/或c末端直接或间接连接的标签或融合结构域，例如亲和力或纯化标签。各种合适的多肽标签和/或融合结构域是已知的，并且包括但不限于聚组氨酸(his)标签、flag标签(seq id no:248)、myc标签和荧光蛋白标签(例如，egfp，如seq id no:244
‑
246中所示)。在一些情况下，包含变体cd86的免疫调节多肽包含至少六个组氨酸残基(seq id no:249中所示)。在一些情况下，包含变体cd86的免疫调节多肽还包含各部分的各种组合。例如，包含变体cd86的免疫调节多肽还包含一个或多个聚组氨酸标签和flag标签。
[0215]
在一些实施方案中，所述cd86多肽与修饰的免疫球蛋白重链恒定区(fc)连接，所述修饰的免疫球蛋白重链恒定区保持为单价形式，如seq id no:252中所示。
[0216]
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白含有直接或经由接头间接与多聚化结构域连接的变体cd86多肽。在一些方面，所述多聚化结构域增加分子的半衰期。两种或更多种变体cd86多肽的相互作用可以通过将其与任何部分或其他多肽直接或间接连接来促进，所述部分或其他多肽本身能够相互作用以形成稳定结构。例如，单独编码的变体cd86多肽链可
以通过多聚化来接合，借此多肽的多聚化由多聚化结构域来介导。通常，所述多聚化结构域提供第一变体cd86多肽与第二变体cd86多肽之间的稳定蛋白质
‑
蛋白质相互作用的形成。
[0217]
同多聚和异多聚多肽可以从单独变体cd86多肽的共表达来生成。第一和第二变体cd86多肽可以是相同的或不同的。在特定实施方案中，所述第一和第二变体cd86多肽在同二聚体中是相同的，并且各自连接至相同的多聚化结构域。在其他实施方案中，异二聚体可以通过连接不同的第一和第二变体cd86多肽来形成。在一些此类实施方案中，所述第一和第二变体cd86多肽与能够促进异二聚体形成的不同多聚化结构域连接。
[0218]
在一些实施方案中，多聚化结构域包括能够形成稳定的蛋白质
‑
蛋白质相互作用的任何结构域。所述多聚化结构域可以经由以下来相互作用：免疫球蛋白序列(例如fc结构域；参见例如，国际专利公开号wo 93/10151和wo 2005/063816 us；美国公开号2006/0024298；美国专利号5,457,035)；亮氨酸拉链(例如，来自核转化蛋白fos和jun，或原癌基因c
‑
myc，或来自一般氮控制(general control of nitrogen，gcn4))(参见例如，busch和sassone
‑
corsi(1990)trends genetics,6:36
‑
40；gentz等人,(1989)science,243:1695
‑
1699)；疏水区；亲水区；或者在同多聚体或异多聚体的嵌合分子之间形成分子间二硫键的游离硫醇。此外，多聚化结构域可以包含含有与包含臼的氨基酸序列互补的突出部的氨基酸序列，诸如例如美国专利号5,731,168；国际专利公布号wo 98/50431和wo 2005/063816；ridgway等人(1996)protein engineering,9:617
‑
621中所述。这种多聚化区域可以被工程化使得空间相互作用不仅促进稳定相互作用，而且还促进从嵌合单体的混合物形成异二聚体超过同二聚体。通常，突出部是通过用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代第一多肽的界面中的小氨基酸侧链来构建。任选地通过用较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链在第二多肽的界面上产生突出部的相同或类似大小的补偿空腔。示例性多聚化结构域描述于下文中。
[0219]
变体cd86多肽可以在任何位置(但通常经由其n末端或c末端)与多聚化结构域的n末端或c末端接合以形成嵌合多肽。所述连接可以是直接的或经由接头间接的。嵌合多肽可以是融合蛋白或者可以通过化学连接来形成，如通过共价或非共价相互作用来形成。例如，在制备含有多聚化结构域的嵌合多肽时，可以将编码变体cd86多肽的全部或部分的核酸与编码多聚化结构域序列的核酸直接或间接或任选地经由接头结构域可操作地连接。在一些情况下，构建体编码嵌合蛋白，其中变体cd86多肽的c末端与多聚化结构域的n末端接合。在一些情况下，构建体可以编码嵌合蛋白，其中变体cd86多肽的n末端与多聚化结构域的c末端接合。
[0220]
多肽多聚体含有通过将两个相同或不同的变体cd86多肽直接或间接连接至多聚化结构域产生的多个(如两个)嵌合蛋白。在一些例子中，在多聚化结构域是多肽的情况下，将编码变体cd86多肽和多聚化结构域的基因融合物插入适当的表达载体中。所得嵌合或融合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达，并且允许组装为多聚体，其中多聚化结构域相互作用以形成多价多肽。多聚化结构域与变体cd86多肽的化学连接可以使用异双功能接头来进行。
[0221]
所得嵌合多肽(如融合蛋白)和由其形成的多聚体可以通过任何合适的方法来纯化，如例如通过亲和色谱在蛋白a或蛋白g柱上纯化。在将编码不同多肽的两种核酸分子转化至细胞中的情况下，将发生同二聚体和异二聚体的形成。可以调整表达条件，使得相对于
同二聚体形成更偏好异二聚体形成。
[0222]
在一些实施方案中，所述多聚化结构域是来自免疫球蛋白的fc结构域或其部分。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含附接于免疫球蛋白fc的变体cd86多肽(产生“免疫调节fc融合物”，如“变体cd86
‑
fc融合物”，也称为cd86 vigd
‑
fc融合物)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽的附接位于fc的n末端。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽的附接位于fc的c末端。在一些实施方案中，两个或更多个cd86变体多肽(相同或不同)独立地附接在n末端和c末端。在一些实施方案中，本文提供的cd86
‑
fc变体融合物包含根据上文第ii部分中所述的描述的变体cd86多肽。
[0223]
在一些实施方案中，所述fc是鼠或人fc。在一些实施方案中，所述fc是哺乳动物或人igg1、igg2、igg3或igg4 fc区。在一些实施方案中，所述fc源自igg1，如人igg1。在一些实施方案中，所述fc包含seq id no:229、230或253中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:229、230或253至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0224]
在一些实施方案中，所述fc区含有一个或多个修饰以改变(例如，降低)其一种或多种正常功能。通常，除了作为免疫球蛋白的主要功能的抗原结合能力以外，fc区还负责效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞毒性(adcc)。此外，所述fc区中存在的fcrn序列通过与体内fcrn受体缀合增加体内半衰期而起到调节血清中igg水平的作用。在一些实施方案中，可以在fc中降低或改变此类功能以与提供的fc融合蛋白一起使用。
[0225]
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的cd86
‑
fc变体融合物的fc区，从而产生fc区变体。在一些实施方案中，所述fc区变体具有降低的效应子功能。有许多可改变效应子功能的fc序列的变化或突变的例子。例如，wo 00/42072、wo 2006019447、wo 2012125850、wo2015/107026、us2016/0017041和shields等人j biol.chem.9(2):6591
‑
6604(2001)描述了与fcr结合改善或减弱的示例性fc变体。这些出版物的内容通过引用特别地并入本文。
[0226]
在一些实施方案中，所提供的变体cd86
‑
fc融合物包含展现降低的效应子功能的fc区，这使其成为一些应用的理想候选物，在该应用中体内cd86
‑
fc变体融合物的半衰期是重要的但某些效应子功能(如cdc和adcc)是不必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认cdc和/或adcc活性的降低/消耗。例如，可以进行fc受体(fcr)结合测定以确保cd86
‑
fc变体融合物缺乏fcγr结合(因此可能缺乏adcc活性)，但保持fcrn结合能力。介导adcc的原代细胞nk细胞仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达总结于ravetch和kinet,annu.rev.immunol.9:457
‑
492(1991)的第464页的表3中。用于评估目标分子的adcc活性的体外测定的非限制性例子描述于以下文献中：美国专利号5,500,362(参见例如，hellstrom,i.等人proc.nat'l acad.sci.usa 83:7059
‑
7063(1986))和hellstrom,i等人,proc.nat'l acad.sci.usa 82:1499
‑
1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见bruggemann,m.等人,j.exp.med.166:1351
‑
1361(1987))。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的acti
tm
非放射性细胞毒性测定(celltechnology公司，山景城，加利福尼亚州)；和cytotox 96
tm
非放射性细胞毒性测定(promega，麦迪逊，威斯康辛州))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。可替代地或另外地，可以在体内(例如在动物模型
中，如clynes等人proc.nat'l acad.sci.usa 95:652
‑
656(1998)中公开的动物模型)评估目标分子的adcc活性。还可以进行c1q结合测定以确认，cd86
‑
fc变体融合物不能结合c1q并且因此缺少cdc活性。参见例如，wo 2006/029879和wo 2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可以进行cdc测定(参见例如，gazzano
‑
santoro等人,j.immunol.methods 202:163(1996)；cragg,m.s.等人,blood 101:1045
‑
1052(2003)；以及cragg,m.s.和m.j.glennie,blood 103:2738
‑
2743(2004))。还可以使用本领域中已知的方法来进行fcrn结合和体内清除率/半衰期确定(参见例如，petkova,s.b.等人,int'l.immunol.18(12):1759
‑
1769(2006))。
[0227]
具有降低的效应子功能的cd86
‑
fc变体融合物包括具有根据eu编号的fc区残基238、265、269、270、297、327和329的一个或多个取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类fc突变体包括在根据eu编号的氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置具有取代的fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“dana”fc突变体(美国专利号7,332,581)。
[0228]
在一些实施方案中，cd86
‑
fc变体融合物的fc区具有fc区，其中位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325和329处(通过eu编号表示)的任何一个或多个氨基酸被不同于天然fc区的氨基酸取代。fc区的此类改变并不限于上述改变，并且包括例如：改变，如current opini on in biotechnology(2009)20(6),685
‑
691中所述的去糖基化链(n297a和n297q)、igg1
‑
n297g、igg1
‑
l234a/l235a、igg1
‑
l234a/l235e/g237a、i gg1
‑
a325a/a330s/p331s、igg1
‑
c226s/c229s、igg1
‑
c226s/c229s/e233p/l234v/l235a、igg1
‑
e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、igg1
‑
l234f/l235e/p331s、igg1
‑
s267e/l328f、igg2
‑
v234a/g237a、igg2
‑
h268q/v309l/a330s/a331s、igg4
‑
l235a/g237a/e318a和igg4
‑
l236e；改变，如wo 2008/092117中所述的g236r/l328r、l235g/g236r、n325a/l328r和n325ll328r；在位置233、234、235和237(依据eu编号指示)处的氨基酸插入；以及在wo 2000/042072中所述位点处的改变。
[0229]
描述了具有改进的或减小的与fcr的结合的某些fc变体。(参见例如，美国专利号6,737,056；wo 2004/056312；wo 2006019447以及shields等人,j.biol.chem.9(2):6591
‑
6604(2001))。
[0230]
在一些实施方案中，提供了一种cd86
‑
fc变体融合物，其包含如本文所述的变体cd86多肽和变体fc区，所述变体fc区包含增加半衰期和/或改善与新生儿fc受体(fcrn)的结合的一个或多个氨基酸取代。具有增加的半衰期和改进的与fcrn的结合的抗体描述于us2005/0014934a1(hinton等人)或wo 2015107026中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的fc区，所述取代改进fc区与fcrn的结合。此类fc变体包括在根据eu编号的以下fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
[0231]
在一些实施方案中，cd86
‑
fc变体融合物的fc区包含根据eu编号的一个或多个氨基酸取代e356d和m358l。在一些实施方案中，cd86
‑
fc变体融合物的fc区包含根据eu编号的一个或多个氨基酸取代c220s、c226s和/或c229s。在一些实施方案中，cd86变体融合物的fc区包含一个或多个氨基酸取代r292c和v302c。关于fc区变体的其他例子还参见duncan和
winter,nature 322:738
‑
40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及wo 94/29351。
[0232]
在一些实施方案中，野生型igg1 fc可以是seq id no:229中所示的fc，其具有根据eu编号在位置356和358含有残基glu(e)和met(m)的同种异型(例如，f同种异型)。在其他实施方案中，野生型igg1 fc含有人g1m1同种异型的氨基酸，如在位置356和358含有asp(d)和leu(l)的残基，例如，如seq id no:332中所示。因此，在一些情况下，本文提供的fc可以含有氨基酸取代e356d和m358l以重构同种异型g1 m1(例如，α同种异型)的残基。在一些方面，通过一个或多个氨基酸取代修饰野生型fc以降低效应子活性或使fc对于fc效应子功能呈惰性。示例性无效应子或惰性突变包括本文所述的那些。本文提供的构建体的fc中可以包括的无效应子突变包括根据eu编号的l234a、l235e和g237a。在一些实施方案中，通过去除一个或多个半胱氨酸残基，如通过根据eu编号在位置220将半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(c220s)来进一步修饰野生型fc。具有降低的效应子功能的示例性惰性fc区显示于seq id no:333或256和seq id no:258或230中，它们分别基于seq id no:229或seq id no:332中所示的同种异型。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的fc区可能进一步缺少c末端赖氨酸残基。
[0233]
在一些实施方案中，在fc区中进行改变，所述改变导致减小的c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，例如，如以下文献中所述：美国专利号6,194,551、wo 99/51642；以及idusogie等人,j.immunol.164:4178
‑
4184(2000)。
[0234]
在一些实施方案中，提供了cd86
‑
fc变体融合物，其包含含有一个或多个氨基酸修饰的变体fc区，其中变体fc区源自igg1，如人igg1。在一些实施方案中，所述变体fc区源自seq id no:229所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述fc含有根据seq id no:229的编号的至少一个氨基酸取代，即n82g(对应于根据eu编号的n297g)。在一些实施方案中，所述fc还含有根据seq id no:229的编号的至少一个氨基酸取代，即r77c或v87c(对应于根据eu编号的r292c或v302c)。在一些实施方案中，所述变体fc区还包含根据seq id no:229的编号的c5s氨基酸修饰(对应于根据eu编号的c220s)，如seq id no:254中所示的fc区。例如，在一些实施方案中，所述变体fc区包含根据eu编号的以下氨基酸修饰：v297g和以下氨基酸修饰c220s、r292c或v302c中的一个或多个(对应于根据seq id no:229的n82g和以下氨基酸修饰c5s、r77c或v87c中的一个或多个)，例如，fc区包含seq id no:255中所示的序列。在一些实施方案中，所述变体fc区包含氨基酸修饰c220s、l234a、l235e或g237a中的一个或多个，例如，fc区包含seq id no:256中所示的序列。在一些实施方案中，所述变体fc区包含氨基酸修饰c220s、l235p、l234v、l235a、g236del或s267k中的一个或多个，例如，fc区包含seq id no:257中所示的序列。在一些实施方案中，所述变体fc包含氨基酸修饰c220s、l234a、l235e、g237a、e356d或m358l中的一个或多个，例如，fc区包含seq id no:258中所示的序列。
[0235]
在一些实施方案中，本文提供的cd86
‑
fc变体融合物包含根据上文第ii部分中所述的描述的变体cd86多肽。在一些实施方案中，提供cd86
‑
fc变体融合物，其包含与变体fc区连接的所述变体cd86多肽中的任何一种，其中所述变体fc区并非含有突变r292c、n297g和v302c(对应于根据seq id no:229中所示的野生型人igg1 fc的r77c、n82g和v87c)的人igg1 fc。在一些实施方案中，提供cd86
‑
fc变体融合物，其包含与fc区或变体fc区连接的任
何一种变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽并非用由三个丙氨酸组成的接头与fc连接。
[0236]
在一些实施方案中，所述fc区缺少对应于seq id no:229中所示的野生型或未经修饰的fc的位置232的c末端赖氨酸(对应于根据eu编号的k447del)。在一些方面，这种fc区可以另外包括一个或多个另外的修饰，例如，氨基酸取代，例如所述的任一种。这种fc区的例子显示于seq id no:255
‑
257、258或259
‑
261中。
[0237]
在一些实施方案中，提供一种cd86
‑
fc变体融合物，其包含变体fc区，其中变体fc包含seq id no:255、258、256、257、254或259
‑
261中任一个中所示的氨基酸序列，或者展现与seq id no:255、258、256、257、254或259
‑
261中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0238]
在一些实施方案中，所述fc源自igg2，如人igg2。在一些实施方案中，所述fc包含seq id no:262中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:262至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0239]
在一些实施方案中，所述fc包含seq id no:263中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:263至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述igg4 fc是稳定的fc，其中人igg4的ch3结构域被人igg1的ch3结构域取代并且展现抑制的聚集体形成；抗体，其中人igg4的ch3和ch2结构域分别被人igg1的ch3和ch2结构域取代；或抗体，其中由kabat等人提出的eu指数表示的人igg4的位置409处的精氨酸被赖氨酸取代并且展现抑制的聚集体形成(参见例如美国专利号8,911,726)。在一些实施方案中，所述fc是含有s228p突变的igg4，已经显示其防止治疗性抗体与内源igg4之间通过fab臂交换进行重组(参见例如，labrijin等人(2009)nat.biotechnol.,27(8):767
‑
71)。在一些实施方案中，所述fc包含seq id no:264中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:264至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
[0240]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽与fc序列间接连接，如经由接头。在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接变体cd86多肽与fc结构域。在一些实施方案中，肽接头长度可以是单个氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，所述肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头是柔性接头。在一些实施方案中，所述接头是(按单字母氨基酸代码)：ggggs(“4gs”或“g4s”；seq id no:223)或4gs接头的多聚体，如2、3、4或5个4gs接头的重复，如seq id no:225(2xggggs；(g4s)2)或seq id no:224(3xggggs；(g4s)3)中所示。在一些实施方案中，所述接头可以包括单独的一系列丙氨酸残基，或者另外包括另一个肽接头(如4gs接头或其多聚体)。在一些实施方案中，每个系列中丙氨酸残基的数量是2、3、4、5或6个丙氨酸。在一些实施方案中，所述接头为三个丙氨酸(aaa)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽与fc序列经由接头间接连接，其中所述接头并非由三个丙氨酸组成。在一些例子中，所述接头是2xggggs，之后是三个丙氨酸(ggggsggggsaaa；seq id no:226)。在一些实施方案中，所述接头还可以包括通过克隆引入和/或来自限制位点的氨基酸，例如接头
可以包括如通过使用限制位点bamhi引入的氨基酸gs(按单字母氨基酸代码)。例如，在一些实施方案中，所述接头(按单字母氨基酸代码)是gsggggs(seq id no:222)、gs(g4s)3(seq id no:227)或gs(g4s)5(seq id no:228)。在一些实施方案中，所述接头是刚性接头。例如，所述接头是α螺旋接头。在一些实施方案中，所述接头是(按单字母氨基酸代码)：eaaak或eaaak接头的多聚体，如2、3、4或5个eaaak接头的重复，如seq id no:265(1xeaaak)、seq id no:266(3xeaaak)或seq id no:247(5xeaaak)中所示。在一些情况下，包含变体cd86的免疫调节多肽包含肽接头的各种组合。
[0241]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽与fc序列直接连接。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽与fc(如惰性fc)直接连接，所述fc另外缺少铰链区的全部或一部分。缺少铰链区的一部分(6个氨基酸)的示例性fc显示于seq id no:267中。
[0242]
在一些实施方案中，在cd86多肽与fc序列直接连接的情况下，cd86多肽可以在c末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽被截短以去除将igv区连接至igc区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。
[0243]
在一些实施方案中，所述变体cd86
‑
fc融合蛋白是由与fc结构域连接的两个变体cd86 fc多肽形成的二聚体。在一些具体的实施方案中，cd86
‑
fc变体融合多肽的相同或基本相同的种类(允许3个或更少的n末端或c末端氨基酸序列差异)将会被二聚化以产生同二聚体。在一些实施方案中，所述二聚体是同二聚体，其中两个变体cd86 fc多肽相同。可替代地，可以将不同种类的cd86
‑
fc变体融合多肽二聚化以产生异二聚体。因此，在一些实施方案中，所述二聚体是异二聚体，其中两个变体cd86 fc多肽是不同的。
[0244]
还提供了编码变体cd86
‑
fc融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，为了产生fc融合蛋白，将编码变体cd86
‑
fc融合蛋白的核酸分子插入合适的表达载体中。得到的变体cd86
‑
fc融合蛋白可以在用表达载体转化的宿主细胞中表达，其中通过fc部分之间形成的链间二硫键发生fc结构域之间的组装，以产生二聚(如二价)变体cd86
‑
fc融合蛋白。
[0245]
所得fc融合蛋白可以通过亲和色谱在蛋白a或蛋白g柱上容易地纯化。为了产生异二聚体，可能需要另外的纯化步骤。例如，当编码不同变体cd86多肽的两个核酸转化至细胞中时，必须生物化学地实现异二聚体的形成，因为携带fc结构域的变体cd86分子也将表达为二硫键连接的同二聚体。因此，同二聚体可以在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下还原。在一些情况下，将不同的变体cd86
‑
fc单体以等摩尔量混合并氧化以形成同二聚体和异二聚体的混合物。此混合物的组分通过色谱技术分离。可替代地，这种类型的异二聚体的形成可以使用下述杵臼结构方法通过遗传工程化和表达含有变体cd86多肽的fc融合分子来产生偏差。c.具有另外的igsf结构域的堆叠分子
[0246]
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白可含有直接或间接与一个或多个其他免疫球蛋白超家族(igsf)结构域(“堆叠的”免疫调节蛋白构建体，也称为“ii型”免疫调节蛋白)连接的本文提供的任何变体cd86多肽。在一些方面，这可以产生独特的多结构域免疫调节蛋白，其结合两种或更多种，如三种或更多种同源结合配偶体，从而提供免疫突触的多靶向调节。
[0247]
在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含变体cd86结构域与野生型igsf家族成员中
未发现的另一个igsf家族成员(例如哺乳动物igsf家族成员)的一个或多个其他亲和力修饰和/或非亲和力修饰的igsf结构域序列的组合(“非野生型组合”)和/或排列(“非野生型排列”或“非野生型置换”)。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白含有2、3、4、5或6个免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，其中根据提供的描述，igsf结构域中的至少一个是变体cd86 igsf结构域(cd86的vigd)。
[0248]
在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域的序列可以是修饰的igsf结构域，其含有与野生型或未经修饰的igsf结构域相比的一个或多个氨基酸修饰，例如，取代。在一些实施方案中，所述igsf结构域可以是非亲和力修饰的(例如野生型)或经亲和力修饰的。在一些实施方案中，所述未经修饰的或野生型igsf结构域可以来自小鼠、大鼠、食蟹猴或人来源，或其组合。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域可以是表2中所示的igsf家族成员的igsf结构域。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域可以是含有与表2中所示的igsf家族成员中包含的igsf结构域相比的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)的亲和力修饰的igsf结构域。
[0249]
在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域是包含在以下家族的igsf家族成员中的亲和力或非亲和力修饰的igsf结构域：信号调节蛋白(sirp)家族、在骨髓细胞样(treml)家族上表达的触发受体、癌胚抗原相关细胞粘附分子(ceacam)家族、唾液酸结合ig样凝集素(siglec)家族、嗜乳脂蛋白家族、b7家族、cd28家族、含v集和免疫球蛋白结构域(vsig)的家族、v集跨膜结构域(vstm)家族、主要组织相容性复合物(mhc)家族、信号淋巴细胞活化分子(slam)家族、白细胞免疫球蛋白样受体(lir)、nectin(nec)家族、nectin样(necl)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关(pvr)家族、天然细胞毒性触发受体(ncr)家族、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白(tim)家族或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)家族。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域独立地源自选自以下的igsf蛋白：cd80(b7
‑
1)、cd86(b7
‑
2)、cd274(pd
‑
l1、b7
‑
h1)、pdcd1lg2(pd
‑
l2、cd273)、icoslg(b7rp1、cd275、icosl、b7
‑
h2)、cd276(b7
‑
h3)、vtcn1(b7
‑
h4)、cd28、ctla4、pdcd1(pd
‑
1)、icos、btla(cd272)、cd4、cd8a(cd8
‑
α)、cd8b(cd8
‑
β)、lag3、havcr2(tim
‑
3)、ceacam1、tigit、pvr(cd155)、pvrl2(cd112)、cd226、cd2、cd160、cd200、cd200r1(cd200r)和nc r3(nkp30)。
[0250]
表2的第一列提供了该特定igsf成员的名称，以及任选一些可能同义词的名称。第二列提供了来自uniprotkb数据库的蛋白质标识符，uniprotkb数据库是经由互联网在uniprot.org，或者在一些情况下经由genbank登录号可访问的公共可获得的数据库。universal protein resource(uniprot)是蛋白质序列和注释数据的综合性资源。uniprot数据库包括uniprot knowledgebase(uniprotkb)。uniprot是欧洲生物信息研究所(embl
‑
ebi)、sib瑞士生物信息研究所和蛋白质信息资源(pir)之间的合作项目，并且主要由美国国立卫生研究院(nih)的资助支持。genbank是nih基因序列数据库，是所有公共可获得的dna序列的注释集合(nucleic acids research,2013年1月；41(d1):d36
‑
42)。第三列提供了所示igsf结构域所在的区域。所述区域被规定为一个范围，其中结构域包含定义所述范围的残基。第3列还表明规定的igsf区域的igsf结构域类别。第4栏提供所指示其他结构域所在的区域(信号肽，s；细胞外结构域，e；跨膜结构域，t；胞质结构域，c)。应当理解，结构域的描述可以根据用于鉴定或分类结构域的方法而变化，并且可以根据不同来源而差异地鉴定。对应于表2中的结构域的残基的描述仅用于举例说明，并且可以是更长或更短，相差若
干个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。第5列表示一些列出的igsf成员，igsf成员的一些同源细胞表面结合配偶体。
[0251]
存在于“堆叠的”免疫调节蛋白构建体中的这种非亲和力修饰或亲和力修饰的igsf结构域的数量(无论是非野生型组合还是非野生型排列)为至少2、3、4或5，并且在一些实施方案中恰好为2、3、4或5个igsf结构域(由此确定的亲和力修饰的igsf结构域的数量忽略其任何非特异性结合部分的序列和/或其基本上免疫失活部分的序列)。
[0252]
在本文提供的堆叠的免疫调节蛋白的一些实施方案中，igsf结构域的数量为至少2，其中亲和力修饰的igsf结构域的数量和非亲和力修饰的igsf结构域的数量各自独立地为至少：0、1、2、3、4、5或6。因此，亲和力修饰的igsf结构域的数量和非亲和力修饰的igsf结构域的数量分别地(亲和力修饰的igsf结构域:非亲和力修饰的igsf结构域)可以恰好为或为至少：2:0(亲和力修饰的:野生型)、0:2、2:1、1:2、2:2、2:3、3:2、2:4、4:2、1:1、1:3、3:1、
1:4、4:1、1:5或5:1。
[0253]
在堆叠的免疫调节蛋白的一些实施方案中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域中的至少两个是相同的igsf结构域。
[0254]
在一些实施方案中，本文提供的堆叠的免疫调节蛋白包含来自单个igsf成员但为非野生型排列(或者“置换”)的至少两个亲和力修饰和/或非亲和力修饰的igsf结构域。非野生型排列或置换的一个说明性例子是免疫调节蛋白，其包含相对于在野生型cd86中发现的那些igsf结构域序列的非野生型顺序的亲和力修饰和/或非亲和力修饰的igsf结构域序列，所述野生型cd86的igsf结构域序列用作本文提供的变体igsf结构域的来源。因此，在一个例子中，所述免疫调节蛋白可以包含在跨膜结构域近端的igv和远端的igc，虽然是非亲和力修饰和/或亲和力修饰的形式。在本文提供的免疫调节蛋白中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的非野生型组合和非野生型排列的存在也在所提供的主题范围内。
[0255]
在堆叠的免疫调节蛋白的一些实施方案中，所述非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域是不相同的(即，不同的)igsf结构域。在特异性结合条件下不相同的亲和力修饰的igsf结构域特异性结合不同的同源结合配偶体，并且无论它们工程化来源的野生型或未经修饰的igsf结构域是否相同，所述不相同的亲和力修饰的igsf结构域是“不相同的”。因此，例如，免疫调节蛋白中的至少两个不相同的igsf结构域的非野生型组合可以包含至少一个igsf结构域序列(其来源于且仅来源于一个cd86)和至少一个第二igsf结构域序列(其来源于且仅来源于非cd86的另一种igsf家族成员)，其中所述免疫调节蛋白的igsf结构域是非亲和力修饰和/或亲和力修饰的形式。然而，在替代实施方案中，所述两个不相同的igsf结构域来源于相同的igsf结构域序列，但至少一个是亲和力修饰的，使得它们与不同的同源结合配偶体特异性结合。
[0256]
在一些实施方案中，除了含有变体cd86多肽之外，所提供的免疫调节蛋白还含有至少1、2、3、4、5或6个另外的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，如表2中所示的igsf家族成员的igd结构域。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少一个另外的igsf结构域(例如，第二igsf结构域)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少两个另外的igsf结构域(例如，第二和第三igsf结构域)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少三个另外的igsf结构域(例如，第二、第三和第四)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少四个另外的igsf结构域(例如，第二、第三、第四和第五)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少五个另外的igsf结构域(例如，第二、第三、第四、第五和第六)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少六个另外的igsf结构域(例如，第二、第三、第四、第五、第六和第七)。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白中的每个igsf结构域是不同的。在一些实施方案中，至少一个另外的igsf结构域与免疫调节蛋白中的至少一个其他igsf结构域相同。在一些实施方案中，每个igsf结构域来自或源自不同的igsf家族成员。在一些实施方案中，igsf结构域中的至少两个来自或源自相同的igsf家族成员。
[0257]
在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域包含igv结构域或一个或多个igc(例如，igc2)结构域，或者igv结构域的特异性结合片段或一个或多个igc(例如，igc2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域是或包含全长igv结构域。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域是或包含一个或多个全长igc(例如，igc2)结构
域。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域是或包含igv结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域是或包含一个或多个igc(例如，igc2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白含有来自单一(相同)igsf成员的至少两个另外的igsf结构域。例如，在一些方面，所述免疫调节蛋白含有igsf成员的ecd或其部分，所述igsf成员含有全长igv结构域和一个或多个全长igc(例如，igc2)结构域或其特异性结合片段。
[0258]
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少一个另外的igsf结构域(例如第二或在一些情况下还第三igsf结构域等等)，其中至少一个另外的或第二igsf结构域是野生型或未经修饰的igsf结构域中所示的igsf结构域或其特异性结合片段(包含在seq id no:2
‑
27和82中任一个中所示的氨基酸序列中)。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的igsf结构域是igv结构域或igc结构域，如igc1或igc2结构域。
[0259]
在一些实施方案中，除了含有变体cd86多肽之外，所提供的免疫调节蛋白还含有至少一个另外的亲和力修饰的igsf结构域(例如第二或在一些情况下还第三亲和力修饰的igsf结构域，等等)，其中至少一个另外的igsf结构域是与野生型或未经修饰的igsf结构域中的igsf结构域(如表2中所示的igsf家族成员中的igsf结构域)相比含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代、缺失或突变)的vigd。在一些实施方案中，所述另外的例如第二或第三亲和力修饰的igsf结构域包含与野生型或未经修饰的igsf结构域或其特异性结合片段(包含在seq id no:2
‑
27和82中任一个中所示的氨基酸序列中)至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的igsf结构域是igv结构域或igc结构域，如igc1或igc2结构域。在一些实施方案中，所述另外的例如第二或第三igsf结构域是亲和力修饰的igv结构域和/或igc结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的igsf结构域是含有igv结构域和/或一个或多个igc(例如，igc2)结构域，或者igv结构域的特异性结合片段和/或一个或多个igc(例如，igc2)结构域的特异性结合片段的亲和力修饰的igsf结构域，其中igv和/或igc结构域含有一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的亲和力修饰的igsf结构域包含含有一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)的igv结构域。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的亲和力修饰的igsf结构域包括存在于相应未经修饰的igsf家族成员的ecd或ecd的一部分中的igsf结构域，如全长igv结构域和一个或多个全长igc(例如，igc2)结构域或其特异性结合片段，其中igv和igc中的之一或二者含有一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。
[0260]
在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白含有至少一个另外的或第二igsf结构域，其为除cd86之外的与野生型或未经修饰的igsf结构域的igsf结构域(例如，igv)相比含有一个或多个氨基酸取代的vigd。
[0261]
含有变体cd86的至少一个igsf结构域和一个或多个第二或另外的igsf结构域的堆叠分子免疫调节蛋白可以以如第iii.c.3节中所述的各种构建体形式提供。构建体的非限制性例子如下所述。1.pd
‑
1igsf结构域
[0262]
在一些实施方案中，所述至少一个另外的(例如，第二或第三)vigd是与未经修饰的或野生型pd
‑
1相比在igsf结构域(例如igv)中含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代、
缺失或添加)的变体pd
‑
1多肽的igsf结构域(例如igv)。在一些实施方案中，pd
‑
1的igsf结构域包含igv结构域或igv结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述igd可以是单独的igv(包括整个细胞外结构域(ecd))或pd
‑
1的ig结构域的任何组合。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽具有(i)seq id no:10中所示的氨基酸序列或其缺少信号序列的成熟形式，(ii)展现与seq id no:10或其成熟形式至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有igv结构域或其特异性结合片段的一部分。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽具有(i)seq id no:37中所示的氨基酸序列，(ii)展现与seq id no:37至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有igv结构域或其特异性结合片段的一部分。在一些实施方案中，所述未经修饰的pd
‑
1多肽与seq id no:37、335、336或337或其特异性结合片段具有85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。在一些实施方案中，所述未经修饰的pd
‑
1多肽具有seq id no:37、335、336或337中任一个中所示的序列。
[0263]
在一些实施方案中，pd
‑
1的igsf结构域是变体pd
‑
1多肽，所述变体pd
‑
1多肽相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽中包含的igsf结构域含有至少一个亲和力修饰的igsf结构域(例如igv或igc)或其特异性结合片段，使得与野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽相比，所述变体pd
‑
1多肽展现对pd
‑
l1或pd
‑
l2改变(增加或降低)的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽中包含的igsf结构域含有至少一个亲和力修饰的igsf结构域(例如igv)或其特异性结合片段，使得与野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽相比，所述变体pd
‑
1多肽展现对一种或多种配体pd
‑
l1或pd
‑
l2改变(增加或降低)的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2的结合亲和力不同于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽对照序列的结合亲和力，如通过例如固相elisa免疫测定、流式细胞术、fortebio octet或biacore测定所测定的。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽具有对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的pd
‑
l1多肽，所述变体pd
‑
1多肽具有对pd
‑
l2降低的结合亲和力。所述pd
‑
l1和/或所述pd
‑
l2可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。
[0264]
每个同源结合配偶体的结合亲和力是独立的；也就是说，在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽，所述变体pd
‑
1多肽具有对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2中的一种或两种增加的结合亲和力和对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2中的一种或两种降低的结合亲和力。
[0265]
在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽，变体pd
‑
1多肽与对pd
‑
l1增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的pd
‑
l1多肽，变体pd
‑
1多肽具有对pd
‑
l2增加或降低的结合亲和力。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽具有对pd
‑
l1增加的结合亲和力，并且相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽具有对pd
‑
l2降低的结合亲和力。
[0266]
在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽对照，对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2具有增加或更高的结合亲和力的变体pd
‑
1多肽将具有对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2的结合亲和力的至少约5％(如至少约10％、15％、20％、25％、35％或50％)增加。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽的结合亲和力的增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5
倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此类例子中，野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽具有与变体pd
‑
1多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
[0267]
在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽对照，对pd
‑
l2具有减小或降低的结合亲和力的变体pd
‑
1多肽将具有对pd
‑
l2的结合亲和力的至少5％(如至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)降低。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽的结合亲和力的降低超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此类例子中，野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽具有与变体pd
‑
1多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
[0268]
所述pd
‑
l1和/或pd
‑
l2可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。在一些实施方案中，所述pd
‑
l1是人蛋白质。在一些实施方案中，所述pd
‑
l2是人蛋白质。
[0269]
在一些实施方案中，任何前述实施方案的对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2的平衡解离常数(k
d
)可以小于1x10
‑
5 m、1x10
‑
6 m、1x10
‑
7 m、1x10
‑
8 m、1x10
‑
9 m、1x10
‑
10 m或1x10
‑
11
m或1x10
‑
12 m或更小。
[0270]
野生型或未经修饰的pd
‑
1序列不一定必须用作起始组合物以产生本文所述的变体pd
‑
1多肽。因此，术语“修饰”，如“取代”的使用并不意味着所提供的实施方案限于制备变体pd
‑
1多肽的特定方法。变体pd
‑
1多肽可以例如通过从头肽合成来制备，因此不一定需要在改变密码子来为修饰例如取代进行编码的意义上进行修饰，如“取代”。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定制备方法。设计或产生变体pd
‑
1多肽的手段并不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，由野生型或未经修饰的pd
‑
1遗传物质诱变野生型或未经修饰的pd
‑
1编码核酸，并针对所希望的特异性结合亲和力和/或ifn
‑
γ表达的诱导或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中，使用可在很多公共可获得的数据库中获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体pd
‑
1多肽，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供所述信息，并且其网站可通过互联网公开访问，如前所述的uniprotkb数据库也是如此。
[0271]
除非另有说明，否则如本公开文本全文所示，一个或多个氨基酸取代是依据对应于seq id no:37中所示的未经修饰的ecd序列或者未经修饰的igv序列(含有seq id no:10的残基35
‑
145)(在适用时)的位置编号的氨基酸位置编号命名。
[0272]
本文提供的修饰可以位于seq id no:37中所示的野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽中或其含有igv结构域或其特异性结合片段的部分中。在一些实施方案中，所述野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽含有如seq id no:335中所示的pd
‑
1的igv。在一些实施方案中，所述未经修饰的pd
‑
1多肽含有这样的igv，其可以比由seq id no:335所示的氨基酸序列更长或更短，相差若干个氨基酸，如1
‑
15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一些实施方案中，所述未经修饰的pd
‑
1多肽与seq id no:37、335、336或337具有85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。在一些实施方案中，所述未经修饰的pd
‑
1多肽具有seq id no:37中任一个中所示的序列。在一些实施方案中，所述未经修饰的pd
‑
1多肽具有由seq id no:335所示的序列。在一些实施方案中，所述未经修饰的pd
‑
1多肽具有由seq id no:336所示的序列。在一些实施方案中，所述未经修
饰的pd
‑
1多肽具有由seq id no:337所示的序列。在一些实施方案中，所述未经修饰的pd
‑
1多肽具有由seq id no:339所示的序列。
[0273]
如通过参考序列与seq id no:37的比对来鉴定pd
‑
1多肽(包括其含有igsf结构域(例如igv)的部分)中修饰(例如，氨基酸取代)的相应位置，这在技术人员的水平内。例如，在比对后，seq id no:37的残基112对应于seq id no:336的残基107。
[0274]
在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽在野生型或未经修饰的pd
‑
1序列中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)可以在野生型或未经修饰的pd
‑
1序列的胞外结构域(细胞外结构域)中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于igv结构域或其特异性结合片段中。
[0275]
在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。所述修饰(例如取代)可以位于igv结构域中。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽在igv结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽与野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽或其特异性结合片段(如具有seq id no:37、335、336、337或339的氨基酸序列)具有少于100％序列同一性以及至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0276]
在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽在未经修饰的pd
‑
1或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，所述一个或多个氨基酸修饰对应于以下中的关于seq id no:37中所示位置的一个或多个位置：8、9、11、12、13、14、16、17、18、20、21、22、23、24、25、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、64、66、67、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、81、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、100、102、104、105、107、109、111、112、113、114、115、116、119、120、125、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143或144。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽相比，此类变体pd
‑
1多肽展现对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2中的一种或多种改变的结合亲和力。例如，在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽相比，所述变体pd
‑
1多肽展现对pd
‑
l1和/或pd
‑
l2增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未经修饰的pd
‑
1多肽相比，所述变体pd
‑
1多肽展现对pd
‑
l1或pd
‑
l2降低的结合亲和力。
[0277]
在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：p8t、d9e、d9g、d9n、d9v、p11a、w12g、w12l、w12r、n13d、n13s、n13y、p14h、p14l、p14s、t16a、t16i、t16s、f17i、f17l、f17v、f17y、s18t、a20s、a20t、a20v、l21v、l22i、v23e、v23g、v24l、t25a、d28e、n29d、n29s、a30v、t31i、t31n、t31s、t33i、c34y、s35n、f36i、f36l、f36y、s37p、s37t、n38d、n38s、n38t、t39a、t39r、t39s、s40p、s40t、e41d、e41v、s42g、s42r、f43l、f43y、v44h、v44m、v44r、l45i、l45v、n46i、n46v、y48f、y48h、y48n、r49y、r49l、m50d、m50e、m50i、m50l、m50q、m50v、m50t、s51g、p52a、p52l、s53d、s53g、s53l、s53n、s53t、s53v、n54c、n54h、n54d、n54g、n54s、n54y、q55e、q55h、q55k、q55r、t56a、t56l、t56m、t56p、t56s、t56v、d57f、d57r、d57v、d57y、k58l、k58r、k58t、l59m、l59r、l59v、a61l、a61s、e64d、e64k、r66h、r66s、s67c、s67g、s67i、s67n、s67r、q68e、q68i、q68l、q68p、q68r、q68t、p69h、p69l、p69s、g70c、
g70e、g70f、g70i、g70l、g70n、g70r、g70v、g70s、q71h、q71k、q71l、q71p、q71r、d72a、d72g、d72n、c73a、c73g、c73h、c73p、c73s、c73r、c73y、f75y、r76g、r76h、r76s、v77d、v77i、t78i、t78s、q79a、q79p、q79r、l80q、p81s、n82s、r84h、r84q、d85g、d85n、f86y、h87l、h87q、h87r、m88l、m88f、s89g、s89n、v90l、v90m、v91a、v91d、v91i、r92g、r92n、r92s、a93v、r94q、r95l、r95k、r95g、n96d、n96s、n96t、t100a、t100i、t100s、y101f、l102f、l102i、l102y、l102v、g104a、g104t、g104s、g104v、a105c、a105g、a105i、a105l、a105v、i106l、s107a、s107f、s107l、s107t、s107v、l108f、l108i、l108t、l108y、a109d、a109g、a109h、a109s、p110a、k111e、k111g、k111i、k111m、k111n、k111r、k111t、k111v、a112i、a112p、a112v、q113r、q113w、i114t、k115d、k115e、k115in、k115n、k115q、k115r、e116d、r119g、r119h、r119l、r119p、r119q、r119w、a120v、t125a、t125k、t125i、t125s、t125v、r127f、r127l、r127k、r127s、r127v、r128g、r128m、a129s、e130k、v131a、v131e、v131i、v131r、p132h、p132r、p132s、p132t、t133a、t133r、t133s、a134d、a134v、h135n、h135r、h135y、p136l、p136t、s137c、p138s、p138t、s139t、p140a、p140l、p140r、r141g、r141m、r141s、r141w、p142a、p142l、p142r、p142t、a143d、a143s、a143v、g144d或g144s、或其保守氨基酸取代。
[0278]
在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1是含有来自以下的一个或多个氨基酸取代的变体pd
‑
1：n13d、n13s、f17l、t25a、n29s、a30v、n38d、t39a、v44h、v44r、l45i、l45v、n46i、n46v、y48f、y48h、r49y、r49l、m50d、m50e、m50i、m50l、m50q、m50v、s53d、s53g、s53l、s53n、s53v、n54c、n54d、n54g、n54s、n54y、q55e、q55h、q55k、t56a、t56l、t56v、d57f、d57r、d57v、d57y、k58l、k58t、a61l、a61s、s67g、q68e、q68i、q68l、q68p、q68r、q68t、p69l、p69s、g70f、g70i、g70l、g70n、g70r、g70v、q71p、q71r、d72a、d72g、c73s、c73r、r76g、v77i、t78i、q79a、q79r、n82s、h87q、h87r、m88l、m88f、r92g、r95k、r95g、n96d、n96s、y101f、l102i、l102y、l102v、g104s、a105i、a105v、s107a、s107f、s107l、s107t、s107v、l108f、l108i、l108y、a109d、a109h、a109s、p110a、k111e、k111g、k111i、k111r、k111t、k111v、a112i、a112p、a112v、k115r、r119g、a120v、t125a、t125i、t125v、r127f、r127l、r127k、r127v、r128g、v131i、v131r、或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽含有氨基酸取代s67n/c73r/f86y/v91d/s107t/a112v/k115d/a120v。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽具有seq id no:315中所示的氨基酸序列，或展现与seq id no:315至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽含有氨基酸取代v44h/l45v/n46i/y48h/m50e/n54g/k58t/l102v/a105v/a112i。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽具有seq id no:334中所示的氨基酸序列，或展现与seq id no:334至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。此类变体pd
‑
1多肽可以与如所述的一个或多个其他免疫球蛋白超家族(igsf)结构域直接或间接连接。
[0279]
本文提供了免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白含有变体cd86多肽(如第ii节中所述的任一种)和与pd
‑
l1和/或pd
‑
l2结合的pd
‑
1多肽或其变体的igsf结构域(cd86/pd
‑
1免疫调节蛋白)。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽是或含有cd86的细胞外结构域或其igsf(例如igv)结构域或其特异性结合片段，它们含有一个或多个修饰(例如取代)，如本文所述的任一种。在一些实施方案中，所述变体pd
‑
1多肽是或含有pd
‑
1的细胞外结构域或其
igsf(例如igv)结构域或其特异性结合片段，它们含有一个或多个修饰(例如取代)，如本文所述的任一种。cd86/pd
‑
1免疫调节蛋白可以以如第iii.c.3节中所述的各种构建体形式提供。2.肿瘤抗原结合igsf结构域
[0280]
在一些实施方案中，所述一个或多个另外的igsf结构域(例如第二或第三igsf)结构域是结合或识别肿瘤抗原的另一igsf家族成员的igsf结构域(例如，igv)。在此类实施方案中，所述igsf家族成员充当肿瘤定位部分，从而使cd86的vigd非常接近肿瘤微环境中的免疫细胞。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域(例如，第二igsf)是结合或识别肿瘤细胞上表达的b7
‑
h6的nkp30的igsf结构域。
[0281]
在一些实施方案中，所述至少一个另外的(例如，第二)igsf结构域(例如nkp30)是含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代、缺失或添加)的亲和力修饰的igsf结构域或vigd。在一些实施方案中，与未经修饰的igsf结构域(例如nkp30)相比，所述一个或多个氨基酸修饰增加对b7
‑
h6的结合亲和力和/或选择性，如增加至少或至少约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。变体nkp30多肽的igsf结构域(例如，igc样或全ecd)中的示例性氨基酸修饰(如取代、缺失或添加)显示于表2中。在示例性多肽中有nkp30变体，其包含参考对应于seq id no:54中所示位置的在nkp30细胞外结构域中的位置的突变l30v/a60v/s64p/s86g。在一些实施方案中，提供了一种免疫调节蛋白，其含有所提供的变体cd86多肽中的任一种和变体nkp30多肽，所述变体nkp30多肽含有igc样结构域(包括表3中所示的任何氨基酸修饰)(如seq id no:268
‑
272中任一个中所示的igc样结构域)或具有seq id no:268
‑
272中任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％并且含有一个或多个氨基酸修饰的igv结构域。在一些实施方案中，提供了一种免疫调节蛋白，其含有所提供的变体cd86多肽中的任一种和变体nkp30多肽，所述变体nkp30多肽含有ecd或其含有一个或多个igsf结构域的部分(其中含有表3中所示的任何氨基酸修饰)，所述ecd是如seq id no:273
‑
277中任一个中所示的ecd或含有seq id no:273
‑
277中任一个的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％并且含有一个或多个氨基酸修饰的ecd。
[0282]
表3提供了含有可用于本文提供的堆叠构建体中的一个或多个亲和力修饰的igsf结构域的示例性多肽。
[0283]
本文提供了免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白含有变体cd86多肽(如第ii节中所述的任一种)和与b7
‑
h6结合的nkp30多肽或其变体(cd86/nkp30免疫调节蛋白)。在一些实
施方案中，所述变体cd86多肽是或含有cd86的细胞外结构域或其igsf(例如igv)结构域或其特异性结合片段，它们含有一个或多个修饰(例如取代)，如本文所述的任一种。在一些实施方案中，所述变体nkp30多肽是或含有nkp30的细胞外结构域或其igsf(例如igv)结构域或其特异性结合片段，它们含有一个或多个修饰(例如取代)，如本文所述的任一种。所述cd86/nkp30免疫调节蛋白可以以如第iii.c.3节中所述的各种构建体形式提供。在一些实施方案中，所述cd86/nkp30免疫调节蛋白展现与seq id no:135、136、137、138、139或140中任一个中所示的序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，变体cd86/nkp30免疫调节蛋白具有seq id no:135、136、137、138、139或140中所示的序列。3.构建体
[0284]
在一些实施方案中，所述两个或更多个igsf结构域是共价或非共价连接的，其包括cd86的vigd和来自另一个igsf家族成员的一个或多个另外的igsf结构域(例如第二或第三变体igsf结构域)。堆叠的免疫调节蛋白多肽链中的多个非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域不需要彼此直接共价连接。在一些实施方案中，所述两个或更多个igsf结构域直接或如经由接头间接连接。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基的中间跨度将igsf结构域彼此间接共价键合。所述连接可以是经由n末端到c末端残基。在一些实施方案中，可以经由不位于一个或多个igsf结构域的n末端或c末端的氨基酸残基的侧链进行连接。因此，可以经由末端或内部氨基酸残基或其组合进行连接。
[0285]
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白含有各自直接或经由接头间接连接的至少两个igsf结构域。在一些实施方案中，免所述疫调节蛋白含有各自直接或经由接头间接连接的至少三种免疫调节蛋白。各种构型示出在图23a和图23b中。
[0286]
在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接cd86的vigd和一个或多个另外的igsf结构域(例如，第二或第三变体igsf结构域)。在一些实施方案中，肽接头长度可以是单个氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，所述肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头是柔性接头。在一些实施方案中，所述接头是(以单字母氨基酸代码的形式)：ggggs(“4gs”)或4gs接头的多聚体，如2、3、4或5个4gs接头的重复序列。在一些实施方案中，所述肽接头是(ggggs)2(seq id no:225)或(ggggs)3(seq id no:224)。在一些实施方案中，所述接头还可以单独包含一系列丙氨酸残基或者还包含另一个肽接头(如4gs接头或其多聚体)。在一些实施方案中，每个系列中丙氨酸残基的数量是2、3、4、5或6个丙氨酸。在一些实施方案中，所述接头还可以单独包含一系列丙氨酸残基或者还包含另一个肽接头(如4gs接头或其多聚体)。在一些实施方案中，每个系列中丙氨酸残基的数量是2、3、4、5或6个丙氨酸。在一些实施方案中，所述接头是刚性接头。例如，所述接头是α螺旋接头。在一些实施方案中，所述接头是(按单字母氨基酸代码)：eaaak或eaaak接头的多聚体，如2、3、4或5个eaaak接头的重复，如seq id no:265(1xeaaak)、seq id no:266(3xeaaak)或seq id no:247(5xeaaak)中所示。在一些实施方案中，所述接头还可以包括通过克隆引入和/或来自限制位点的氨基酸，例如接头可以包括如通过使用限制位点bamhi引入的氨基酸gs(按单字母氨基酸代码)。例如，在一些实施方案中，所述接头(按单字母氨基酸代码)是gsggggs(seq id no:222)、gs(g4s)3(seq id no:227)或gs(g4s)5(seq id no:228)。在一些例子中，所述
接头是2xggggs，之后是三个丙氨酸(ggggsggggsaaa；seq id no:226)。在一些情况下，包含变体cd86的免疫调节多肽包含肽接头的各种组合。
[0287]
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包括变体cd86分子和变体nkp30分子。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含或具有与由seq id no:135、136、137、138、139或140所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含或具有由seq id no:135、136、137、138、139或140所示的序列。在一些实施方案中，任何前述序列形成同二聚体。在一些实施方案中，所述同二聚体经由多聚化结构域形成，所述多聚化结构域是免疫调节蛋白中包含的fc结构域。在一些实施方案中，所述同二聚体包含seq id no:135的序列。在一些实施方案中，所述同二聚体包含seq id no:136的序列。在一些实施方案中，所述同二聚体包含seq id no:137的序列。在一些实施方案中，所述同二聚体包含seq id no:138的序列。在一些实施方案中，所述同二聚体包含seq id no:139的序列。在一些实施方案中，所述同二聚体包含seq id no:140的序列。
[0288]
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包括变体cd86分子和变体pd
‑
1分子。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含或具有与由seq id no:316、317、318、319、320、321、322或323所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含或具有由seq id no:316、317、318、319、320、321、322或323所示的序列。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含或具有与由seq id no:326或327所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含或具有由seq id no:326或327所示的序列。在一些实施方案中，任何前述序列形成同二聚体。在一些实施方案中，所述同二聚体经由多聚化结构域形成，所述多聚化结构域是免疫调节蛋白中包含的fc结构域。在一些实施方案中，所述同二聚体包含或具有seq id no:326的序列。在一些实施方案中，所述同二聚体包含或具有seq id no:327的序列。
[0289]
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含或具有与由seq id no:328、329、330或331所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白包含或具有由seq id no:328、329、330或331所示的序列。在一些实施方案中，任何前述序列形成异二聚体。在一些实施方案中，所述异二聚体经由多聚化结构域形成，所述多聚化结构域是免疫调节蛋白中包含的fc结构域。在一些实施方案中，所述异二聚体的第一多肽包含seq id no:350的序列，并且异二聚体的第二多肽包含seq id no:351的序列。在一些实施方案中，所述异二聚体的第一多肽包含seq id no:350的序列，并且异二聚体的第二多肽包含seq id no:352的序列。在一些实施方案中，所述异二聚体的第一多肽包含seq id no:350的序列，并且异二聚体的第二多肽包含seq id no:353的序列。
[0290]
在一些实施方案中，所述非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域是通过在非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的n末端和/或c末端插入的“野生型肽接头”连接。这些接头也称为前导序列(非亲和力修饰或亲和力修饰的igsf结构域的n末端)或尾随序列(非亲和力修饰或亲和力修饰的igsf结构域的c末端)，以及存在于野生型蛋白质中
的这样的序列
‑
其紧接着跨于igsf的ig折叠的结构预测的外侧。在一些实施方案中，“野生型接头”是在野生型蛋白质的氨基酸序列中存在于信号序列之后但在igsf结构域(如定义的igv结构域)之前的氨基酸序列。在一些实施方案中，“野生型”接头是在野生型蛋白质的氨基酸序列中紧接在igsf结构域之后(如紧接在定义的igv结构域之后)但在igc结构域之前存在的氨基酸序列。这些接头序列可有助于一个或多个邻近igsf结构域的适当折叠和功能。在一些实施方案中，存在在第一igsf结构域的n末端插入的前导肽接头和/或在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的c末端插入的尾随序列。在一些实施方案中，存在在第二igsf结构域的n末端插入的第二前导肽接头和/或在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的c末端插入的第二尾随序列。当第一和第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自相同的亲本蛋白质并以相同方向连接时，第一与第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域之间的野生型肽接头不重复。例如，当第一尾随野生型肽接头和第二前导野生型肽接头相同时，ii型免疫调节蛋白不包含第一尾随野生型肽接头或第二前导野生型肽接头。
[0291]
在一些实施方案中，所述ii型免疫调节蛋白包含在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的n末端插入的第一前导野生型肽接头，其中所述第一前导野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在所述野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自亲本igsf结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或igsf结构域)之间。在一些实施方案中，所述第一前导野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在所述野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自亲本igsf结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或igsf结构域)之间。
[0292]
在一些实施方案中，所述ii型免疫调节蛋白还包含在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的c末端插入的第一尾随野生型肽接头，其中所述第一尾随野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在所述野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自亲本igsf结构域与紧随其后的结构域(如igsf结构域或跨膜结构域)之间。在一些实施方案中，所述第一尾随野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在所述野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自亲本igsf结构域与紧随其后的结构域(如igsf结构域或跨膜结构域)之间。
[0293]
在一些实施方案中，所述ii型免疫调节蛋白还包含在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的n末端插入的第二前导野生型肽接头，其中所述第二前导野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多中的任何一个)连续氨基酸，在所述野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自亲本igsf结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或igsf结构域)之间。在一些实施方案中，所述第二前导野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在所述野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自亲本igsf结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或igsf结构域)之间。
[0294]
在一些实施方案中，所述ii型免疫调节蛋白还包含在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的c末端插入的第二尾随野生型肽接头，其中所述第二尾随野生型
肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在所述野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自亲本igsf结构域与紧随其后的结构域(如igsf结构域或跨膜结构域)之间。在一些实施方案中，所述第二尾随野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在所述野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域源自亲本igsf结构域与紧随其后的结构域(如igsf结构域或跨膜结构域)之间。
[0295]
在一些实施方案中，所述两个或更多个igsf结构域(包括cd86的vigd和来自另一个igsf家族成员的一个或多个另外的igsf结构域(例如，第二和/或第三变体igsf结构域))与fc连接或附接以形成fc融合物，fc融合物在细胞中表达时在一些方面可以产生二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白。因此，还提供了二聚体多结构域免疫调节蛋白。
[0296]
在一些实施方案中，所述变体cd86多肽和一个或多个igsf结构域独立地与fc区的n或c末端直接或间接连接。在一些实施方案中，所述变体cd86多肽和一个或多个另外的igsf结构域中的至少一个直接或间接连接，并且变体cd86之一和所述一个或多个另外的igsf结构域之一也与fc区的n或c末端直接或间接连接。在一些实施方案中，fc区的n或c末端与变体cd86多肽或所述一个或多个另外的igsf结构域连接，并且fc区的n或c末端中的另一个与cd86变体的中另一个或所述一个或多个另外的igsf结构域中的另一个连接。在一些实施方案中，与fc的连接是经由肽接头，例如如上所述的肽接头。在一些实施方案中，所述变体cd86与所述一个或多个另外的igsf结构域之间的连接是经由肽接头，例如如上所述的肽接头。在一些实施方案中，cd86的vigd、一个或多个另外的igsf结构域和fc结构域可以以多种构型中的任一种连接在一起。在实施例中描述了示例性构型。参见例如图14a至图14d。
[0297]
在一些实施方案中，堆叠的免疫调节蛋白是由两个免疫调节fc融合多肽形成的二聚体。还提供了核酸分子，其编码堆叠的免疫调节蛋白中的任一种。在一些实施方案中，所述二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白可以通过堆叠免疫调节性fc融合多肽的表达或在一些情况下共表达在细胞中产生，如上文根据产生二聚体fc融合蛋白所述。
[0298]
在一些实施方案中，所述二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白对于每个fc区是二价的，对于每个亚基是单价的，或对于一个亚基是二价的而对于另一个亚基是四价的。
[0299]
在一些实施方案中，所述二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白是同二聚体多结构域堆叠fc蛋白。在一些实施方案中，所述二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白包含第一堆叠免疫调节性fc融合多肽和第二堆叠免疫调节性fc融合多肽，其中所述第一多肽和第二多肽相同。在一些实施方案中，所述多结构域堆叠分子包含含有变体cd86和第二igsf结构域的第一fc融合多肽，以及含有变体cd86和第二igsf结构域的第二fc融合多肽。在一些实施方案中，所述多结构域堆叠分子包含含有变体cd86、第二igsf结构域和第三igsf结构域的第一fc融合多肽和含有变体cd86、第二igsf结构域和第三igsf结构域的第二fc融合多肽。在一些实施方案中，所述第一和/或第二融合多肽的fc部分可以是如上所述的任何fc。在一些实施方案中，所述第一和第二融合多肽的fc部分或区是相同的。
[0300]
在一些实施方案中，所述多结构域堆叠分子是异二聚体，其包含两种不同的fc融合多肽，例如第一和第二fc融合多肽，其中至少一种是含有至少一种变体cd86多肽的fc融合多肽和/或至少一种是含有第二igsf结构域(例如第二变体igsf结构域)的fc融合多肽。在一些实施方案中，所述第一或第二fc融合多肽还含有第三igsf结构域(例如，第三变体
igsf结构域)。在一些实施方案中，所述多结构域堆叠分子包含含有变体cd86的第一fc融合多肽和含有第二igsf结构域的第二fc融合多肽，其中，在一些情况下，第一或第二fc融合多肽另外含有第三igsf结构域。在一些实施方案中，所述多结构域堆叠分子包含含有变体cd86、第二igsf结构域、以及在一些情况下第三igsf结构域的第一fc融合多肽和不与变体cd86多肽或另外的igsf结构域连接的第二fc融合多肽。在一些实施方案中，所述第一和第二融合多肽的fc部分或区是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二融合多肽的fc部分或区是不同的。
[0301]
在一些实施方案中，所述多结构域堆叠分子包含含有1、2、3、4个或更多个变体cd86多肽和1、2、3、4个或更多个另外的igsf结构域的第一fc融合多肽，其中第一堆叠fc融合多肽中igsf结构域的总数大于2、3、4、5、6个或更多个。在这种实施方案的一个例子中，所述第二堆叠fc融合多肽含有1、2、3、4个或更多个变体cd86多肽和1、2、3、4个或更多个另外的igsf结构域，其中第一堆叠fc融合多肽中igsf结构域的总数大于2、3、4、5、6个或更多个。在这种实施方案的另一个例子中，所述第二fc融合多肽不与变体cd86多肽或另外的igsf结构域连接。
[0302]
在一些实施方案中，所述异二聚体堆叠分子含有第一堆叠免疫调节性fc融合多肽和第二堆叠免疫调节性fc融合多肽，其中所述第一多肽和第二多肽不同。在一些实施方案中，所述异二聚体堆叠分子包含含有fc区和第一变体cd86多肽和/或第二igsf结构域(例如，第二变体igsf结构域)的第一fc多肽融合物和含有fc区和第一变体cd86多肽或第二igsf结构域中的另一个的第二fc多肽融合物。在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含含有fc区和第一变体cd86多肽和/或第二igsf结构域(例如，第二变体igsf结构域)的第一fc多肽融合物和含有fc区和第一变体cd86多肽和第二igsf结构域(例如，第二变体igsf结构域)二者但处于与第一fc区不同的取向或构型的第二fc多肽融合物。在一些实施方案中，所述第一和/或第二fc融合多肽还含有第三igsf结构域(例如，第三变体igsf结构域)。
[0303]
在一些实施方案中，所述第一和第二堆叠的免疫调节fc融合多肽中的之一或二者的fc结构域包含修饰(例如取代)，使得fc分子的界面被修饰为有利于和/或促进异二聚化。在一些实施方案中，修饰包括将突出部(杵)引入第一fc多肽中并将腔(臼)引入第二fc多肽中，使得突出部可定位在腔中以促进第一含fc的多肽和第二含fc的多肽的复合。靶向用于替代和/或修饰以在多肽中产生突出部或腔的氨基酸通常是与第二多肽的界面中的一个或多个氨基酸相互作用或接触的界面氨基酸。
[0304]
在一些实施方案中，在构建体的fc序列前面添加氨基酸序列，其中fc序列是所述序列的n末端部分。在一些情况下，紧接在构建体的fc序列前面添加氨基酸序列hmssvsaq(seq id no:279)，其中fc序列是所述序列的n末端部分。在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含含有fc区(杵；例如，seq id no:252或324中所示的fc序列)和第一变体多肽和/或第二igsf结构域(例如，第二变体igsf结构域)的第一fc多肽融合物和含有fc区(臼；例如，seq id no:280或325中所示的fc序列)的第二fc多肽融合物，并且紧接在所述第一和第二fc多肽融合物的两个fc区前面添加填充序列hmssvsaq(seq id no:279)。
[0305]
在一些实施方案中，被修饰以含有突出部(杵)氨基酸的第一多肽包含用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸，所述至少一个侧链从第一多肽的界面突出，因此可位于第二多肽的相邻界面中的补偿腔(臼)中。最常见的是，所述替代氨基酸是具有比
原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定产生突出部的理想的替代氨基酸。在一些实施方案中，用于形成突出部的替代残基是天然存在的氨基酸残基，并且包括例如精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)或色氨酸(w)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始残基是具有小侧链的氨基酸残基，例如像丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
[0306]
在一些实施方案中，被修饰以含有腔(臼)的第二多肽是包含用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸的多肽，所述至少一个侧链从第二多肽的界面凹进，因此能够从第一多肽的界面容纳相应的突出部。最常见的是，所述替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定对于形成腔而言理想的替代残基。通常，用于形成腔的替代残基是天然存在的氨基酸，并且包括例如丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和缬氨酸(v)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始氨基酸是具有大侧链的氨基酸，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
[0307]
例如，人igg1的ch3界面例如包括位于四个反平行β链上的每个结构域上的十六个残基，所述每个结构域从每个表面掩埋1090(参见例如deisenhofer等人(1981)biochemistry,20:2361
‑
2370；miller等人,(1990)j mol.biol.,216,965
‑
973；ridgway等人,(1996)prot.engin.,9:617
‑
621；美国专利号5,731,168)。例如，用于产生突出部或腔而对ch3结构域的修饰描述于以下文献中：例如美国专利号5,731,168；国际专利申请wo98/50431和wo2005/063816；和ridgway等人,(1996)prot.engin.,9:617
‑
621。在一些例子中，用于产生突出部或腔而对ch3结构域的修饰通常靶向位于两个中心反平行β链上的残基。目的是最小化以下风险，即产生的突出部可通过突出到周围溶剂中而被容纳而不是由配偶体ch3结构域中的补偿腔容纳。
[0308]
在一些实施方案中，所述异二聚体分子含有“杵链”的ch3结构域中的t366w突变，以及“臼链”的ch3结构域中的t366s、l368a、y407v突变。在一些情况下，例如通过将y349c突变引入“杵”或“臼”链的ch3结构域中，以及将e356c突变或s354c突变引入另一条链的ch3结构域中，还可以使用ch3结构域之间的另外的链间二硫桥(merchant,a.m.,等人,nature biotech.16(1998)677
‑
681)。在一些实施方案中，所述异二聚体分子含有两个ch3结构域之一中的s354ct366w突变，以及两个ch3结构域中的另一个中的y349c、t366s、l368a、y407v突变。在一些实施方案中，所述异二聚体分子包含两个ch3结构域之一中的e356c、t366w突变，以及两个ch3结构域中的另一个中的y349c、t366s、l368a、y407v突变。在一些实施方案中，所述异二聚体分子包含两个ch3结构域之一中的y349c、t366w突变以及两个ch3结构域中的另一个中的e356c、t366s、l368a、y407v突变。在一些实施方案中，所述异二聚体分子包含两个ch3结构域之一中的y349c、t366w突变以及两个ch3结构域中的另一个中的s354c、t366s、l368a、y407v突变。其他杵臼结构技术的例子是本领域已知的，例如，如ep 1 870 459a1所述。
[0309]
在一些实施方案中，所述异二聚体分子的fc区另外可以含有一个或多个其他fc突变，如上文所述的任一种。在一些实施方案中，所述异二聚体分子含有具有降低效应子功能的突变的fc区。
[0310]
在一些实施方案中，含有ch3突出部(杵)/腔(臼)修饰的fc变体可以在任何地方与
堆叠的免疫调节多肽接合，但通常经由其n或c末端与第一和/或第二堆叠的免疫调节多肽的n或c末端接合，例如以形成融合多肽。所述连接可以是直接的或经由接头间接的。通常，通过含有一个或多个ch3突出部修饰的fc变体连接的第一堆叠的免疫调节多肽与含有一个或多个ch3腔修饰的fc变体连接的第二堆叠的免疫调节多肽的共表达来产生杵和臼分子。d.变体多肽和免疫调节蛋白的缀合物和融合物
[0311]
在一些实施方案中，本文提供的变体多肽是包含igsf家族(vigd)的ig结构域的变体的免疫调节蛋白，所述变体多肽可以与部分(如效应子部分，如另一种蛋白质)直接或间接地缀合或融合以形成缀合物(“igsf缀合物”)。在一些实施方案中，所述附接可以是共价的或非共价的，例如，经由生物素
‑
链霉亲和素非共价相互作用。在cd86
‑
fc变体融合物的一些实施方案中，任何两种或更多种前述缀合物中的任何一种或组合可以附接至fc或变体cd86多肽或附接至二者。
[0312]
在一些实施方案中，所述部分可以是靶向部分、小分子药物(小于500道尔顿摩尔质量的非多肽药物)、毒素、细胞抑制剂、细胞毒剂、免疫抑制剂、适用于诊断目的的放射性试剂、用于治疗目的的放射性金属离子、前药活化酶、增加生物半衰期的试剂、或诊断或可检测的试剂。
[0313]
在一些实施方案中，所述效应子部分是治疗剂，如癌症治疗剂，其具有细胞毒性、细胞抑制性或以其他方式提供一些治疗益处。在一些实施方案中，所述效应子部分是靶向部分或试剂，如靶向细胞表面抗原(例如肿瘤细胞表面上的抗原)的试剂。在一些实施方案中，所述效应子部分是标记，其可以直接或间接地产生可检测信号。在一些实施方案中，所述效应子部分是毒素。在一些实施方案中，所述效应子部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。
[0314]
在一些实施方案中，1、2、3、4、5个或更多个可以相同或不同的效应子部分与变体多肽或蛋白质缀合、连接或融合以形成igsf缀合物。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的和下文描述的各种分子生物学或化学缀合和连接方法将此类效应子部分附接于变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，接头，如肽接头、可切割接头、不可切割接头或有助于缀合反应的接头可用于将效应子部分与变体多肽或免疫调节蛋白连接或缀合。
[0315]
在一些实施方案中，所述igsf缀合物包含如下组分：(蛋白质或多肽)、(l)
q
和(效应子部分)
m
，其中所述蛋白质或多肽是能够结合所述的一种或多种同源反结构配体的变体多肽或免疫调节蛋白中的任何一种；l是用于将蛋白质或多肽与所述部分连接的接头；m为至少1；q为0或更大；并且所得的igsf缀合物与一种或多种反结构配体结合。在具体实施方案中，m为1至4且q为0至8。
[0316]
在一些实施方案中，提供了igsf缀合物，其包含与靶向剂缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白，所述靶向剂与细胞表面分子缀合，例如，以用于将变体多肽或免疫调节蛋白靶向递送至特定细胞。在一些实施方案中，所述靶向剂是一种或多种分子，其具有定位并结合受试者中正常细胞/组织和/或肿瘤细胞/肿瘤上存在的分子的能力。换言之，包含靶向剂的igsf缀合物可以与存在于细胞(如肿瘤细胞)上的配体(直接或间接地)结合。预期使用的本发明的靶向剂包括可以结合靶细胞或分子的组分的抗体、多肽、肽、适体、其他配体或其任何组合。
[0317]
在一些实施方案中，所述靶向剂在施用至受试者后结合一个或多个肿瘤细胞或可
在肿瘤细胞附近(例如肿瘤血管或肿瘤微环境)结合。所述靶向剂可以与癌细胞表面上的受体或配体结合。在本发明的另一个方面，选择对非癌性细胞或组织具有特异性的靶向剂。例如，靶向剂可以对于通常存在于特定细胞或组织上的分子具有特异性。此外，在一些实施方案中，相同的分子可以存在于正常细胞和癌细胞上。各种细胞组分和分子是已知的。例如，如果靶向剂对egfr具有特异性，则所得的igsf缀合物可以靶向表达egfr的癌细胞以及表达egfr的正常皮肤表皮细胞。因此，在一些实施方案中，本发明的igsf缀合物可通过两种不同的机制(靶向癌细胞和非癌细胞)起作用。
[0318]
在本文公开的本发明的各个方面，本发明的igsf缀合物包含靶向剂，其可以结合/靶向细胞组分，如肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、支原体抗原、真菌抗原、朊病毒抗原、来自寄生虫的抗原。在一些方面，细胞组分、抗原或分子可以各自用于表示靶向剂的所需靶标。例如，在各种实施方案中，靶向剂对组分具有特异性或与组分结合，所述组分包括但不限于表皮生长因子受体(egfr、erbb
‑
1、her1)、erbb
‑
2(her2/neu)、erbb
‑
3/her3、erbb
‑
4/her4、egfr配体家族；胰岛素样生长因子受体(igfr)家族、igf结合蛋白(igfbp)、igfr配体家族；血小板衍生生长因子受体(pdgfr)家族、pdgfr配体家族；成纤维细胞生长因子受体(fgfr)家族、fgfr配体家族、血管内皮生长因子受体(vegfr)家族、vegf家族；hgf受体家族；trk受体家族；肝配蛋白(eph)受体家族；axl受体家族；白细胞酪氨酸激酶(ltk)受体家族；tie受体家族、血管生成素1,2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ror)受体家族，例如ror1；cd171(l1cam)；b7
‑
h6(ncr3lg1)；cd80、肿瘤糖基化抗原，例如stn或tn(如muc1的stn ag)；lhr(lhcgr)；磷脂酰丝氨酸、盘状结构域受体(ddr)家族；ret受体家族；klg受体家族；ryk受体家族；musk受体家族；转化生长因子
‑
α(tgf
‑
α)受体、tgf
‑
β；细胞因子受体、i类(血细胞生成素家族)和ii类(干扰素/il
‑
10家族)受体、肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族(tnfrsf)、死亡受体家族；癌
‑
睾丸(ct)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原、α
‑
辅肌动蛋白
‑
4、artcl、断点簇区域
‑
阿贝尔森(abelson)(bcr
‑
abl)融合产物、b
‑
raf、半胱天冬酶
‑
5(casp
‑
5)、半胱天冬酶
‑
8(casp
‑
8)、β
‑
连环蛋白(ctnnb1)、细胞分裂周期27(cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)、cdkn2a、coa
‑
i、dek
‑
can融合蛋白、eftud
‑
2、延伸因子2(elf2)、ets变异基因6/急性髓细胞白血病1基因ets(etc6
‑
aml1)融合蛋白、纤连蛋白(fn)(例如纤连蛋白的额胞外域a(eda))、gpnmb、低密度脂质受体/gdp
‑
l岩藻糖：β
‑
d
‑
半乳糖2
‑
α
‑
l
‑
岩藻糖基转移酶(ldlr/fut)融合蛋白、hla
‑
a2、在hla
‑
a2基因(hla
‑
a*201
‑
r170i)中α2
‑
结构域的α
‑
螺旋的残基170处精氨酸与异亮氨酸交换、hla
‑
a1、热休克蛋白70
‑
2突变(hsp70
‑
2m)、k1aa0205，mart2、黑色素瘤普遍突变1,2,3(mum
‑
1,2,3)、前列腺酸性磷酸酶(pap)、新
‑
pap、肌球蛋白i类、nfyc、ogt、os
‑
9、pml
‑
rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、k
‑
ras(kras2)、n
‑
ras(nras)、hras、rbaf600、sirt2、snrpd1、syt
‑
ssx1或
‑
ssx2融合蛋白、磷酸丙糖异构酶、bage、bagk
‑
1、bage
‑
2,3,4,5、gage
‑
1,2,3,4,5,6,7,8、gnt
‑
v(异常n
‑
乙酰葡糖胺基转移酶v、mgat5)、herv
‑
k
‑
mel、kk
‑
lc、km
‑
hn
‑
i、lage、lage
‑
i、ctl识别的黑色素瘤抗原(camel)、mage
‑
a1(mage
‑
i)、mage
‑
a2、mage
‑
a3、mage
‑
a4、mage
‑
a5、mage
‑
a6、mage
‑
a8、mage
‑
a9、mage
‑
alo、mage
‑
ai l、mage
‑
a12、mage
‑
3、mage
‑
bl、mage
‑
b2、mage
‑
b5、mage
‑
b6、mage
‑
cl、mage
‑
c2、粘蛋白1(muc1)、mart
‑
1/melan
‑
a(mlana)、gp1oo、gp1oo/pmell7(silv)、酪氨酸酶(tyr)、trp
‑
i、hage、na
‑
88、ny
‑
eso
‑
i、ny
‑
eso
‑
l/lage
‑
2、sage、spl7、ssx
‑
1,2,3,4、trp2
‑
int2、癌胚抗原(cea)、激肽释放酶4、乳房珠蛋白
‑
a、oal、前列腺特异性抗原(psa)、trp
‑
1/gp75、trp
‑
2、脂肪分化相关蛋白
(adipophilin)、黑色素瘤2(aim
‑
2)中不存在的诱导蛋白、bing
‑
4、cpsf、细胞周期蛋白d1、上皮细胞粘附分子(ep
‑
cam)、epha3、成纤维细胞生长因子
‑
5(fgf
‑
5)、糖蛋白250(gp250)、egfr(erbb1)、her
‑
2/neu(erbb2)、白介素13受体α2链(il13rα2)、il
‑
6受体、肠道羧基酯酶(ice)、甲胎蛋白(afp)、m
‑
csf、mdm
‑
2、muc1、p53(tp53)、pbf、prame、psma、rage
‑
i、rnf43、ru2as、soxlo、steap1、存活蛋白(birc5)、人端粒酶逆转录酶(htert)、端粒酶、肾母细胞瘤基因(wt1)、sycpl、brdt、spanx、xage、adam2、page
‑
5、lipl、ctage
‑
i、csage、mmal、cage、boris、hom
‑
tes
‑
85、af15ql4、hca661、ldhc、morc、sgy
‑
i、spol 1、tpxl、ny
‑
sar
‑
35、fthl17、nxf2、tdrdl、tex15、fate、tpte、免疫球蛋白独特型、bence
‑
jones蛋白、雌激素受体(er)、雄激素受体(ar)、cd40，cd30、cd20、cd19、cd33、癌抗原72
‑
4(ca 72
‑
4)、癌抗原15
‑
3(ca 15
‑
3)、癌抗原27
‑
29(ca 27
‑
29)、癌抗原125(ca 125)、癌抗原19
‑
9(ca 19
‑
9)、β
‑
人绒毛膜促性腺激素、β
‑
2微球蛋白、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇化酶、热休克蛋白gp96、gm2、沙格司亭、ctla
‑
4、707丙氨酸脯氨酸(707
‑
ap)、t细胞识别的腺癌抗原4(art
‑
4)、致癌胚抗原肽
‑
1(cap
‑
i)、钙激活氯通道
‑
2(clca2)、亲环蛋白b(cyp
‑
b)、人印戒肿瘤
‑
2(hst
‑
2)、人乳头瘤病毒(hpv)蛋白(hpv
‑
e6、hpv
‑
e7、主要或次要衣壳抗原及其他)、epstein
‑
barr病毒(ebv)蛋白(ebv潜伏膜蛋白质
‑
lmp1、lmp2；其他)、乙型肝炎或丙型肝炎病毒蛋白以及hiv蛋白。
[0319]
在一些实施方案中，igsf缀合物通过其靶向剂将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而经由调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫细胞激活的负调节分子)、抑制存活信号(例如，生长因子或细胞因子或激素受体拮抗剂)、激活死亡信号和/或免疫介导的细胞毒性(如通过抗体依赖性细胞毒性)促进靶细胞的杀伤。此类igsf缀合物可通过几种机制起作用以预防、减少或消除肿瘤细胞，如促进缀合的效应子部分向肿瘤靶标的递送，如通过受体介导的igsf缀合物的内吞作用进行递送；或这种缀合物可以募集、结合和/或激活免疫细胞(例如，nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、t细胞、b细胞)。此外，在一些情况下，一种或多种前述途径可以在施用一种或多种本发明的igsf缀合物时起作用。
[0320]
在一些实施方案中，igsf缀合物通过其靶向剂将定位于(如结合)肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而调节肿瘤附近的免疫应答的细胞。在一些实施方案中，所述靶向剂促进缀合的igsf(例如，vigd)递送至肿瘤靶标，如以与其同源结合配偶体相互作用以改变携带同源结合配偶体的免疫细胞(例如，nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、t细胞、b细胞)的信号传导。
[0321]
在一些实施方案中，所述靶向剂是免疫球蛋白。如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括天然或人工单价或多价抗体，其包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、fab片段、f(ab')片段，由fab表达文库产生的片段、单链fv(scfv)、抗独特型(抗id)抗体(包括针对例如本发明抗体的抗id抗体)以及任何上述的表位结合片段。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，例如，含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以具有任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或免疫球蛋白分子的子类。
[0322]
在一些实施方案中，igsf缀合物通过其抗体靶向部分将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而经由调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫
细胞激活的负调节分子)、抑制存活信号(例如，生长因子或细胞因子或激素受体拮抗剂)、激活死亡信号和/或免疫介导的细胞毒性(如通过抗体依赖性细胞毒性)促进靶细胞的凋亡。此类igsf缀合物可通过几种机制起作用以预防、减少或消除肿瘤细胞，如促进缀合的效应子部分向肿瘤靶标的递送，如通过受体介导的igsf缀合物的内吞作用进行递送；或这种缀合物可以募集、结合和/或激活免疫细胞(例如nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、t细胞、b细胞)。
[0323]
在一些实施方案中，igsf缀合物通过其抗体靶向部分将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫细胞激活的负调节)。在一些实施方案中，此类缀合物可识别、结合和/或调节(例如抑制或激活)免疫细胞(例如nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、t细胞、b细胞)。
[0324]
本发明的抗体靶向部分包括抗体片段，其包括但不限于fab、fab’和f(ab')2、fd、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)和包含vl或vh结构域的片段。结合抗原的抗体片段(包括单链抗体)可以单独包含一个或多个可变区或者一个或多个可变区与以下的全部或部分的组合：铰链区、ch1、ch2和ch3结构域。本发明还包括抗原结合片段，所述抗原结合片段还包含一个或多个可变区与铰链区、ch1、ch2和ch3结构域的任何组合。本发明还包括fc片段、抗原
‑
fc融合蛋白和fc靶向部分缀合物或融合产物(fc
‑
肽、fc
‑
适体)。本发明的抗体靶向部分可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。在一个方面，所述抗体靶向部分是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。此外，此类抗体可以是人源化或嵌合形式的动物抗体。本发明的抗体靶向部分可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更高的多特异性。
[0325]
在各种实施方案中，抗体/靶向部分经由fc(抗体中)与fc受体(免疫细胞上)之间的相互作用以及经由本文提供的缀合的变体多肽或免疫调节蛋白来募集、结合和/或激活免疫细胞(例如，nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞)。在一些实施方案中，抗体/靶向部分识别或结合肿瘤剂，并经由本文提供的缀合变体多肽或免疫调节蛋白定位于肿瘤细胞，以促进肿瘤附近免疫细胞的调节。
[0326]
可以掺入igsf缀合物中的抗体的例子包括但不限于以下抗体，如帕妥珠单抗西妥昔单抗(imc
‑
c225；)、曲妥珠单抗利妥昔单抗(rituxanb；)、贝伐单抗阿伦单抗帕尼单抗(abx
‑
egf；)、兰尼单抗替伊莫单抗、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)托西莫单抗、碘i 131托西莫单抗卡妥索单抗吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星阿巴西普(ctla4
‑
ig；)、贝拉西普(l104ea29yig；lea29y；lea)、伊匹单抗(mdx
‑
010；mdx
‑
101)、曲美木单抗(替西木单抗；cp
‑
675,206)、prs
‑
010、prs
‑
050、阿柏西普(vegf trap、ave005)、伏洛昔单抗(m200)、f200、morab
‑
009、ss1p(cat
‑
5001)、西妥木单抗(imc
‑
a12)、马妥珠单抗(emd72000)、尼妥珠单抗(h
‑
r3)、扎鲁木单抗(humax
‑
egfr)、耐昔妥珠单抗imc
‑
11f8、mab806/ch806、sym004、mab
‑
425、panorex@(17
‑
1a)(鼠单克隆抗体)；panorex@(17
‑
1a)(嵌合鼠单克隆抗体)；idec
‑
y2b8
(鼠，抗cd20 mab)；bec2(抗独特型mab，模拟gd表位)(具有bcg)；oncolym(lym
‑
1单克隆抗体)；smart mi95 ab、人源化13'i lym
‑
i(oncolym)、ovarex(b43.13、抗独特型小鼠mab)；mdx
‑
210(人源化抗her
‑
2双特异性抗体)；与腺癌上的egp40(17
‑
1a)泛癌抗原结合的3622w94 mab；抗vegf、赛尼哌(zenapax)(smart抗tac(il
‑
2受体)；smart mi95 ab、人源化ab，人源化)；mdx
‑
210(人源化抗her
‑
2双特异性抗体)；mdx
‑
447(人源化抗egf受体双特异性抗体)；novomab
‑
g2(泛癌特异性ab)；tnt(嵌合mab至组蛋白抗原)；tnt(嵌合mab至组蛋白抗原)；gliomab
‑
h(monoclon s
‑
人源化ab)；gni
‑
250mab；emd
‑
72000(嵌合
‑
egf拮抗剂)；lymphocide(人源化ll2抗体)；以及mdx
‑
260双特异性靶标gd
‑
2、ana ab、smart idlo ab、smart abl 364ab或immurait
‑
cea。如前述列表中所展示，常规地制备针对特定靶表位的抗体。
[0327]
在一些实施方案中，所提供的缀合物(包括融合分子)的抗体或抗原结合片段是西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗
‑
美坦新(ado
‑
trastuzumab emtansine)、托西莫单抗利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(zevalin)、达克珠单抗(zenapax)、吉妥珠单抗(mylotarg)、阿仑单抗、cea
‑
scan fab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼、阿昔替尼、博舒替尼、卡博替尼、色瑞替尼、克唑替尼、达拉菲尼、达沙替尼、地努图希单抗(dinutuximab)(unituxin
tm
)、埃罗替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼罗替尼、奥拉帕尼、奥拉妥单抗(olaratumab)(lartruvo
tm
)、帕博西尼(palbociclib)、帕唑帕尼、帕妥珠单抗雷莫芦单抗瑞戈非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、替西罗莫司、曲美替尼、凡德他尼、维莫非尼(vemurafenib)、维莫德吉(vismodegib)、巴利昔单抗、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、皮地利珠单抗(ct
‑
011)、amp
‑
224、msb001078c或medi4736、bms
‑
935559、ly3300054、阿特珠单抗、阿维鲁单抗或度伐单抗或是其抗原结合片段。在一些，所提供的缀合物(包括融合分子)的抗体或抗原结合片段是帕妥珠单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体靶向部分是含有fc结构域的全长抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述变体多肽或免疫调节蛋白与抗体靶向部分的fc部分缀合，如通过与抗体的fc部分的n末端缀合。
[0328]
在一些实施方案中，所述vigd与抗体的轻链和/或重链的n或c末端直接或间接连接。在一些实施方案中，连接可以经由肽接头，如以上描述的任何一种肽接头。在一些实施方案中，所述接头还可以包括通过克隆和/或从限制性位点引入的氨基酸。在一些实施方案中，所述接头可以在由限制性位点引入的任一端上包括另外的氨基酸。例如，所述接头可以包括如通过使用限制性位点afei引入的另外的氨基酸如sa(呈一个字母的氨基酸代码的形式)。可以构建各种构型。图18a至图18c描绘了示例性构型。在一些实施方案中，可以通过在细胞中共表达抗体的重链和轻链来产生抗体缀合物。
[0329]
在一些实施方案中，可以将her2抗体或其抗原结合片段掺入igsf缀合物中。可以掺入igsf缀合物中的her2抗体的例子包括但不限于诸如帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的抗体。在一些实施方案中，vigd与抗her2抗体的轻链和/或重链的n或c末端直接或间接连接。在一些实施方案中，所述抗her2抗体是帕妥珠单抗抗her2抗体帕妥
珠单抗的示例性轻链和重链分别显示于seq id no:341和340中。在一些实施方案中，本文所述的变体cd86多肽与帕妥珠单抗的轻链和/或重链的n或c末端连接。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含或具有seq id no:342的v
h
序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含或具有seq id no:343的v
l
序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含或具有seq id no:344的v
h
序列。在一些实施方案中，包含帕妥珠单抗的缀合物包含或具有seq id no:345的v
l
序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含与seq id no:342具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链序列和与seq id no:341具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含与seq id no:340具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链序列和与seq id no:343具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含与seq id no:344具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链序列和与seq id no:341具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含与seq id no:340具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链序列和与seq id no:345具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含seq id no:342的重链序列和seq id no:341的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含seq id no:340的重链序列和seq id no:343的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含seq id no:344的重链序列和seq id no:341的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕妥珠单抗的缀合物包含seq id no:340的重链序列和seq id no:345的轻链序列。
[0330]
在一些实施方案中，可以将egfr(her1)抗体或其抗原结合片段掺入igsf缀合物中。可以掺入igsf缀合物中的egfr抗体的例子包括但不限于诸如帕尼单抗和西妥昔单抗的抗体。在一些实施方案中，vigd与抗egfr抗体的轻链和/或重链的n或c末端直接或间接连接。在一些实施方案中，抗egfr抗体是帕尼单抗。在一些实施方案中，本文所述的变体cd86多肽与帕尼单抗的轻链和/或重链的n或c末端连接。抗egfr抗体帕尼单抗的示例性轻链和重链分别显示于seq id no:347和346中。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含或具有seq id no:348的v
h
序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含或具有seq id no:349的v
l
序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含或具有seq id no:350的v
h
序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含或具有seq id no:351的v
l
序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含与seq id no:348具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链序列和与seq id no:347具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含与seq id no:346具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链序列和与seq id no:349具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含与seq id no:350具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链序列和与seq id no:347具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含与seq id no:346具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链序列和与seq id no:351具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含seq id no:348的重链序列和seq id no:347的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含seq id no:346的重链序列和seq id no:349的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含seq id no:350的重链序列和seq id no:347的轻链序列。在一些实施方案中，含有帕尼单抗的缀合物包含seq id no:346的重链序列和seq id no:351的轻链序列。
[0331]
在本发明的一个方面，所述靶向剂是适体分子。例如，在一些实施方案中，所述适体由充当靶向剂的核酸构成。在各种实施方案中，本发明的igsf缀合物包含对肿瘤细胞、肿瘤血管和/或肿瘤微环境上的分子具有特异性的适体。在一些实施方案中，所述适体本身可以包含生物活性序列以及靶向模块(序列)，其中所述生物活性序列可以诱导针对靶细胞的免疫应答。换言之，这种适体分子是两用试剂。在一些实施方案中，本发明的igsf缀合物包括适体与抗体的缀合，其中所述适体和所述抗体特异性结合肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤微环境和/或免疫细胞上的单独分子。
[0332]
术语“适体”包括基于对特定分子的特异性结合特性选择的dna、rna或肽。例如，可以选择一种或多种适体用于结合如本文所公开的肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤微环境和/或免疫细胞中的特定基因或基因产物，其中通过本领域已知且本领域技术人员熟悉的方法进行选择。
[0333]
在本发明的一些方面，所述靶向剂是肽。例如，本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白可以与可与癌症或肿瘤细胞的组分结合的肽缀合。因此，本发明的这种igsf缀合物包含肽靶向剂，其与肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境的组分结合。在一些实施方案中，靶向剂肽可以是整合素的拮抗剂或激动剂。包含α和β亚基的整合素包括本领域技术人员公知的许多类型。
[0334]
在一个实施方案中，所述靶向剂是vvβ3。整合素vvβ3在多种细胞上表达，并且已显示介导几种生物相关过程，包括破骨细胞粘附于骨基质、血管平滑肌细胞的迁移和血管生成。整合素的合适靶向分子包括针对其他整合素如v4.βi(vla
‑
4)、v4
‑
p7(参见例如美国专利号6,365,619；chang等人,bioorganic&medicinal chem lett,12:159
‑
163(2002)；lin等人,bioorganic&medicinal chem lett,12:133
‑
136(2002))的rgd肽或肽模拟物以及非rgd肽或肽模拟物(参见例如美国专利号5,767,071和5,780,426)等。
[0335]
在一些实施方案中，提供了igsf缀合物，其包含与治疗剂缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，所述治疗剂包括例如道诺霉素、多柔比星、甲氨
蝶呤和长春地辛(rowland等人,cancer immunol.immunother.21:183
‑
187,1986)。在一些实施方案中，所述治疗剂具有细胞内活性。在一些实施方案中，所述igsf缀合物被内化，并且治疗剂是阻断细胞的蛋白质合成从而导致细胞死亡的细胞毒素。在一些实施方案中，所述治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素，包括例如白树毒素、bouganin、皂草素、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白a链、异株泻根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌外毒素a及其变体。在一些实施方案中，在治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素时，igsf缀合物必须在结合至靶细胞结合后内化，以使所述蛋白质对所述细胞具有细胞毒性。
[0336]
在一些实施方案中，提供了igsf缀合物，其包含与毒素缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，所述毒素包括例如细菌毒素(如白喉毒素)、植物毒素(如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(如格尔德霉素(mandler等人,j.nat.cancer inst.92(19):1573
‑
1581(2000)；mandler等人,bioorganic&med.chem.letters 10:1025
‑
1028(2000)；mandler等人,bioconjugate chem.13:786
‑
791(2002))、美登木素生物碱(ep 1391213；liu等人,proc.natl.acad.sci.usa 93:8618
‑
8623(1996))和加利车霉素(lode等人,cancer res.58:2928(1998)；hinman等人,cancer res.53:3336
‑
3342(1993)))。所述毒素可通过包括微管蛋白结合、dna结合或拓扑异构酶抑制的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制作用。
[0337]
在一些实施方案中，提供了igsf缀合物，其包含与标记缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白，所述标记可间接或直接地产生可检测信号。这些igsf缀合物可用于研究或诊断应用，如用于体内癌症检测。所述标记优选能够直接或间接地产生可检测信号。例如，所述标记可以是不透射线的或放射性同位素，如3h、14c、32p、35s、123i、125i、131i；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，如碱性磷酸酶、β
‑
半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在一些实施方案中，所述标记是用于闪烁照相研究的放射性原子(例如99tc或123i)或用于核磁共振(nmr)成像的自旋标记(也称为磁共振成像，mri)，如锆
‑
89、碘
‑
123、碘
‑
131、铟
‑
111、氟
‑
19、碳
‑
13、氮
‑
15、氧
‑
17、钆、锰或铁。锆
‑
89可以与各种金属螯合剂复合并与抗体缀合，例如用于pet成像(wo 2011/056983)。在一些实施方案中，所述igsf缀合物可间接地检测。例如，对igsf缀合物具有特异性并含有可检测标记的二级抗体可用于检测igsf缀合物。
[0338]
所述igsf缀合物可以使用本领域已知的任何方法制备。参见例如wo 2009/067800、wo 2011/133886和美国专利申请公开号2014322129，其通过引用其全文并入本文。
[0339]
igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以通过任何方法“附接于”效应子部分，变体多肽或免疫调节蛋白可以通过所述任何方法与效应子部分缀合或连接。例如，igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以通过化学或重组方法附接于效应子部分。用于制备融合物或缀合物的化学方法是本领域已知的，并且可用于制备igsf缀合物。用于缀合变体多肽或免疫调节蛋白和效应子部分的方法必须能够使变体多肽或免疫调节蛋白与效应子部分连接，而不会干扰变体多肽或免疫调节蛋白与其一个或多个反结构配体结合的能力。
[0340]
igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以间接地与效应子部分连接。例如，igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以直接地与含有几种类型之一的效应子部分的脂质体连接。一个或多个效应子部分和/或变体多肽或免疫调节蛋白也可以结合至固体表
面。
[0341]
在一些实施方案中，igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白以及效应子部分均为蛋白质并且可以使用本领域公知的技术缀合。几百种可以缀合两种蛋白质的交联剂是可用的。(参见例如“chemistry of protein conjugation and crosslinking,”1991,shans wong,crc press,ann arbor)。通常基于可用的或在变体多肽或免疫调节蛋白和/或效应子部分插入的反应性官能团来选择交联剂。此外，如果没有反应性基团，则可以使用可光活化的交联剂。在某些情况下，可能需要在变体多肽或免疫调节蛋白与效应子部分之间包括间隔子。本领域已知的交联剂包括同双功能试剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺化物(dimethyladipimidate)和双(重氮基联苯胺)以及异双功能试剂：m马来酰亚胺基苯甲酰基
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺和磺基
‑
m马来酰亚胺基苯甲酰基
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺。
[0342]
在一些实施方案中，igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以用特定残基工程化，以用于效应子部分的化学附接。用于本领域已知的分子的化学附接的特定残基包括赖氨酸和半胱氨酸。基于在变体多肽或免疫调节蛋白和/或效应子部分插入的反应性官能团来选择交联剂，并且所述交联剂可用于效应子部分。
[0343]
也可以使用重组dna技术制备igsf缀合物。在这种情况下，编码变体多肽或免疫调节蛋白的dna序列与编码效应子部分的dna序列融合，从而产生嵌合dna分子。将嵌合dna序列转染至表达融合蛋白的宿主细胞中。可以从细胞培养物中回收融合蛋白，并且使用本领域已知的技术纯化。
[0344]
将作为标记的效应子部分附接至变体多肽或免疫调节蛋白的例子包括以下文献中描述的方法：hunter等人,nature 144:945(1962)；david等人,biochemistry 13:1014(1974)；pain等人,j.immunol.meth.40:219(1981)；nygren,j.histochem.and cytochem.30:407(1982)；wensel和meares,radioimmunoimaging and radioimmunotherapy,elsevier,n.y.(1983)；以及colcher等人,“use of monoclonal antibodies as radiopharmaceuticals for the localization of human carcinoma xenografts in athymic mice”,meth.enzymol.,121:802
‑
16(1986)。
[0345]
可以以已知的方式将放射性标记或其他标记掺入缀合物中。例如，所述肽可以是生物合成的，或者可以通过化学氨基酸合成使用合适的氨基酸前体合成，所述氨基酸前体包含例如替代氢的氟
‑
19。标记如99tc或123i、186re、188re和111in可以经由肽中的半胱氨酸残基附接。钇
‑
90可以经由赖氨酸残基附接。iodogen方法(fraker等人,biochem.biophys.res.commun.80:49
‑
57(1978))可以用于掺入碘
‑
123。“monoclonal antibodies in immunoscintigraphy”(chatal,crc press 1989)详细描述了其他方法。
[0346]
可以使用多种双功能蛋白偶联剂如n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基
‑4‑
(n
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑1‑
羧酸盐(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基二亚胺代己二酸酯hci)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对
‑
叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双
‑
(对
‑
重氮基苯甲酰基)
‑
乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6
‑
二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5
‑
二氟
‑
2,4
‑
二硝基苯)制备变体多肽或免疫调节蛋白和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如vitetta等人,science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳
‑
14
‑
标记的1
‑
异硫氰酸基苄基
‑3‑
甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx
‑
dtpa)是用于
将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见例如wo 94/11026。所述接头可以是“可切割接头”，其促进细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(chari等人,cancer research 52:127
‑
131(1992)；美国专利号5,208,020)。
[0347]
本发明的igsf缀合物明确地考虑但不限于用如下交联试剂制备的药物缀合物：bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc
‑
smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基
‑
emcs、磺基
‑
gmbs、磺基
‑
kmus、磺基
‑
mbs、磺基
‑
siab、磺基
‑
smcc和磺基
‑
smpb以及svsb(琥珀酰亚胺基
‑
(4
‑
乙烯砜)苯甲酸酯)，它们可商购获得(例如，来自pierce biotechnology公司，罗克福德，伊利诺伊州，美国)。参见2003
‑
2004应用手册和目录第467
‑
498页。e.跨膜和可分泌性免疫调节蛋白和工程化细胞
[0348]
本文提供了表达免疫调节变体cd86多肽的工程化细胞(可替代地，“工程化细胞”)。在一些实施方案中，表达的免疫调节变体cd86多肽是跨膜蛋白并且是表面表达的。在一些实施方案中，表达的免疫调节变体cd86多肽由细胞表达和分泌。1.跨膜免疫调节蛋白
[0349]
在一些实施方案中，包含变体cd86的免疫调节多肽可以是膜结合蛋白。如下文更详细描述的，所述免疫调节多肽可以是包含变体cd86的跨膜免疫调节多肽，在所述变体cd86中包含：含有至少一个亲和力修饰的igsf结构域(igv或igc)的胞外结构域、跨膜结构域和任选胞质结构域。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白可以在免疫细胞(如哺乳动物细胞)的表面上表达，包括在淋巴细胞(例如，t细胞或nk细胞)或抗原呈递细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白在哺乳动物t细胞的表面上表达，包括如下t细胞：t辅助细胞、细胞毒性t细胞(或者，细胞毒性t淋巴细胞或ctl)、自然杀伤t细胞、调节性t细胞、记忆t细胞或γδt细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是抗原呈递细胞(apc)。通常但非唯一地，所述胞外结构域(可替代地，“细胞外结构域”)包含本发明的变体cd86的一个或多个氨基酸变异(例如氨基酸取代)。因此，例如，在一些实施方案中，跨膜蛋白将包含胞外结构域，所述胞外结构域包含本发明的变体cd86的一个或多个氨基酸取代。
[0350]
在一些实施方案中，所述工程化细胞表达作为跨膜免疫调节多肽(tip)的变体cd86多肽，所述跨膜免疫调节多肽可以是膜蛋白，如跨膜蛋白。在典型的实施方案中，膜蛋白的胞外结构域包含本文提供的变体cd86的细胞外结构域或其igsf结构域，其中在至少一个igsf结构域中含有一个或多个氨基酸取代。本文提供的跨膜免疫调节蛋白还包含连接至胞外结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域产生用于在细胞上进行细胞表面表达的经编码蛋白质。在一些实施方案中，所述跨膜结构域与胞外结构域直接连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域经由一个或多个接头或间隔子与胞外结构域间接连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域主要含有疏水氨基酸残基，例如亮氨酸和缬氨酸。
[0351]
在一些实施方案中，全长跨膜锚定结构域可用于确保，tip将在工程化细胞(如工程化t细胞)的表面上表达。方便地，这可以来自亲和力修饰的特定天然蛋白质(例如，cd86或其他天然igsf蛋白质)，并且以与天然igsf蛋白质(例如，cd86)类似的方式与第一膜近端结构域的序列简单融合。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白包含相应的野生型或未经修饰的igsf成员的跨膜结构域，如seq id no:2中所示的氨基酸序列中包含的跨膜结
构域(表2)。在一些实施方案中，所述膜结合形式包含相应的野生型或未经修饰的多肽的跨膜结构域，如对应于seq id no:2的残基248
‑
268。
[0352]
在一些实施方案中，所述跨膜结构域是非天然跨膜结构域，所述非天然跨膜结构域不是天然cd86的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自来自另一种非cd86家族成员多肽的跨膜结构域，所述跨膜结构域是膜结合的或是跨膜蛋白。在一些实施方案中，可使用来自t细胞上的另一蛋白质的跨膜锚定结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自cd8。在一些实施方案中，所述跨膜结构域还可包含cd8的细胞外部分用作间隔子结构域。示例性cd8来源的跨膜结构域是seq id no:281、282或283中所示的或其含有cd8跨膜结构域的部分。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是合成跨膜结构域。
[0353]
在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白还含有与跨膜结构域连接的胞内结构域，如胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，胞质信号传导结构域诱导细胞信号传导。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白的胞内结构域包含相应的野生型或未经修饰的多肽的胞质结构域，如seq id no:2中所示的氨基酸序列中包含的胞质结构域，如seq id no:2的氨基酸269
‑
329(参见表2)。
[0354]
在一些实施方案中，所提供的跨膜免疫调节蛋白(其是或包含变体cd86)包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列展现与seq id no:56至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且包含含有至少一个如本文所述的亲和力修饰的cd86 igsf结构域的胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白在如所述的igsf结构域(例如igv结构域)中含有任何一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白可还包含所述的胞质结构域。
[0355]
本文提供了cd86跨膜免疫调节蛋白。在一些实施方案中，所述cd86 tip展现与seq id no:233的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，所述cd86 tip是在其胞外结构域(细胞外部分)或其igsf(例如igv)结构域或其特异性结合部分中含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的变体cd86 tip。示例性氨基酸修饰(例如取代)包括如第ii节中所述的任一种。在一些实施方案中，所述变体cd86 tip展现与seq id no:234、235、236、237、238、239、240或241中任一个中所示的序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，所述变体cd86 tip具有seq id no:234、235、236、237、238、239、240或241中所示的序列。
[0356]
在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白还可以含有信号肽。在一些实施方案中，所述信号肽是野生型igsf成员的天然信号肽，如seq id no:2中所示的氨基酸序列中包含的信号肽(参见例如表2)。
[0357]
还提供了核酸分子，其编码此类跨膜免疫调节蛋白。在一些实施方案中，编码跨膜免疫调节蛋白的核酸分子包含核苷酸序列，其编码这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列展示与seq id no:56的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且包含含有至少一个如本文所述的亲和力修饰的igsf结构域的胞外域、跨膜结构域和任选胞质结构域。在一些实施方案中，所述核酸分子还可以包含编码信号肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽是相应的野生型igsf
成员的天然信号肽(参见例如表2)。在一些实施方案中，所述信号肽是异源信号肽，如表4中所示的任一种。
[0358]
在一些实施方案中，提供了car相关跨膜免疫调节蛋白，其中跨膜免疫调节蛋白的胞内结构域包含胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域包含至少一个含itam(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)的信号传导结构域。itam是在多个参与免疫细胞中的信号转导的蛋白质信号传导结构域中发现的保守基序，包括在参与t细胞受体信号转导的cd3
‑
ζ链(“cd3
‑
z”)中发现的保守基序。在一些实施方案中，胞内结构域包含cd3
‑
ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述cd3
‑
ζ信号传导结构域包含seq id no:284中陈述的氨基酸序列，或展现与seq id no:284的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％并保持t细胞信号传导的活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，car相关跨膜免疫调节蛋白的胞内结构域还可以包含共刺激信号传导结构域，以进一步调节t细胞的免疫调节应答。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域是cd28、icos、4
‑
1bb或ox40。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域源自cd28或4
‑
1bb，并且包含seq id no:285
‑
288中任一个所示的氨基酸序列或展现与seq id no:285
‑
288至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％并且保持t细胞共刺激信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的car相关的跨膜免疫调节蛋白具有car的特征，以在亲和力修饰的igsf结构域与同源结合配偶体或反结构结合后刺激t细胞信号传导。在一些实施方案中，通过亲和力修饰的igsf结构域与其反结构的特异性结合可以导致如细胞毒性、增殖或细胞因子产生的变化所反映的t细胞活性的免疫活性的变化。
[0359]
在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白不含能够介导胞质信号传导的胞内结构域。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白缺少野生型或未经修饰的多肽的信号转导机制，并且因此自身不诱导细胞信号传导。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白缺乏相应的野生型或未经修饰的多肽的细胞内(胞质)结构域或细胞内结构域的一部分，如seq id no:2中所示的氨基酸序列中包含的胞质信号传导结构域(参见表2)。在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白不含itim(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)，如某些抑制性受体(包括igsf家族的抑制性受体(例如pd
‑
1或tigit))中包含的itim。因此，在一些实施方案中，所述跨膜免疫调节蛋白仅含有细胞外结构域和跨膜结构域，如所述的任一种。2.分泌的免疫调节蛋白和工程化细胞
[0360]
在一些实施方案中，含有如本文所述的任何一种或多种氨基酸突变的cd86变体免疫调节多肽如在从细胞表达时是可分泌的。这种变体cd86免疫调节蛋白不包含跨膜结构域。在一些实施方案中，所述变体cd86免疫调节蛋白不与半衰期延长部分(如fc结构域或多聚化结构域)缀合。在一些实施方案中，所述变体cd86免疫调节蛋白包含信号肽，例如抗体信号肽或其他有效的信号序列，以获得细胞外的结构域。在免疫调节蛋白包含信号肽并由工程化细胞表达时，所述信号肽引起工程化细胞分泌免疫调节蛋白。通常，所述信号肽或信号肽的一部分在分泌时从免疫调节蛋白切割。所述免疫调节蛋白可由核酸(其可以是表达载体的一部分)编码。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白是由细胞(例如免疫细胞，例如原代免疫细胞)表达和分泌。
[0361]
因此，在一些实施方案中，提供还包含信号肽的变体cd86免疫调节蛋白。在一些实
施方案中，本文提供了编码变体cd86免疫调节蛋白的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至编码信号肽的分泌序列。
[0362]
信号肽是在免疫调节蛋白的n末端上的序列，其发出从细胞分泌免疫调节蛋白的信号。在一些实施方案中，所述信号肽的长度为约5至约40个氨基酸(如长度为约5至约7、约7至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25或约25至约30、约30至约35或约35至约40个氨基酸)。
[0363]
在一些实施方案中，所述信号肽是来自相应野生型cd86的天然信号肽(参见表2)。在一些实施方案中，所述信号肽是非天然信号肽。例如，在一些实施方案中，所述非天然信号肽是来自相应野生型cd86的突变天然信号肽，并且可以包括一个或多个(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)取代、插入或缺失。在一些实施方案中，所述非天然信号肽是来自与野生型igsf家族成员的相同igsf家族的家族成员的信号肽或其突变体。在一些实施方案中，所述非天然信号肽是来自与野生型igsf家族成员不同的igsf家族的igsf家族成员的信号肽或其突变体。在一些实施方案中，所述信号肽是来自非igsf蛋白家族的信号肽或其突变体，如来自免疫球蛋白的信号肽(如igg重链或igg
‑
κ轻链)、细胞因子(如白介素
‑
2(il
‑
2)或cd33)、血清白蛋白蛋白质(例如hsa或白蛋白)、人天青杀素前蛋白(human azurocidin preprotein)信号序列、萤光素酶、胰蛋白酶原(例如胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶原)或能够使细胞有效分泌蛋白质的其他信号肽。示例性信号肽包括表4中所述的任一种。
[0364]
在可分泌变体cd86免疫调节蛋白的一些实施方案中，免疫调节蛋白在表达时包含信号肽，并且所述信号肽(或其部分)在分泌时被从免疫调节蛋白切割。
[0365]
在一些实施方案中，工程化细胞表达由细胞分泌的变体cd86多肽。在一些实施方案中，这种变体cd86多肽是由如下核酸分子编码，所述核酸分子编码在用于分泌的信号序列的可操作控制下的免疫调节蛋白。在一些实施方案中，编码的免疫调节蛋白在从细胞表达时分泌。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白不包含跨膜结构域。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白不包含半衰期延长部分(如fc结构域或多聚化结构域)。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白包含信号肽。在一些实施方案中，本发明核酸还包含编码分泌性或信号肽的核苷酸序列，其可操作地连接至编码免疫调节蛋白的核酸，由此容许分泌免疫调节蛋白。3.细胞和工程化细胞
[0366]
本文提供了表达所提供的免疫调节多肽中的任一种的工程化细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞在其表面上表达任何所提供的跨膜免疫调节多肽。在一些实施方案中，所述工程化细胞在适合于分泌蛋白质的条件下表达免疫调节蛋白并且可以或能够由所述细胞分泌免疫调节蛋白。在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白在淋巴细胞上表达，如肿瘤浸润淋巴细胞(til)、t细胞或nk细胞或在骨髓细胞上表达。在一些实施方案中，所述工程化细胞是抗原呈递细胞(apc)。在一些实施方案中，所述工程化细胞是工程化哺乳动物t细胞或工程化哺乳动物抗原呈递细胞(apc)。在一些实施方案中，所述工程化t细胞或apc是人或鼠细胞。
[0367]
在一些实施方案中，所述工程化t细胞包括但不限于t辅助细胞、细胞毒性t细胞(可替代地，细胞毒性t淋巴细胞或ctl)、自然杀伤t细胞、调节性t细胞、记忆t细胞或γδt细胞。在一些实施方案中，所述工程化t细胞是呈cd4+或cd8+。除了mhc的信号以外，所述工程化t细胞还需要共刺激信号。在一些实施方案中，所述工程化t细胞还通过抑制性信号进行调节，在一些情况下，所述抑制性信号是由如先前所讨论以膜结合形式表达的变体cd86跨膜免疫调节多肽提供的。
[0368]
在一些实施方案中，所述工程化apc包括例如表达mhc ii的apc，如巨噬细胞、b细胞和树突细胞，以及人工apc(aapc)，包括细胞和无细胞(例如，可生物降解的聚合微粒)aapc。人工apc(aapc)是apc的合成形式，其可以与apc相似的方式作用，其将抗原呈递至t细胞以及将t细胞激活。抗原呈递是通过mhc(i类或ii类)进行。在一些实施方案中，在工程化apc(如aapc)中，在一些实施方案中，加载至mhc上的抗原是肿瘤特有抗原或肿瘤相关抗原。加载至mhc上的抗原被t细胞的t细胞受体(tcr)识别，在某些情况下，t细胞可以表达ctla
‑
4、cd28或由本文提供的变体cd86多肽识别的其他分子。可以用于工程化aapc的材料包括：聚(乙醇酸)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)、氧化铁、脂质体、脂质双层、琼脂糖和聚苯乙烯。
[0369]
在一些实施方案中，细胞aapc可经工程化以含有用于过继性细胞疗法中的tip和tcr激动剂。在一些实施方案中，细胞aapc可以被工程化以含有用于人t细胞的离体扩增中的tip和tcr激动剂，所述离体扩增如在施用前进行，例如用于重引入患者体内。在一些方面，aapc可以包括至少一种抗cd3抗体克隆(例如，如例如okt3和/或ucht1)的表达。在一些方面，可以使aapc失活(例如，辐照)。在一些实施方案中，tip可以包括展现对t细胞上的同源结合配偶体的结合亲和力的任何变体igsf结构域。
[0370]
在一些实施方案中，将本文所提供的免疫调节蛋白(如跨膜免疫调节蛋白或可分泌免疫调节蛋白)共表达或工程化至表达抗原结合受体(如重组受体，如嵌合抗原受体
(car)或t细胞受体(tcr))的细胞中。在一些实施方案中，所述工程化细胞(如工程化t细胞)识别与癌症、炎性和自身免疫性障碍或病毒感染相关的所需抗原。在具体实施方案中，所述抗原结合受体含有特异性地结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述工程化t细胞是car(嵌合抗原受体)t细胞，其含有与抗原(如肿瘤特有抗原或肿瘤相关抗原)特异性结合的抗原结合结构域(例如，scfv)。在一些实施方案中，所述tip蛋白是在工程化t细胞受体细胞或工程化嵌合抗原受体细胞中表达。在此类实施方案中，所述工程化细胞共表达tip和car或tcr。在一些实施方案中，所述sip蛋白是在工程化t细胞受体细胞或工程化嵌合抗原受体细胞中表达。在此类实施方案中，工程化细胞共表达sip和car或tcr。
[0371]
嵌合抗原受体(car)是重组受体，其包括抗原结合结构域(细胞外结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导区(胞内结构域)，所述细胞内信号传导区能在结合抗原后诱导或介导激活信号至t细胞。在一些例子中，car表达细胞经工程化以表达细胞外单链可变片段(scfv)，所述细胞外单链可变片段具有对连接至细胞内信号传导部分的特定肿瘤抗原的特异性，所述细胞内信号传导部分包含激活结构域和在一些情况下的共刺激结构域。共刺激结构域可以源自例如cd28、ox
‑
40、4
‑
1bb/cd137、诱导型t细胞共刺激物(icos)。激活结构域可源自例如cd3，如cd3ζ、ε、δ、γ等。在某些实施方案中，car设计为具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。car scfv可以被设计为靶向细胞上表达的与疾病或病症相关的抗原，例如肿瘤抗原，诸如例如her2，其是显示出在某些类型的侵袭性乳腺癌的发展和进展中起作用的癌基因。
[0372]
在一些方面中，所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，如单链片段(scfv)。在一些实施方案中，所述抗原是在肿瘤或癌细胞上表达。抗原的示例是her2。car的示例是抗her2 car，如含有抗her2scfv的car。其他示例性car包括抗cd19 car、抗bcma car、抗cd22car和对肿瘤相关抗原具有特异性的其他car。在一些实施方案中，car还含有间隔子、跨膜结构域和包含itam信号传导结构域(如cd3ζ信号传导结构域)的细胞内信号传导结构域或区域。在一些实施方案中，所述car还包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，所述间隔子和跨膜结构域是源自cd8的铰链和跨膜结构域，例如具有seq id no:281、282或283中所示的示例性序列，或展现与seq id no:281、282或283至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述胞内结构域包含cd3
‑
ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述cd3
‑
ζ信号传导结构域包含seq id no:284中所述的氨基酸序列或展现与seq id no:284至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性并保持t细胞信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，car的胞内结构域还可包含共刺激信号传导结构域或区域以进一步调节性t细胞的免疫调节反应。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域是或包含cd28、icos、4
‑
1bb或ox40的共刺激区，或者源自cd28、icos、4
‑
1bb或ox40的共刺激区。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域源自cd28或4
‑
1bb并且包含seq id no:285
‑
288的任一个中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:285
‑
288至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性并保持t细胞共刺激信号传导活性的氨基酸序列。
[0373]
在一些实施方案中，编码car的构建体还编码通过自切割肽序列从car分离的第二蛋白，如标记物，例如，可检测蛋白。在一些实施方案中，所述自切割肽序列是f2a、t2a、e2a或p2a自切割肽。t2a自切割肽的示例性序列显示于seq id no:309、310、311中的任一个中，或者是展现与seq id no:309、310、311中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，t2a是由seq id no:311中所示的核苷酸序列或展现与seq id no:311中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的序列编码。p2a自切割肽的示例性序列显示于seq id no:243或展现与seq id no:243至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列中。在一些情况下，核酸构建体编码超过一种p2a自切割肽(如p2a1和p2a2)，其中核苷酸序列p2a1和p2a2各自编码seq id no:243中所示的p2a，所述核苷酸序列可以是不同的，以避免序列之间的重组。
[0374]
在一些实施方案中，所述标记物是可检测蛋白，如荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白(gfp)或蓝色荧光蛋白(bfp)。荧光蛋白标记物的示例性序列显示于seq id no:313、312、244
‑
246，或者是展现与seq id no:313、312、244
‑
246至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列中。
[0375]
在一些实施方案中，car包含抗her scfv、cd8铰链区和源自4
‑
1bb和cd3
‑
ζ信号传导结构域的跨膜信号传导结构域。在一些实施方案中，car包含含有曲妥珠单抗的可变重链和轻链的scfv。
[0376]
在另一实施方案中，所述工程化t细胞具有tcr，包括重组或工程化tcr。在一些实施方案中，所述tcr可以是天然tcr。本领域技术人员将认识到，通常天然哺乳动物t细胞受体包含参与抗原特异性识别和结合的α链和β链(或γ链和δ链)。在一些实施方案中，所述tcr是经修饰的工程化tcr。在一些实施方案中，所述工程化t细胞的tcr与通过apc呈递的肿瘤相关抗原或肿瘤特有抗原特异性结合。在一些实施方案中，所述tcr是hpv16 e6肽(e6 tcr)。在一些实施方案中，所述tcr是hpv16 e7肽(e7tcr)。示例性hpv tcr包括在国际公开的pct申请号wo 2015009606或wo 2015184228中所述的那些。
[0377]
在一些实施方案中，所述免疫调节多肽，如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽，可通过多种策略(如用于重组宿主细胞的那些策略)掺入工程化细胞中，如工程化t细胞或工程化apc。将dna构建体引入原代t细胞中的多种方法是本领域已知的。在一些实施方案中，采用病毒转导或质粒电穿孔。在典型的实施方案中，编码免疫调节蛋白或表达载体的核酸分子包含信号肽，所述信号肽将表达的跨膜免疫调节蛋白定位于细胞膜或用于分泌。在一些实施方案中，将编码本发明的跨膜免疫调节蛋白的核酸亚克隆至允许在宿主哺乳动物细胞中表达的病毒载体中，如逆转录病毒载体。可以将表达载体引入哺乳动物宿主细胞中，并且在宿主细胞培养条件下，免疫调节蛋白在表面上表达或分泌。
[0378]
在一个示例性例子中，可以离体纯化原代t细胞(cd4+细胞或cd8+细胞或两者)，并用由各种tcr/cd28激动剂组成的激活方案(如抗cd3/抗cd28包被的珠)刺激原代t细胞。在激活过程后2或3天，可以通过本领域标准慢病毒或逆转录病毒转导方案或质粒电穿孔策略将含有免疫调节多肽的重组表达载体稳定地引入原代t细胞中。可以通过例如流式细胞术
使用与天然亲本分子交叉反应的抗表位标签或抗体以及含有变体cd86的多肽监测细胞的免疫调节多肽表达。表达免疫调节多肽的t细胞可以通过用抗表位标签抗体分选来富集，或者根据应用针对高表达或低表达来富集。
[0379]
在免疫调节多肽表达后，可以通过多种手段来测定工程化t细胞的适当功能。可以验证工程化car或tcr共表达以表明该部分工程化t细胞不受免疫调节蛋白表达的显著影响。一旦验证，标准的体外细胞毒性、增殖或细胞因子测定(例如，ifn
‑
γ、il2、tnfα表达)可用于评估工程化t细胞的功能。示例性标准终点是培养上清液中肿瘤细胞系的裂解、工程化t细胞的增殖或ifn
‑
γ蛋白表达的百分比。可以选择如下工程化构建体，其相对于对照构建体导致统计学上显著增加的肿瘤系的裂解、增加的工程化t细胞的增殖或增加的ifn
‑
γ表达。另外，也可以将非工程化(如天然)原代或内源t细胞并入相同的体外测定，以测量在工程化细胞(如工程化t细胞)上表达的免疫调节多肽构建体调节活性(在一些情况下，包括在旁观天然t
‑
细胞中激活并生成效应子功能)的能力。可以监测在内源性t细胞上的激活或分化标记物如cd25、cd69或cd44的增加的表达，并且增加的增殖和/或细胞因子产生可以表明在工程化t细胞上表达的免疫调节蛋白的所需活性。
[0380]
在一些实施方案中，可以使用类似测定来比较仅含有car或tcr的工程化t细胞与含有car或tcr和tip构建体的那些工程化t细胞的功能。通常，这些体外测定是通过将各种比率的工程化t细胞和含有同源car或tcr抗原的“肿瘤”细胞系在培养中一起铺板来进行。标准终点是培养上清液中肿瘤系的裂解百分比、工程化t细胞的增殖或ifn
‑
γ产生。可以选择导致与单独的相同tcr或car构建体相比统计学上显著增加的肿瘤细胞系裂解、增加的工程化t细胞增殖或增加的ifn
‑
γ产生的工程化免疫调节蛋白。可在免疫受损的小鼠(如nsg种系，其缺少小鼠t、nk和b细胞)中分析工程化人类t细胞。工程化人t细胞(其中car或tcr结合异种移植物上的靶反结构并与tip亲和力修饰的igsf结构域共表达)可以以与异种移植物不同的细胞数量和比例过继转移至体内。在常见实施方案中，将异种移植物引入鼠类模型中，然后在几天后引入工程化t细胞。可以测定含有免疫调节蛋白的工程化t细胞相对于仅含有car或tcr的工程化t细胞增加的存活、肿瘤清除或扩增的工程化t细胞数量。如在体外测定中，可以共过继转移内源天然(即，非工程化)人t细胞，以寻求所述群体中的成功表位扩散，从而导致更好的存活或肿瘤清除。
[0381]
在一些实施方案中，与未用如本文所述的免疫调节蛋白(例如tip)如此工程化的参考细胞相比，表达所提供的免疫调节蛋白的所提供的工程化t细胞展现一种或多种改善的特性或活性。在一些实施方案中，所述参考细胞(如参考t细胞、参考car工程化t细胞或参考tcr工程化t细胞)是通过类似的离体程序产生或工程化但不表达免疫调节蛋白或尚未工程化为表达免疫调节蛋白的细胞。在一些实施方案中，所述特性或活性与t细胞功能相关或有关。在一些实施方案中，所述一种或多种特性或活性包括但不限于细胞增殖、细胞毒性活性、细胞因子(例如ifn
‑
γ、il
‑
2或tnf
‑
α)产生和/或一种或多种激活标记物(例如cd69或cd25)的表达。在一些实施方案中，与参考细胞或参考细胞组合物相比，所述活性或特性增加至少或至少约1.2倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或更多倍。f.表达变体多肽和免疫调节蛋白的感染原
[0382]
还提供了含有编码任何变体多肽(如cd86 vigd多肽，包括本文所述的可分泌性或
跨膜免疫调节蛋白)的核酸的感染原。在一些实施方案中，此类感染原可将编码本文所述的变体免疫调节多肽的核酸(如cd86 vigd多肽)递送至受试者的靶细胞，如受试者中的免疫细胞和/或抗原呈递细胞(apc)或肿瘤细胞。还提供了包含在这些感染原中的核酸，和/或用于产生或修饰这些感染原的核酸(如载体和/或质粒)以及含有这种感染原的组合物。
[0383]
在一些实施方案中，所述感染原是微生物(microorganism或microbe)。在一些实施方案中，所述感染原是病毒或细菌。在一些实施方案中，所述感染原是病毒。在一些实施方案中，所述感染原是细菌。在一些实施方案中，这种感染原可递送编码任何变体多肽(如cd86 vigd多肽，包括本文所述的可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)的核酸序列。因此，在一些实施方案中，受试者中被感染原感染或接触的细胞可以在细胞表面上表达或分泌变体免疫调节多肽。在一些实施方案中，所述感染原还可将一种或多种其他治疗剂或编码其他治疗剂的核酸递送至受试者体内的细胞和/或环境。在一些实施方案中，可通过感染原递送的其他治疗剂包括细胞因子或其他免疫调节分子。
[0384]
在一些实施方案中，所述感染原例如病毒或细菌含有编码任何变体多肽(如cd86 vigd多肽，包括本文所述的可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)的核酸序列，并且通过接触和/或感染受试者中的细胞，所述细胞表达由感染原中包含的核酸序列编码的变体多肽(如cd86 vigd多肽，包括可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)。在一些实施方案中，可以将感染原施用至受试者。在一些实施方案中，可使感染原与来自受试者的细胞离体接触。
[0385]
在一些实施方案中，由感染原感染的细胞表达的变体多肽(如cd86 vigd多肽，包括跨膜免疫调节蛋白)是跨膜蛋白并且是表面表达的。在一些实施方案中，由感染原感染的细胞表达的变体多肽(如cd86 vigd多肽，包括可分泌性免疫调节蛋白)由细胞表达并分泌。跨膜免疫调节蛋白或分泌的免疫调节蛋白可以是本文所述的任何蛋白质。
[0386]
在一些实施方案中，所述受试者中被感染原靶向的细胞包括肿瘤细胞、免疫细胞和/或抗原呈递细胞(apc)。在一些实施方案中，所述感染原靶向肿瘤微环境(tme)中的细胞。在一些实施方案中，所述感染原将编码变体多肽的核酸(如cd86 vigd多肽，包括可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)递送至合适的细胞(例如，apc，如在其细胞表面展示肽/mhc复合物的细胞，如树突细胞)或组织(例如，淋巴组织)，所述合适的细胞或组织将诱导和/或增强所需效果，例如免疫调节和/或特定细胞介导的免疫应答，例如cd4和/或cd8 t细胞应答，所述cd8 t细胞应答可包括细胞毒性t细胞(ctl)应答。在一些实施方案中，所述感染原靶向apc，如树突细胞(dc)。在一些实施方案中，通过本文所述的感染原递送的核酸分子包括在特定靶细胞中表达编码变体免疫调节多肽的可操作地连接的编码序列所需的适当核酸序列，例如调节元件，例如启动子。
[0387]
在一些实施方案中，含有编码免疫调节多肽的核酸序列的感染原也可含有编码一种或多种其他基因产物(例如细胞因子、前药转化酶、细胞毒素和/或可检测基因产物)的核酸序列。例如，在一些实施方案中，感染原是溶瘤病毒，并且病毒可以包括编码另外的治疗基因产物的核酸序列(参见例如kirn等人,(2009)nat rev cancer 9:64
‑
71；garcia
‑
aragoncillo等人,(2010)curr opin mol ther 12:403
‑
411；参见美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和7,754,221以及美国专利公开号2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/
0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917和2011/0064650。在一些实施方案中，另外的基因产物可以是可导致靶细胞(例如，肿瘤细胞)死亡的治疗性基因产物，或是可增强或加强或调节免疫应答的基因产物(例如，细胞因子)。示例性基因产物还包括抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、免疫检查点抑制剂、抗体、细胞因子、生长因子、抗原、细胞毒性基因产物、促凋亡基因产物、抗凋亡基因产物、细胞基质降解基因、用于组织再生或将人类体细胞重编程为多能性的基因、以及本文描述的或本领域技术人员已知的其他基因。在一些实施方案中，另外的基因产物是粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)。1.病毒
[0388]
在一些实施方案中，所述感染原是病毒。在一些实施方案中，所述感染原是溶瘤病毒，或靶向特定细胞(例如免疫细胞)的病毒。在一些实施方案中，所述感染原靶向受试者中的肿瘤细胞和/或癌细胞。在一些实施方案中，所述感染原靶向免疫细胞或抗原呈递细胞(apc)。
[0389]
在一些实施方案中，所述感染原是溶瘤病毒。溶瘤病毒是在肿瘤细胞中积累并在肿瘤细胞中复制的病毒。通过在细胞中复制，以及任选递送编码本文所述的变体免疫调节变体cd86多肽或免疫调节蛋白的核酸，肿瘤细胞被溶解，肿瘤收缩并且可以被消除。溶瘤病毒还可具有宽的宿主和细胞类型范围。例如，溶瘤病毒可以在免疫特权细胞或免疫特权组织(包括肿瘤和/或转移，并且还包括受伤组织和细胞)中积累，从而允许在广泛的细胞类型范围内递送和表达编码本文所述变体免疫调节多肽的核酸。溶瘤病毒也可以以肿瘤细胞特异性方式复制，导致肿瘤细胞溶解和有效的肿瘤消退。
[0390]
示例性溶瘤病毒包括腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(vsv)、柯萨奇病毒和痘苗病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以特异性定殖于实体瘤，而不感染其他器官，并且可以用作感染原以将编码本文所述变体免疫调节多肽的核酸递送至此类实体瘤。
[0391]
用于在递送编码本文所述的变体cd86多肽或免疫调节蛋白的核酸中使用的溶瘤病毒可以是本领域技术人员已知的任一种，并且包括例如水泡性口炎病毒(参见例如美国专利号7,731,974、7,153,510、6,653,103和美国专利公开号2010/0178684、2010/0172877、2010/0113567、2007/0098743、20050260601、20050220818以及欧洲专利号1385466、1606411和1520175)；单纯疱疹病毒(参见例如美国专利号7,897,146、7,731,952、7,550,296、7,537,924、6,723,316、6,428,968和美国专利公开号2014/0154216、2011/0177032、2011/0158948、2010/0092515、2009/0274728、2009/0285860、2009/0215147、2009/0010889、2007/0110720、2006/0039894、2004/0009604、2004/0063094、国际专利公开号wo 2007/052029、wo 1999/038955)；逆转录病毒(参见例如美国专利号6,689,871、6,635,472、5,851,529、5,716,826、5,716,613和美国专利公开号20110212530)；痘苗病毒(参见例如2016/0339066)；以及腺相关病毒(参见例如美国专利号8,007,780、7,968,340、7,943,374、7,906,111、7,927,585、7,811,814、7,662,627、7,241,447、7,238,526、7,172,893、7,033,826、7,001,765、6,897,045和6,632,670)。
[0392]
溶瘤病毒还包括已经遗传改变以减弱其毒力、改善其安全性特征、增强其肿瘤特异性的病毒，并且其还已配备有其他基因，例如细胞毒素、细胞因子、前药转化酶，以改善所述病毒的整体功效(参见例如kirn等人,(2009)nat rev cancer 9:64
‑
71；garcia
‑
aragoncillo等人,(2010)curr opin mol ther 12:403
‑
411；参见美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和7,754,221以及美国专利公开号2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917和2011/0064650)。在一些实施方案中，所述溶瘤病毒可以是已经修饰使得其在癌性细胞中选择性复制，并且因此是溶瘤的那些溶瘤病毒。例如，所述溶瘤病毒是腺病毒，其已经工程化以具有针对肿瘤疗法以及也作为基因疗法载体的改变的向性。这种溶瘤病毒的示例是onyx
‑
015、h101和ad5δcr(hallden和portella(2012)expert opin ther targets,16:945
‑
58)以及tnferade(mcloughlin等人(2005)ann.surg.oncol.,12:825
‑
30)，或条件复制型腺病毒
[0393]
在一些实施方案中，所述感染原是修饰的单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，所述感染原是talimogene laherparepvec(也称为t
‑
vec、iml ygic或oncovex gm
‑
csf)的修饰形式，其被修饰为含有编码任何本文所述的变体免疫调节多肽的核酸，如任何本文所述的变体cd86多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，所述感染原是描述在例如wo 2007/052029、wo1999/038955、us 2004/0063094、us 2014/0154216中的经修饰的单纯疱疹病毒，或其变体。
[0394]
在一些实施方案中，所述感染原是靶向被施用病毒的受试者的特定细胞类型的病毒，例如靶向免疫细胞或抗原呈递细胞(apc)的病毒。树突细胞(dc)是起始和控制免疫应答必需的apc。dc可捕获并加工抗原，从外周移行至淋巴器官，并以主要组织相容性复合物(mhc)限制的方式将抗原呈递至静息t细胞。在一些实施方案中，所述感染原是可特异性地靶向dc以递送编码变体cd86多肽或免疫调节蛋白的核酸以在dc中表达的病毒。在一些实施方案中，所述病毒是慢病毒或其变体或衍生物，如整合缺陷型慢病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒是慢病毒，其经假型化以有效结合并高效感染能表达细胞表面标记物树突细胞特异性细胞间粘附分子
‑3‑
捕捉非整联蛋白(dc
‑
sign)的细胞，如dc。在一些实施方案中，所述病毒是经辛德比斯病毒e2糖蛋白假型化的慢病毒或其经修饰形式，例如wo 2013/149167中描述的那些慢病毒。在一些实施方案中，所述病毒允许将目标序列(例如，编码任何本文所述的变体cd86多肽或免疫调节蛋白的核酸)递送至dc并表达所述目标序列。在一些实施方案中，所述病毒包括wo 2008/011636或us 2011/0064763；tareen等人(2014)mol.ther.,22:575
‑
587中描述的那些病毒或其变体。噬树突细胞载体平台的示例是zvex
tm
。2.细菌
[0395]
在一些实施方案中，所述感染原是细菌。例如，在一些实施方案中，所述细菌可以将编码任何本文所述的变体免疫调节多肽(例如变体cd86多肽或免疫调节蛋白)的核酸递送至受试者中的靶细胞，如肿瘤细胞、免疫细胞、抗原呈递细胞和/或吞噬细胞。在一些实施方案中，所述细菌可以优先靶向受试者体内的特定环境，如肿瘤微环境(tme)，以用于表达和/或分泌变体免疫调节多肽，和/或靶向环境中的靶特异性细胞以用于表达变体免疫调节多肽。
[0396]
在一些实施方案中，经由细菌介导的质粒dna转移至哺乳动物细胞将核酸递送至细胞(也称为“细胞转染”)。例如，在一些实施方案中，通过整个细菌进入靶细胞来实现遗传物质的递送。在一些实施方案中，自发或诱导的细菌溶解可导致质粒的释放，以用于随后的真核细胞表达。在一些实施方案中所述，细菌可以将核酸递送至非吞噬哺乳动物细胞(例
如，肿瘤细胞)和/或递送至吞噬细胞，例如某些免疫细胞和/或apc。在一些实施方案中，通过细菌递送的核酸可以转移至受试者中的细胞的细胞核中以用于表达。在一些实施方案中，所述核酸还包括在特定宿主细胞中表达编码变体免疫调节多肽的可操作连接的序列所必需的合适的核酸序列，例如调节元件如启动子或增强子。在一些实施方案中，所述感染原(其为细菌)可以以rna的形式递送编码免疫调节蛋白的核酸，如预先制备的能翻译的rna，其递送至靶细胞的细胞质以供靶细胞机制进行翻译。
[0397]
在一些实施方案中，所述细菌可以复制并裂解靶细胞，例如，肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细菌可含有和/或释放靶细胞的细胞质中的核酸序列和/或基因产物，由此杀死靶细胞，例如肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述感染原是可以在受试者的特定环境(例如肿瘤微环境(tme))中特异性复制的细菌。例如，在一些实施方案中，所述细菌可在缺氧或低氧微环境中特异性复制。在一些实施方案中，存在于特定环境中的条件或因子，例如在tme中由细胞产生的天冬氨酸盐、丝氨酸、柠檬酸盐、核糖或半乳糖，可充当化学吸引剂以将细菌吸引到所述环境中。在一些实施方案中，细菌可在所述环境(例如，tme)中表达和/或分泌本文所述的免疫调节蛋白。
[0398]
在一些实施方案中，所述感染原是以下细菌：利斯特菌属物种(listeria sp.)、双歧杆菌属物种(bifidobacterium sp.)、埃希氏菌属物种(escherichia sp.)、梭菌属物种(clostridium sp.)、沙门氏菌属物种(salmonella sp.)、志贺氏菌属物种(shigella sp.)、弧菌属物种(vibrio sp.)或耶尔森菌属物种(yersinia sp.)。在一些实施方案中，所述细菌选自以下中的一种或多种：单核细胞增生利斯特菌(listeria monocytogenes)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、猪霍乱沙门氏菌(salmonella choleraesuis)、大肠杆菌(escherichia coli)、霍乱弧菌(vibrio cholera)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)、诺维氏梭菌(clostridium novyi)、丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、婴儿双岐杆菌(bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)和青春双岐杆菌(bifidobacterium adolescentis)。在一些实施方案中，所述细菌是工程化细菌。在一些实施方案中，所述细菌是工程化细菌，如以下中所述的那些：例如seow和wood(2009)molecular therapy 17(5):767
–
777；baban等人(2010)bioengineered bugs 1:6,385
‑
394；patyar等人(2010)j biomed sci17:21；tangney等人(2010)bioengineered bugs 1:4,284
‑
287；van pijkeren等人(2010)hum gene ther.21(4):405
‑
416；wo 2012/149364；wo 2014/198002；us 9103831；us 9453227；us 2014/0186401；us 2004/0146488；us 2011/0293705；us 2015/0359909和ep 3020816。可以修饰细菌以递送编码任何本文提供的变体免疫调节多肽、缀合物和/或融合物的核酸序列，和/或以在受试者中表达此类变体免疫调节多肽。g.用于产生多肽或细胞的核酸、载体和方法
[0399]
本文提供了分离的或重组的核酸(统称为“核酸”)，其编码本文提供的变体cd86多肽或免疫调节多肽的各种提供的实施方案中的任一种。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的全部核酸)可用于重组生产(例如表达)本文提供的变体cd86多肽或免疫调节多肽。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的全部核酸)可用于在细胞(如在工程化细胞中，例如，免疫细胞或感染原细胞)中表达本文提供的变体cd86多肽或免疫调节多肽。本文提供的核酸可以是rna形式或dna形式，并且包括mrna、crna、重组或合
成rna和dna，以及cdna。本文提供的核酸通常是dna分子，并且通常是双链dna分子。然而，还提供了包含本发明的任何核苷酸序列的单链dna、单链rna、双链rna和杂合dna/rna核酸或其组合。
[0400]
本文还提供了用于产生本文提供的变体cd86多肽或免疫调节多肽的重组表达载体和重组宿主细胞。
[0401]
本文还提供了工程化细胞(如工程化免疫细胞)，其含有所提供的免疫调节多肽中的任一种，如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽中的任一种。
[0402]
本文还提供了感染原(如细菌或病毒细胞)，其含有所提供的免疫调节多肽中的任一种，如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽中的任一种。
[0403]
在上文提供的任何实施方案中，可以使用重组dna和克隆技术将编码本文提供的免疫调节多肽的核酸引入细胞中。为此，制备编码免疫调节多肽的重组dna分子。制备此类dna分子的方法是本领域中熟知的。例如，可以使用合适的限制性酶从dna切除肽的编码序列。可替代地，可以使用化学合成技术(如亚磷酰胺法)来合成dna分子。同样，可以使用这些技术的组合。在一些情况下，重组或合成核酸可通过聚合酶链式反应(pcr)来生成。在一些实施方案中，可以产生编码一种或多种变体cd86多肽的dna插入物，所述一种或多种变体cd86多肽含有至少一个亲和力修饰的igsf结构域，并且在一些实施方案中，根据提供的描述含有信号肽、跨膜结构域和/或胞内结构域。如本领域技术人员已知的，可以将所述dna插入片段克隆至合适的转导/转染载体中。还提供含有核酸分子的表达载体。
[0404]
在一些实施方案中，所述表达载体能在适当细胞中在适于表达蛋白质的条件下表达免疫调节蛋白。在一些方面，核酸分子或表达载体包含编码与合适的表达控制序列可操作地连接的免疫调节蛋白的dna分子。在dna分子插入载体之前或之后实现这种有效连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。
[0405]
在一些实施方案中，所述免疫调节蛋白的表达受启动子或增强子控制，以控制或调节表达。所述启动子与核酸分子中编码变体多肽或免疫调节蛋白的部分可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子是组成型活性启动子(如组织特异性组成型活性启动子或其他组成型启动子)。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子，其可响应于诱导剂(如t细胞激活信号)。
[0406]
在一些实施方案中，组成型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子操作性连接。示例性组成型启动子包括猿猴空泡病毒40(sv40)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、泛素c(ubc)启动子和ef
‑
1α(ef1a)启动子。在一些实施方案中，组成型启动子是组织特异性的。例如，在一些实施方案中，启动子允许免疫调节蛋白在特定组织(如免疫细胞、淋巴细胞或t细胞)中组成型表达。示例性组织特异性启动子描述于美国专利号5,998,205中，包括例如甲胎蛋白、df3、酪氨酸酶、cea、表面活性蛋白和erbb2启动子。
[0407]
在一些实施方案中，诱导型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子操作性连接，使得所述核酸的表达可通过控制适当转录诱导物的存在或不存在来控制。例如，所述启动子可以是调节的启动子和转录因子表达系统，如已公开的四环素调节的系统或其他可调节系统(参见例如，已公开的国际pct申请号wo 01/30843)，以允许调节所编码多肽的表达。示例性可调节启动子系统是例如可从clontech(帕洛阿尔托，加利福尼亚州)获得
的tet
‑
on(和tet
‑
off)系统。此启动子系统允许通过四环素或四环素衍生物(如多西环素)控制的转基因的经调节表达。其他可调节启动子系统是已知的(参见例如，已公开的美国申请号2002
‑
0168714，标题为“regulation of gene expression using single
‑
chain,monomeric,ligand dependent polypeptide switches”，其描述含有配体结合结构域和转录调节结构域(如来自激素受体的那些)的基因开关)。
[0408]
在一些实施方案中，所述启动子响应于对t细胞激活信号传导有反应的元件。仅举例来说，在一些实施方案中，工程化t细胞包含编码免疫调节蛋白的表达载体和可操作地连接以控制所述免疫调节蛋白的表达的启动子。所述工程化t细胞可以例如通过工程化t细胞受体(tcr)或嵌合抗原反应器(car)信号传导而被激活，并且由此通过反应性启动子触发免疫调节蛋白的表达和分泌。
[0409]
在一些实施方案中，诱导型启动子与编码免疫调节蛋白的核酸分子操作性连接，使得所述免疫调节蛋白响应于激活的t细胞的核因子(nfat)或激活的b细胞的核因子κ
‑
轻链增强子(nf
‑
κb)而表达。例如，在一些实施方案中，所述诱导型启动子包含nfat或nf
‑
κb的结合位点。例如，在一些实施方案中，所述启动子是nfat或nf
‑
κb启动子或其功能性变体。因此，在一些实施方案中，所述核酸使得可能控制免疫调节蛋白的表达，同时也减小或消除免疫调节蛋白的毒性。特定地，包含本发明核酸的工程化免疫细胞仅在所述细胞(例如，由所述细胞表达的t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car))受到抗原的特异性刺激和/或所述细胞(例如，所述细胞的钙信号传导途径)受到例如乙酸肉豆蔻佛波醇(pma)/离子霉素的非特异性刺激时，才表达并分泌免疫调节蛋白。因此，免疫调节蛋白的表达和(在一些情况下)分泌可以被控制以仅在需要它的时间和地点(例如，在感染性致病因子、癌症的存在下或在肿瘤部位)进行，从而可以减少或避免不需要的免疫调节蛋白相互作用。
[0410]
在一些实施方案中，编码本文所述免疫调节蛋白的核酸包含编码nfat启动子、nf
‑
κb启动子或其功能变体的合适核苷酸序列。如本文所用的“nfat启动子”意指与最小启动子连接的一个或多个nfat反应元件。“nf
‑
κb启动子”是指与最小启动子连接的nf
‑
κb反应元件。在一些实施方案中，基因的最小启动子是人类il
‑
2启动子或cmv启动子。nfat反应元件可以包含例如nfat1、nfat2、nfat3和/或nfat4反应元件。nfat启动子、nf
‑
κb启动子或其功能变体可以包含任何数量的结合基序，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或多达十二个结合基序。
[0411]
使用其上具有dna分子的所得重组表达载体来转化适当宿主。该转化可以使用本领域中熟知的方法来进行。在一些实施方案中，本文提供的核酸还包含编码分泌或信号肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码免疫调节多肽的核酸可操作地连接，使得从培养基、宿主细胞或宿主细胞周质回收所得的可溶性免疫调节多肽。在其他实施方案中，选择适当的表达控制信号以允许免疫调节多肽的膜表达。此外，可商购试剂盒以及签约制造公司也可以用于制备本文提供的工程化细胞或重组宿主细胞。
[0412]
在一些实施方案中，使用其上具有dna分子的所得表达载体来转化(如转导)适当细胞。可以使用本领域熟知的方法进行引入。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些方法，包括通过病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，所述表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，通过慢病毒或逆转录病毒转导方法将核酸转移至细胞中。
[0413]
大量公共可获得且熟知的哺乳动物宿主细胞(包括哺乳动物t细胞或apc)中的任一种可用于制备多肽或工程化细胞。细胞的选择取决于本领域中公认的多种因素。这些因素包括例如与所选表达载体的相容性、由dna分子编码的肽的毒性、转化率、回收肽的容易性、表达特征、生物安全性和成本。要平衡这些因素，必须深入理解，并非所有细胞都可以同等有效地用于特定dna序列的表达。
[0414]
在一些实施方案中，所述宿主细胞可以是多种真核细胞，如酵母细胞，或哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(cho)或hek293细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是悬浮细胞，并且多肽是在培养悬浮液中，如在培养的悬浮cho细胞(例如，cho
‑
s细胞)中进行工程化或产生。在一些例子中，所述细胞系是缺乏dhfr(dhfr
‑
)cho细胞系，如dg44和duxb11。在一些实施方案中，所述细胞缺乏谷氨酰胺合酶(gs)，例如，cho
‑
s细胞、chok1 sv细胞和chozn((r))gs
‑
/
‑
细胞。在一些实施方案中，所述cho细胞(如悬浮cho细胞)可以是cho
‑
s
‑
2h2细胞、cho
‑
s
‑
克隆14细胞或expicho
‑
s细胞。
[0415]
在一些实施方案中，宿主细胞也可以是原核细胞，如大肠杆菌。将转化的重组宿主在多肽表达条件下培养，然后将其纯化以获得可溶蛋白质。可以在常规发酵条件下培养重组宿主细胞，使得表达所需多肽。此类发酵条件是本领域熟知的。最后，可以通过本领域公知的许多方法中的任何一种从重组细胞培养物中回收和纯化本文提供的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法和亲和色谱法。在完成成熟蛋白质的构型时，可以视需要使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以在最终纯化步骤中采用高效液相色谱法(hplc)。
[0416]
在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，如上文结合制备工程化细胞所述的任何免疫细胞。在一些实施方案中，此类工程化细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述工程化细胞对于所述受试者是自体的。在一些实施方案中，所述工程化细胞与受试者是同种异体的。在一些实施方案中，所述工程化细胞是例如通过白细胞单采术从受试者获得，并进行离体转化用于表达免疫调节多肽，例如，跨膜免疫调节多肽或可分泌免疫调节多肽。
[0417]
还提供了编码本文所述的感染原中包含的任何变体免疫调节多肽的核酸。在一些实施方案中，所述感染原将核酸递送至受试者中的细胞，和/或允许编码的变体多肽在细胞中表达。还提供了用于生成、产生或修饰此类感染原的核酸。例如，在一些实施方案中，提供了载体和/或质粒，其含有编码变体免疫调节多肽的核酸，以用于产生感染原，递送至受试者中的细胞和/或在受试者的细胞中表达变体免疫调节多肽。
[0418]
在一些实施方案中，所提供的核酸是含有编码变体免疫调节多肽的核酸序列的重组病毒或细菌载体。在一些实施方案中，所述重组载体可用于产生感染原，其含有编码变体免疫调节多肽和/或有待递送至受试者中的靶细胞以供靶细胞表达的核酸序列。在一些实施方案中，所述重组载体是表达载体。在一些实施方案中，所述重组载体包括生成和/或产生感染原和在靶细胞中表达所必需的合适序列。
[0419]
在一些实施方案中，所述重组载体是质粒或粘粒。含有编码如本文所述的变体免疫调节多肽的核酸序列的质粒或粘粒是使用本领域中熟知的标准技术容易地构建。对于感染原的生成，可以以质粒形式构建载体或基因组，随后可以将其转染至包装或生产细胞系或宿主细菌中。可以使用本领域已知的任何重组技术生成重组载体。在一些实施方案中，所述载体可以包括原核复制起点和/或如下基因，所述基因的表达赋予可检测或可选择标记
物，如用于在原核系统中繁殖和/或选择的抗药性。
[0420]
在一些实施方案中，所述重组载体是病毒载体。示例性重组病毒载体包括慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可以是活的、减毒的、有复制条件的或复制缺陷的、非致病的(有缺陷的)、可复制的病毒载体和/或经修饰以表达异源基因产物，例如本文提供的变体免疫调节多肽。用于生成病毒的载体还可以被修饰以改变病毒的衰减，其包括增加或减少转录或翻译负荷的任何方法。
[0421]
可以使用的示例性病毒载体包括修饰的痘苗病毒载体(参见例如，guerra等人,j.virol.80:985
‑
98(2006)；tartaglia等人,aids research and human retroviruses 8:1445
‑
47(1992)；gheradi等人,j.gen.virol.86:2925
‑
36(2005)；mayr等人,infection 3:6
‑
14(1975)；hu等人,j.virol.75:10300
‑
308(2001)；美国专利号5,698,530、6,998,252、5,443,964、7,247,615和7,368,116)；腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体(参见例如，molin等人,j.virol.72:8358
‑
61(1998)；narumi等人,am j.respir.cell mol.biol.19:936
‑
41(1998)；mercier等人,proc.natl.acad.sci.usa 101:6188
‑
93(2004)；美国专利号6,143,290；6,596,535；6,855,317；6,936,257；7,125,717；7,378,087；7,550,296)；逆转录病毒载体，包括基于鼠白血病病毒(mulv)、长臂猿白血病病毒(galv)、嗜亲性逆转录病毒、猿猴免疫缺陷病毒(siv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)及组合的那些(参见例如，buchscher等人,j.virol.66:2731
‑
39(1992)；johann等人,j.virol.66:1635
‑
40(1992)；sommerfelt等人,virology 176:58
‑
59(1990)；wilson等人,j.virol.63:2374
‑
78(1989)；miller等人,j.virol.65:2220
‑
24(1991)；miller等人,mol.cell biol.10:4239(1990)；kolberg,nih res.4:43 1992；cornetta等人,hum.gene ther.2:215(1991))；慢病毒载体，包括基于人类免疫缺陷病毒(hiv
‑
1)、hiv
‑
2、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(siv)和梅迪/维斯纳(maedi/visna)病毒的那些(参见例如，pfeifer等人,annu.rev.genomics hum.genet.2:177
‑
211(2001)；zufferey等人,j.virol.72:9873,1998；miyoshi等人,j.virol.72:8150,1998；philpott和thrasher,human gene therapy 18:483,2007；engelman等人,j.virol.69:2729,1995；nightingale等人,mol.therapy,13:1121,2006；brown等人,j.virol.73:9011(1999)；wo 2009/076524；wo 2012/141984；wo 2016/011083；mcwilliams等人,j.virol.77:11150,2003；powell等人,j.virol.70:5288,1996)或其任何变体；和/或可用于产生上述任何病毒的载体。在一些实施方案中，所述重组载体可以包括调节序列，如启动子或增强子序列，所述调节序列可以调节病毒基因组(如在rna病毒的情况下)在包装细胞系中的表达(参见例如美国专利号5,385,839和5,168,062)。
[0422]
在一些实施方案中，所述重组载体是表达载体，例如，当递送至靶细胞(例如受试者中的细胞，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或apc)中时允许编码的基因产物进行表达的表达载体。在一些实施方案中，所述感染原中包含的重组表达载体能够在适合于蛋白质表达的条件下在受试者的靶细胞中表达免疫调节蛋白。
[0423]
在一些方面，核酸或表达载体包含编码与合适的表达控制序列可操作地连接的免疫调节蛋白的核酸序列。在编码免疫调节蛋白的核酸序列插入载体中之前或之后实现这种可操作连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信
号。所述启动子可以与核酸序列中编码免疫调节蛋白的部分可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是靶细胞中的组成型活性启动子(如组织特异性组成型活性启动子或其他组成型启动子)。例如，所述重组表达载体还可以包括淋巴组织特异性转录调节元件(tre)，如b淋巴细胞、t淋巴细胞或树突细胞特异性tre。淋巴组织特异性tre是本领域已知的(参见例如，thompson等人,mol.cell.biol.12:1043
‑
53(1992)；todd等人,j.exp.med.177:1663
‑
74(1993)；penix等人,j.exp.med.178:1483
‑
96(1993))。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子，其可响应于诱导剂(如t细胞激活信号)。在一些实施方案中，递送至受试者中的靶细胞(例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或apc)的核酸可以与上述任何调节元件可操作地连接。
[0424]
在一些实施方案中，所述载体是细菌载体，例如，细菌质粒或粘粒。在一些实施方案中，经由细菌介导的质粒dna转移至哺乳动物细胞(也称为“细胞转染”)将细菌载体递送至靶细胞，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或apc。在一些实施方案中，递送的细菌载体还含有用于在靶细胞中表达的适当表达控制序列，例如启动子序列和/或增强子序列，或上述任何调节或控制序列。在一些实施方案中，所述细菌载体含有合适的表达控制序列，以用于在感染原例如细菌中表达和/或分泌编码的变体多肽。
[0425]
在一些实施方案中，本文提供的多肽还可以通过合成方法来制备。固相合成是制备单独肽的优选技术，因为它是制备小肽的最划算的方法。例如，熟知的固相合成技术包括保护基团、接头和固相支持体的使用以及特定的保护和去保护反应条件、接头切割条件、清除剂的使用以及固相肽合成的其他方面。然后可以将肽组装成如本文所提供的多肽。iv.评估变体cd86多肽和免疫调节蛋白的活性免疫调节的方法
[0426]
在一些实施方案中，本文提供的变体cd86多肽(全长和/或特异性结合片段或缀合物、堆叠构建体或其融合物或工程化细胞)展现调节t细胞活化的免疫调节活性。在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86对照，cd86多肽在t细胞测定中调节细胞因子产生，如ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达。在一些情况下，相对于对照cd86，表达细胞活性的调节可以增加或减少由或来自t细胞的细胞因子产生，如ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达。用于确定特异性结合和细胞因子产物如ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达的测定是本领域熟知的，并且包括测量培养上清液中的细胞因子水平的mlr(混合淋巴细胞反应)测定(wang等人,cancer immunol res.2014年9月2(9):846
‑
56)、seb(葡萄球菌肠毒素b)t细胞刺激测定(wang等人,cancer immunol res.2014年9月:2(9):846
‑
56)和抗cd3 t细胞刺激测定(li和kurlander,j transl med.2010:8:104)。
[0427]
在一些实施方案中，相对于野生型cd86对照，在原代t细胞测定中，变体cd86多肽可以在一些实施方案中增加或在替代实施方案中降低细胞因子产生，如ifn
‑
γ(干扰素
‑
γ)、tnfα或il
‑
2表达。在一些实施方案中，这种活性可以取决于变体cd86多肽是以拮抗剂活性的形式还是以激动剂活性的形式提供。技术人员将认识到，存在不同形式的原代t细胞测定用于确定ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达的增加或减少。
[0428]
在原代t细胞测定中，在测定变体cd86增加ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达的能力时，可以使用混合淋巴细胞反应(mlr)测定。在一些实施方案中，以拮抗剂形式(如可溶性形式)提供的变体cd86多肽或免疫调节蛋白(例如变体cd86
‑
fc或可分泌性免疫调节蛋白)阻断cd28的活性，从而降低测定中的mlr活性，如通过测定中降低的ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2产生而观察
到的。在一些实施方案中，以激动剂形式(如含有肿瘤定位部分的定位vigd堆叠或缀合物或表达如提供的跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞)提供的变体cd86多肽或免疫调节蛋白可以刺激cd28的活性，从而增加mlr活性，如通过增加的ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2产生证明的。
[0429]
可替代地，在原代t细胞测定中，在测定变体cd86调节ifn
‑
γ或il
‑
2表达的增加或降低的能力时，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中由抗cd3抗体提供的tcr信号与共固定化变体cd86结合使用，用于确定相对于cd86未经修饰的或野生型对照增加或减少ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达的能力。在一些实施方案中，在共固定化测定中，变体cd86多肽或免疫调节蛋白(例如，共固定化变体cd86(例如，cd86
‑
fc))增加ifn
‑
γ产生。
[0430]
在一些实施方案中，在测定变体cd86调节ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达的增加或减少的能力时，可以使用t细胞报告物测定。在一些实施方案中，t细胞是jurkat t细胞系，或者源自jurkat t细胞系。在报告物测定中，也可以产生报告细胞系(例如，jurkat报告细胞)以过表达抑制性受体例如ctla
‑
4，所述抑制性受体是变体igsf结构域多肽的同源结合配偶体。在一些实施方案中，所述报告t细胞还含有报告构建体，其含有与报告物可操作连接的响应于t细胞激活的诱导型启动子。在一些实施方案中，所述报告物是荧光或发光报告物。在一些实施方案中，所述报告物是萤光素酶。在一些实施方案中，所述启动子响应于cd3信号传导。在一些实施方案中，所述启动子是nfat启动子。在一些实施方案中，所述启动子响应于共刺激信号传导，例如，cd28共刺激信号传导。在一些实施方案中，所述启动子是il
‑
2启动子。
[0431]
在报告物测定的方面中，如通过与表达野生型配体(例如，cd86)的抗原呈递细胞(apc)共孵育来刺激报告细胞系。在一些实施方案中，所述apc是人工apc。人工apc是技术人员熟知的。在一些实施方案中，人工apc源自一种或多种哺乳动物细胞系，如k562、cho或293细胞。在一些实施方案中，所述人工apc被工程化以表达抗cd3抗体以及(在一些情况下)共刺激配体。在一些实施方案中，生成人工apc以过表达变体igsf结构域多肽的同源结合配偶体。例如，在变体cd86的情况下，产生报告细胞系(例如，jurkat报告细胞)以过表达配体cd28。在一些实施方案中，将jurkat报告细胞与过表达的人工apc在变体igsf结构域分子或免疫调节蛋白(例如，变体cd86多肽或免疫调节蛋白)的存在下共孵育。在一些实施方案中，例如通过确定细胞的发光或荧光，监测报告物表达。可以监测同源结合配偶体的激动剂或拮抗剂(阻断)活性。
[0432]
适当对照的使用是本领域技术人员已知的，然而，在前述实施方案中，对照通常涉及使用未经修饰的cd86，如来自从其衍生或开发出变体cd86的相同哺乳动物物种的野生型的天然cd86同种型。在一些实施方案中，野生型或天然cd86具有与变体相同的形式或对应的形式。例如，如果变体cd86是含有与fc蛋白融合的变体ecd的可溶形式，那么对照是含有与fc蛋白融合的cd86的野生型或天然ecd的可溶形式。
[0433]
在一些实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86对照，变体cd86多肽或免疫调节蛋白将ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达(即，蛋白质表达)增加至少：5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在其他实施方案中，相对于野生型或未经修饰的cd86对照，变体cd86或免疫调节蛋白将ifn
‑
γ、tnfα或il
‑
2表达(即蛋白质表达)降低至少：5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方案中，野生
型cd86对照是鼠cd86，如通常针对变体cd86来使用，所述变体cd86的序列与野生型鼠cd86序列的序列相比有所改变。在一些实施方案中，野生型cd86对照是人cd86，如通常针对变体cd86来使用，所述变体cd86的序列与相应的野生型人cd86序列的序列(如包含seq id no:2、seq id no:122或seq id no:123的氨基酸序列的cd86序列)相比有所改变。v.药物配制品
[0434]
本文提供了含有本文所述的任何变体cd86多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞或感染原的组合物。所述药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。例如，所述药物组合物可以含有一种或多种赋形剂，用于改变、维持或保持例如组合物的ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在一些方面，技术人员理解，含有细胞的药物组合物可以与含有蛋白质的药物组合物不同。
[0435]
在一些实施方案中，所述药物组合物是固体，如粉末、胶囊或片剂。例如，所述药物组合物的组分可以是冻干的。在一些实施方案中，在施用之前将固体药物组合物重构或溶解在液体中。
[0436]
在一些实施方案中，所述药物组合物是液体，例如溶解在水溶液(如生理盐水或林格氏溶液)中的变体cd86多肽。在一些实施方案中，所述药物组合物的ph为约4.0至约8.5(如约4.0至约5.0、约4.5至约5.5、约5.0至约6.0、约5.5至约6.5、约6.0至约7.0、约6.5至约7.5、约7.0至约8.0或约7.5至约8.5)。
[0437]
在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，例如填充剂、粘合剂、包衣、防腐剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂、缓冲剂、螯合剂或稳定剂。药学上可接受的填充剂的例子包括纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙、微晶纤维素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、麦芽酚、预胶化淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。药学上可接受的粘合剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、乳糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、明胶、蔗糖、聚乙二醇、甲基纤维素或纤维素。药学上可接受的包衣的例子包括羟丙基甲基纤维素(hpmc)、虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或明胶。药学上可接受的崩解剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或羟基乙酸淀粉钠。药学上可接受的润滑剂的例子包括聚乙二醇、硬脂酸镁或硬脂酸。药学上可接受的防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。药学上可接受的甜味剂的例子包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨糖醇。药学上可接受的缓冲剂的例子包括碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。
[0438]
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含用于产物的受控释放或持续释放的药剂，如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂质体。
[0439]
在一些实施方案中，所述药物组合物是无菌的。灭菌可以通过经由无菌滤膜过滤或辐射来完成。在冻干组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。此外，通常肠胃外组合物通常置于具有无菌进入口的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
[0440]
在一些实施方案中，提供了药物组合物，其含有跨膜免疫调节蛋白，包括表达此类跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物和配制品包括一种或多种可选的药学上可接受的载体或赋形剂。所述组合物可包含缓冲液，例如中性缓冲盐
水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本发明组合物优选地经配制用于静脉内施用。
[0441]
这种配制品可以例如呈适于静脉内输注的形式。药学上可接受的载体可以是药学上可接受的材料、组合物或媒剂，其参与将所关注细胞从身体的一个组织、器官或部分携带或运送至身体的另一组织、器官或部分。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料或其一些组合。载剂的每一组分必须是“药学上可接受的”，因为其必须与配制品中的其他成分相容。它还必须适于与它可能遇到的身体的任何组织、器官或部分接触，这意味着它不得带有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过多超出其治疗益处的任何其他并发症的风险。
[0442]
在一些实施方案中，将药物组合物施用至受试者。通常，根据标准药学实践，根据受试者的体型和状况确定药物组合物的剂量和给药途径。例如，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴中估算治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定适当的浓度范围和施用途径。所述信息随后可用于确定在人类中的可用剂量和施用途径。确切剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和给药以提供足够水平的活性化合物或以维持所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、施用的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对治疗的反应。
[0443]
长效药物组合物可以根据特定制剂的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周施用一次。给药频率将取决于所用制剂中分子的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，组合物可以以单剂量的方式施用，或随时间以多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)的方式施用，或以连续输注的方式施用。常规地对合适的剂量做出进一步改进。通过使用适当的剂量反应数据可以确定合适的剂量。可以监测许多针对治疗效果的生物标记物或生理学标记物，包括t细胞活化或增殖、细胞因子合成或产生(例如，tnf
‑
α、ifn
‑
γ、il
‑
2的产生)、诱导各种活化标记物(例如，cd25、il
‑
2受体)、炎症、关节肿胀或压痛、c反应蛋白的血清水平、抗胶原抗体产生和/或一种或多种t细胞依赖性抗体应答。
[0444]
在一些实施方案中，通过任何途径向受试者施用所述药物组合物，包括口服、透皮、通过吸入、静脉内、动脉内、肌内、直接应用于伤口部位、应用于外科手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内或脊柱内。
[0445]
在一些实施方案中，所述药物组合物的剂量是单剂量或重复剂量。在一些实施方案中，向受试者施用所述剂量为每天一次、每天两次、每天三次或者每天四次或更多次。在一些实施方案中，在一周内施用约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，在数天、数周、数月或数年的过程中施用多剂量。在一些实施方案中，治疗过程为约1或更多个剂量(例如约2或更多个剂量、约3或更多个剂量、约4或更多个剂量、约5或更多个剂量、约7或更多个剂量、约10或更多个剂量、约15或更多个剂量、约25或更多个剂量、约40或更多个剂量、约50或更多个剂量或约100或更多个剂量)。
[0446]
在一些实施方案中，所施用的药物组合物的剂量为每kg受试者体重约1μg蛋白质或更多(如每kg受试者体重约2μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约5μg蛋白质)或更多、每
kg受试者体重约10μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约25μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约50μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约100μg蛋白质或更高、每kg受试者体重约250μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约500μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约1mg蛋白质或更多、每kg受试者体重约2mg蛋白质或更多或每kg受试者体重约5mg蛋白质或更多)。
[0447]
在一些实施方案中，施用治疗量的细胞组合物。通常，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。通常，可以说包含如本文所述的工程化细胞(例如，t细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重(如105至106个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有整数值)的剂量施用。工程化细胞组合物(例如t细胞组合物)也可以这些剂量多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如，rosenberg等人,new eng.j.of med.319:1676,1988)。特定患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病体征和相应调整治疗容易地确定。
[0448]
在一些实施方案中，所述药物组合物包含含有编码免疫调节变体多肽的核酸序列的感染原。在一些实施方案中，所述药物组合物含有一定剂量的感染原，所述剂量适合于施用适合治疗的受试者。在一些实施方案中，所述药物组合物含有感染原，所述感染原是如下单剂量或多剂量量的病毒：在或在约1
×
105与约1
×
10
12
噬斑形成单位(pfu)、1
×
106与1
×
10
10
pfu，或1
×
107与1
×
10
10
pfu之间，每个都包含端值，如至少或至少约或为约1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、2
×
109、3
×
109、4
×
109、5
×
109pfu或约1
×
10
10
pfu。在一些实施方案中，所述药物组合物可以含有如下病毒浓度：从或从约105至约10
10
pfu/ml，例如，5
×
106至5
×
109或1
×
107至1
×
109pfu/ml，如至少或至少约或为约106pfu/ml、107pfu/ml、108pfu/ml或109pfu/ml。在一些实施方案中，所述药物组合物含有感染原，所述感染原是如下单剂量或多剂量量的细菌：在或在约1
×
103与约1
×
109菌落形成单位(cfu)、1
×
104与1
×
109cfu或1
×
105与1
×
107cfu之间，每个都包含端值，如至少或至少约或为约1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108或1
×
109cfu。在一些实施方案中，药物组合物可以含有如下细菌浓度：从或从约103至约108cfu/ml，例如，5
×
105至5
×
107或1
×
106至1
×
107cfu/ml，如至少或至少约或为约105cfu/ml、106cfu/ml、107cfu/ml或108cfu/ml。
[0449]
已知多种手段用于确定施用本发明的治疗组合物通过如下方式是否充分调节免疫活性：消除、隔离或灭活介导或能够介导不希望的免疫应答的免疫细胞；诱导、产生或开启介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些效应的组合。免疫活性调节的测量的例子包括但不限于检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微镜、聚合酶链式反应(pcr))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号进行增殖或分裂的能力或抵抗响应于信号的增殖或分裂(如用抗cd3抗体、抗t细胞受体抗体、抗cd28抗体、钙离子载体、载有肽或蛋白质抗原的pma(佛波醇12
‑
肉豆蔻酸酯13
‑
乙酸酯)抗原呈递细胞刺激后，使用基于3h
‑
胸苷掺入的t细胞增殖测定和肽扫描分析；b细胞增殖测定)；测量杀死或裂解其他细胞的能力(如细胞毒性t细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径的激活的生化标记物(例如蛋白质印迹和免疫沉淀分析酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割以及蛋白质复合物的形成或解离；蛋白质阵列分
析；dna转录、使用dna阵列或消减杂交的分析)；通过细胞凋亡、坏死或其他机制测量细胞死亡(例如，膜联蛋白v染色、tunel测定、用于测量dna梯度的凝胶电泳、组织学；荧光半胱天冬酶测定、半胱天冬酶底物的蛋白质印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白质和其他分子(例如，northern印迹分析、聚合酶链式反应、dna微阵列、蛋白质微阵列、2维凝胶电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞术)；以及测量临床症状或结果，如自身免疫性疾病、神经退行性疾病和其他涉及自身蛋白质或自身多肽的疾病的改善(临床评分、使用其他疗法的要求、功能状态、影像学研究)，例如，在多发性硬化的情况下通过测量复发率或者疾病严重程度(使用普通技术人员已知的临床评分)，在i型糖尿病的情况下测量血糖，或在类风湿性关节炎的情况下测量关节炎症。vi.制品和试剂盒
[0450]
本文还提供了处于合适包装中的包含本文所述药物组合物的制品。用于本文所述组合物的合适包装是本领域已知的，并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(mylar)或塑料袋)等。可进一步将这些制品灭菌和/或密封。
[0451]
还提供试剂盒，其包含本文所述的药物组合物(或制品)，所述试剂盒还可以包含关于使用所述组合物的方法(如本文所述的用途)的一个或多个说明书。本文所述的试剂盒还可包含商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器以及具有针对执行本文所述任何方法的说明书的包装插页。vii.治疗性应用
[0452]
本文提供了使用所提供的含有本文所述的变体cd86多肽免疫调节蛋白、工程化细胞或感染原的药物组合物来调节受试者(如人患者)的免疫应答(包括与治疗疾病或病症有关)的方法。本文所述的药物组合物(包括包含本文所述的变体cd86多肽、免疫调节蛋白、缀合物和工程化细胞的药物组合物)可用于多种治疗应用，如疾病的治疗。例如，在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗哺乳动物的炎性或自身免疫性疾病、癌症、器官移植、病毒感染和/或细菌感染。所述药物组合物可以调节(例如，增加或减少)免疫应答以治疗疾病。在一些实施方案中，所述方法用增加受试者的免疫应答的形式的变体cd86多肽进行。在一些此类方面，增加免疫应答治疗受试者的疾病或病症，如肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述方法用降低受试者的免疫应答的形式的变体cd86多肽进行。在一些此类方面，降低免疫应答治疗受试者的疾病或病症，如炎性疾病或病症，例如自身免疫性疾病。
[0453]
在一些实施方案中，所提供的方法适用于本文所述的变体cd86多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞和感染原的治疗性施用。鉴于所提供的公开内容，技术人员能够根据所需的免疫应答的调节类型(例如，增加或减少)选择用于适应症的形式。
[0454]
在一些实施方案中，施用刺激或增加免疫应答的本文提供的药物组合物，其可用于例如治疗癌症、病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，所述药物组合物含有某种形式的变体cd86多肽，所述形式展现其同源结合配偶体cd28的激动剂活性和/或经由cd28刺激或启动共刺激信号传导。用于与此类治疗性应用结合使用的cd86多肽的示例性形式包括，例如，免疫调节蛋白或变体cd86多肽的“堆叠”以及与肿瘤抗原结合的igsf结构域或其变体(例如nkp30或亲和力修饰的变体)(也称为“肿瘤定位igsf结构域”)、含有与肿瘤靶向部分(也称为肿瘤定位部分)连接的变体cd86多肽的缀合物、表达跨膜免疫调节蛋白的工程化细
胞或包含编码跨膜免疫调节蛋白的核酸分子的感染原，如用于在感染细胞(例如肿瘤细胞或apc，例如树突细胞)中表达跨膜免疫调节蛋白。
[0455]
所提供的调节免疫应答的方法可用于治疗疾病或病症，如肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述药物组合物可用于抑制哺乳动物癌细胞(如人癌细胞)的生长。治疗癌症的方法可包括向患有癌症的受试者施用有效量的本文所述的任何药物组合物。可施用有效量的药物组合物以抑制、中止或逆转癌症的进展。人癌细胞可以进行体内或离体处理。在人患者的离体治疗中，在身体外部处理含有癌细胞的组织或流体，然后将所述组织或流体再引入回到患者体内。在一些实施方案中，通过将治疗组合物施用至患者中来在人患者体内治疗癌症。因此，本发明提供抑制、停止或逆转肿瘤进展，或者相对于用对照治疗以其他方式导致无进展存活(即，在治疗期间和之后，患者在癌症不恶化的情况下存活的时间长度)或总存活(也称为“存活率”；即，研究或治疗组中，在被诊断为患有癌症或针对癌症进行治疗后存活一定时间段的人的百分比)的统计学显著增加的离体和体内方法。
[0456]
可通过本文所述的药物组合物和治疗方法治疗的癌症包括但不限于黑色素瘤、膀胱癌、血液恶性肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌(腺癌)、结直肠癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、脾癌、胸腺癌或血细胞癌(即，白血病)、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。在一些实施方案中，所述癌症是尤因肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌和血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、宫颈癌、神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。
[0457]
在一些实施方案中，所述药物组合物作为单一疗法(即，作为单一药剂)或作为组合疗法(即，与一种或多种另外的抗癌剂组合，如化学治疗药物、癌症疫苗或免疫检查点抑制剂)施用。在一些实施方案中，所述药物组合物还可以与放射疗法一起施用。在本公开文本的一些方面中，所述免疫检查点抑制剂是纳武单抗、曲美木单抗、派姆单抗、伊匹单抗等。
[0458]
在一些实施方案中，所述药物组合物阻抑免疫应答，其可用于治疗炎性或自身免疫性障碍或器官移植。在一些实施方案中，所述药物组合物含有某种形式的变体cd86多肽，所述形式展现其同源结合配偶体cd28的拮抗剂活性和/或经由cd28阻断或抑制共刺激信号传导。用于与此类治疗性应用结合使用的cd86多肽的示例性形式包括，例如，可溶性变体cd86多肽(例如变体cd86
‑
fc融合蛋白)、变体cd86多肽的免疫调节蛋白或“堆叠”和另一种igsf结构域(包括作为fc融合物的可溶形式)、表达可分泌性免疫调节蛋白的工程化细胞或包含编码可分泌性免疫调节蛋白的核酸分子的感染原，如用于在感染细胞(例如肿瘤细胞或apc，例如树突细胞)中表达和分泌可分泌性免疫调节蛋白。
[0459]
在一些实施方案中，所述药物组合物含有某种形式的变体cd86多肽，所述形式展现激动其同源结合配偶体cd28的活性和/或经由cd28促进共刺激信号传导。用于与此类治疗性应用结合使用的cd86多肽的示例性形式包括，例如，作为跨膜免疫调节多肽的变体cd86多肽、表达跨膜免疫调节多肽的工程化细胞或包含编码跨膜免疫调节多肽的核酸分子的感染原，如以用于在感染细胞(例如t细胞、apc，例如树突细胞)上表达跨膜免疫调节蛋白。
[0460]
在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性障碍是抗中性粒细胞胞质抗体(anca)
相关血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液学疾病。
[0461]
在一些实施方案中，可通过本文所述的药物组合物治疗的炎性和自身免疫性障碍是艾迪生(addison’s)病、过敏、斑秃、阿尔茨海默症、抗中性粒细胞胞质抗体(anca)相关性血管炎、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征(休斯(hughes)综合征)、哮喘、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、无精子症、白塞病、伯杰病、大疱性类天疱疮、心肌病、心血管疾病、口炎性腹泻/乳糜泻、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(cfids)、慢性特发性多发性神经炎、慢性炎性脱髓鞘、多发性神经病(cidp)、慢性复发性多发性神经病(格林
‑
巴利(guillain
‑
barr
é
)综合征)、查格
‑
施特劳斯(churg
‑
strauss)综合征(css)、瘢痕性类天疱疮、冷凝激素病(cad)、copd(慢性阻塞性肺病)、crest综合征、克罗恩病、皮炎、疱疹、皮肌炎、糖尿病、盘状狼疮、湿疹、获得性大疱性表皮松解症、原发性混合型冷球蛋白血症、埃文综合征、眼球突出、纤维肌痛、古德帕斯丘(goodpasture)综合征、格雷夫斯(graves’)病、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga肾病、免疫增殖性疾病或障碍、炎性肠病(ibd)、间质性肺病、幼年型关节炎、幼年特发性关节炎(jia)、川崎病、莱伯特
‑
伊顿(lambert
‑
eaton)肌无力综合征、扁平苔藓、狼疮性肾炎、淋巴细胞性垂体炎、梅尼埃(m
é
ni
è
re)病、米勒鱼(miller fish)综合征/急性播散性脑脊髓神经病变(emr)、混合性结缔组织病、多发性硬化(ms)、肌肉风湿病、肌痛性脑脊髓炎(me)、重症肌无力、眼部炎症、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征(惠特克(whitaker)综合征)、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化/自身免疫性胆管病、银屑病、银屑病性关节炎、雷诺(raynaud’s)现象、赖特(reiter’s)综合征/反应性关节炎、再狭窄、风湿热、风湿性疾病、结节病、施密特(schmidt’s)综合征、硬皮病、舍格伦综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮(sle)、系统性硬皮病、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、甲状腺炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、间质性肠病或韦格纳肉芽肿(wegener’s granulomatosis)。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性障碍选自间质性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎和银屑病。
[0462]
在一些实施方案中，施用所述药物组合物以调节自身免疫性病症。例如，抑制免疫应答在用于抑制接受者对供体的组织、细胞或器官移植的排斥的方法中是有益的。因此，在一些实施方案中，本文所述的药物组合物用于限制或预防移植物相关或移植相关的疾病或障碍，如移植物抗宿主病(gvhd)。在一些实施方案中，所述药物组合物用于抑制移植(transplant或graft)的骨髓、器官、皮肤、肌肉、神经元、胰岛或实质细胞的自身免疫排斥。
[0463]
本文所述的包含工程化细胞的药物组合物和方法可用于过继细胞转移应用。在一些实施方案中，包含工程化细胞的细胞组合物可以在相关方法中使用，例如以在免疫疗法方法中调节免疫活性，从而治疗例如哺乳动物癌症，或者在其他实施方案中，治疗自身免疫性障碍。所采用的方法通常包括在容许亲和力修饰的igsf结构域的特异性结合和调节哺乳动物细胞的免疫学活性的条件下使本发明的tip与哺乳动物细胞接触的方法。在一些实施方案中，免疫细胞(如肿瘤浸润淋巴细胞(til)、t细胞(包括cd8+或cd4+细胞)或apc)被工程化以表达为膜蛋白和/或如本文所述的可溶性变体cd86多肽、免疫调节蛋白或缀合物。然
后，所述工程化细胞可以接触哺乳动物细胞，如apc、第二淋巴细胞或肿瘤细胞，其中需要调节免疫活性并且所述调节是在允许亲和力修饰的igsf结构域与哺乳动物细胞上的反结构特异性结合的条件下，使得可以在哺乳动物细胞中调节免疫活性。细胞可以在体内或离体接触。
[0464]
在一些实施方案中，所述工程化细胞是自体细胞。在其他实施方案中，所述细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，所述细胞是自体的工程化细胞，其重新输注至它所分离自的哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，所述细胞是输注至哺乳动物中的同种异体工程化细胞。在一些实施方案中，从患者的血液或肿瘤收获细胞，工程化以表达多肽(如本文所述的变体cd86多肽、免疫调节蛋白或缀合物)，在体外培养体系中扩增(例如，通过刺激细胞)，并重新输注至患者中以介导肿瘤破坏。在一些实施方案中，所述方法通过过继性细胞转移进行，其中将表达tip的细胞(例如，t细胞)输注回患者中。在一些实施方案中，本发明的治疗性组合物和方法用于治疗哺乳动物患者的癌症，如淋巴瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、宫颈癌、神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤。
[0465]
在一些实施方案中，所提供的方法用于治疗患有或怀疑患有治疗性应用所针对的疾病或病症的受试者。在一些情况下，可以在治疗之前基于一种或多种特征或参数来选择用于治疗的受试者，如以确定对于疗法的适合性，或者以鉴定或选择受试者用于根据任何所提供实施方案的治疗，包括使用所提供的变体cd86多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞或感染原中的任一种的治疗。viii.示例性实施方案
[0466]
所提供的实施方案包括：1.一种变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含细胞外结构域或igv结构域或其特异性结合片段，其中所述变体cd86多肽包含在未经修饰的cd86多肽或其特异性结合片段中的一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰对应于选自以下的关于seq id no:29中所示位置的一个或多个位置：13、18、25、28、33、38、39、40、43、45、52、53、60、68、71、77、79、80、82、86、88、89、90、92、93、97、102、104、113、114、123、128、129、132、133、137、141、143、144、148、153、154、158、170、172、175、178、180、181、183、185、192、193、196、197、198、205、206、207、212、215、216、222、223、或224。2.根据实施方案1所述的变体cd86多肽，其中所述氨基酸修饰包括氨基酸取代、缺失或插入。3.根据实施方案1或实施方案2所述的变体cd86多肽，其中所述未经修饰的cd86多肽是哺乳动物cd86多肽或其特异性结合片段。4.根据实施方案3所述的变体cd86多肽，其中所述未经修饰的cd86多肽是人cd86多肽或其特异性结合片段。5.根据实施方案1
‑
4中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽包含人cd86的细胞外结构域，其中所述一个或多个氨基酸修饰是在所述未经修饰的cd86多肽的细胞外结构域的一个或多个残基中。6.根据实施方案1
‑
5中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述未经修饰的cd86多肽包含(i)seq id no:29中所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:29具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)其部分，所述其部分包含igv结构域或所述igv结构域的特异性
结合片段。7.根据实施方案1
‑
6中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述未经修饰的cd86包含seq id no:29中所示的氨基酸序列。8.根据实施方案6所述的变体cd86多肽，其中所述其部分包含所述igv结构域的氨基酸残基33
‑
131或24
‑
134或所述igv结构域的特异性结合片段。9.根据实施方案1
‑
6和实施方案8中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述未经修饰的cd86多肽包含(i)seq id no:123中所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:123具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)其部分，所述其部分包含igv结构域或所述igv结构域的特异性结合片段。10.根据实施方案1
‑
6中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述未经修饰的cd86包含seq id no:123中所示的氨基酸序列。11.根据实施方案1
‑
6、8和9中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述未经修饰的cd86多肽包含(i)seq id no:122中所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:122具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)或其特异性结合片段。12.根据实施方案1
‑
6、8、9和11中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述未经修饰的cd86包含seq id no:122中所示的氨基酸序列。13.根据实施方案1
‑
12中任一项所述的变体cd86多肽，其中：所述特异性结合片段具有至少50、60、70、80、90、95个或更多个氨基酸的长度；或者所述特异性结合片段包含如下长度，所述长度为如seq id no:2的残基33
‑
131所示的igv结构域的长度的至少80％。14.根据实施方案1
‑
13中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地氨基酸取代、插入和/或缺失。15.根据实施方案1
‑
14中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是选自以下的一个或多个氨基酸取代：a13v、q18k、q25l、s28g、f33i、e38v、n39d、l40m、l40s、n43k、v45i、f52l、d53g、m60k、d68n、t71a、l77p、i79n、k80e、k80m、k80r、k82t、q86k、q86r、i88f、i88t、i89v、h90 l、h90y、k92i、k93t、m97l、q102h、n104s,f113s、s114g、n123d、v128a、y129n、l132m、t133a、i137t、p141a、p143h、k144e、v148d、k153e、k153r、n154d、e158g、v170d、e172g、d175e、i178t、l180s、s181p、s183p、p185s、t192n、i193v、i196v、l197m、e198d、l205s、s206t、s207p、e212v、d215v、p216h、h222t或i223f、或其保守氨基酸取代。16.根据实施方案1
‑
15中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：q25l/t71a/h90y、q25l/d53g/e212v、q25l/h90l、n43k/i79n/h90l/i178t/e198d、a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t、q25l/q86r/h90l/k93t/l132m/v148d/s181p/p216h、q25l/f33i/h90y/v128a/p141a/e158g/s181p、q25l/n39d/k80r/q86r/i88f/h90l/k93t/n123d/n154d、q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v、q25l/q86r/h90l/n104s、q25l/l40m/h90l/l180s/s183p、q18k/q25l/f33i/l40s/h90l、q25l/q86k/h90l/i137t/s181p、q25l/l77p/h90y/k153r/v170d/s181p、q25l/s28g/f33i/
f52l/h90l/q102h/i178t、q25l/f33i/h90l/k144e/l180s、q25l/f33i/h90l/k153e/e172g/t192n、q25l/f33i/q86r/h90y/d175e/i196v/e198d、q25l/v45i/d68n/h90l/s183p/l205s、e38v/s114g/p143h、h90y/l180s、h90y/y129n、i89v/h90l/i193v、k80e/h90y/h222t/i223f/p224l、k80m/i88t、k92i/f113s、m60k/h90l、q25l/f33i/h90l、q25l/f33i/q86r/h90l/k93t、q25l/h90l、q25l/h90l/p185s、q25l/h90l/p185s/p224l、q25l/h90l/s179r、q25l/h90y/s181p/i193v、q25l/k82t/h90l/t152s/s207p、q25l/q86r/h90l/k93t或s28g/h90y。17.根据实施方案1
‑
14中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是在位置25和/或位置90处。18.根据实施方案1
‑
14和17中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包括q25l、h90y或h90l。19.根据实施方案1
‑
14和17中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包括在位置25和位置90处的修饰。20.根据实施方案19所述的变体cd86多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自q25l/h90y或q25l/h90l。21.根据实施方案1
‑
20中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰：q25l/t71a/h90y、q25l/d53g/e212v、q25l/h90l、n43k/i79n/h90l/i178t/e198d、a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t、q25l/q86r/h90l/k93t/l132m/v148d/s181p/p216h、q25l/f33i/h90y/v128a/p141a/e158g/s181p、q25l/n39d/k80r/q86r/i88f/h90l/k93t/n123d/n154d、q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v、q25l/q86r/h90l/n104s、q25l/l40m/h90l/l180s/s183p、q18k/q25l/f33i/l40s/h90l、q25l/q86k/h90l/i137t/s181p、q25l/l77p/h90y/k153r/v170d/s181p、q25l/s28g/f33i/f52l/h90l/q102h/i178t、q25l/f33i/h90l/k144e/l180s、q25l/f33i/h90l/k153e/e172g/t192n、q25l/f33i/q86r/h90y/d175e/i196v/e198d、q25l/v45i/d68n/h90l/s183p/l205s/e212x、h90y/l180s、h90y/y129n、i89v/h90l/i193v、k80e/h90y/h222t/i223f/p224l、m60k/h90l、q25l/f33i/h90l、q25l/f33i/q86r/h90l/k93t、q25l/h90l、q25l/h90l/p185s、q25l/h90l/p185s/p224l、q25l/h90l/s179r、q25l/h90y/s181p/i193v、q25l/k82t/h90l/t152s/s207p、q25l/q86r/h90l/k93t、s28g/h90y、a13v/q25l/h90l、q25l/h90l/k93t/m97l、q25l/q86r/h90l或i89v/h90l。22.根据实施方案1
‑
21中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰a13v/q25l/h90l。23.根据实施方案1
‑
22中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰a13v/q25l/h90l/s181p/l197m/s206t。24.根据实施方案1
‑
21中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰q25l/h90l/k93t/m97l。25.根据实施方案1
‑
21和24中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体c d86多肽包含一个或多个氨基酸修饰q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v。26.根据实施方案1
‑
21和24中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰q25l/q86r/h90l。27.根据实施方案1
‑
21和26中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包
含一个或多个氨基酸修饰q25l/q86r/h90l/n104s。28.根据实施方案1
‑
21中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰i89v/h90l。29.根据实施方案1
‑
21和28中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰i89v/h90l/i193v。30.根据实施方案1
‑
21中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰m60k/h90l。31.根据实施方案1
‑
21中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰q25l/f33i/h90l。32.根据实施方案1
‑
21中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽包含一个或多个氨基酸修饰q25l/h90l/p185s。33.根据实施方案1
‑
32中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽包含展现与seq id no:29或其特异性结合片段至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。34.根据实施方案1
‑
33中任一项所述的变体cd86多肽，其中与所述未经修饰的cd86对cd28的胞外结构域的结合相比，所述变体cd86多肽以增加的亲和力特异性地结合至相同胞外结构域。35.根据实施方案34所述的变体cd86多肽，其中所述结合亲和力增加至少或至少约1.5倍、至少或至少约2.0倍、至少或至少约5.0倍、至少或至少约10倍、至少或至少约20倍、至少或至少约30倍、至少或至少约40倍、至少或至少约50倍、至少或至少约60倍、至少或至少约70倍、至少或至少约80倍、至少或至少约90倍、至少或至少约100倍、或至少或至少约125倍。36.根据实施方案1
‑
35中任一项所述的变体cd86多肽，其中与所述未经修饰的cd86对ctla
‑
4的胞外结构域的结合相比，所述变体cd86多肽以降低的亲和力特异性地结合至相同胞外结构域。37.根据实施方案36所述的变体cd86多肽，其中所述降低的结合亲和力是降低至少或至少约1.2倍、至少或至少约1.4倍、至少或至少约1.5倍、至少或至少约1.75倍、至少或至少约2.0倍、至少或至少约2.5倍、至少或至少约3.0倍、至少或至少约4.0倍、或至少或至少约5.0倍。38.根据实施方案1
‑
37中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽以与所述未经修饰的cd86对ctla
‑
4的胞外结构域的结合相同或相似的结合亲和力特异性地结合至相同胞外结构域，任选地其中所述相同或相似的结合亲和力是所述未经修饰的cd86的结合亲和力的从为或约90％至120％。39.根据实施方案1
‑
38中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽包含全细胞外结构域。40.根据实施方案1
‑
39中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽包含seq id no:85
‑
121中任一个中所示的氨基酸序列或其特异性结合片段、展现与seq id no:85
‑
121中任一个或其特异性结合片段至少95％序列同一性并且含有seq id no:85
‑
121中任一个中所示的相应seq id no的所述氨基酸修饰中的一个或多个的氨基酸序列。
41.根据实施方案1
‑
40中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽包含seq id no:141
‑
177中任一个中所示的氨基酸序列或其特异性结合片段、展现与seq id no:141
‑
177中任一个或其特异性结合片段至少95％序列同一性并且含有seq id no:141
‑
177中任一个中所示的相应seq id no的所述氨基酸修饰中的一个或多个的氨基酸序列。42.根据实施方案34
‑
41中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述cd28是人cd28。43.根据实施方案34
‑
42中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述ctla
‑
4是人ctla
‑
4。44.根据实施方案1
‑
43中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽是可溶性蛋白质。45.根据实施方案1
‑
44中任一项所述的变体cd86多肽，其中：所述变体cd86多肽缺乏cd86跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和/或所述变体cd86多肽不能在细胞表面上表达。46.根据实施方案1
‑
45中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽与多聚化结构域连接。47.根据实施方案46所述的变体cd86多肽，其中所述多聚化结构域是fc结构域或其具有降低的效应子功能的变体。48.根据实施方案1
‑
47中任一项所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽与fc结构域或其具有降低的效应子功能的变体连接。49.根据实施方案47或实施方案48所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域是人igg1或者是其具有降低的效应子功能的变体。50.根据实施方案47
‑
49中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域包含seq id no:229中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:229至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。51.根据实施方案47
‑
50中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域是或包含seq id no:229中所示的氨基酸序列。52.根据实施方案47
‑
50中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域是包含选自以下的一个或多个氨基酸修饰的变体igg1 fc结构域：e233p、l234a、l234v、l235a、l235e、g236del、g237a、s267k、n297g、v302c和k447del，其每一个均依据eu编号。53.根据实施方案47
‑
50和52中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域包含氨基酸修饰l234a/l235e/g237a。54.根据实施方案47
‑
50、52和53中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域包含依据eu编号的氨基酸修饰c220s。55.根据实施方案47
‑
50和52
‑
54中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域包含依据eu编号的氨基酸修饰k447del。56.根据实施方案47
‑
50和52
‑
55中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域包含seq id no:230中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:230至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且与人igg1相比包含seq id no:230中所示的相应氨基酸修饰中的一个或多个的氨基酸序列。
57.根据实施方案47
‑
50和52
‑
56中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述fc结构域是或包含seq id no:230中所示的氨基酸序列。58.根据实施方案47
‑
57中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽经由接头、任选地g4s接头与所述多聚化结构域或fc间接连接。59.根据实施方案1
‑
43中任一项所述的变体cd86多肽，其中所述变体cd86多肽是还包含跨膜结构域的跨膜免疫调节蛋白，任选地其中所述跨膜结构域与所述变体cd86多肽的细胞外结构域(ecd)或其特异性结合片段直接或间接连接。60.根据实施方案59所述的变体cd86多肽，其中所述跨膜结构域包含如seq id no:2的残基248
‑
268所示的氨基酸序列或其功能变体，所述其功能变体展现与seq id no:2的残基248
‑
268至少85％序列同一性。61.根据实施方案59或实施方案60所述的变体cd86多肽，所述变体cd86多肽还包含胞质结构域，任选地其中所述胞质结构域与所述跨膜结构域直接或间接连接。62.根据实施方案61所述的变体cd86多肽，其中所述胞质结构域是或包含天然cd86胞质结构域。63.根据实施方案61或实施方案62所述的变体cd86多肽，其中所述胞质结构域包含如seq id no:2的残基269
‑
329所示的氨基酸序列或其功能变体，所述其功能变体展现与seq id no:2的残基269
‑
329至少85％序列同一性。64.根据实施方案61所述的变体cd86多肽，其中所述胞质结构域包含itam信号传导基序和/或是或包含cd3ζ的细胞内信号传导结构域。65.根据实施方案59或实施方案60所述的变体cd86多肽，其中所述多肽不包含胞质信号传导结构域和/或当在细胞上表达时不能介导或调节细胞内信号。66.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含根据实施方案1
‑
65中任一项所述的第一变体cd86多肽和根据实施方案1
‑
58中任一项所述的第二变体cd86多肽。67.根据实施方案66所述的免疫调节蛋白，其中所述第一和第二变体cd86多肽经由接头间接连接。68.根据实施方案66或实施方案67所述的免疫调节蛋白，其中所述第一和第二变体cd86多肽各自与多聚化结构域连接，由此所述免疫调节蛋白是包含所述第一和第二变体cd86多肽的多聚体。69.根据实施方案68所述的免疫调节蛋白，其中所述多聚体是二聚体、任选地同二聚体。70.根据实施方案66
‑
69中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述第一变体cd86多肽和所述第二变体cd86多肽是相同的。71.一种免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白包含直接或经由接头间接与包含免疫球蛋白超家族(igsf)家族成员的igsf结构域的第二多肽连接的根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽。72.根据实施方案71所述的免疫调节蛋白，其中所述igsf结构域是亲和力修饰的igsf结构域，所述亲和力修饰的igsf结构域与所述igsf家族成员的未经修饰的或野生型igsf结构域相比包含一个或多个氨基酸修饰。73.根据实施方案72所述的免疫调节蛋白，其中所述igsf结构域是亲和力修饰的
igsf结构域，相比于所述igsf家族成员的未经修饰的或野生型igsf结构域与其一个或多个同源结合配偶体的结合，所述亲和力修饰的igsf结构域展现与相同的一个或多个同源结合配偶体中的一个或多个的改变的结合。74.根据实施方案73所述的免疫调节蛋白，其中相比于所述igsf家族成员的未经修饰的或野生型igsf结构域与其一个或多个同源结合配偶体的结合，所述igsf结构域展现与相同的一个或多个同源结合配偶体中的一个或多个的增加的结合。75.根据实施方案71
‑
74中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述第二多肽的igsf结构域是与在肿瘤上表达的配体结合或者与在肿瘤上表达的配体结合的肿瘤定位部分，或者是与和炎性环境相关的细胞或组织结合的炎性定位部分。76.根据实施方案75所述的免疫调节多肽，其中所述配体是b7h6。77.根据实施方案75或实施方案76所述的免疫调节多肽，其中所述igsf结构域来自nkp30。78.根据实施方案71
‑
77中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白还包含与所述变体cd86多肽或所述第二多肽中的至少一种连接的多聚化结构域。79.根据实施方案71
‑
78中任一项所述的免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白还包含含有igsf家族成员的igsf结构域或其亲和力修饰的igsf结构域的第三多肽，所述亲和力修饰的igsf结构域与所述igsf家族成员的未经修饰的或野生型igsf结构域相比包含一个或多个氨基酸修饰。80.根据实施方案79所述的免疫调节蛋白，其中：所述第三多肽与所述第一和/或第二多肽相同；或者所述第三多肽与所述第一和/或第二多肽不同。81.根据实施方案79或实施方案80所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白还包含与所述变体cd86多肽、所述第二多肽和/或所述第三多肽中的至少一种连接的多聚化结构域。82.根据实施方案68
‑
70、78和81中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域是免疫球蛋白的fc结构域，任选地其中所述免疫球蛋白蛋白质是人的和/或所述fc区是人的。83.根据实施方案82所述的免疫调节蛋白，其中所述fc结构域是igg1、igg2或igg4，或者是其具有降低的效应子功能的变体。84.根据实施方案83所述的免疫调节蛋白，其中所述fc结构域是igg1fc结构域、任选地人igg1，或者是其具有降低的效应子功能的变体。85.根据实施方案82
‑
84中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc结构域包含seq id no:229中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:229至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。86.根据实施方案82
‑
85中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc结构域是或包含seq id no:229中所示的氨基酸序列。87.根据实施方案84或实施方案85所述的免疫调节蛋白，其中所述fc结构域是包含一个或多个氨基酸取代的变体igg1，并且所述一个或多个氨基酸取代选自e233p、l234a、
l234v、l235a、l235e、g236del、g237a、s267k或n297g，其每一个均按照依据kabat的eu索引编号。88.根据实施方案87所述的免疫调节蛋白，其中所述fc结构域包含氨基酸取代n297g、氨基酸取代r292c/n297g/v302c或氨基酸取代l234a/l235e/g237a，其每一个均按照kabat的eu索引编号。89.根据实施方案87或实施方案88所述的免疫调节蛋白，其中所述变体fc区还包含氨基酸取代c220s，其中所述残基是按照kabat的eu索引来编号。90.根据实施方案87
‑
89中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc区包含k447del，其中所述残基是按照kabat的eu索引来编号。91.根据实施方案84、85和87
‑
90中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc结构域包含seq id no:230中所示的氨基酸序列或展现与seq id no:230至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且与人igg1相比包含seq id no:230中所示的相应氨基酸修饰中的一个或多个的氨基酸序列。92.根据实施方案84、85和87
‑
91中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc结构域是包含seq id no:230中所示的氨基酸序列。93.一种缀合物，所述缀合物包含与靶向部分连接的根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽，所述靶向部分特异性结合至细胞表面上的分子。94.根据实施方案93所述的缀合物，其中所述细胞是免疫细胞或者是肿瘤细胞。95.根据实施方案93或实施方案94所述的缀合物，其中所述部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。96.根据实施方案93
‑
95中任一项所述的缀合物，其中所述部分是抗体或抗原结合片段。97.根据实施方案93
‑
96中任一项所述的缀合物，所述缀合物是融合蛋白。98.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽、根据实施方案66
‑
92中任一项所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的根据实施方案93
‑
97中任一项所述的缀合物。99.根据实施方案98所述的核酸分子，所述核酸分子是合成核酸。100.根据实施方案98或实施方案99所述的核酸分子，所述核酸分子是cdna。101.一种载体，所述载体包含根据实施方案98
‑
100中任一项所述的核酸分子。102.根据实施方案101所述的载体，所述载体是表达载体。103.根据实施方案101或实施方案102所述的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。104.一种细胞，所述细胞包含根据实施方案101
‑
103中任一项所述的载体。105.根据实施方案104所述的细胞，所述细胞是哺乳动物细胞。106.根据实施方案104或实施方案105所述的细胞，所述细胞是人细胞。107.一种产生包含变体cd86多肽的蛋白质的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下将根据实施方案98
‑
100中任一项所述的核酸分子或根据实施方案101
‑
103中任一项所述的载体引入所述细胞中。108.根据实施方案107所述的方法，所述方法还包括从所述细胞分离或纯化所述
蛋白质。109.一种工程化表达变体cd86多肽的细胞的方法，所述方法包括在所述多肽在宿主细胞中表达的条件下将编码根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽、根据实施方案66
‑
92中任一项所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的根据实施方案93
‑
97中任一项所述的缀合物的核酸分子引入所述细胞中。110.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽、根据实施方案66
‑
92中任一项所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的根据实施方案93
‑
97中任一项所述的缀合物、根据实施方案98
‑
100中任一项所述的核酸分子或根据实施方案101
‑
103中任一项所述的载体。111.根据实施方案110所述的工程化细胞，其中：所述变体cd86多肽包含跨膜结构域或者是根据实施方案59
‑
65中任一项所述的跨膜免疫调节蛋白；和/或包含所述变体cd86多肽的所述蛋白质在所述细胞表面上表达。112.根据实施方案110所述的工程化细胞，其中：所述变体cd86多肽不包含跨膜结构域和/或不在所述细胞表面上表达；和/或所述变体cd86多肽能够从所述工程化细胞分泌。113.根据实施方案110或112所述的工程化细胞，其中：所述蛋白质不包含胞质信号传导结构域或跨膜结构域和/或不在所述细胞表面上表达；和/或所述蛋白质能够在表达时从所述工程化细胞分泌。114.根据实施方案110
‑
113中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞。115.根据实施方案114所述的工程化细胞，其中所述免疫细胞是淋巴细胞。116.根据实施方案115所述的工程化细胞，其中所述淋巴细胞是t细胞。117.根据实施方案116所述的工程化细胞，其中所述t细胞是cd4+和/或cd8+ t细胞。118.根据实施方案116或实施方案117所述的工程化细胞，其中所述t细胞是调节性t细胞(treg)。119.根据实施方案110
‑
118中任一项所述的工程化细胞，所述工程化细胞是原代细胞。120.根据实施方案110
‑
119中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。121.根据实施方案110
‑
120中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是人细胞。122.根据实施方案110
‑
121中任一项所述的工程化细胞，所述工程化细胞还包含嵌合抗原受体(car)。123.根据实施方案110
‑
121中任一项所述的工程化细胞，所述工程化细胞还包含工程化t细胞受体(tcr)。124.一种感染原，所述感染原包含根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽、根据实施方案66
‑
92中任一项所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的根据实施方案93
‑
97中任一项所述的缀合物、根据实施方案98
‑
100中任一项所述的核酸分子或根据实施方案101
‑
103中任一项所述的载体。125.根据实施方案124所述的感染原，其中所述感染原是细菌或病毒。126.根据实施方案125所述的感染原，其中所述感染原是病毒，并且所述病毒是溶瘤病毒。127.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽、根据实施方案66
‑
92中任一项所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的根据实施方案93
‑
97中任一项所述的缀合物、根据实施方案110
‑
123中任一项所述的工程化细胞或根据实施方案124
‑
126中任一项所述的感染原。128.根据实施方案127所述的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。129.根据实施方案127或实施方案128所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。130.一种制品，所述制品包含在小瓶或容器中的根据实施方案127
‑
129中任一项所述的药物组合物。131.根据实施方案130所述的制品，其中所述小瓶或容器是密封的。132.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案127
‑
129中任一项所述的药物组合物或根据实施方案131或实施方案132所述的制品和使用说明书。133.一种调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括施用根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽、根据实施方案66
‑
92中任一项所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的根据实施方案93
‑
97中任一项所述的缀合物、根据实施方案110
‑
123中任一项所述的工程化细胞、根据实施方案124
‑
126中任一项所述的感染原或根据实施方案127
‑
129中任一项所述的药物组合物。134.一种调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括施用根据实施方案110
‑
123中任一项所述的工程化细胞。135.根据实施方案134所述的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者是自体的。136.根据实施方案134所述的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者是同种异体的。137.根据实施方案133
‑
136中任一项所述的方法，其中调节所述免疫应答治疗所述受试者的疾病或病症。138.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用根据实施方案1
‑
65中任一项所述的变体cd86多肽、根据实施方案66
‑
92中任一项所述的免疫调节蛋白或作为融合蛋白的根据实施方案93
‑
97中任一项所述的缀合物、根据实施方案110
‑
123中任一项所述的工程化细胞、根据实施方案124
‑
126中任一项所述的感染原或根据实施方案127
‑
129中任一项所述的药物组合物。139.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用根据实施方案110
‑
123中任一项所述的工程化细胞。140.根据实施方案139所述的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者是自体
的。141.根据实施方案139所述的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者是同种异体的。142.根据实施方案133
‑
141中任一项所述的方法，其中所述免疫应答在所述受试者中增加。143.根据实施方案133、137、138和142中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用包含与肿瘤定位部分连接的变体cd86多肽的免疫调节蛋白或缀合物。144.根据实施方案143所述的方法，其中所述肿瘤定位部分是或包含识别肿瘤抗原的结合分子。145.根据实施方案144所述的方法，其中所述结合分子包含抗体或其抗原结合片段或包含野生型igsf结构域或其变体。146.根据实施方案133和137
‑
145中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用包含根据实施方案71
‑
90中任一项所述的免疫调节蛋白或根据实施方案93
‑
97中任一项所述的缀合物的药物组合物。147.根据实施方案133
‑
142中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用包含作为跨膜免疫调节蛋白的变体cd86多肽的工程化细胞，其中所述工程化细胞是根据实施方案110、111和114
‑
123所述的。148.根据实施方案147中任一项所述的方法，其中所述跨膜免疫调节蛋白是根据实施方案59
‑
65中任一项所述的。149.根据实施方案137
‑
148中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。150.根据实施方案137
‑
149中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。151.根据实施方案133
‑
141中任一项所述的方法，其中所述免疫应答降低。152.根据实施方案133、137、138和151中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用可溶性变体cd86多肽或免疫调节蛋白。153.根据实施方案152所述的方法，其中所述可溶性多肽或免疫调节蛋白是fc融合蛋白。154.根据实施方案133、137、138和151
‑
153中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用包含根据实施方案1
‑
58中任一项所述的变体cd86多肽或根据实施方案66
‑
74和78
‑
91中任一项所述的免疫调节蛋白的药物组合物。155.根据实施方案133、137、138和151中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用包含可分泌性变体cd86多肽的工程化细胞，任选地其中所述工程化细胞是根据实施方案110和112
‑
123中任一项所述的。156.根据实施方案133、137、138和151
‑
155中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是炎性或自身免疫性疾病或病症。157.根据实施方案133、137、138和151
‑
155中任一项所述的方法，其中所述疾病或
病症是抗中性粒细胞胞质抗体(anca)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。158.根据实施方案156或实施方案157所述的方法，其中所述疾病或病症选自炎性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎或银屑病。ix.实施例
[0467]
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。实施例1cd86 igsf结构域的突变体dna构建体的产生
[0468]
实施例1描述了用于在作为酵母展示文库的酵母表面上翻译和表达的人cd86 igsf结构域的突变体dna构建体的产生、将dna文库向酵母中的引入、以及对表达亲和力修饰的cd86 ecd变体的酵母细胞的选择。
[0469]
基于seq id no:29中所示的野生型人cd86序列产生构建体，其含有细胞外结构域(ecd；对应于如uniprot登录号p42081中所示的残基24
‑
247)，命名为如下“cd86 ecd(24
‑
247)”：cd86 ecd(24
‑
247)(seq id no:29):aplkiqayfnetadlpcqfansqnqslselvvfwqdqenlvlnevylgkekfdsvhskymgrtsfdsdswtlrlhnlqikdkglyqciihhkkptgmirihqmnselsvlanfsqpeivpisnitenvyinltcssihgypepkkmsvllrtknstieydgvmqksqdnvtelydvsislsvsfpdvtsnmtifciletdktrllsspfsieledpqpppdhip
[0470]
构建随机dna文库以鉴定seq id no:29中所示的cd86的ecd的变体。在修饰的酵母表达载体pbyds03(life technologies usa)的bamhi与kpni位点之间克隆编码野生型ecd结构域的dna，从而将cd86ecd置于酵母表面锚定结构域sag1(酵母α
‑
凝集素的c末端结构域)的n末端，其中框内ha融合标签在cd86 ecd序列的n末端并且c
‑
myc融合标签在cd86 ecd序列的c末端。在此载体中的表达由诱导型gal
‑
1启动子驱动。在验证了正确dna序列并在酵母表面上正确展示了野生型cd86 ecd蛋白之后，将野生型dna构建体用作易错pcr的模板，以在cd86 ecd序列中引入随机突变。易错pcr后，对诱变的cd86 ecd dna进行凝胶纯化，然后使用含有与pbyds03中bamhi上游序列和kpni下游序列同源的40bp重叠区的引物进行pcr扩增，以制备大规模酵母电穿孔。将凝胶纯化的突变型cd86 ecd dna插入片段重悬于无菌去离子水中。
[0471]
通过在2500v下使用btx ecm399电穿孔系统的电穿孔将突变型cd86文库dna与bamhi和kpni消化的pbyds03载体dna一起插入具有电穿孔能力的bj5464酵母细胞(atcc)中。通过在scd
‑
leu琼脂板上铺板新鲜回收的细胞的系列稀释液来确定文库大小。使电穿孔培养物的其余部分在scd
‑
leu选择培养基中在选择下生长至饱和。将来自此培养物的细胞再一次1/100继代培养至相同培养基中并生长至饱和，以使未转化细胞的级分降至最低并允许从可能含有两个或更多个文库变体的细胞分离质粒。为了维持文库多样性，使用所含细胞比所计算文库大小多至少10倍的接种物进行此继代培养步骤。将来自第二饱和培养物的细胞重悬于新鲜培养基中，并在
‑
80℃下冷冻并储存(冷冻文库原液)。
[0472]
从单独文库原液中解冻来自文库的细胞，并使其过夜生长。第二天，将细胞重悬于含半乳糖的诱导培养基(scdg
‑
leu培养基)中，并且在30℃下生长过夜以诱导酵母细胞表面
上文库蛋白质的表达。一升scdg
‑
le u诱导培养基含有溶解于水中的5.4克na2hpo4、8.56克nah2po4·
h20、20克半乳糖、2.0克右旋糖、6.7克酵母氮源和1.6克不含亮氨酸的酵母合成缺陷型培养基补充剂并将其经由0.22μm膜过滤器装置灭菌。
[0473]
使用加载有cd28
‑
fc的蛋白a磁珠(new england biolabs，美国)将10x诱导的文库细胞分选一次，以减少非结合物并富集所有能够结合其外源重组反结构蛋白的cd86 ecd变体。然后，通过用渐减浓度的cd28
‑
fc(20nm、1nm或250pm)的蛋白质染色和荧光激活细胞分选(facs)进行三轮阳性cd28选择，以富集显示改善的结合物的酵母细胞级分。通过流式细胞术进行的磁珠富集和选择基本上如以下文献所述进行：miller k.d.,等人,current protocols in cytometry 4.7.1
‑
4.7.30,2008年7月。从上述的第三轮阳性选择酵母细胞输出中选择命中。
[0474]
从来自第三轮cd28阳性选择细胞的酵母细胞输出进行第二次随机诱变循环。在使用如上所述的渐减浓度的cd28
‑
fc进行三轮fac阳性选择后选择进一步的命中。从来自第三轮cd28
‑
fc阳性选择的酵母细胞输出中，在用100nm ctla
‑
4fc进行蛋白质染色后进一步进行ctla
‑
4的阴性facs选择。
[0475]
将来自选定facs输出的插入物亚克隆至fc融合载体中，以用于单独克隆的序列分析。选择命中用于蛋白质产生以及基于经如实施例2中所述的选择过程富集的变体氨基酸的频率的结合和功能活性筛选。实施例2将选择输出重新格式化为fc融合物和各种免疫调节蛋白形式
[0476]
将在实施例1中选择的示例性命中重新格式化为含有与fc分子融合的亲和力修饰的(变体)cd86的免疫调节蛋白。
[0477]
将来自选定cd86 facs分类的输出细胞池在scd
‑
leu选择培养基中生长至终密度，并且使用酵母质粒dna分离试剂盒(zymoresearch，美国)分离质粒dna。为了产生fc融合物，用含有在任一端与afei和bamhi消化的fc融合载体(编码fc区并与fc区在框内)同源的40bp同源区的引物对亲和力成熟的cd86 ecd变体进行pcr扩增，以使用gibson组装主混合物(new england biolabs)进行体外重组。按照制造商的说明，将gibson组装反应物添加到大肠杆菌菌株neb5α(new england biolabs，美国)中以进行热休克转化。
[0478]
将转化反应物的稀释液铺板在含有100μg/ml羧苄西林(teknova，美国)的lb琼脂上以分离单一菌落用于选择。通常，然后使来自每次转化的多达96个菌落在96孔板中在37℃下在含有100μg/ml羧苄西林的lb肉汤(teknova目录号l8112)中过夜生长至饱和，并且将来自每个孔的小等分试样提交用于dna测序，以鉴定所有克隆中的一个或多个突变。
[0479]
在对目标克隆进行序列分析和鉴定后，使用midiplus试剂盒(qiagen)制备质粒dna。
[0480]
dna编码产生的亲和力修饰的(变体)cd86 fc融合蛋白如下：变体cd86结构域，之后是7个氨基酸(gsggggs)的接头，之后是seq id no:230中所示的人igg1无效应子fc序列，其含有依据免疫球蛋白蛋白质eu索引编号系统的突变l234a、l235e和g237a。由于构建体不包括任何可与半胱氨酸形成共价键的抗体轻链，因此人igg1 fc还在依据免疫球蛋白蛋白质的eu索引编号系统的位置220处含有半胱氨酸残基被丝氨酸残基的替代(c220s)(对应于关于seq id no:299中所示的野生型或未经修饰的fc的位置5(c5s))。fc区还缺少在野生型
人igg1恒定区基因中通常编码的位置447(对应于seq id no:229中所示的野生型或未经修饰的fc的位置232)处的c末端赖氨酸(命名为k447del)。seq id no:230epkssdkthtcppcpapeaegapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
[0481]
重组变体fc融合蛋白是使用expi293表达系统(invitrogen，美国)从悬浮适应的人胚肾(hek)293细胞产生。收获悬浮液并且将fc蛋白捕获在mab selectsure(ge healthcare目录号17543801)上。使用50mm乙酸盐(ph 3.6)从柱中洗脱蛋白质。合并mabselect sure洗脱液，并将ph调节至高于ph 5.0。然后在制备型sec柱上精制此材料，以产生高度纯化的单体材料。将此材料缓冲液交换成10mm乙酸盐、9％蔗糖(ph 5.0)(a5su)中。通过分析sec评估蛋白质纯度。将材料装入小瓶并在
‑
80下储存。实施例3对含有亲和力成熟的igsf结构域的分子与细胞表达的反结构的结合的评估
[0482]
此实施例描述对来自上文实施例的纯化蛋白质的fc融合物结合研究，以评估cd86结构域变体免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。
[0483]
针对以下项测定上述cd86结构域变体的结合：与cd28的结合(使用jurkat细胞)或与ctla
‑
4的结合(使用经转导以稳定表达ctla
‑
4的中国仓鼠卵巢(cho)细胞(cho/ctla
‑
4))。为了通过流式细胞术染色，将大约100,000个配体表达细胞与不同浓度的每种候选cd86变体fc融合蛋白一起孵育。对照包括野生型cd86的细胞外结构域(ecd)(“wt cd86
‑
fc”)和仅fc对照。为了评估结合，用抗人fc二抗(jackson immunoresearch，美国)对细胞进行染色，并且在lsrii(bd biosciences,inc.，美国)流式细胞仪上分析样品。
[0484]
用flowjo 10版(flowjo 10版，美国)计算平均荧光强度(mfi)，并且将其与野生型cd86 ecd
‑
fc对照的结合进行比较。针对11nm的示例性测试变体cd86 ecd
‑
fc融合分子对cd28或ctla
‑
4表达细胞的结合的结合研究结果示出于表e1中。所述表还指示出在上述筛选中选定的变体cd86的ecd中的氨基酸取代。在表中，ecd结构域中的示例性氨基酸取代和插入是依据对应于seq id no:29中所示的相应参考未经修饰的成熟cd86细胞外结构域(ecd)序列中的氨基酸位置的氨基酸位置编号来命名的。氨基酸位置指示于中间，相应的未经修饰的(例如野生型)氨基酸列示于所述编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列示于所述编号之后。第2列示出了变体ecd
‑
fc融合分子中包含的每个变体ecd结构域的seq id no标识符。
[0485]
如表e1中所示，所述选择导致鉴定出经亲和力修饰以展示对cd28增加的结合的多种cd86 igsf(例如ecd)结构域变体。在一些情况下，选定的变体展现与ctla4改变(例如降低)的结合。
实施例4cd86 igv
‑
fc免疫调节蛋白的产生和结合活性
[0486]
将在实施例1
‑
3中鉴定和产生的示例性cd86 ecd变体转化为含有igv结构域作为分子的唯一igsf结构域的免疫调节蛋白。所产生的变体igv构建体是基于seq id no:123中所示的野生型人cd86序列，其含有igv结构域(对应于如uniprot登录号p42081中所示的残基24
‑
134)，命名为“cd86igv(24
‑
134)”，如下：
cd86 igv(24
‑
134)(seq id no:123):aplkiqayfnetadlpcqfansqnqslselvvfwqdqenlvlnevylgkekfdsvhskymgrtsfdsdswtlrlhnlqikdkglyqciihhkkptgmirihqmnselsvla
[0487]
如实施例2中所述将变体cd86 igv分子格式化为fc融合蛋白，并且如实施例3中所述测试与cd28或ctla
‑
4的结合。针对示例性测试变体cd86 igv
‑
fc融合分子对cd28或ctla
‑
4表达细胞的25nm结合的结合研究结果示出于表e2中。在表中，igv结构域中的示例性氨基酸取代和插入是依据对应于seq id no:29中所示的相应参考未经修饰的成熟cd86细胞外结构域(ecd)序列中的氨基酸位置的氨基酸位置编号命名。氨基酸位置指示于中间，相应的未经修饰的(例如野生型)氨基酸列示于所述编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列示于所述编号之后。第2列示出了变体igv
‑
fc融合分子中包含的每个变体igv结构域的seq id no标识符。实施例5使用jurkat/il2报告物测定对含有亲和力成熟的cd86 igsf结构域的分子的生物活性的评估
[0488]
此实施例描述用于评估cd86结构域变体免疫调节蛋白对cd28共刺激的生物活性的jurkat/il2报告物测定。
[0489]
在测定前一天，准备测定板。为了准备测定板，将10nm抗cd3抗体(克隆okt3；biolegend，目录号317315)与cd86
‑
fc变体(浓度范围为200nm至12pm)或对照蛋白(wt cd86
‑
fc和fc对照)在pbs中的滴定液合并。将100μl/孔的okt3+cd86
‑
fc等分到白色平底96孔板(costar)中。将板在4℃下孵育过夜以允许抗体和cd86
‑
fc变体蛋白附着至板的表面。第二天，在测定前将测定板的孔用150μl pbs洗涤两次。
[0490]
测定当天，将表达il
‑2‑
萤光素酶报告物的jurkat效应细胞计数并重悬于测定缓冲液中至1x106个细胞/ml的浓度。然后向测定板中添加100μl/孔的jurkat细胞悬浮液。
[0491]
将测定板短暂旋转沉降(在1200rpm下10秒)并且在37℃下孵育5小时。在5小时孵
育后，取出板并平衡至室温持续15分钟。在测定板的每孔中添加100μl bio
‑
glo(promega)，然后将其置于定轨振荡器上持续10分钟。用1秒/孔的积分时间使用biotek cytation 3发光计测量发光。
[0492]
确定每种变体cd86 ecd
‑
fc和变体cd86 igv
‑
fc的平均相对发光值，并且计算与野生型cd86 ecd
‑
fc蛋白相比，每种变体的il
‑
2报告物信号的倍数增加。针对50nm浓度的结果提供于下面的表e3(cd86 ecd
‑
fc)或表e4(cd86 igv
‑
fc)中。如表所示，与wt cd86 ecd
‑
fc或仅fc阴性对照相比，将示例性变体cd86 ecd
‑
fc或变体cd86 igv
‑
fc分子与表达il
‑
2萤光素酶报告物的jurkat效应细胞共培养导致增加的cd28共刺激(即，激动作用)。激动作用)。激动作用)。实施例6表达跨膜免疫调节蛋白和t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的工程化细胞的产生和评估
[0493]
此实施例描述在含有变体cd86 igsf结构域的跨膜免疫调节蛋白(tip)与示例性
重组hpv16 e6特异性t细胞受体(tcr)或抗her2car在人t细胞中的表达。cd86
‑
tip具有亲和力修饰的ecd结构域，并且还包括分别对应于seq id no:2的残基248
‑
268和269
‑
329的野生型cd86跨膜结构域和胞质结构域。示例性tip包括含有对应于q25l/q86r/h90l/n104s(seq id no:94)、i89v/h90l/i193v(seq id no:107)或q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v(seq id no:93)的氨基酸突变的cd86 t ip，其中突变的编号是关于seq id no:29中所示的cd86细胞外结构域中的位置。
[0494]
将编码tip的核酸分子单独地克隆至慢病毒载体中，所述慢病毒载体用于转导t细胞。简而言之，在将hek293细胞与载体和慢病毒包装构建体共转染后，产生了含有核酸序列的慢病毒颗粒。用培养基收集慢病毒颗粒。使用easysep
tm
人t细胞分离试剂盒从正常献血者的外周血单核细胞(pbmc)中分离人泛t细胞。将泛t细胞与抗cd3和抗cd28磁珠以及il
‑
2一起培养6小时，然后与tip慢病毒和用于表达识别i类mhc呈递的hpv16 e6肽的示例性tcr(e6 tcr)或抗her2 car的慢病毒共转导。对于共转导，在聚凝胺的存在下，以1:1比率转导慢病毒。通过在30℃下使用以1000xg持续30分钟的离心感染进行转导。
[0495]
第二天去除慢病毒，并且用含有新鲜il
‑
2的培养基替代。每2天用新鲜il
‑
2更换培养基，并且将转导的t细胞扩增10天。培养10天后，如下所述评估工程化细胞的活性。作为对照，将活性与用wt cd86 tip(seq id no:2)、仅car或tcr转导的对照t细胞或与模拟物转导的t细胞进行比较。a.cd86 tip/tcr工程化t细胞
[0496]
培养10天后，使用测量培养基中细胞因子的量的luminex分析用cd86 tip和e6 tcr、或仅对照tcr、仅tip共转导的t细胞或模拟物转导的t细胞在与靶抗原表达细胞共培养后的细胞因子产生。从40,000个细胞/孔开始，将hla
‑
a2+hpv+靶细胞(scc152)接种至96孔板中，以1:2稀释度滴定，进行4点滴定。将靶细胞培养6小时以形成单细胞层。将转导的或对照t细胞以40,000个细胞/孔添加至孔并且再培养24小时。收集培养上清液并且通过进行分析。结果显示并记录为细胞因子产生的原始值(以pg/ml计)。图1a示出了干扰素
‑
γ、il
‑
2和tnfα从共表达变体cd86 tips的工程化细胞的释放，将其以pg/ml对靶细胞数进行绘图。误差条表示一式三份孔的标准偏差。从共表达cd86 tip的e6 tcr表达细胞观察到增加的细胞因子产生。与wt cd86 tip相比，在用示例性变体cd86 tip共转导的细胞中观察到更大的细胞因子产生。表e5示出了在对表达单独的或与如所指示的野生型或变体cd86 tip组合的tcr的工程化细胞进行24小时孵育后，在上清液中检测到的ifng的示例性原始值。
[0497]
转导的细胞也是细胞痕量紫罗兰(ctv)标记的，并将所述细胞与滴定量的scc152靶细胞一起孵育，并且3天后评价tcr+cd4+(图1b)或tcr+cd8+(图1c)t细胞的增殖。绘制了分裂％+/
‑
一式三份孔的标准偏差。如图1b至图1c中所示，与表达野生型cd86 tip的对照或细胞相比，共表达变体cd86 tips的工程化细胞响应于靶scc
‑
152细胞系具有增加的增殖。
[0498]
为了评估工程化t细胞的细胞毒性活性，用编码组成型活性表达载体的病毒稳定转导hla
‑
a2+hpv+肿瘤靶细胞系scc
‑
152，所述表达载体驱动萤火虫萤光素酶的表达。以不同的数量接种转导的t细胞或对照t细胞，以给出一系列效应子与靶标比率(e:t比率)。将t细胞与靶细胞在37℃下一起孵育4天，并且测量萤光素酶活性。通过以下公式计算杀伤百分比：杀伤百分比＝(1
‑
(t细胞+靶标中的萤光素酶信号/仅来自靶细胞的萤光素酶信号))*100％，并且以杀伤百分比对e:t比率进行绘图。如图1d中所示，在共表达cd86 tip的工程化细胞的情况下观察到杀伤，在仅表达tcr的t细胞的中检测到很小的杀伤。与wt cd86 tip的共表达相比，变体cd86 tip的共表达导致e6 tcr表达t细胞的杀伤活性显著增强。数据示出为+/
‑
一式三份孔的标准差。b.cd86 tip/car工程化t细胞
[0499]
为了评估细胞毒性活性，将工程化细胞与表达高(nci
‑
n87)或低(scc
‑
152)水平her2抗原的靶细胞一起孵育(图2a)。用编码组成型活性表达载体的病毒稳定转导靶细胞，所述表达载体驱动萤火虫萤光素酶的表达，并且与上述类似地评估细胞毒性活性。以不同的数量接种抗her2car转导的t细胞，以给出一系列效应子与靶标比率(e:t比率)。将t细胞与靶细胞nci
‑
n87或scc
‑
152在37℃下一起孵育，并且在24小时后通过测量萤光素酶活性评估杀伤活性。通过以下公式计算杀伤百分比：杀伤百分比＝(1
‑
(t细胞+靶标中的萤光素酶信号/仅来自靶细胞的萤光素酶信号))*100％，并且以杀伤百分比对e:t比率进行绘图。
[0500]
如图2b和图2c中所示，变体cd86 tip的表达增强对表达高抗原(图2b)或低抗原(图2c)的靶细胞的抗her2 car
‑
t细胞杀伤。数据示出为+/
‑
一式三份孔的标准差。实施例7含不同亲和力修饰的结构域的cd86堆叠分子的产生和评估
[0501]
使用实施例1
‑
4中描述的经亲和力修饰以增加与cd28的结合的选定变体cd86分子
来产生具有变体nkp30 igv结构域作为肿瘤定位结构域(命名为“l”)的“堆叠”fc融合分子。通过针对与b7
‑
h6的增加的结合亲和力筛选含有编码nkp30变体的诱变dna的酵母展示文库来鉴定示例性变体nkp30。通过用重组b7h6.fc(rb7h6.fc)染色进行两轮facs筛选后，在用16.6nm rb7h6.fc染色时，输出得到533的mfi值，而在用相同浓度的rb7h6.fc染色时，测得亲代nkp30菌株mfi为90(改善6倍)。所鉴定的nkp30变体包括如下变体，所述变体(seq id no:231)含有关于nkp30细胞外结构域中对应于seq id no:54中所示位置的位置的突变l30v/a60v/s64p/s86g。评估所产生的cd86
‑
nkp30堆叠构建体的结合和活性。a.cd86
‑
nkp30堆叠构建体的产生
[0502]
通过将pcr产物或基因块组合来获得堆叠构建体(integrated dna technologies，科拉尔维尔，爱荷华州)，所述pcr产物或基因块编码某种形式的堆叠，所述形式能够通过使用gibson组装试剂盒(new england biolabs，美国)的标准gibson组装实现其与fc的融合。产生了通过与人igg1无效应子fc序列(例如seq id no:230中所示)融合而含有两个相同多肽的同二聚体形式的堆叠。产生所有堆叠的编码核酸分子以编码如下设计的蛋白质：第一变体cd86 ecd或igv，之后是由三个ggggs(g4s)基序构成的15个氨基酸接头(seq id no:224)，之后是变体nkp30 igv结构域，之后是gsggggs接头(seq id no:222)，之后是如上所述的seq id no:230中所示的人igg1无效应子fc序列。
[0503]
将编码fc融合蛋白的表达构建体转染至expi293 hek293细胞(例如invitrogen)中。收获上清液，并且使用akta蛋白质纯化系统从蛋白质a柱中捕获并洗脱蛋白质。b.结合
[0504]
使用表达cd28的jurkat/il
‑
2细胞和经转导以表达ctla
‑
4的cho细胞来测试堆叠构建体的变体cd86结构域与其同源结合配偶体cd28和ctla
‑
4的结合。将细胞与表e5中所示的不同浓度(100,000pm至98pm，6点，1:4稀释系列)的示例性构建体一起孵育。为了比较，还测试如实施例2和表e1中所述的多种示例性变体cd86
‑
fc构建体、和单独无效应子fc(seq id no:230)的结合。使用抗fc抗体
‑
pe通过流式细胞术评估结合并且确定平均荧光强度(mfi)。
[0505]
如图10中所示，与示例性变体cd86
‑
fc构建体和单独fc相比，示例性nkp30
‑
cd86堆
叠构建体保持与cd28和ctla
‑
4的结合。尽管堆叠构建体通常比相应的变体cd86 vigd
‑
fc构建体结合得较差，但对于所有堆叠构建体观察到与cd28和ctla
‑
4的结合，且对于seq id no:135中所示的堆叠构建体显示出特别高的结合。c.t细胞共刺激
[0506]
在共固定化测定中评估示例性变体nkp30
‑
cd86堆叠构建体共刺激原代t细胞的能力。将平底96孔板用在pbs中稀释的5nm抗人cd3(okt3)和40nm b7h6包被，并且在4℃下孵育过夜。第二天，用无菌pbs冲洗板3次，并且将1x105个cfse标记的人泛t细胞添加至每个孔。将t细胞与100nm、8.333nm或0.694nm的示例性nkp30
‑
cd86堆叠构建体一起孵育72小时(参见表e5)。为了比较，还测试了由seq id no:93所示的示例性变体cd86(如实施例4中所述作为fc融合物产生的)、由seq id no:231所示的示例性变体nkp30(如实施例4中所述作为fc融合物产生的)和单独的无效应子fc(seq id no:230)。一式三份地进行实验。
[0507]
用抗fc抗体
‑
pe染色后，通过流式细胞术确定堆叠构建体与原代t细胞的结合，并且确定平均荧光强度(mfi)。通过对cfse染料稀释液的流式细胞术测量来评估t细胞增殖，并且确定增殖百分比。图11a示出了示例性堆叠构建体与原代人cd4+ t细胞的结合。如图11b中所示，与示例性变体cd86
‑
fc、示例性变体nkp30
‑
fc和单独fc相比，与每种浓度下的示例性堆叠构建体的孵育诱导t细胞增殖。对于cd8+ t细胞观察到类似的结合和增殖结果。
[0508]
为了评估t细胞的细胞因子产生，在孵育24小时后收获上清液，并且通过elisa测定il
‑
2浓度。如图12中所示，与示例性变体cd86
‑
fc和单独fc相比，与示例性堆叠构建体的孵育增加il
‑
2产生。
[0509]
上述结果共同证明，堆叠构建体能够结合至原代t细胞并提供共刺激。为了评估堆叠构建体活性是否取决于b7h6(nkp30的同源结合配偶体)的存在，如上所述进行了单独的共固定化实验，但是将板仅用抗cd3(okt3)包被。图13显示，与在b7h6的存在下的孵育相比，在不存在b7h6的情况下与示例性堆叠构建体(100nm)一起孵育的原代t细胞导致降低的cd4+ t细胞增殖活性。对于cd8+ t细胞观察到类似的结果。这些数据表明cd86
‑
nkp30堆叠构建体的共刺激活性是b7h6依赖性的。实施例8含有变体pd
‑
1分子和变体cd86分子的堆叠分子的产生
[0510]
使用实施例1
‑
5中所述的经亲和力修饰的示例性变体cd86分子来产生具有经亲和力修饰为对pd
‑
l1具有增加的结合的示例性变体pd
‑
1igsf结构域(例如seq id no:315中所示)的“堆叠”fc融合分子。所述堆叠构建体含有野生型cd86细胞外结构域(ecd；seq id no:29)、野生型cd86 igv结构域(seq id no:123)或如表e18中所述的经亲和力修饰以增加与cd28的结合的cd86 ecd或igv结构域。经由cd86和pd
‑
1序列的重叠pcr获得堆叠构建体，所述重叠pcr编码某种形式的堆叠，所述形式能够通过使用gibson组装试剂盒(new england biolabs，美国)的标准gibson组装实现其与fc的融合。产生所有堆叠的编码核酸分子以编码如下设计的蛋白质：第一野生型或变体cd86 ecd或igv结构域，之后是由三个ggggs(g4s)基序构成的15个氨基酸接头(seq id no:224)，之后是变体pd
‑
1结构域，之后是gsggggs接头(seq id no:222)，之后是如上所述的seq id no:230中所示的人igg1无效应子fc序列。
[0511]
表e6示出了示例性产生的cd86
‑
pd
‑
1堆叠。
实施例9对含有变体pd
‑
1分子和变体cd86分子的堆叠分子的结合和活性的评估
[0512]
基本上如实施例8中所述产生示例性堆叠构建体，其含有变体pd
‑
1igsf结构域(例如seq id no:315)与野生型cd86细胞外结构域(ecd；例如seq id no:29)、野生型cd86 igv结构域(例如seq id no:123)或变体cd86 igsf结构域(ecd，例如seq id no:89或93或94；或igv，例如seq id no:145、149或150)，并且评估其结合和活性。a.结合
[0513]
为了评估与同源结合配偶体的结合，转导细胞以表达huctla、hucd28和hupd
‑
l1全长哺乳动物蛋白质。将细胞与表e6中所示的不同浓度(0.1nm至100nm)的示例性构建体一起孵育。为了比较，还测试了野生型cd80
‑
fc的结合。对于与pd
‑
l1的结合，还将结合与抗pd
‑
1抗体(英飞凡(imfinzi)和阿特珠单抗)进行比较。还测试了仅fc的分子作为对照。通过流式细胞术评估结合并且确定平均荧光强度(mfi)。
[0514]
如图4a至图6b中所示，与仅含有单独野生型或变体igsf结构域的分子相比，示例性pd1
‑
cd86堆叠构建体保持与ctla
‑
4、cd28和pd
‑
l1的结合。与仅含有单独野生型或变体igsf结构域的分子相比，在igv(seq id no:149，例如seq id no:322中所示的堆叠)或ecd(seq id no:93，例如seq id no:318中所示的堆叠)中含有突变的q25l/h90l/k93t/m97l/t133a/s181p/d215v的堆叠构建体保持与ctla
‑
4(图4a)、cd28(图5a)和pd
‑
l1(图6a)的结合。在igv(seq id no:150，例如seq id no:323中所示的堆叠)或ecd(seq id no:94，例如seq id no:319中所示的堆叠)中含有突变的q25l/q86r/h90l/n104s的堆叠构建体保持与
ctla
‑
4(图4b)、cd28(图5b)和pd
‑
l1(图6b)的结合。b.pd
‑
l1依赖性cd28共刺激
[0515]
使用表达pd
‑
1的jurkat/il
‑
2报告细胞评估示例性变体堆叠构建体递送pd
‑
l1依赖性cd28共刺激的能力。以20,000个细胞/孔铺板k562/okt3/pd
‑
l1或k562/okt3人工抗原呈递细胞(aapc)，并且将其与从0.01nm至100nm的不同量的示例性变体堆叠构建体一起预孵育。还测试仅fc分子作为对照。以总共100,000个细胞/孔添加表达il
‑2‑
萤光素酶报告基因的jurkat效应细胞，使得每个孔具有1:5k562:jurkat细胞的最终比率。将jurkat细胞、k562细胞和示例性堆叠构建体在37摄氏度下孵育6小时。将100μl的细胞裂解和萤光素酶底物溶液(bioglo萤光素酶试剂，promega)添加至每个孔，并且测量发光。
[0516]
如图7a中所示，在不存在pd
‑
l1的情况下添加示例性变体堆叠构建体展现很少或不展现共刺激信号，这与含有pd
‑
1/cd86的堆叠蛋白需要pd
‑
l1结合以经由cd28诱导共刺激信号的观察结果一致。如图7b中所示，在存在pd
‑
l1的情况下添加ecd和igv示例性变体堆叠构建体二者激动cd28依赖性发光活性，如通过il
‑
2发光相对发光单位(rlu)测量的。共刺激水平与变体分子的cd28和/或pd
‑
l1结合亲和力相关联。此结果与含有变体pd
‑
1的堆叠免疫调节蛋白展现pd
‑
l1依赖性cd28介导的共刺激的活性一致。c.t细胞反应
[0517]
使用巨细胞病毒(cmv)抗原特异性功能测定来评估示例性变体堆叠分子对t细胞应答的影响。
[0518]
将从cmv血清阳性供体获得的外周血单核细胞(pbmc)解冻，并且在测试的示例性变体堆叠构建体(以1:3稀释度从100,000pm稀释至46pm)的存在下，将cmv裂解物以1μg/ml添加至250,000个pbmc/孔。还测试仅fc分子作为对照。在孵育后48小时收集上清液以通过elisa测定il
‑
2，并且在孵育后96小时收集上清液以通过elisa测定ifng。
[0519]
示例性pd1
‑
cd86堆叠构建体显示il
‑
2产生(图8)和ifng产生(图9)的浓度依赖性增加。与pd
‑
l1对照抗体(阿特珠单抗)或单独变体pd1igv
‑
fc分子相比，pd1
‑
cd86堆叠构建体在更大程度上刺激细胞因子的产生。与野生型cd86 ecd
‑
fc或单独变体cd86 ecd
‑
fc分子相比，pd1
‑
cd86堆叠构建体也在更大程度上刺激细胞因子的产生。
[0520]
这些结果与pd1
‑
cd86堆叠分子以pd
‑
l1依赖性方式显示刺激cd28的共刺激作用一致。对于如以上实施例18.b中所示的对jurkat细胞上的cd28具有不同程度的结合的构建体(包括观察到与cd28具有低可检测结合的含有野生型cd86 ecd的堆叠构建体)，观察到这些结果。实施例10含有变体pd
‑
1分子和变体cd86分子的格式化堆叠分子的产生和对其结合和活性的评估
[0521]
使用分别如实施例1
‑
5和实施例8中所述的经亲和力修饰的示例性变体cd86分子和示例性变体pd
‑
1分子来产生“堆叠”fc融合分子。评估所产生的cd86
‑
pd1堆叠构建体的结合和活性。a.cd86
‑
pd
‑
1堆叠构建体的产生
[0522]
通过将pcr产物或基因块组合来产生堆叠(integrated dna technologies，科拉尔维尔，爱荷华州)，所述pcr产物或基因块编码某种形式的堆叠，所述形式能够通过使用
gibson组装试剂盒(new england biolabs，美国)的标准gibson组装实现其与fc的融合。堆叠构建体具有通过与人igg1无效应子fc序列(例如，seq id no:230中所示)融合而含有两个相同多肽的同二聚体形式。可替代地，堆叠构建体具有通过“杵臼结构”fc工程化以促进异二聚体的两条不同的单独链缔合的异二聚体形式，其中一个多肽与“杵”fc亚基(seq id no:346)融合，并且第二多肽与“臼”fc亚基(seq id no:347)融合。
[0523]
将编码fc融合蛋白的表达构建体转染至expi293 hek293细胞(例如invitrogen)中。收获上清液，并且使用akta蛋白质纯化系统从蛋白质a柱中捕获并洗脱蛋白质。
[0524]
表e7示出了示例性产生的pd
‑1‑
cd86堆叠和形式。图14a至图14d描绘了示例性格式化堆叠构建体的结构。
b.结合
[0525]
为了评估结合活性，将示例性格式化堆叠构建体与表达cd28(cd86的同源结合配偶体)的jurkat细胞以及经转导以表达pdl1(pd
‑
1的同源结合配偶体)的k562细胞一起孵育。将细胞(50,000个细胞/孔)在冰上与在不同浓度(起始浓度为100nm，向下滴定的8次系列1:4稀释)下的表e7中所示的格式化堆叠构建体一起孵育30min。然后用facs缓冲液洗涤细胞，并且用50μl抗fc抗体
‑
pe重悬30min。通过流式细胞术评估结合并且确定平均荧光强度(mfi)。
[0526]
如图15a和图15b中所示，与示例性变体未格式化对照堆叠相比，示例性pd
‑1‑
cd86堆叠构建体形式保持与pdl1和cd28的结合。这些数据表明不同的堆叠分子形式保持与同源结合配偶体的结合活性。c.t细胞共刺激
[0527]
为了测试示例性堆叠构建体是否可以驱动t细胞的靶标特异性共刺激，使用了包括用于测量共刺激的t细胞报告细胞系的转染细胞系统。使用包括il
‑
2启动子萤光素酶报告物并且表达或不表达pd1的jurkat细胞来评价共刺激功能。为了刺激jurkat细胞，对k562细胞进行工程化以用作人工抗原呈递细胞。具体地，在使用或不使用引导pdl1表达的单独慢病毒转导的情况下，用编码抗cd3抗体okt3的单链fv形式的慢病毒转导k562细胞。将具有或不具有表面pdl1表达的显示细胞表面抗cd3单链fv(okt3)的k562细胞以2x104个细胞/孔铺板在培养基中。将靶细胞与示例性pd1
‑
cd86堆叠构建体(从2nm开始向下滴定，8次系列1:3稀释)在37℃下一起孵育10min。以1x105个细胞/孔添加表达il
‑
2萤光素酶报告基因(promega)的jurkat效应细胞，以使最终体积/孔至100μl。在存在或不存在示例性堆叠构建体的情况下将靶细胞和jurkat细胞在37℃下孵育5小时。将板从培养箱中取出并使其适应室温15分钟。将100μl的细胞裂解和萤光素酶底物溶液(bioglo萤光素酶试剂，promega)添加至每个孔，并且将板在定轨振荡器上孵育10分钟。使用cytation 3成像阅读器(biotek instruments)以1秒/孔的积分时间测量发光。确定每个测试样品的相对发光值(rlu)并报告。
[0528]
如图16a和图16b中所示，与示例性堆叠构建体的孵育在pdl1+k562/okt3细胞的存在下提供对t细胞的共刺激，而不管t细胞是pd1+还是pd1
‑
。这些结果表明，即使在强检查点阻断的存在下，堆叠构建体也能够递送t细胞共刺激信号。d.细胞因子产生
[0529]
为了评估示例性cd86
‑
pd
‑
1堆叠构建体(参见表e7)促进t细胞中的细胞因子产生的能力，在不同浓度的示例性格式化堆叠的存在下将已知表达pd
‑
l1的hla
‑
a2+hpv+靶细胞系(scc152 pdl1+)与经转导以表达示例性重组hpv16 e6特异性t细胞受体(tcr)的t细胞共培养。将scc152pdl1+细胞以40,000个细胞/孔接种至具有培养基的96孔板中，并且在37℃下孵育过夜。第二天，将不同浓度的示例性格式化堆叠构建体(0.666nm，以1:3稀释度滴定，进行5点滴定)和表达重组hpv16 e6特异性t细胞受体(tcr)的40,000个t细胞添加至每个孔。为了比较，将细胞与已知结合cd28和pd
‑
l1的变体cd80 igv
‑
fc融合蛋白一起孵育，与模拟物转导的t细胞(模拟)一起孵育，或在格式化堆叠构建体的不存在(无蛋白质)下孵育。将板在37℃下孵育，并且在孵育24小时后收集上清液以测试分泌的细胞因子，例如ifng、il
‑
2、tnfa。
[0530]
如图17a中所示，相对于对照，格式化cd86
‑
pd
‑
1堆叠构建体在24小时诱导更高水平的ifng、il
‑
2和tnfa细胞因子产生。这些数据表明格式化cd86
‑
pd
‑
1堆叠构建体促进靶标特异性t细胞中的共刺激和细胞因子产生。e.细胞毒性活性
[0531]
评估示例性cd86
‑
pd
‑
1堆叠构建体(参见表e7)促进t细胞的细胞毒性活性的能力。将hla
‑
a2+hpv+靶细胞系scc152 pdl1+以20,000个细胞/孔接种至具有培养基的96孔板中，并且在37℃下孵育过夜。第二天，丢弃培养基，并且将细胞在37℃下与100μl萤光素一起孵育10min。将不同浓度的示例性格式化堆叠构建体(0.666nm，以1:3稀释度滴定，进行5点滴定)和用示例性重组hpv16 e6特异性t细胞受体(tcr)转导的20,000个t细胞添加至每个孔，并且在37℃下孵育10min，然后离心(1300rpm)30秒。为了比较，将细胞与已知结合cd28和pd
‑
l1的变体cd80 igv
‑
fc融合蛋白、模拟物转导的t细胞(模拟物)一起孵育，或在不存在格
式化堆叠构建体的情况(无蛋白质)下孵育。将板在37℃下孵育，并且在孵育24、48和72小时后确定相对发光值(rlu)。
[0532]
图17b示出了在每种浓度下在24、48和72小时的如通过rlu测量的细胞杀伤。与对照相比，cd86
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pd
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1堆叠构建体在24小时增强了t细胞的细胞毒性活性。这些数据支持cd86
‑
pd
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1堆叠构建体能够共刺激t细胞以诱导t细胞的细胞毒性活性。实施例11对缀合物her2和egfr靶向抗体的结合和共刺激功能的评估
[0533]
将示例性变体cd86 igv分子与her2和egfr靶向抗体缀合以形成缀合物(融合蛋白)。将由seq id no:150所示的变体cd86 igv结构域与her2靶向抗体帕妥珠单抗或egfr靶向抗体帕尼单抗的轻链或重链的氨基或羧基末端融合，且间插g4s接头(参见表e8)。缀合物(融合蛋白)的示例性构型如图18中所示。将编码图19a和图19b中所图示的每个构建体的dna转染到hek
‑
293细胞中，并且通过蛋白a和大小排阻色谱纯化分泌的蛋白。接下来针对适当结合特性的保持评估所得的缀合蛋白。a.结合
[0534]
为了评估示例性帕妥珠单抗
‑
cd86缀合物(融合蛋白)结合her2的能力，将scc
‑
152细胞与不同浓度的示例性缀合物(参见表e8)、帕妥珠单抗或对照抗体(雷莫芦单抗)一起孵育。将scc152细胞(50,000个细胞/孔)在冰上与在不同浓度(起始浓度为33nm，向下滴定的9
次系列1:3稀释)下的表e8中所示的cd86抗体缀合物(融合蛋白)一起孵育30min。然后用facs缓冲液洗涤细胞，并且用50μl抗fc抗体
‑
pe重悬30min。通过流式细胞术评估结合并且确定中值荧光强度(mfi)。如图19a中所示，缀合物保持与her2的结合。
[0535]
为了评估示例性帕尼单抗
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cd86缀合物结合egfr的能力，将经转导以表达egfr的cho细胞与不同浓度的示例性缀合物(参见表e8)、帕尼单抗或对照抗体(雷莫芦单抗)一起孵育。将cho
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egfr细胞(50,000个细胞/孔)在冰上与在不同浓度(起始浓度为33nm，向下滴定的9次系列1:3稀释)下的表e8中所示的cd86抗体融合缀合物构建体一起孵育30min。然后用facs缓冲液洗涤细胞，并且用50μl抗fc抗体
‑
pe重悬30min。通过流式细胞术评估结合并且确定中值荧光强度(mfi)。如图19b中所示，缀合物保持与egfr的结合。b.t细胞共刺激
[0536]
为了测试示例性缀合物(融合蛋白)是否可以驱动t细胞的靶标特异性共刺激，使用包括具有il
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2启动子萤光素酶报告基因的jurkat细胞的转染细胞系统来评价共刺激功能。为了刺激jurkat细胞，将组成型表达hpv病毒蛋白的靶scc
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152细胞以2x104个细胞/孔接种在培养基中。将靶细胞与cd86抗体融合缀合物(从2nm开始向下滴定，8次系列1:4稀释)在37℃下一起孵育10min。以1x105个细胞/孔添加表达il
‑
2萤光素酶报告基因(promega)的jurkat效应细胞，以使最终体积/孔至100μl。在存在或不存在示例性缀合物的情况下将靶细胞和jurkat细胞在37℃下孵育5小时。将板从培养箱中取出并使其适应室温15分钟。将100μl的细胞裂解和萤光素酶底物溶液(bioglo萤光素酶试剂，promega)添加至每个孔，并且将板在定轨振荡器上孵育10分钟。使用cytation 3成像阅读器(biotek instruments)以1秒/孔的积分时间测量发光。确定每个测试样品的相对发光值(rlu)并报告。
[0537]
在存在或不存在不同浓度的缀合物或对照抗体的情况下，将scc
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152细胞与用对hpv肽e6具有特异性的tcr转导的jurkat il2报告细胞系共培养。如图20a和图20b中所示，rlu测量揭示，与对照抗体相比，t细胞在缀合物的存在下经历了增加的共刺激。c.细胞毒性活性
[0538]
评估示例性缀合物促进t细胞的细胞毒性活性的能力。将靶细胞系scc
‑
152以20,000个细胞/孔接种至具有培养基的96孔板中，并且在37℃下孵育过夜。第二天，丢弃培养基，并且将细胞在37℃下与100μl萤光素一起孵育10min。将用e6 tcr转导的20,000个原代人t细胞在2nm示例性缀合物的存在下以不同效应子与靶标比率(e:t)添加至每个孔，并且在37℃下孵育10min，然后离心(1300rpm)30秒。为了比较，将细胞与仅帕妥珠单抗、仅帕尼单抗、对照抗体雷莫芦单抗(模拟物)一起孵育，或在不存在蛋白质的情况下孵育。将板在37℃下孵育，并且在孵育24小时后确定靶细胞杀伤的百分比。
[0539]
图21a和图21b展示了在示例性缀合物的存在下，在每种e:t下24小时后的细胞杀伤百分比的最小增加。c.细胞因子产生
[0540]
为了评估示例性缀合物促进t细胞中的细胞因子产生的能力，在不同浓度的示例性缀合物(参见表e8)的存在下将scc
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152细胞与用e6tcr(三个供体)转导的原代人t细胞共培养。将scc
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152细胞以40,000个细胞/孔接种至具有培养基的96孔板中，并且在37℃下孵育过夜。第二天，将不同浓度的示例性缀合物和40,000个t细胞添加至每个孔。为了比较，将细胞与仅帕妥珠单抗、仅帕尼单抗、对照抗体雷莫芦单抗(模拟物)一起孵育，或在不存在蛋
白质的情况下孵育。将板在37℃下孵育，并且在孵育24小时后收集上清液以测试分泌的细胞因子，例如ifng、il
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2、tnfa。
[0541]
图22a和图22b示出了每个供体的ifng、il
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2和tnfa的浓度。如图所示，与仅抗体对照相比，cd86
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抗体缀合物导致细胞展现增强的细胞因子产生。这些数据证明，缀合物能够促进t细胞中的共刺激和细胞因子产生。
[0542]
本发明在范围上并不旨在限于具体公开的实施方案，提供具体公开的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。