HOLDEMANELLASP.细菌及其用途的制作方法

holdemanella sp.细菌及其用途
技术领域
1.本发明涉及holdemanella属、holdemanella biformis属和h.biformis cect 9752菌株、其细胞成分、代谢物和分泌分子、以及包含上述产物的组合物、以及所述菌株用于预防和/或治疗能量稳态和葡萄糖代谢改变的用途。本发明属于药物组合物或制剂的治疗活性领域，也属于食品领域。


背景技术：

2.由于其高患病率和与能量稳态改变相关的合并症，肥胖目前是全球健康面临的重大挑战。这些合并症包括，例如，血脂异常、代谢综合征、糖尿病、心血管疾病、肝脂肪变性或脂肪肝、高血压、视网膜病变和饮食行为的改变。这些病理，尤其是那些涉及葡萄糖代谢改变的病理，如糖尿病，也可能发生在非肥胖受试者中，尽管体重增加是一个重要的风险因素。
3.肥胖的特点是体重和体重增加，主要是由于摄入和能量消耗之间的不平衡引起的。
4.神经内分泌系统通过肠道激素调节能量平衡，这是控制不同器官和组织摄入和代谢的关键。在肠道激素中，主要存在于肠道远端区域的l细胞分泌的胰高血糖素样肽1(glp
‑
1)和肽yy(pyy)脱颖而出。这些激素不仅对远端器官(肝脏、脂肪组织)有直接作用以控制能量代谢，而且它们还通过经肠
‑
脑轴的神经和内分泌途径在代谢和饮食习惯的中央控制中充当中介。glp
‑
1是一种肽，可在下丘脑水平抑制食欲并诱导饱腹感，通过诱导胰腺中的胰岛素分泌来调节葡萄糖代谢，减少胰高血糖素合成并减少胃排空。此外，glp
‑
1有助于减轻体重、肝脂肪变性以及患糖尿病和心血管疾病的风险。pyy比glp
‑
1更稳定；同样，它主要通过减少胃排空来引起饱腹感和调节葡萄糖代谢，从而有助于减少摄入量和体重。它还通过激活阿黑皮素原(pomc)和抑制中枢神经系统中的神经肽y(npy)来减少过度的食物消耗。
5.肝脏是整合内分泌、神经和营养信号的重要器官，目的是根据能量需求储存或调动营养。这种综合作用使肝脏成为维持生理浓度的能量稳态和血糖的重要器官。其代谢活性受胰岛素和其他代谢激素的密切控制。在葡萄糖存在的情况下，胰岛素刺激糖酵解和脂肪生成，但抑制糖异生；相反，在长期禁食期间，肝脏糖异生是内源性葡萄糖产生的主要来源。肝脏不仅使用葡萄糖作为主要的代谢燃料，还使用脂肪酸。肝细胞从血液中获取脂肪酸，这些脂肪酸从脂肪组织中释放出来或从胃肠道中的食物中吸收。脂肪酸通过肉碱棕榈酰转移酶1(cpt
‑
1)转移到线粒体中，以便通过酸的β氧化进行代谢，从而产生乙酰辅酶a。线粒体β
‑
氧化不仅为肝细胞提供能量，还产生酮体(β
‑
羟基丁酸、乙酰乙酸和丙酮)，这些酮体输出到循环系统，为肝外组织提供能量。肠道和肝脏通过门静脉连接，可以运输肠道微生物群的营养物质、激素和代谢物。肝脏代谢的调节也可由肠道通过中枢神经系统(cns)间接调节。为响应食物摄入，信号通过迷走神经传入传递到大脑中的孤束核(nts)。
6.基于低热量饮食和增加体力活动的预防和治疗策略是控制肥胖及其代谢并发症的首选；然而，它们的长期效力往往有限。为此，需要支持改变生活方式的替代方案，从而提
高其有效性。此外，药理学策略，包括那些基于gpl
‑
1受体激动剂的策略，部分原因是它们在用于治疗慢性疾病时会持续消耗。此外，其有效性是有限的，因为它们基于单一的治疗目标，而没有解决导致肥胖及其并发症的机制的复杂性。
7.在人类观察性研究中，肥胖及其合并症(2型糖尿病、血脂异常、心血管疾病、脂肪肝、代谢综合征等)与肠道微生物群的组成和功能的变化有关，这表明肠道微生物群可能在这些疾病中发挥重要作用。通过将疾病或健康个体的微生物群转移到新受试者并观察后者获得了供体的表型，这一假设得到了证实。这些实验证实，部分由于高热量饮食引起的微生物群的所述变化导致肥胖及其代谢并发症的发展。这一证据导致了肠道生态系统干预策略的发展，例如使用益生菌，作为改善肥胖症治疗和预防的替代方法。由于它们在食品中的安全使用历史，最初开发的产品基于属于乳酸杆菌属和双歧杆菌属的细菌菌株。然而，目前已知，在人体肠道中天然存在的更高比例的其他细菌，与瘦肉表型相关，可能是更有效的替代品。与药理学策略不同，使用共生肠道细菌的优势在于能够通过各种作用机制发挥作用，调节控制能量平衡的内分泌和神经通路，并且先验地不会造成不利影响。关于holdemanella菌属和holdemanella biformis菌种及其菌株的可能有益特性，之前没有文献证实它们对作为本发明主题的改变和病理学的有益作用。
8.发明概述
9.本发明涉及holdemanella菌属、holdemanella biformis菌种和h.biformis株cect 9752及其细胞成分、代谢物、所述细菌分泌的分子，以及包含上述产品的组合物，以及它们用于预防和/或治疗能量稳态和葡萄糖代谢的改变的用途。
10.本发明的细菌对象以及由其衍生的产品的有益作用之一是它们能够减少炎症的细胞和体液介质，炎症与肥胖和与葡萄糖代谢相关的功能障碍(例如，但不仅限于胰岛素抵抗、代谢综合征和糖尿病)。
11.如本发明人进行的体外试验(本说明书的实施例2)所见，本发明范围内的细菌在外周血单核细胞(pbmc)中诱导抗炎反应，因为相对于促炎性ifnγ，它增加了抗炎细胞因子il
‑
4的产生，并且就脂多糖lps诱导的作用而言，它降低经典单核细胞(cd14++cd16
‑
)的水平，脂多糖lps是肥胖症炎症的诱导剂(见表1)。上述抗炎作用可以比其他肠道细菌更大程度地改善由肥胖的促炎状态引起的胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良(参见实施例2)。
12.本发明的一个基本方面是holdemanella菌属，特别是h.biformis菌属，特别是cect 9752菌株调节肠内分泌系统的能力，从而有助于改善葡萄糖代谢和食欲调节，这从长远来看可以减少体重和体脂。在体内试验中获得的最重要的结果中(见实施例3)，值得强调包括在本发明范围内的菌株的能力：(i)使血浆中肽yy(pyy)和肠促胰岛素glp
‑
1的水平标准化(见图2a、2b)；(ii)降低由高热量饮食引起的基础高血糖(见图1a)和(iii)在口服葡萄糖超负荷试验中改善葡萄糖耐量(见图1b)，在喂食含有高能量含量的饱和脂肪(45％)和糖(20％)的饮食时出现肥胖和糖尿病前期状态的小鼠中。此外，根据在该器官中进行的基因表达分析推断，该细菌恢复了胰岛素信号级联并改善了肝脏中的葡萄糖摄取(见图3和图4)。
13.这些细菌对维持或恢复能量稳态，特别是葡萄糖稳态的有益作用将适用于患有高血糖、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗、代谢综合征、2型糖尿病、妊娠糖尿病、1糖尿病、胰腺功能障碍、超重、肥胖、荷尔蒙改变、甲状腺炎、肝功能障碍、肝脂肪变性、血脂
异常、高甘油三酯血症、心血管疾病、视网膜病变和饮食行为改变，或有这些改变风险的个体。
14.将其作为食品补充剂或药物给药代表了能量和葡萄糖代谢改变的初级预防以及相关的慢性病理学方面的重要进展，由于过度食用富含脂肪和糖分的食物，其患病率在过去三年中增加了两倍，这是西方社会的主要死亡原因之一。
15.因此，一方面，本发明涉及h.biformis cect 9752菌株，下文称为“本发明菌株”或“菌株cect 9752”或“菌株g59”。
16.h.biformis是从人类粪便中分离出来的。该菌株于2018年11月5日根据布达佩斯条约由西班牙国家研究委员会(csic)保藏在西班牙典型培养物保藏中心(cect,calle catedr
á
tico agust
í
n escardino,9,46980paterna,valencia,spain)。指定的存款编号为cect 9752。
17.本发明菌株的科学分类为域细菌；厚壁菌门；丹毒类；订购梭菌；丹参科；holdemanella属；holdemanella biformis种。随着时间的推移，本发明的菌株获得了不同的名称，例如“pseudobacterium biforme”(eggerth1935)krasil'nikov 1949、eubacterium biforme(eggerth 1935)prevot 1938和“bacteroides biformis”eggerth 1935。它在碎肉培养基(dsmz培养基78)中生长，含有0.1％吐温80，在37℃和厌氧条件下。
18.本发明的另一方面涉及衍生自菌株h.biformis cect 9752的细菌菌株，其中本发明通篇描述的能力得到保持或提高。衍生的微生物可以通过本领域已知的诱变方法自然地或有意地产生，例如但不限于在诱变剂或引起应激的试剂存在下生长原始微生物，或通过旨在修改特定基因的基因工程产生。根据优选的实施方案，源自菌株h.biformis cect 9752的菌株是遗传修饰的突变体。术语“突变菌株”或“衍生菌株”可以互换使用。
19.菌株h.biformis cect 9752或其任何突变体或衍生物可以以发挥所述作用的任何方式使用，例如，根据本发明的优选实施方案，菌株h.biformis cect 9752为活细胞形式(可培养或不可培养)，或者根据本发明的另一个优选实施方案，菌株是非活细胞的形式(通过本领域已知的任何技术灭活的“死”细胞，例如但不限于加热、冷冻或紫外线辐射)。
20.本发明的另一方面涉及从本发明的菌株或从包含本发明的至少一种菌株的微生物的组合获得的细胞组分、代谢物、分泌分子或其任何组合。
21.细菌的细胞成分可包括细胞壁成分(例如但不限于肽聚糖)、核酸、膜成分或其他成分，例如蛋白质、脂质和碳水化合物及其组合，例如脂蛋白、糖脂或糖蛋白。代谢物包括细菌在其生长过程中、在技术过程中(例如但不限于食品或药物制造过程)、产品储存过程中或胃肠道运输过程中，由于其代谢活动而产生或修饰的任何分子。这些代谢物的实例是但不限于有机和无机酸、蛋白质、肽、氨基酸、酶、脂质、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、维生素、盐、金属或核酸。分泌的分子包括细菌在其生长、其在技术过程中的使用(例如，食品或药物制造)、产品储存或胃肠道转运过程中输出或释放到外部的任何分子。这些分子的例子是但不限于有机和无机酸、蛋白质、肽、氨基酸、酶、脂质、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、维生素、盐、金属或核酸。
22.本发明的另一方面涉及一种组合物，在下文中称为“本发明的组合物”，其包含本发明的菌株和/或本发明的菌株的细胞组分、代谢物、分泌分子或其任何组合。
23.以一般方式定义的组合物是至少由任何浓度的本发明菌株组成的一组组分；或至
少本发明菌株的细胞成分、代谢物、分泌分子或其任何组合；或其组合。
24.在优选的实施方案中，本发明的组合物具有每克或毫升最终组合物103至10
14
个菌落形成单位(cfu)的本发明菌株浓度。
25.在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物可以进一步包含本发明的相同或不同属、种或菌株的至少另一种另外的微生物和/或其细胞成分、代谢物或分泌分子，或其任何组合。例如，但不限于，可以是所述组合物的一部分的额外微生物选自以下组中的至少一个：
26.‑
至少一种holdemanella菌属或h.biformis菌属的另一物种的菌株；
27.‑
bacteroides菌属或b.uniformis菌属的另一物种的至少一种菌株；
28.‑
phascolarctobacterium属或p.faecium种的至少一种菌株；
29.‑
christensenella属和c.minuta种的至少一种菌株；
30.‑
至少一种人类、食物或环境来源的乳酸菌或bifidobacterium。乳酸菌选自包括但不限于bifidobacterium、乳杆菌、乳球菌属、肠球菌、丙酸杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、片球菌属或链球菌的细菌的列表；
31.但不限于bifidobacterium,乳杆菌,乳球菌属,肠球菌,丙酸杆菌属,明串珠菌属,魏斯氏菌属,片球菌属或链球菌的细菌；
32.‑
至少一种人类、食物或环境来源的原核生物的其他系统发育群、属或种的菌株，例如但不限于archaea,拟杆菌门,拟杆菌纲,变形菌门,放线菌门,疣微菌门,梭杆菌纲,甲烷杆菌,螺旋体门,纤维杆菌门,脱铁杆菌门,deinococcus,thermus,蓝细菌,methanobrevibacterium,消化链球菌属,瘤胃球菌属,coprococcus,subdolingranulum,dorea,bulleidia,anaerofustis,gemella,roseburia,catenibacterium,dialister,anaerotruncus,staphylococcus,micrococcus,丙酸杆菌属,肠杆菌科,faecalibacterium,拟杆菌属,parabacteroides,prevotella,eubacterium,akkermansia,bacillus,丁酸弧菌属或梭状杆菌；
33.‑
至少一种真菌或酵母菌株，例如但不限于属于酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、圆酵母属、曲霉属、根霉属、毛霉属或青霉属的一种。
34.额外的微生物可以是来自相同物种或不同物种的菌株或来自对应于本发明菌株的微生物的分类群。包含组合物的细胞可以是无活力的或有活力的并且处于发育或生长状态的任何阶段(潜伏的、指数的、静止的等)，而不管其具有的形态。在特定实施方案中，所述另外的微生物包括至少一种肠道细菌或一种乳酸菌，特别是一种人类肠道细菌。
35.任选地，在另一特定实施例中，本发明的组合物还可包含至少一种生物活性成分(活性物质、活性成分或治疗剂)，例如其他食物成分、植物产品和/或药物。
36.术语“生物活性成分”是指在专利申请范围内具有生物活性的化合物，可以提高或补充菌株cect 9752的活性，包括食品成分或成分(例如但不限于：多不饱和脂肪酸、共轭亚油酸、益生元、纤维、瓜尔胶、葡甘露聚糖、壳聚糖、吡啶甲酸铜、钙等)、其他益生菌、植物、植物提取物或成分和药物。
37.在特定实施方案中，本发明的组合物是药物组合物。药物组合物是至少由任意浓度的本发明菌株组成的一组组分；或至少本发明菌株的细胞成分、代谢物、分泌分子或其任何组合，其在改善受试者的身体、生理或心理健康方面具有至少一种应用，这意味着他们的
总体健康状况有所改善或疾病风险降低。所述药物组合物可以是药物。
38.术语“药物”具有比本发明中定义的“药物组合物”的含义更有限的含义，因为“药物”必然意味着预防或治疗作用。本发明涉及的药物可以供人或兽用。“人用药物”是指具有治疗或预防人类疾病的特性，或可用于人类或给予人类以恢复、纠正或改变生理功能，发挥药理学、免疫或代谢作用，或建立医学诊断的任何物质或物质组合。“兽用药物”是指对动物疾病具有治疗或预防特性，或可给予动物以恢复、纠正或改变其生理功能，发挥药理学、免疫或代谢作用，或建立兽医诊断的物质或物质组合。“兽药”也将被视为准备掺入饲料中的“加药饲料预混物”。
39.除了对治疗功效的要求之外，所述药物组合物可能需要使用其他治疗剂，可能有另外的基本原因迫使或推荐在很大程度上使用本发明的化合物和生物活性成分的组合，其中所述生物活性成分具有适当的活性以构成药物。所述本发明的化合物显然是指本发明的菌株，或由其衍生的菌株，或从本发明的菌株获得的细胞组分、代谢物、分泌分子或其任何组合。
40.在特定实施方案中，该药物组合物还至少包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0041]“载体”优选为惰性物质。载体的功能是促进其他化合物的掺入，允许更好的剂量和给药或使药物组合物具有一致性和形状。因此，载体是药物中用于将本发明药物组合物的任一组分稀释至一定体积或重量的物质；或者，即使不稀释所述组分，也能够允许更好的剂量和给药或赋予药物稠度和形状。当呈递形式是液体时，药学上可接受的载体是稀释剂。
[0042]
术语“赋形剂”是指帮助本发明组合物的任何组分的吸收、稳定所述组分或帮助制备药物组合物的物质，其意义在于赋予其稠度或提供使其更愉快。因此，赋形剂可以具有将组分保持在一起(例如淀粉、糖或纤维素)的功能，甜味的功能，着色的功能，保护药物(例如将其与空气和/或水分隔离)的功能，填充片剂、胶囊或任何其他形式(例如磷酸氢钙)的表现形式的功能，崩解功能，以利于成分在肠内溶解和吸收，不排除本文未提及的其他类型赋形剂。因此，术语“赋形剂”被定义为一种材料，包括在盖仑制剂中，被添加到活性成分或其组合中以允许其制备和稳定性、改变其感官特性或确定药物组合物的物理化学特性及其生物利用度。“药学上可接受的”赋形剂必须考虑到药物组合物的化合物的活性，换言之，它与所述组分相容。
[0043]
此外，如本领域技术人员所理解的，赋形剂和载体必须是药理学上可接受的，换言之，赋形剂和载体被允许和评估以便不会对其施用的生物体造成伤害。
[0044]
药物组合物或药物可以任何临床允许的给药形式和治疗有效量存在。例如，它可以是适合于口服、舌下、鼻、鞘内、支气管、淋巴管、直肠、经皮、吸入或肠胃外给药的形式，优选适合于口服给药的形式。本发明的药物组合物可以制成固体、半固体、液体或气体形式，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球剂或气雾剂。适用于口服给药的形式选自包括但不限于滴剂、糖浆、凉茶、酏剂、混悬剂、临时混悬剂、可饮用小瓶、片剂、胶囊剂、颗粒剂、小袋、囊片、丸剂、丸剂、锭剂或冻干剂形式的列表。在特定实施方案中，本发明的组合物以适于口服、舌下、鼻、支气管、淋巴、直肠、透皮、吸入或肠胃外给药的形式存在。
[0045]
在更特定实施方案中，本发明的组合物以适于口服给药的形式存在。适于口服给药的形式是指可以允许其口服给药的物理状态。所述适于口服给药的形式选自包括但不限
于滴剂、糖浆剂、凉茶、酏剂、混悬剂、临时混悬剂、可饮用小瓶、片剂、胶囊剂、颗粒剂、香囊剂、囊片、丸剂、丸剂、锭剂或冻干形式的列表。
[0046]“盖仑制剂形式”或“药物形式”是活性成分和赋形剂适应以构成药物的处置。它由制造商提供的药物组合物的形式与其给药形式的组合定义。
[0047]
在本发明中，术语“治疗有效量”是指药物组合物的成分在施用于哺乳动物，优选人时足以产生如下定义的预防和/或治疗的量哺乳动物，优选人中感兴趣的疾病或病理状况。治疗有效量将根据例如本发明菌株的活性而变化；以任何形式呈现的细胞成分、代谢物、分泌分子或其任何组合；治疗有效量也将根据化合物的代谢稳定性和作用持续时间而变化；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药方式和时间；排泄率，药物组合；特定疾病或病理状况的严重性；以及正在接受治疗的患者，但这可以由本领域技术人员根据他或她自己的知识和描述来确定。
[0048]
替代药物组合物，本发明的组合物也可以是营养组合物。
[0049]
本发明的术语“营养组合物”是指一种食物，无论向服用它的受试者提供营养，都会有益地影响身体的一种或多种功能，以提供更好的健康和福祉状态。因此，所述营养组合物可用于预防和/或治疗疾病或引起疾病的因素。因此，本发明的术语“营养组合物”可用作具有健康特性的食品、功能性食品或用于特定营养目的的食品或药用食品的同义词。
[0050]
在特定实施方案中，所述营养组合物是食物、补充剂、营养品、益生菌或共生物质。
[0051]
在更特定实施方案中，食物选自包括以下的列表：乳制品、植物产品、肉制品、零食、巧克力、饮料或婴儿食品。乳制品选自包括但不限于源自发酵乳(例如但不限于酸奶或奶酪)或非发酵乳(例如但不限于冰淇淋、黄油、人造黄油、牛奶血清)。植物产品是例如但不限于呈任何呈现形式、发酵或未发酵的谷物。饮料可以是但不限于任何果汁或未发酵的牛奶。
[0052]
与任何术语“膳食补充剂”、“营养补充剂”或“食品补充剂”同义的术语“补充剂”是旨在补充食物的“食物成分”。膳食补充剂的一些例子是但不限于维生素、矿物质、植物药、氨基酸和食物成分，例如酶和腺体提取物。它们不是作为传统食物的替代品或作为膳食或食物饮食的唯一组成部分，而是作为饮食的补充。
[0053]
本发明中使用的术语“营养品”是指从食物中分离出来并以对健康有益的剂型使用的物质。
[0054]
本发明中使用的术语“益生菌”是指活的微生物，当以足够的量施用时，可以促进宿主生物体的健康益处。
[0055]
本发明中使用的术语“共生”是指含有益生元和益生菌混合物的食物。作为一般规则，它们包含有利于生长和/或代谢活动并最终促进与其结合的益生菌的作用的益生元组分，例如但不限于低聚果糖或低聚半乳糖与双歧杆菌的结合。
[0056]
本发明的另一方面涉及本发明的菌株、或源自其的组分、或本发明的组合物用于制造药物、营养组合物或食品的用途。
[0057]
本发明的另一方面涉及菌株cect 9752、获自本发明菌株或本发明组合物的细胞组分、代谢物、分泌分子或其任何组合，以将其用作药物。术语“药物”之前已经定义，并且它适用于本发明方面。
[0058]
在另外方面，本发明涉及holdemanella属细菌或源自其的细菌、源自
holdemanella属细菌的细胞组分、代谢物、分泌分子或其任意组合、或包含holdemanella属细菌的组合物在用于预防和/或治疗选自葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗、代谢综合征、2型糖尿病、妊娠糖尿病、1型糖尿病、胰腺功能障碍、超重、肥胖、激素改变、甲状腺炎、肝功能障碍、肝脂肪变性、血脂异常、高甘油三酯血症、心血管疾病和视网膜病变的与葡萄糖代谢改变相关的疾病中的用途。
[0059]
在特定实施方案中，holdemanella属细菌是h.biformis种，特别是保藏号为cect 9752的h.biformis菌株。
[0060]
在本发明中，术语“治疗”是指对抗受试者(优选哺乳动物，更优选人类)中感兴趣的疾病或病理状况的影响，包括：
[0061]
(i)抑制疾病或病理状况，换言之，阻止其发展；
[0062]
(ii)减轻疾病或病理状况，换言之，导致疾病或病理状况或其症状的缓解；
[0063]
(iii)稳定疾病或病理状况。
[0064]
在本发明中，术语“预防”是指防止疾病的发生，换言之，防止疾病或病理状况在受试者(优选哺乳动物，更优选人类)中出现，特别是当所述受试者具有病理状况的倾向时。
[0065]
在本发明中，“与葡萄糖代谢改变相关的疾病”被理解为所有这些疾病，其中细胞、器官或组织对葡萄糖的错误使用可以以原发性或继发性方式产生，包括高血糖、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗、代谢综合征、2型糖尿病、妊娠期糖尿病、1型糖尿病、胰腺功能障碍、超重、肥胖、激素改变、甲状腺炎、肝功能障碍、肝脂肪变性、血脂异常、高甘油三酯血症、心血管疾病和视网膜病变。
[0066]
在本发明中，“葡萄糖不耐受”被理解为由于缺乏胰岛素产生或抵抗而发生的改变，其中胰腺产生的胰岛素不足以代谢血糖，导致血糖水平居高不下。然而，即使血糖水平高于正常水平，也不能归类为糖尿病。这种状态被认为是“糖尿病前期”。
[0067]
在本发明中，“胰岛素抵抗”被理解为组织对胰岛素作用的反应降低，这使得它们难以具有循环葡萄糖的状况；尤其是肝脏、骨骼肌、脂肪组织和大脑。这种改变与胰腺产生胰岛素的不足相结合，可能会在一段时间后导致2型糖尿病的发展。对胰岛素的抵抗也称为胰岛素抵抗。
[0068]
在本发明中，“代谢综合征”被理解为包括使个体处于患心脏病和2型糖尿病风险的一组病症的疾病。这些病症的例子包括但不限于动脉高血压、高血糖、高甘油三酯血液水平、低血液水平的高密度脂蛋白和腰部脂肪过多。
[0069]
在本发明中，“2型糖尿病”被理解为特征在于由于胰腺不能产生足够的胰岛素或细胞对胰岛素不敏感并且不能使用它而导致血液中葡萄糖水平高的疾病。胰岛素是一种帮助葡萄糖进入细胞为细胞提供能量的激素。随着时间的推移，高血糖水平会导致心脏、眼睛、肾脏、神经、牙龈和牙齿出现严重问题。糖尿病在怀孕期间出现时称为妊娠糖尿病。
[0070]
在特定实施方案中，本发明涉及holdemanella属细菌或源自其的细菌、源自holdemanella属细菌的细胞组分、代谢物、分泌分子或其任意组合、或包含holdemanella属细菌的组合物，将其用作治疗前述段落中提及的任何疾病的佐剂。
[0071]
在本发明中，“佐剂”被理解为有助于：
[0072]
‑
提高其他药物治疗与葡萄糖代谢改变相关疾病的有效性或效率，包括高血糖、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗、代谢综合征、2型糖尿病、妊娠糖尿病、1型糖尿
病、胰腺功能障碍、超重、肥胖、荷尔蒙改变、甲状腺炎、肝功能障碍、肝脂肪变性、血脂异常、高甘油三酯血症、心血管疾病和视网膜病变，和/或
[0073]
‑
通过施用具有互补作用机制的本发明菌株的制剂来降低施用频率或增强其功效。
[0074]
在另一个特定的实施方案中，糖尿病2的治疗基于肠促胰岛素。在本发明中，“肠促胰素”被理解为一系列激素，其响应于食物摄入而在肠中产生并调节它，以及葡萄糖代谢。其最重要的作用之一是刺激胰腺分泌胰岛素和降低血糖水平。两种主要的肠促胰素是抑胃多肽(gip)和胰高血糖素样肽1(glp
‑
1)。
[0075]
在另外方面，本发明涉及holdemanella属细菌或源自其的细菌、源自holdemanella属细菌的细胞组分、代谢物、分泌分子或其任意组合、或包含holdemanella属细菌的组合物用于制备食物。术语药物先前已在本说明书中定义并且适用于本发明方面。
[0076]
在本发明用途的特定实施方案中，所述细菌是经过基因改造的突变体。
[0077]
在本发明用途的另外特定实施方案中，所述细菌为活细胞形式或非活细胞形式。
[0078]
在本发明用途的另外特定实施方案中，所述组合物另外包含至少一种生物活性成分。
[0079]
在本发明用途的另外特定实施方案中，组合物另外包含至少一种不同于holdemanella属细菌、特别h.biformis、更特别h.biformis cect 9752的微生物。在更特定实施方案中，不同于holdemanella属细菌的微生物是人类细菌或乳酸菌。
[0080]
在本发明用途的另外特定实施方案中，组合物是药物组合物。在更特定实施方案中，所述组合物另外包含至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0081]
在本发明用途的另外特定实施方案中，组合物以适于口服、舌下、鼻、支气管、淋巴、直肠、透皮、吸入或肠胃外给药的形式存在。
[0082]
在本发明用途的另外特定实施方案中，组合物是营养组合物，更特别地，所述营养组合物是食物、补充剂、营养品、益生菌或共生物质。在另外甚至更特定实施方案中，所述食物选自乳制品、植物产品、肉制品、零食、巧克力、饮料或婴儿食品。
[0083]
在本发明用途的另外特定实施方案中，所述组合物具有每克或毫升最终组合物103至10
14
个菌落形成单位(cfu)的菌株浓度。
[0084]
在本发明用途的另外特定实施方案中，holdemanella属细菌是h.biformis种，特别是保藏号为cect 9752的h.biformis菌株。
[0085]
在整个说明书和权利要求书中，“包含”一词及其变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组件或步骤。对于本领域技术人员来说，从本发明的描述和实施例中可以部分地推导出本发明的其他目的、优点和特征。以下实施例和附图仅作为说明提供，并非旨在限制本发明。
[0086]
附图简述
[0087]
图1：将菌株h.biformis cect 9752(1x108cfu/天)施用于肥胖c57bl/6小鼠(n＝10/组)14周对基础血糖和葡萄糖耐量的影响。(a)第8周和第10周的空腹血糖水平(mg/dl)。(b)葡萄糖耐量试验，在给予口服葡萄糖超负荷(2g/kg)后15、30、60和120分钟测量血糖。显示了葡萄糖耐量试验结果的曲线下面积(auc)。数据用平均值和标准误差表示。通过应用单向方差分析和随后的tukey检验建立了统计学上的显着差异(p<0.05)。cd，对照饮食；
workstation，don whitley scientific)中搅拌发酵24小时，保持ph值在6.9
‑
7.0之间。
[0101]
将发酵24小时的ibm培养基过滤(通过0.22μm的孔径)并用作“fastidious anaerobe agar”(faa)培养基琼脂平板的补充物，其中含有0.5％去纤维蛋白的血液，其中接种了发酵粪便的系列稀释液(每个平板中每种系列稀释液的接种物为0.1ml)。这种ibm发酵培养基补充剂含有肠道微生物群产生的底物，这种培养基富含肠道生态系统中存在的营养物质，可在实验室条件下更好地回收本地细菌。接种的平板在厌氧室中在37℃下孵育72小时。
[0102]
在平板上生长72小时后的菌落中，分离出了holdemanella biformis cect 9752。通过使用引物27f(5'
‑
agagtttgatcctggctcag
‑
3'(seq id no:1))和1401r(5'
‑
cggttggttacaagaccc
‑
3'(seq id no:2)对16s rrna基因(1.26kb)进行测序来鉴定它。dna扩增后的反应用illustra gfx pcr dna和凝胶带纯化试剂盒(ge healthcare)纯化，并在abi 3730xl测序仪(stabvida
‑
caparica
‑
portugal)中通过sanger技术测序。通过比较ncbi数据库和blastn算法获得的序列，分离菌株(g59)与holdemanella biformis菌菌株dsm 3989(部分序列，16s核糖体rna)的鉴定得到98％的同一性。
[0103]
16s序列(seq id no：3)用于通过blastn算法鉴定身份，使用寡核苷酸27f和1401r对其进行测序：
[0104]
cttcatgaagtcgggttgcagacttcaatccgaactgagacgtcctttatgagattcgcttgccttcacaggcttgccgctctttgtagacgccattgtagtacgtgtgtagcccaggccataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttatcaccggcagtctgatatgagtcctcaactcaatgttagtaacatatcacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtctccttgataacctcggatatatctctatacctctgcaagggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatactccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcacacttgcgtgcatactccccaggcggagaacttattgcgttaactgcggcactgagttattcccccaacacctagttctcatcgtttacggcgtggactactagggtatctaatcctatttgctccccacgctttcgtgcttcagtgtcagaatccagaccagacggccgccttcgccaccggtgttcttccatatatctacgcattttaccgctacacatggagttccgccgtcctcttctgttctctagctgatcagtttccagagcaagtacgggttgagcccataccttttactccagacttgatctgccacctacgcaccctttacgcccaatcattccggataacgctcgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtgactttctggtaagataccatcactcactcatcattccctatgagtgccgtttttctcttacaacagagctttacgatccgaagaccttcctcactcacgcggcattgctcgttcagggttccccccattgacgaaaattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgtccgccctctcaggccggctatgcatcgtcgccttggtgggccgttacctcaccaactagctaatgcaccgcaggtccatccatgttcatggccttagccactttaatagcagtcaaatgcttgtctgctacctatccggttttagcatccgtttccagaagttatcccgggcacatgggcaggttacctacgtgttactcacccgttcgccactagatttaggaaagcaagctttccttcctctcgttc
[0105]
使用dsmz培养物保藏中心推荐的方法对这种菌株的特定生长进行了优化，以用于未来的分析。培养基由肉末(碎肉培养基)(dsmz培养基78)和0.1％吐温80组成。
[0106]
实施例2.h.biformis基于其体外调节炎症的能力的选择.
[0107]
进行体外测定以比较评估细菌分离物集合的免疫调节特性，从而选择能够在经典单核细胞中诱导最大抗炎反应的细菌，因此，对治疗与肥胖相关的炎症和葡萄糖代谢的改变具有潜在的治疗兴趣。为此，不同细菌的细胞悬液被用作外周血单核细胞(pbmc)和经典
单核细胞数量以及抗炎细胞因子il
‑
4相对于促炎细胞因子的水平的刺激物ifnγ通过流式细胞术测量。
[0108]
‑
pbmc的培养和刺激
[0109]
从健康志愿者的全血中，使用ficoll梯度(ficoll paque
‑
plus17
‑
1440
‑
02，bioscience)分离外周血单核细胞(pbmc)。用溶解红细胞的溶液(红细胞裂解缓冲液，rbc，miltenyi biotec.，西班牙)处理它们后，将它们重悬于rpmi 1640培养基(gibco，巴塞罗那，西班牙)中，并添加10％胎牛血清(gibco，巴塞罗那，西班牙)、链霉素(100μg/ml，sigma)、青霉素(100u/ml，sigma)和l
‑
谷氨酰胺(sigma)。为了进行实验，将pbmc以106/ml的浓度在24孔平底聚苯乙烯板(corning，马德里，西班牙)中在37℃、5％co2下孵育。使用浓度为107cfu/ml的活细菌悬浮液作为刺激物。来自肠道沙门氏菌血清型鼠伤寒杆菌(sigma chemical co，madrid，spain)的纯化脂多糖(lps)用作阳性对照，浓度为1μg/ml，未处理的pbmc样品用作阴性对照。在37℃、5％co2条件下，刺激时间为24小时。这段时间过后，收集细胞并离心，将细胞沉淀与上清液分离。每种类型的刺激在3个独立实验中一式三份进行测定。将培养物上清液分级并在
‑
80℃等分储存。
[0110]
‑
通过流式细胞术表征分离的细菌菌株对pbmc的免疫调节特性
[0111]
通过流式细胞术分析受刺激的pbmc，以确定经典促炎单核细胞的水平，使用标记cd14和cd16。此外，还评估了单核细胞中的促炎细胞因子ifnγ水平和抗炎细胞因子il
‑
4水平。为此，将细胞透化和固定(fixation/permeabilization solution kit，bd
‑
bioscience)并用facs溶液(pbs1x+bsa 0.2％)重新悬浮。使用bd lsrfortessa测量标记物水平。
[0112]
从分离的细菌集合中，本发明的holdemanella biformis菌cect 9752菌株是诱导最显着的免疫调节作用的菌株，相对于促炎性ifnγ(较高的il
‑
4/ifnγ)，诱导抗炎细胞因子il
‑
4的产生更高，并且相对于未处理和lps
‑
减少经典的促炎性单核细胞(cd14++cd16
‑
)处理过的细胞(表1)。选择该菌株以评估其防止肥胖动物模型中葡萄糖代谢改变的能力(实施例3)。
[0113]
表1：pbmc上细菌分离物的免疫调节特性的体外表征。结果表示为经典单核细胞的相对水平和通过流式细胞术测量的il
‑
4/ifnγ比率的平均值和标准误差(括号中)。组间显着性差异(p<0.05)通过单向方差分析确定，然后是tukey检验。不同字母表示实验组间差异显着。
[0114][0115]
实施例3.h.biformis在肥胖动物模型中调节能量和葡萄糖代谢的作用表征
[0116]
肥胖动物模型的开发和采样
[0117]
将成年雄性c57bl/6小鼠(6
‑
8周，charles river，les oncins，france)保持在受控温度(23℃)、相对湿度(40
‑
50％)和12小时光/暗循环条件下喂食富含脂肪(45％kcal)和蔗糖(17％kcal)的高热量饮食(hfhsd；d12451，研究饮食，brogaarden，丹麦)或具有标准脂肪含量且不含蔗糖的对照饮食(cd，来自脂肪的10％kcal；d12450k，研究饮食，brogaarden，丹麦)14周。每天，喂食hfhsd饮食的小鼠接受悬浮在10％脱脂牛奶中的本发明的细菌菌株对象(1x108菌落形成单位[cfu])的口服剂量。以相同的方式将载体或安慰剂(10％脱脂乳)给予肥胖表型(hfhsd)对照组和瘦弱表型(cd)对照组(每组n＝10只小鼠)。14周后，颈椎脱臼处死小鼠，获取生物样本(血液、肠、肝等)。
[0118]
代谢表型的表征
[0119]
空腹基础血糖(第8周和第10周)使用葡萄糖试纸(contour xt bayer，barcelona，spain)从大隐静脉的血液中测定，并使用口服葡萄糖测试(ogtt，第10周)测定口服葡萄糖耐量，其中在给禁食4小时的小鼠口服葡萄糖超负荷(2g/kg)后15、30、60和120分钟测量血糖。胰岛素和胃肠激素如胰高血糖素样肽1(glp
‑
1)和肽yy(pyy)的血浆水平也通过多重测量(小鼠代谢磁珠面板，默克化学和生命科学，马德里，西班牙)。
[0120]
本发明的细菌对象能够改善基础血糖(图1a)和口服葡萄糖耐受性(图1b)。根据这些结果，该细菌还通过刺激胰岛素分泌和减少摄入量来增加控制餐后血糖水平的胃肠激素glp
‑
1和pyy的水平。
[0121]
肝脏能量代谢分析
[0122]
考虑到肝脏在维持血糖方面的重要性，还检查了该组织中的能量代谢。为此，通过使用qpcr，分析了限制糖化和脂质代谢的酶的mrna水平，例如：促进在合成代谢条件下以糖原形式储存葡萄糖的激酶(糖生成；gck，葡萄糖激酶)；葡萄糖
‑6‑
磷酸酶(g6pc)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1(pck1)的分解代谢单位，两者都参与糖异生；调节血浆中甘油三酯(tg)稳态的脂肪酶(脂蛋白脂肪酶，lpl)；乙酰辅酶a羧化酶(acc)和脂肪酸合成酶(fas)，这两种酶都参与脂肪生成，水解tg(脂解)的激素敏感性脂肪酶(hsl)和限制脂肪酸β
‑
氧化的肉碱棕榈酰转移酶。根据制造商(bioline,luckenwalde)的说明，使用trisure试剂分离总rna。使用high
‑
capacity cdna reverse transcription kit(美国加利福尼亚州)对2μg总rna进
行逆转录。使用480sybr green i master(曼海姆，德国)和正向(f)和反向(r)引物(序列见表2)在roche light循环仪480设备(roche，boulogne
‑
billancourt，法国)中通过qpcr扩增cdna(表2中详述的cdna ng)。mrna的相对表达量采用方法2
‑
δδct
计算。
[0123]
表2.用于通过qpcr分析基因表达的引物序列。葡萄糖激酶(gck)、葡萄糖6磷酸酶催化单元(g6pc)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶1(pck1)、脂蛋白脂肪酶(lpl)、乙酰辅酶a羧化酶(acc)、脂肪酸合成酶(fas)、激素敏感性脂肪酶(hsl)、肉碱棕榈酰转移酶(cpt1a)、胰高血糖素样肽受体(glp
‑
1r)和肽yy(pyy)。f＝正向；r＝反向。
[0124][0125][0126]
这些酶在肝脏中的表达研究揭示了对肥胖小鼠能量代谢的显着影响，特别是观察到lpl和acc表达的降低和cpt1a的mrna水平的增加(图3)。该细菌阻止了肥胖小鼠肝脏cpt1a的过度表达，达到了喂食对照饮食的对照小鼠的水平；然而，它对lpl和acc的表达没有产生显着影响。这一结果连同acc表达的降低表明，给予该细菌的肥胖小鼠的丙二酰辅酶
a水平可能降低，丙二酰辅酶a是一种来自葡萄糖代谢的代谢物，可抑制cpt1a，从而增加脂肪酸的氧化。细菌诱导的外周组织葡萄糖摄取的改善(图2a和b)与脂肪酸氧化的正常化有关。此外，这种细菌会降低g6pc的mrna水平，但不会显着降低，g6pc是限制葡萄糖生产的酶。
[0127]
鉴定介导细菌对葡萄糖耐量影响的肠道信号
[0128]
分析了肠中神经元标记外周蛋白的表达水平，这可能表明该细菌通过肠
‑
脑
‑
肝机制并通过刺激回肠中的迷走神经传入神经和glp
‑
1r(位于迷走神经传入纤维中)起作用。尽管与对照组相比，肥胖小鼠回肠中外周蛋白或glp
‑
1r的表达没有显着变化(分别为图4a和4b)，该细菌使外周蛋白的表达增加了8倍，使glp
‑
1r的表达增加了两倍，表明细菌诱导的glp
‑
1增加可能会刺激肠
‑
脑
‑
肝轴，其中肠道神经支配的刺激会将神经信号引导至大脑，以便整合到下丘脑中，从而通过传出纤维调节能量稳态。
[0129]
此外，与对照小鼠相比，肥胖小鼠的结肠中胰高血糖素原表达水平降低(图4c)，而本发明的细菌能够防止这种降低并使mrna水平正常化。