修饰的正痘病毒载体的制作方法

修饰的正痘病毒载体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年11月4日提交的美国临时专利申请号62/930,524、2019年7月10日提交的美国临时专利申请号62/872,699和2018年12月21日提交的美国临时专利申请号62/784,372的优先权权益，其各自的公开内容以引用的方式整体并入本文中。
3.序列表
4.本技术以引用的方式并有以ascii文本文件形式与本技术一起提交的序列表，所述文本文件名称为14596
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051
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228_sl.txt，于2019年12月18日创建且具有1,252,729字节的大小。
1.技术领域
5.本发明涉及例如用于治疗诸如癌症的细胞增殖病症的免疫疗法的领域。具体来说，本发明涉及基因修饰的正痘病毒以及其制备及使用方法。
2.

背景技术：

6.可刺激免疫系统以鉴别肿瘤细胞并靶向肿瘤细胞以便进行破坏。采用溶瘤正痘病毒的免疫疗法为癌症研究中的迅速进展领域。需要新途径来对溶瘤病毒进行工程改造和/或增强其肿瘤选择性，以便使效率和安全性达到最大。当将可能有毒的治疗剂或基因添加到病毒中时，此选择性尤为重要。
7.尽管将正痘病毒用作临床溶瘤载体是癌症治疗有前景的范例，但归因于其毒性(诸如患者的痘病变及免疫抑制副作用)，最新临床候选物仅展示较小的临床收效。需要对展现更稳固病毒复制、癌细胞杀灭及从感染点扩散的正痘病毒进行工程改造的方法。本发明解决此需求并且通过采用修饰的的正痘病毒提供关于选择性和安全性限制的解决方案。
3.

技术实现要素：

8.本公开描述了正痘病毒用于治疗癌症的用途。具体来说，本公开是部分基于当正痘病毒被基因修饰以在以下基因中的一个或多个或全部中含有缺失时产生的提高的溶瘤活性、感染扩散和安全性结果：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。在这些基因中的一个或多个或全部中展现突变的基因修饰的正痘病毒，诸如痘苗病毒(例如copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
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1、修饰的安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia ankara；mva)、dairen i、glv
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1h68、ihd
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j、l
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ivp、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
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1病毒)可展现一系列有益的特征，诸如改善的溶瘤能力、在肿瘤中的复制、感染性、免疫逃避、肿瘤持久性(tumor persistence)、掺入外源性dna序列的能力和/或对大规模制造的适应性。本公开描述了进一步被基因修饰以在b8r基因中含有缺失的正痘病毒。在各种实施方案中，修饰的正痘病毒表达三种转基因中的至少一种：含有跨膜结构域的白介素12(il
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12
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tm)、fms样酪氨酸激酶3配体(flt3
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l)及抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4
(ctla
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4)抗体。
9.一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'反向末端重复序列(itr)中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；以及(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
10.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
11.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
12.在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
13.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；以及(d)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。
14.在某些实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
15.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
16.在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
17.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；以及(c)第二转基
因，其包含编码白介素12(il
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12)多肽的第二核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
18.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子。在又一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在又另一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在仍另一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
19.在一些实施方案中，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
20.在特定实施方案中，所述il
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12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽包含il
‑
12p35或il
‑
12p70。在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
21.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列；以及(d)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。
22.在某些实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在一个特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在仍另一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
23.在一些实施方案中，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
24.在特定实施方案中，所述il
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12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，所述il
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12多肽包含il
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12p35或il
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12p70。在特定实施方案中，所述il
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12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
25.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；以及(c)第三转基因，其包含编码fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r
及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
26.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
27.在一些实施方案中，所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
28.在特定实施方案中，所述flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
29.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；以及(d)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
30.在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
31.在一些实施方案中，所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
32.在特定实施方案中，所述flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
33.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；以及(d)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
34.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
35.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子。在又一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在仍另一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
36.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
37.在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
38.在特定实施方案中，所述il
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12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，所述il
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12多肽包含il
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12p35或il
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12p70。在特定实施方案中，所述il
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12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
39.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；以及(d)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操
作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；和/或(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。
40.在某些实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
41.在某些实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在一个特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在仍另一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
42.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
43.在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
44.在特定实施方案中，所述il
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12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，所述il
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12多肽包含il
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12p35或il
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12p70。在特定实施方案中，所述il
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12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
45.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
46.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
47.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷
酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
48.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
49.在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
50.在特定实施方案中，所述flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
51.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；和/或(ii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
52.在某些实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
53.在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
54.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘
苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
55.在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
56.在特定实施方案中，所述flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
57.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
58.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子。在又一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在仍另一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
59.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
60.在一些实施方案中，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
61.在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽包含il
‑
12p35或il
‑
12p70。在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
62.在特定实施方案中，所述flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
63.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子；和/或(ii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
64.在某些实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在一个特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在仍另一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
65.在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
66.在一些实施方案中，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
67.在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽包含il
‑
12p35或il
‑
12p70。在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
68.在特定实施方案中，所述flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，
所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
69.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；以及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
70.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
71.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子。在又一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在仍另一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
72.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
73.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
74.在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
75.在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，所述il
‑
12多
肽包含il
‑
12p35或il
‑
12p70。在特定实施方案中，所述il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
76.在特定实施方案中，所述flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
77.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；以及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子；和/或(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
78.在某些实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
79.在某些实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在一个特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在仍另一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
80.在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
81.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘
苗病毒基因呈相同取向，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
82.在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
83.在特定实施方案中，所述il
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12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，所述il
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12多肽包含il
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12p35或il
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12p70。在特定实施方案中，所述il
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12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
84.在特定实施方案中，所述flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
85.在一个特定实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)，且所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)。在一个特定实施方案中，所述第一转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间(即，存在于剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间)，且所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)。在又一特定实施方案中，所述第三转基因在所述第二转基因的上游。
86.在本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述b8r基因中的缺失为至少50％所述b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，所述b8r基因中的缺失为至少60％所述b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，所述b8r基因中的缺失为至少70％所述b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，所述b8r基因中的缺失为至少80％所述b8r基因序列的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r基因中的缺失为约75％所述b8r基因序列的缺失。在另一特定实施方案中，所述b8r基因中的缺失为约80％所述b8r基因序列的缺失。
87.在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，所述重组痘苗病毒基因组来源于copenhagen株痘苗病毒的基因组。
88.在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，所述重组痘苗病毒基因组包含seq id no:210的核苷酸序列。
89.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；(d)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列；以及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的
至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
90.在特定实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在特定实施方案中，所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间，且所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中。在特定实施方案中，所述第一转基因插入剩余的b14r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间，且所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中。在特定实施方案中，所述第三转基因在所述第二转基因的上游。在特定实施方案中，所述第三转基因在所述第二转基因的下游。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。
91.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基
因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
92.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
93.在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因中的任何一个、两个或三个插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因中的任何一个、两个或三个插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间。
94.在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因中的任何一个、两个或三个插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因的基因座中)。
95.在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因中的任何一个、两个或三个插入所述部分b13r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b13r基因与所述部分b29r基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因中的任何一个、两个或三个插入剩余的b13r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间。
96.在一个特定实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第一转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中，且所述第三转基因插入剩余的b14r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间。
97.在一个特定实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第二转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中，且所述第一转基因插入剩余的b14r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间。
98.在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中，且所述第一转基因插入剩余的b14r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间。
99.在一个特定实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)。在一个特定实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中。
100.在一个特定实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间，且所述第三转基因插入剩余的b14r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间。
101.在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)，且所述第一转基因和所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中
的缺失的基因座中)。在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间，且所述第一转基因和所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中。
102.在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)，且所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间，且所述第一转基因和所述第二转基因插入剩余的b14r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间。
103.在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)，且所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分b13r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b13r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中，且所述第一转基因和所述第二转基因插入剩余的b13r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间。
104.在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入所述部分b13r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b13r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间)，且所述第一转基因和所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)。在一个特定实施方案中，所述第三转基因插入剩余的b13r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间，且所述第一转基因和所述第二转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中。
105.在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间(即，存在于所述部分c2l基因与所述部分f3l基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因插入剩余的c2l痘苗基因部分与剩余的f3l痘苗基因部分之间。
106.在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中(即，存在于所述b8r基因中的缺失的基因座中)。
107.在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间(即，存在于所述部分b14r基因与所述部分b29r基因之间)。在一个特定实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因插入剩余的b14r痘苗基因部分与剩余的b29r痘苗基因部分之间。
108.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列
与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。
109.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(d)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中所述c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含所述b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。
110.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至细胞毒
性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
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4)的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中；(c)第二转基因，其包含编码白介素12(il
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12)多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于阐述于中seq id no:215中；以及(d)第三转基因，其包含编码fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
111.在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
112.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码所述抗ctla
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4抗体的所述第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于编码所述抗ctla
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4抗体的所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码所述抗ctla
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4抗体的所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子。
113.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码所述il
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12多肽的所述第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于编码所述il
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12多肽的所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为晚期启动子。在另一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，所述f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，所述d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
114.在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的所述第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，所述b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
115.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸
序列列举于seq id no:216中；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在特定实施方案中，所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在特定实施方案中，所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间，且所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的缺失的基因座中。在特定实施方案中，所述第三转基因在所述第二转基因的上游。在特定实施方案中，所述第三转基因在所述第二转基因的下游。
116.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于
所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
117.另一方面，本文提供一种包含重组痘苗病毒基因组的核酸，其包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
118.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列
列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
119.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施
方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
120.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
121.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包
含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
122.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
123.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；
(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
124.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动
子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
125.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
126.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举
于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
127.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第
三核苷酸序列的所述至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，所述b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且所述b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
128.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
129.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于
no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
131.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，所述h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且所述h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
132.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包
含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，所述ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
133.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，所述ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
134.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘
苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，所述ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
135.另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含所述b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
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4的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中所述第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第一转基因插入seq id no:210中的所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
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12多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中所述第二核苷酸序列与侧接所述第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中；以及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中所述第三核苷酸序列与侧接所述第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且其中所述第三转基因在所述第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第二核苷酸序列的所述至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于所述第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于所述第三核苷酸序列的所述至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，所述ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
136.在其中所述核酸包含所述第一转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，
所述第一转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
137.在其中所述核酸包含所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
138.在其中所述核酸包含所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
139.在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
140.在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第一转基因和所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
141.在其中所述核酸包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
142.在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其
中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因插入到所述b8r基因的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
143.在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
144.在其中所述核酸包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸
包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
145.在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
146.在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因和所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因
和所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因和所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第二转基因和所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第一转基因和所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第一转基因和所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文
所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因和所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
147.在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第一转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，所述第一转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第三转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，所述第三转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，所述第一转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第二转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。在其中所述核酸包含所述第一转基因、所述第二转基因和所述第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，所述第三转基因插入所述部分c2l痘苗基因与所述部分f3l痘苗基因之间，所述第二转基因插入到所述b8r基因中的所述缺失的所述基因座中，且所述第一转基因插入所述部分b14r痘苗基因与所述部分b29r痘苗基因之间。
148.在其中所述核酸包含seq id no:210的核苷酸序列的本文所述的各种实施方案和方面中，部分c2l和f3l痘苗基因为seq id no:210中的部分c2l和f3l痘苗基因。在其中所述核酸包含seq id no:210的核苷酸序列的本文所述的各种实施方案和方面中，部分b14r和b29r痘苗基因为seq id no:210中的部分b14r和b29r痘苗基因。
149.一方面，本文提供一种病毒，其包含本文所描述的核酸。
150.一方面，提供包装细胞系，其包含本文所公开的核酸或病毒。
151.一方面，本文提供药物组合物，其包含本文所公开的病毒及生理学上可接受的载剂。
152.一方面，提供治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的病毒。另一方面，提供治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如本文所公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述哺乳动物患者为人患者。
153.在一些实施方案中，所述病毒在初免
‑
加强治疗(prime:boost treatment)中用作初免剂(prime)。在一些实施方案中，所述病毒在初免
‑
加强治疗中用作加强剂。
154.在一些实施方案中，所述哺乳动物患者患有癌症。举例来说，在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌及咽喉癌。
155.在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：急性淋巴母细胞性白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、肾上腺皮质癌、aids相关淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文氏肉瘤家族(ewing sarcoma family)、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)、类癌瘤(carcinoid tumor)、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性赘瘤、结肠癌、肝外胆管癌、乳腺管原位癌(dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤(esthesioneuroblastoma)、颅外生殖细胞肿瘤(extracranial germ cell tumor)、性腺外生殖细胞肿瘤(extragonadal germ cell tumor)、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病(gestational trophoblastic disease)、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(langerhans cell histiocytosis)、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin lymphoma)、下咽癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆氏肿瘤(wilms tumor)和其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤t细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线癌(midline tract carcinoma)、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、上皮卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、横纹肌肉瘤、塞泽里综合征(s
é
zary syndrome)、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌及华氏巨球蛋白血症(macroglobulinemia)。
156.在一些实施方案中，提供的方法进一步包括向所述患者施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段或抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗pd1或抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂
为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
157.在一些实施方案中，提供的方法进一步包括向所述患者施用白介素。
158.在一些实施方案中，所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。在一些实施方案中，所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。在一些实施方案中，所述白介素为膜结合的。
159.在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述患者施用干扰素。在一些实施方案中，所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
160.在一些实施方案中，提供的方法进一步包括向所述患者施用细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子为tnf超家族成员蛋白。在一些实施方案中，tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。在一些实施方案中，所述细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及ckit。在一些实施方案中，所述细胞因子为flt3配体。
161.一方面，提供试剂盒，其包含如本文所公开的核酸或病毒和指导所述试剂盒的使用者在宿主细胞中表达所述核酸或所述病毒的药品说明书。
162.一方面，提供试剂盒，其包含如本文所公开的病毒和指导使用者向哺乳动物癌症患者施用治疗有效量的所述病毒从而治疗所述癌症的药品说明书。在一些实施方案中，所述哺乳动物患者为人患者。
163.3.1.定义
164.如本文所用，术语“约”是指高于或低于所描述值的不超过10％的值。举例来说，术语“约5nm”指示4.5nm至5.5nm的范围。
165.如本文所用，术语“抗体”(ab)是指免疫球蛋白分子，其特异性结合至特定抗原或可与特定抗原免疫反应，且包括多克隆、单克隆、基因工程改造及以其他方式修饰形式的抗体，包括(但不限于)嵌合抗体、人源化抗体、异缀合抗体(例如双、三及四特异性抗体、双抗体、三抗体以及四抗体)以及抗体的抗原结合片段，包括例如fab'、f(ab')2、fab、fv、rigg及scfv片段。此外，除非另有指示，术语“单克隆抗体”(mab)意在包括能够特异性结合至靶蛋白的完整分子以及抗体片段(诸如fab和f(ab')2片段)两者。fab和f(ab')2片段缺乏完整抗体的fc片段，从动物循环中更快地清除，并且可具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见，例如wahl等人，j.nucl.med.24:31 6,1 983；以引用的方式并入本文中)。
166.如本文所用的术语“抗原结合片段”是指一个或多个保留特异性结合至靶抗原的能力的抗体片段。抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段执行。抗体片段可为fab、f(ab')2、scfv、smip、双抗体、三抗体、亲和抗体、纳米抗体、适体或结构域抗体。术语抗体的“抗原结合片段”涵盖的结合片段的实例包括(但不限于)：(i)fab片段，由vl、vh、cl及ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含两个在铰链区通过二硫桥键连接的fab片段的二价片段；(iii)fd片段，由vh和ch1结构域组成；(iv)fv片段，由抗体的单一臂的vl和vh结构域组成，(v)dab，包括vh和vl结构域；(vi)dab片段(ward等人，nature 341:544
‑
546,1 989)，由vh结构域组成；(vii)dab，由vh或vl结构域组成；(viii)分离的互补决定区(cdr)；以及(ix)可任选地由合成接头接合的两个或更多个分离的cdr的组合。此外，尽管fv片段的
两个结构域vl和vh由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过接头接合，所述接头使它们可制成单一蛋白链，其中vl和vh区配对以形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见，例如bird等人,science 242:423
‑
426,1988及huston等人，natl.acad.sci.usa 85:5879
‑
5883,1988)。这些抗体片段可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且片段的效用可以与完整抗体相同的方式来筛选。抗原结合片段可通过重组dna技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解或在一些实施方案中通过本领域中已知的化学肽合成程序产生。
167.如本文所用，术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的(通常是)人或人源化单克隆抗体。
168.如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”及“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括其子代，其为任何及所有后代。应理解，所有子代可能归因于有意或无意突变而不一致。
169.如本文所用，术语“嵌合”抗体是指具有来源于一个源生物体(诸如大鼠或小鼠)的免疫球蛋白的可变序列及来源于不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法为本领域中已知的。参见，例如morrison,1985,science 229(4719)：1202
‑
7；oi等人,1986,biotechniques 4:214
‑
221；gillies等人,1985,j.immunol.methods 125:191
‑
202；美国专利号5,807,715；4,816,567；及4,816,397，其以引用的方式整体并入本文中。
170.如本文所用，术语“互补决定区”(cdr)是指见于轻链和重链可变域两者中的高变区。可变域的更高度保守部分称作构架区(fr)。如本领域中所了解，划定抗体的高变区的氨基酸位置可根据情形及本领域中已知的各种定义而变化。可变域内的一些位置可被视为杂合高变位置，因为这些位置可在一组准则下被视为处于高变区内而在一组不同准则下被视为处于高变区外。这些位置中的一个或多个也可见于扩展的高变区中。原生重链和轻链的可变域各自包含主要采用β折叠构型的四个构架区，其经由三个cdr连接，形成连接β折叠结构的环且在一些情况下形成β折叠结构的部分。每条链中的cdr按次序fr1
‑
cdr1
‑
fr2
‑
cdr2
‑
fr3
‑
cdr3
‑
fr4且与来自另一抗体链的cdr通过fr区以紧密接近度结合在一起，促使形成抗体的靶结合位点(参见kabat等人,sequences of proteins of immunological interest(national institute of health,bethesda,md.1987；以引用的方式并入本文中)。
171.如本文所用，除非另有指示，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是根据kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。
172.如本文所用，术语“保守突变”、“保守取代”或“保守氨基酸取代”是指一个或多个氨基酸取代一个或多个展现类似物理化学特性(诸如极性、静电电荷和空间体积)的不同氨基酸。下表1中针对二十种天然存在的氨基酸中的每个概述这些特性。根据此表应了解，保守氨基酸家族包括(i)g、a、v、l和i；(ii)d和e；(iii)c、s和t；(iv)h、k和r；(v)n和q；以及(vi)f、y和w。保守突变或取代因此为一个氨基酸取代相同氨基酸家族中的一个成员(例如ser取代thr或lys取代arg)的突变或取代。
173.表1.天然存在的氨基酸的代表性物理化学特性
[0174][0175][0176]
如本文所用，术语“缺失(delete、deletion)”等是指移除基因或以其他方式致使基因无功能的对基因或与其相关或以可操作方式与其连接的调控元件(例如转录因子结合位点，诸如启动子或增强子元件)的修饰。如本文所述的例示性缺失包括移除编码所关注基因的核酸的从靶基因的起始密码子至终止密码子的整体。如本文所描述的缺失的其他实例包括移除编码靶基因的核酸的一部分(例如一个或多个密码子或其部分，诸如单一核苷酸缺失)，使得在表达部分缺失靶基因时，产物(例如rna转录物、蛋白质产物或调控rna)相比野生型形式的靶基因为无功能的或功能性低。如本文所述的例示性缺失包括移除全部或一部分与所关注基因相关的调控元件，诸如全部或一部分调控靶基因的表达的启动子和/或增强子核酸。
[0177]
在特定实施方案中，本公开中描述的重组痘苗病毒基因组包含以下基因中的一个
或多个中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、b21r(于3'itr中)、b22r(于3'itr中)、b23r(于3'itr中)、b24r(于3'itr中)、b25r(于3'itr中)、b26r(于3'itr中)、b27r(于3'itr中)、b28r(于3'itr中)及b29r(于3'itr中)。在一个特定实施方案中，本公开中描述的重组痘苗病毒基因组包含在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；以及在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。在特定实施方案中，本公开中描述的重组痘苗病毒基因组包含以下基因中的一个或多个中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、b20r、b21r(于3'itr中)、b22r(于3'itr中)、b23r(于3'itr中)、b24r(于3'itr中)、b25r(于3'itr中)、b26r(于3'itr中)、b27r(于3'itr中)、b28r(于3'itr中)及b29r(于3'itr中)，并且还包含b8r基因中的缺失。
[0178]
在一些实施方案中，基因缺失移除基因的整个序列。在其他实施方案中，基因缺失为部分缺失，即，移除基因序列的一部分的缺失。在一个实施方案中，基因缺失为移除基因序列的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的部分缺失。在一个实施方案中，基因缺失为移除基因的蛋白质编码序列的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的部分缺失。在其他实施方案中，基因缺失移除基因序列的100％。在其他实施方案中，基因缺失移除基因的蛋白质编码序列的100％。在一个实施方案中，基因缺失移除基因序列的至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个核苷酸。在另一实施方案中，基因缺失为移除基因序列的至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个核苷酸的部分缺失。在一个特定实施方案中，基因中的部分缺失产生部分基因。
[0179]
如本文所用，术语“衍生抗体”是指通过化学反应被修饰以便裂解残基或将非原生化学部分添加到分离的抗体中的抗体。衍生抗体可通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过添加已知的化学保护/封闭基团进行衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质键联而获得。多种化学修饰中的任一种可通过已知技术使用现有程序进行，所述技术包括(但不限于)特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可例如使用琥珀抑制技术(amber suppression technology)(参见例如美国专利号6,964,859；以引用的方式并入本文中)含有一个或多个非天然氨基酸。
[0180]
如本文所用，术语“双抗体”是指包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括通过接头接合的vh和vl结构域，所述接头极短(例如接头由五个氨基酸构成)以允许相同肽链上vh与vl结构域的分子内缔合。此构型促使每个结构域在另一多肽链上与互补域配对以便形成均二聚结构。因此，术语“三抗体”是指包含三条肽链的三价抗体，所述肽链中的每条含有通过接头接合的一个vh结构域和一个vl结构域，所述接头极其短(例如接头由1至2个氨基酸构成)以允许相同肽链内vh与vl结构域的分子内缔合。为了折叠成其原生结构，以此方式构造的肽通常三聚化以便将相邻肽链的vh和vl结构域定位为在空间上彼此接近，以允许适当折叠(参见holliger等人,proc.natl.acad.sci.usa 90:6444
‑
48,1993；以引用的
方式并入本文中)。
[0181]
如本文所用，“双重可变域免疫球蛋白”(“dvd
‑
ig”)是指经由接头组合两个单克隆抗体的靶标结合可变域以产生四价双重靶向单一试剂的抗体。(gu等人,meth.enzymol.,502:25
‑
41,2012；以引用的方式并入本文中)。
[0182]
如本文所用，术语“内源性”描述天然见于特定生物体(例如人)中或生物体内的特定部位(例如器官、组织或细胞，诸如人细胞)中的分子(例如多肽、核酸或辅因子)。
[0183]
如本文所用，术语“外源性”描述并非天然见于特定生物体(例如人)中或生物体内的特定部位(例如器官、组织或细胞，诸如人细胞)中的分子(例如多肽、核酸或辅因子)。外源性物质包括从外部来源提供到生物体或自其萃取的培养物质的那些物质。
[0184]
如本文所用，术语“构架区”或“fw区”包括邻近于cdr的氨基酸残基。fw区残基可存在于例如尤其人抗体、啮齿动物衍生抗体(例如鼠类抗体)、人源化抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、抗体片段(例如fab片段)、单链抗体片段(例如scfv片段)、抗体结构域及双特异性抗体中。
[0185]
如本文所用，术语“异种特异性抗体”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆(优选人或人源化)抗体。传统上，异种特异性抗体的重组产生是基于共表达两个免疫球蛋白重链/轻链对，其中这两个重链具有不同特异性(milstein等人,nature 305:537,1 983)。类似程序公开于例如wo 93/08829、美国专利号6,210,668、6,193,967、6,132,992、6,106,833、6,060,285、6,037,453、6,010,902、5,989,530、5,959,084、5,959,083、5,932,448、5,833,985、5,821,333、5,807,706、5,643,759、5,601,819、5,582,996、5,496,549、4,676,980、wo 91/00360、wo 92/00373、ep 03089、traunecker等人,embo j.10:3655(1991)、suresh等人,methods in enzymology 121:210(1986)；其以引用的方式并入本文中。异种特异性抗体可包括在多特异性抗体中强制正确链缔合的fc突变，如以引用的方式并入本文中的klein等人,mabs 4(6):653
‑
663,2012所描述。
[0186]
如本文所用，术语“人抗体”是指如下抗体，其中蛋白质的大体上每一部分(例如cdr、构架、c
l
结构域、c
h
结构域(例如c
h
1、c
h
2、c
h
3)、铰链(v
l
、v
h
))在人中为大体上非免疫原性的，其中仅少量序列改变或变化。人抗体可在人细胞中(例如通过重组表达)产生，或通过能够表达在功能上重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。此外，当人抗体为单链抗体时，其可包括未见于原生人抗体中的连接肽。举例来说，fv可包含连接肽，诸如二至约八个甘氨酸或其他氨基酸残基，其连接重链的可变区和轻链的可变区。认为此类连接肽具有人来源。人抗体可通过本领域中已知的包括噬菌体呈现方法的各种方法使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体库制得。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及pct公布wo 1998/46645、wo 1998/50433、wo 1998/24893、wo 1998/16654、wo 1996/34096、wo 1996/33735及wo 1991/10741；其以引用的方式并入本文中。人抗体还可使用不能表达功能内源性免疫球蛋白但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。参见例如pct公布wo 98/24893、wo 92/01047、wo 96/34096、wo 96/33735；美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771及5,939,598；其以引用的方式并入本文中。
[0187]
如本文所用，术语“人源化”抗体是指为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如抗体的fv、fab、fab'、f(ab')2或其他靶标结合子结构域)的非人(例如鼠类)抗体的形
式，含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。一般来说，人源化抗体将包含至少一个及通常两个可变域中的大体上全部，其中全部或大体上全部cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr区。全部或大体上全部fr区也可为人免疫球蛋白序列的fr区。人源化抗体还可包含通常人免疫球蛋白共同序列的免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分。抗体人源化的方法为本领域中已知的。参见例如riechmann等人,nature 332:323
‑
7,1988；queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762及6,180,370；ep239400；pct公布wo 91/09967；美国专利号5,225,539；ep592106；及ep519596；其以引用的方式并入本文中。
[0188]
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而非产生其的方法。
[0189]
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指对超过一个靶抗原展现亲和力的抗体。多特异性抗体可具有类似于完整免疫球蛋白分子的结构且包括fc区，例如igg fc区。此类结构可包括(但不限于)igg
‑
fv、igg
‑
(scfv)2、dvd
‑
ig、(scfv)2
‑
(scfv)2
‑
fc及(scfv)2
‑
fc
‑
(scfv)2。在igg
‑
(scfv)2的情况下，scfv可连接至重链或轻链的n端或c端。例示性多特异性分子已由以下综述：kontermann,2012,mabs 4(2):182
‑
197、yazaki等人,2013,protein engineering,design&selection 26(3):1 87
‑
1 93及grote等人,2012,proetzel&ebersbach(编),antibody methods and protocols,methods in molecular biology第901卷,第16章:247
‑
263；其以引用的方式并入本文中。缺乏fc区且抗体或抗体片段可并入其中的例示性多特异性分子包括scfv二聚体(双抗体)、三聚体(三抗体)及四聚体(四抗体)、fab二聚体(通过粘性多肽或蛋白域缀合)及fab三聚体(以化学方式缀合)，由以引用的方式并入本文中的hudson和souriau,2003,nature medicine 9:129
‑
134描述。
[0190]
如本文所用，术语“序列同一性百分比(％)”是指在必要时比对序列且引入空位以达成最大序列同一性百分比(例如，空位可引入用于最佳比对的候选物及参考序列中的一个或两个中且可出于比较目的忽略非同源序列)之后，与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。出于测测序列同一性百分比目的之比对可以本领域中的技能范围内的各种方式达成，例如使用公开可获得的电脑软件，诸如blast、align或megalign(onastar)软件。本领域技术人员可测定用于测量比对的适当参数，包括用于达成所比较序列的全长内的最大比对所需的任何演算法。举例来说，用于与候选序列比较而比对的参考序列可显示，候选序列跨候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核酸)残基的所选部分展现50％至100％序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可为例如参考序列的长度的至少30％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的一个位置由与参考序列中对应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在那个位置处一致。
[0191]
如本文所用，术语“灵长类化抗体”是指包含来自灵长类动物源抗体的构架区和来自非灵长类动物源的抗体的其他区域(诸如cdr和恒定区)的抗体。灵长类化抗体的产生方法为本领域中已知的。参见例如以引用的方式并入本文中的美国专利号5,658,570、5,681,722及5,693,780。
[0192]
如本文所用，在多核苷酸片段的上下文中的术语“以可操作方式连接”意指接合两个多核苷酸片段以使得由两个多核苷酸片段编码的氨基酸序列保持同框。
[0193]
如本文所用，术语“调控元件”等是指控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增
强子及其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于以引用的方式并入本文中的goeddel,gene expression technology：methods in enzymology 185(academic press,san diego,ca,1990)中。
[0194]
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指接受针对如本文所述的特定疾病或病况(诸如癌症或传染病)的治疗的生物体。受试者和患者的实例包括接受针对疾病或病况(例如细胞增殖病症，诸如癌症)的治疗的哺乳动物，诸如人。
[0195]
如本文所用，术语“scfv”是指其中来自抗体的重链和轻链的可变域已接合形成一条链的单链fv抗体。scfv片段含有包括由接头分隔开的抗体轻链的可变区(vl)(例如cdr
‑
l1、cdr
‑
l2和/或cdr
‑
l3)及抗体重链的可变区(vh)(例如cdr
‑
h1、cdr
‑
h2和/或cdr
‑
h3)的单一多肽链。接合scfv片段的vl区和vh区的接头可为由蛋白型氨基酸构成的肽接头。可使用替代性接头以便增加scfv片段对蛋白水解降解的抗性(例如含有d
‑
氨基酸的接头)，以便增强scfv片段的溶解性(例如诸如含聚乙二醇的接头或含有重复甘氨酸和丝氨酸残基的多肽的亲水性接头)，以提高分子的生理稳定性(例如含有形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基的接头)，或以减弱scfv片段的免疫原性(例如含有糖基化位点的接头)。scfv分子为本领域中已知的且描述于例如美国专利5,892,019,flo等人,(gene 77:51,1989)；bird等人,(science 242:423,1988)；pantoliano等人,(biochemistry 30:10117,1991)；milenic等人,(cancer research 51:6363,1991)；及takkinen等人,(protein engineering 4:837,1991)中。scfv分子的vl和vh结构域可来源于一个或多个抗体分子。本领域普通技术人员还将理解，本发明的scfv分子的可变区可被修饰以使得其氨基酸序列与其所源自的抗体分子不同。举例来说，在一些实施方案中，可进行产生氨基酸残基的保守取代或改变的核苷酸或氨基酸取代(例如在cdr和/或构架残基中)。或者或另外，使用本领域公认的技术对cdr氨基酸残基进行突变以最佳化抗原结合。scfv片段描述于例如以引用的方式并入本文中的wo 2011/084714中。
[0196]
如本文所用，短语“特异性结合”是指决定抗原于异质蛋白质群体及例如通过抗体或其抗原结合片段以特殊性识别的其他生物分子中的存在的结合反应。特异性结合至抗原的抗体或其抗原结合片段可以小于100nm的k
d
结合至抗原。举例来说，特异性结合至抗原的抗体或其抗原结合片段可以至多100nm(例如1pm与100nm之间)的k
d
结合至抗原。对特定抗原或其表位不展现特异性结合的抗体或其抗原结合片段可对那个特定抗原或其表位展现大于100nm(例如大于500nm、1μm、100μm、500μm或1mm)的k
d
。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质或碳水化合物发生特异性免疫反应的抗体。举例来说，固相elisa免疫测定通常用以选择与蛋白质或碳水化合物特异性免疫反应的抗体。关于可用以确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见harlow和lane,antibodies,a laboratory manual,cold spring harbor press,new york(1988)，以及harlow和lane,using antibodies,a laboratory manual,cold spring harbor press,new york(1999)。
[0197]
如本文所用，术语“转染”是指常用于将外源性dna引入原核或真核宿主细胞中的多种技术中的任一种，例如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙沈淀、deae
‑
葡聚糖转染等。
[0198]
如本文所用，术语“治疗(treat或treatment)”是指治疗性治疗，其中目标在于预防或减缓(减轻)不希望的生理学改变或病症，诸如细胞增殖病症(诸如癌症)的进展。有益或所需的临床结果包括(但不限于)症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定(即，未恶化)、
疾病进展延迟或减缓、疾病状态改善或缓和及缓解(部分抑或全部缓解)，无论可检测抑或不可检测。需要治疗的那些患者包括已患有病况或病症的那些患者，以及易于患病况或病症的那些，或待预防病况或病症的那些患者。
[0199]
如本文所用，术语“载体”是指核酸载体，例如dna载体，诸如质粒、rna载体、病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已研发多种载体用于将编码外源性蛋白的多核苷酸递送至原核或真核细胞中。此类表达载体的实例公开于例如以引用的方式并入本文中的wo 1994/1 1026中。本发明的表达载体可含有一个或多个用于蛋白质的表达和/或这些多核苷酸序列向诸如哺乳动物细胞(例如人细胞)的宿主细胞的基因组中的整合的额外序列元件。可用于本文所描述的抗体及抗体片段的表达的例示性载体包括含有导引基因转录的调控序列(诸如启动子和增强子区)的质粒。载体可含有调节靶基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mrna的稳定性或核输出的核酸。这些序列元件可包括例如5'和3'非翻译区、内部核糖体进入位点(ires)及聚腺苷酸化信号位点以便导引表达载体上所携带的基因的有效转录。本文所述的载体还可含有编码用于选择含有此载体的细胞的标记物的多核苷酸。适合的标记物的实例包括编码对诸如安比西林(ampicillin)、氯微素(chloramphenicol)、康微素(kanamycin)或诺尔丝菌素(nourseothricin)的抗生素的抗性的基因。
[0200]
如本文所用，术语“vh”是指抗体的免疫球蛋白重链(包括fv、scfv或fab的重链)的可变区。提及“vl”是指免疫球蛋白轻链(包括fv、scfv、dsfv或fab的轻链)的可变区。抗体(ab)和免疫球蛋白(ig)为具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体对特定目标展现结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏靶特异性的其他抗体样分子两者。原生抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同轻(l)链和两个相同重(h)链构成。天然抗体的每条重链在氨基端具有可变域(vh)，之后为多个恒定域。原生抗体的每条轻链具有在氨基端处的可变域(vl)和在羧基端处的恒定域。
[0201]
3.2.基因定义
[0202]
如本文所用，“b8r”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码与γ干扰素(ifn
‑
γ)受体具有同源性的分泌蛋白的基因。由例示性b8r基因编码于痘苗病毒的copenhagen株中的蛋白质序列的非限制性实例给出于uniprotkb数据库条目p21004中且如下再现：
[0203][0204]
术语“b8r”还可包括上文所列的蛋白质或来自另一痘苗病毒病毒株的同源基因的片段或变体。变体包括(但不限于)与本文所公开的序列具有85％或更高同一性的那些序列。
[0205]
如本文所用，“b14r”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性b14r基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p20842中且如下再现：
[0206][0207]
如本文所用，“b15r”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性b15r基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21089中且如下再现：
[0208][0209]
如本文所用，“b16r”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码il
‑1‑
β抑制剂的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性b16r基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21116中且如下再现：
[0210][0211]
如本文所用，“b17l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性b17l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21075中且如下再现：
[0212][0213]
如本文所用，“b18r”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性b18r基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21076中且如下再现：
[0214][0215]
如本文所用，“b19r”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码ifn
‑
α
‑
β受体样分泌糖蛋白的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性b19r基因编码
的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21077中且如下再现：
[0216][0217]
如本文所用，“b20r”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性b20r基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21078中且如下再现：
[0218][0219]
如本文所用，“c1l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性c1l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21036中且如下再现：
[0220][0221]
如本文所用，“c2l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码影响与细胞外基质的非钙依赖性粘着的kelch样蛋白的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性c2l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21037中且如下再现：
[0222][0223]
如本文所用，“f1l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性f1l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p68450中且如下再现：
[0224][0225]
如本文所用，“f2l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码脱氧尿苷三磷酸酶(dutpase)的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性f2l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p68634中且如下再现：
[0226][0227]
如本文所用，“f3l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码为先天性免疫反应调节剂和毒力因子的kelch样蛋白的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性f3l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21013中且如下再现：
[0228][0229]
如本文所用，“k1l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码nf
‑
κb抑制剂的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性k1l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p20632中且如下再现：
[0230][0231]
如本文所用，“k2l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码防止细胞融合的丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性k2l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p20532中且如下再现：
[0232][0233]
如本文所用，“k3l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码防止pkr抑制剂的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性k3l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p20639中且如下再现：
[0234][0235]
如本文所用，“k4l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码dna修饰核酸酶(例如dna切口酶)的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性k4l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p20537中且如下再现：
[0236][0237]
如本文所用，“k5l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码推定单甘油酯脂肪酶的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性k5l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21084中且如下再现：
[0238][0239]
如本文所用，“k6l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码推定单甘油酯脂肪酶的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性k6l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p68465中且如下再现：
[0240][0241]
如本文所用，“k7r”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码nf
‑
κb和irf3的抑制剂的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性k7r基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p68467中且如下再现：
[0242][0243]
如本文所用，“m1l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性m1l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p20640中且如下再现：
[0244][0245]
如本文所用，“m2l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码nf
‑
κb及细胞凋亡的抑制剂的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性m2l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目q1pj18中且如下再现：
[0246][0247]
如本文所用，“n1l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码抑制nf
‑
κb和细胞凋亡的bcl
‑
2样蛋白的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性n1l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p21054中且如下再现：
[0248][0249]
如本文所用，“n2l”是指正痘病毒(例如痘苗，例如copenhagen)基因，诸如编码抑制irf3的抑制剂的基因。由痘苗病毒的copenhagen株中的例示性n2l基因编码的蛋白质序列的实例给出于uniprotkb数据库条目p20641中且如下再现：
[0250][0251]
本文所述的基因的编码序列(cds)的例示性copenhagen株核苷酸序列提供于下表42中。例示性野生型copenhagen株痘苗病毒基因组的核苷酸序列也提供于下表42中。另一例示性野生型copenhagen株痘苗病毒基因组为seq id no:590(如表42中所提供)，但具有
表46中鉴别的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或所有核苷酸多态性。在某些实施方案中，本文所述的基因的cds具有除表46中鉴别的1、2、3或更多核苷酸多态性以外与表42中所提供的核苷酸序列相同的核苷酸序列。
4.附图说明
[0252]
图1示出了包括正痘病毒病毒株的59个痘病毒株的系统发育分析。
[0253]
图2示出了不同病毒株在不同肿瘤类型中传代5个痘苗病毒之后的丰度。
[0254]
图3示出了野生型痘苗病毒株在各种不同患者肿瘤核心中复制的能力。
[0255]
图4示出了不同野生型痘苗病毒株的空斑大小测量值。
[0256]
图5示出了5p缺失(copmd5p)和3p缺失(copmd3p)的基因组结构。copmd5p与copmd3p两者交叉以产生copmd5p3p。
[0257]
图6示出了热图，其显示用各种剂量的copenhagen或copmd5p3p感染后的癌细胞死亡。
[0258]
图7示出了在4种不同癌细胞系中copenhagen和copmd5p3p复制的生长曲线。
[0259]
图8示出了copenhagen和copmd5p3p在患者离体样本中复制的能力，如通过滴定所示。
[0260]
图9示出了修饰的copmd5p3p病毒形成与亲本病毒不同的空斑。copmd5p3p空斑在中间清晰得多，具有可见的合胞体(细胞融合)。
[0261]
图10示出了在786
‑
o细胞中copmd5p3p诱导合胞体(细胞融合)。
[0262]
图11示出了copmd5p3p能够类似于copenhagen野生型控制肿瘤生长，但不造成体重减轻。
[0263]
图12示出了相较于含有胸苷激酶的溶瘤基因敲除的两个其他痘苗病毒株(copenhagen和wyeth)，copmd5p3p不引起痘病变形成。
[0264]
图13示出了痘苗在cd
‑
1裸小鼠中全身性施用之后的ivis生物分布。编码荧光素酶的copmd5p3p(tk ko)为肿瘤特异性的并且在脱靶组织中不复制。
[0265]
图14示出了痘苗在全身性施用之后的生物分布。copmd5p3p类似于其他溶瘤痘苗在肿瘤中复制，但在脱靶组织/器官中复制得更少。
[0266]
图15示出了痘苗在人pbmc中的免疫原性。copmd5p3p诱导人先天性免疫细胞活化的能力比野生型copenhagen强。
[0267]
图16示出了痘苗在小鼠脾细胞中的免疫原性。copmd5p3p诱导小鼠先天性免疫细胞活化的能力比copenhagen强。
[0268]
图17示出了痘苗在人细胞中的免疫原性。copmd5p3p活化nf
‑
kb免疫转录因子的能力比copenhagen或vvdd强，但类似于mg
‑
1。
[0269]
图18示出了侵袭性黑色素瘤模型(c57bl6小鼠中的b16
‑
f10同基因型黑色素瘤模型)中与免疫检查点抑制剂抗ctla
‑
4抗体的协同作用。通过用痘苗和免疫检查点抑制剂抗ctla
‑
4抗体处理的免疫感受态鼠类模型中的生存率来测量体内功效。
[0270]
图19示出了与免疫检查点抑制剂抗ctla
‑
4抗体的协同作用。通过用痘苗和免疫检查点抑制剂抗ctla
‑
4抗体处理的免疫感受态鼠类模型中的肿瘤生长(顶端行)和生存率(底端行)来测量体内功效。将copmd5p3p(左列)与溶瘤copenhagentk ko(右列)进行比较。
[0271]
图20示出了与免疫检查点抑制剂抗pd1抗体的协同作用。通过用痘苗及免疫检查点抑制剂抗pd1抗体处理的免疫感受态鼠类模型中的肿瘤生长(顶端行)和生存率(底端行)来测量体内功效。将copmd5p3p(左列)与溶瘤copenhagentk ko(右列)进行比较。
[0272]
图21示出了与免疫检查点抑制剂抗pd1抗体和抗ctla
‑
4抗体的协同作用。通过用痘苗及免疫检查点抑制剂抗pd1抗体和抗ctla
‑
4抗体处理的免疫感受态鼠类模型中的肿瘤生长(顶端行)和生存率(底端行)来测量体内功效。将copmd5p3p(左列)与溶瘤copenhagentk ko(右列)进行比较。
[0273]
图22示出了用于产生含有5'(“5p”)主要缺失基因座(左)和3'(“3p”)主要缺失基因座(右)的修饰的痘病毒载体(例如修饰的痘苗病毒载体，诸如修饰的copenhagen痘苗病毒载体)的流程。5p靶向构建体是由c2l的1kb同源区、接着的表达转基因的egfp和f3l的1kb同源区构成。3p靶向构建体是由b14r的729bp同源区、接着的表达转基因的mcherry及b29r的415bp同源区构成。
[0274]
图23示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子在各种细胞系中增殖的能力。
[0275]
图24示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子对各种细胞系的细胞毒性效应，如由结晶紫(上图)和alamar blue测定(下图)评定。针对各细胞系沿下图中所示的图表的x轴列举的病毒株的顺序如下：从左至右为copmd5p、copmd5p3p、copmd3p及copwt(野生型copenhagen痘苗病毒株)。
[0276]
图25示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子在施用于小鼠后的分布。
[0277]
图26示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子激活自然杀伤(nk)细胞及促进抗肿瘤免疫的能力。
[0278]
图27示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子增强针对ht29细胞的nk细胞介导的脱粒(一种nk细胞活性和抗肿瘤免疫的量度)的能力。
[0279]
图28示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子引发t细胞起始抗肿瘤免疫反应的能力。
[0280]
图29示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子扩散至距感染起始点较远位置的能力。
[0281]
图30示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子形成空斑(一种病毒增殖的量度)的能力。
[0282]
图31示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子在u2os细胞中形成空斑的能力。
[0283]
图32示出了野生型copenhagen痘苗病毒及若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子在786
‑
o细胞中形成空斑的能力。
[0284]
图33示出了各种痘病毒基因组中在copmd5p3p中缺失的基因的百分比。
[0285]
图34示出了skv
‑
b8r+病毒对正常细胞系与癌细胞系的感染。
[0286]
图35示出了skv
‑
b8r+不削弱干扰素信号传导。
[0287]
图36示出了针对flt3
‑
lg和il
‑
12
‑
tm转基因的b8r重组靶向策略。
[0288]
图37示出了skv(copmd5p3p
‑
b8r
‑
)与skv
‑
b8r+相比在肿瘤控制方面具有类似功
效。
[0289]
图38示出了描绘skv
‑
123v2溶瘤平台相较于基础野生型copenhagen痘苗病毒基因组的基因组构造的线性示意草图。frt为翻转酶(flippase)的识别位点。
[0290]
图39示出了被工程改造以表达2种免疫治疗转基因和抗体的skv。
[0291]
图40示出了被工程改造以表达2种免疫治疗转基因和抗体的skv。
[0292]
图41示出了针对表达转基因的各种skv病毒定量的hil
‑
12产生。
[0293]
图42示出了对用skv
‑
123、skv
‑
3和对照skv
‑
egfp病毒感染(moi 0.1，感染后24小时)的活vero细胞的il
‑
12p35(il
‑
12)细胞表面免疫染色。
[0294]
图43示出了表达膜结合的鼠类il
‑
12p35的skv在控制鼠类肿瘤方面具有更大功效。
[0295]
图44示出了在各种痘苗病毒株中被工程改造的大部分双重缺失增强体外癌细胞杀灭。
[0296]
图45示出了用各种痘苗病毒株感染的hela细胞的表型表征。
[0297]
图46示出了5p3p痘苗病毒株相较于野生型病毒株并未诱发体重减轻。示出了小鼠身体质量测量值。经由静脉内尾部静脉注射用1
×
107pfu(颗粒形成单位)处理cd
‑
1裸小鼠，且在指定时间点进行测量。
[0298]
图47示出了5p3p痘苗病毒株相较于野生型病毒株并未诱发痘病变。展示痘病变的存在的评定。经由静脉内尾部静脉注射用1
×
107pfu指定痘苗病毒株处理cd
‑
1裸小鼠。注射后6天检查小鼠的痘病变。
[0299]
图48a至图48h示出了用0.05ml skv(痘苗病毒)(剂量：1
×
107pfu)处理的八个异种移植小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积和生存曲线。图48a示出了miapaca
‑
2异种移植小鼠模型的结果。图48b示出了pc
‑
3异种移植小鼠模型的结果。图48c示出了u87mg异种移植模型的结果。图48d示出了uacc
‑
62异种移植模型的结果。图48e示出了um
‑
uc
‑
3异种移植小鼠模型的结果。图48f示出了colo
‑
205异种移植小鼠模型的结果。图48g示出了nci
‑
h460异种移植小鼠模型的结果。图48h示出了ht29异种移植模型的结果。
[0300]
图49示出了mc
‑
38肿瘤用编码活性转基因的skv处理的表达人ctla
‑
4的转基因c57/bl6小鼠模型中随时间推移的平均肿瘤体积和生存曲线。随后将动物随机分为5个处理组，且随后用pbs、pbs伊匹单抗(ipilimumab)、skv、抗pd
‑
1抗体、skv
‑
12m3v2
‑
egfp或skv
‑
12m3v2
‑
egfp加抗pd
‑
1抗体处理。skv
‑
12m3v2
‑
egfp为表达人抗ctla
‑
4抗体、人flt3配体及小鼠il
‑
12tm p35的skv。
[0301]
图50示出了图49中所示的实验的个别肿瘤体积。
[0302]
图51示出了用膜结合小鼠il
‑
12p35或膜结合小鼠il
‑
12p70处理的mc
‑
38小鼠模型中随时间推移的平均肿瘤体积。
[0303]
图52示出了使用病毒(编码ova抗原的skvb
8r+tk
‑
)的异源初免
‑
加强溶瘤疫苗方案的结果。
[0304]
图53a至图53f示出了flt3
‑
l和抗ctla
‑
4抗体在移植ct26肿瘤细胞且it或iv施用skv
‑
123v2的balb/c小鼠的血清和组织中的生物分布。
[0305]
图54a至图54d示出了il
‑
12
‑
tm在移植ct26肿瘤细胞且it或iv施用skv
‑
123v2的balb/c小鼠的血清和组织中的生物分布。
[0306]
图55示出了未处理或用skv
‑
123v2处理的ngs小鼠中的肿瘤体积。
[0307]
图56示出了用skv
‑
123v2病毒感染的癌细胞(顶部图)和正常细胞(底部图)的alamar blue活力动力学。
[0308]
图57示出了用skv
‑
123v2病毒感染的癌细胞(786
‑
o，hela)和正常细胞(pbmc，prec)中的病毒复制生长曲线。
[0309]
图58示出了用skv
‑
123v2病毒感染的癌细胞(786
‑
o，hela)和正常细胞(pbmc，prec)中的抗ctla
‑
4抗体表达量。
[0310]
图59示出了用skv
‑
123v2病毒感染的癌细胞(786
‑
o，hela)和正常细胞(pbmc，prec)中的flt3l表达量。
[0311]
图60示出了用于将转基因插入痘苗病毒基因组中的靶向构建体的设计。构建体可为扩增的pcr产物或细菌质粒的部分。转基因的数目以及其取向是灵活的。转基因的顺序和荧光标记物是灵活的。
5.具体实施方式
[0312]
本发明的特征在于基因修饰的正痘病毒，诸如痘苗病毒(例如copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
‑
1、修饰的安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia ankara；mva)、dairen i、glv
‑
1h68、ihd
‑
j、l
‑
ivp、lc16m8、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
‑
1病毒)，以及其用于治疗各种癌症的用途。本发明是部分基于以下发现：当正痘病毒(诸如copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
‑
1、修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)、dairen i、glv
‑
1h68、ihd
‑
j、l
‑
ivp、lc16m8、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
‑
1病毒)被工程改造以在以下中的一个或多个或全部中含有缺失时，所述病毒展现明显改善的溶瘤活性、肿瘤中的复制、感染性、免疫逃避、肿瘤持久性、掺入外源性dna序列的能力及对大规模制造的适应性：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、k orf a、k orf b、b orf e、b orf f和b orf g基因，以及b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r itr的拷贝。在本发明的各种实施方案中，修饰的正痘病毒含有b8r基因的缺失。虽然在小鼠中无活性，但b8r基因抵消人ifn
‑
γ的抗病毒活性。在各种实施方案中，随后经由同源重组靶向策略将至少一个转基因插入到b8r基因(现缺失)的基因座中。在各种实施方案中，修饰的正痘病毒表达三个转基因中的至少一个：il
‑
12
‑
tm、flt3
‑
l及抗clta4抗体。如本文所用，flt3l、flt
‑
3配体、flt3lg、flt3
‑
lg、flt3
‑
l为同义词且均是指fms样酪氨酸激酶3配体。
[0313]
本文所述的正痘病毒可向诸如哺乳动物患者(例如人患者)的患者施用，以治疗多种细胞增殖病症，包括广泛多种癌症。以下章节描述正痘病毒及其基因修饰，以及产生和繁殖基因修饰的正痘病毒的方法及将其向患者施用的技术。
[0314]
5.1.痘病毒
[0315]
一般来说，痘病毒病毒颗粒是卵形或块状的，长度经测量为约200至400nm。外表面以平行列成脊状，有时成螺旋形排列。此类颗粒极其复杂，含有超过100种不同蛋白质。细胞外形式含有两个膜(eev：细胞外包膜病毒粒子)，而细胞内颗粒仅具有一个内部膜(imv：细胞内成熟病毒粒子)。外表面由包围核心的脂质和蛋白质构成，该核心由紧密压缩的核蛋白
构成。在抗原性方面，痘病毒也十分复杂，诱导特异性和交叉反应抗体两者。颗粒中存在至少十种酶，主要与核酸代谢/基因组复制有关。
[0316]
野生型痘病毒的基因组为130至300kbp的线性双股dna。基因组的末端具有含有若干串列重复序列的末端发夹环。已对若干痘病毒基因组测序，大部分必需基因位于基因组的中心部分中，而非必需基因位于末端处。痘病毒基因组中存在约250个基因。当病毒足够复杂以获得基因组复制所需的所有功能时，复制发生于细胞质中。细胞具有一定贡献，但此贡献的性质尚不清楚。然而，即使痘病毒基因表达及基因组复制无核细胞中，仍会阻碍成熟，指示细胞具有一定作用。
[0317]
一旦进入细胞质中，基因表达通过与核心相关的病毒酶进行。表达划分成2个阶段：代表约50％基因组且在基因组复制之前表达的早期基因，及在基因组复制之后表达的晚期基因。表达的时间控制由晚期启动子提供，其取决于针对活性的dna复制。认为基因组复制涉及自引发，使得形成随后被裂解及修复以形成病毒基因组的高分子量串联体。病毒组装发生于细胞骨架中且可能涉及与细胞骨架蛋白(例如肌动蛋白结合蛋白)的相互作用。包涵体形成于细胞质中，从而成熟形成病毒颗粒。细胞至细胞扩散可提供用于感染扩散的替代性机制。总体而言，此大型复杂病毒的复制相当快速，平均仅花费12小时。至少九个不同痘病毒引起人的疾病，但天花病毒和痘苗最为人知。痘苗病毒株经划分成重型天花(25至30％死亡)和轻型天花(症状相同但死亡率小于1％)。两种病毒的感染是通过呼吸道途径自然发生且为全身性的，从而产生各种症状，但最值得注意的是天花特征性脓包和皮肤瘢痕。
[0318]
5.2.正痘病毒
[0319]
5.2.1.痘苗病毒
[0320]
痘苗病毒为痘病毒或痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxyirinae subfamily)及正痘病毒属的成员。正痘病毒相比脊椎动物亚科的其他成员相对更同质且包括11种不同但紧密相关的物种，其包括痘苗病毒、天花病毒(天花的病原体)、牛痘病毒、水牛痘病毒(buffalopox virus)、猴痘病毒、鼠痘病毒及马痘病毒物种以及其他物种(参见moss,1996)。
[0321]
痘苗病毒为具有约190kb的线性双股dna基因组且编码大约250个基因的大型复杂包膜病毒。痘苗因其用作根除天花的疫苗而为人熟知。根除天花后，科学家一直探究痘苗作为将基因递送至生物组织中(基因疗法及基因工程改造)的工具的用途。痘苗病毒在dna病毒中为独特的，因为其仅在宿主细胞的细胞质中复制。因此，需要较大基因组来编码病毒dna复制所需的各种酶和蛋白质。在复制期间，痘苗产生若干种不同之处在于其外部膜的感染性形式：细胞内成熟病毒粒子(imv)、细胞内包膜病毒粒子(iev)、细胞缔合的包膜病毒粒子(cev)及细胞外包膜病毒粒子(eev)。imv为最大量的感染性形式且被认为负责宿主之间的扩散。另一方面，认为cev在细胞至细胞扩散中起作用，且认为eev对于宿主生物体内的远程播散至关重要。
[0322]
痘苗病毒与引起牛痘的病毒密切相关。痘苗的精确来源未知，但最常见观点为痘苗病毒、牛痘病毒及天花病毒(天花的病原体)皆来源于共同的上代病毒。还推测痘苗病毒最初是从马中分离的。痘苗病毒感染为轻度的且在健康个体中通常无症状，但其可引起轻度皮疹和发热，死亡率极低。针对痘苗病毒感染产生的免疫反应保护人免受致死性天花感染影响。因此，痘苗病毒是用作针对天花的活病毒疫苗。痘苗病毒疫苗是安全的，因为其不
含有天花病毒，但偶尔可能出现某些并发症和/或疫苗副作用，尤其在疫苗用于免疫功能降低者时。
[0323]
痘苗病毒的例示性病毒株包括(但不限于)copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
‑
1、修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)、dairen i、glv
‑
1h68、ihd
‑
j、l
‑
ivp、lc16m8、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
‑
1。
[0324]
5.2.2.胸苷激酶突变体和血凝素突变体
[0325]
若干将痘苗病毒作为溶瘤病毒进行测试的当前临床研究具有病毒性胸苷激酶(tk)基因中的缺失。此缺失使病毒衰减，从而使病毒依赖于用于dna复制的细胞胸苷激酶的活性且因此引起病毒繁殖。细胞胸苷激酶以较低量表达于大部分正常组织中且以较高量表达于许多癌细胞中。经由代谢靶向，tk病毒可在具有高代谢速率的细胞(例如健康细胞或肿瘤细胞)中生长且在具有低含量的胸苷激酶的细胞中将不良地生长。由于存在静息肿瘤细胞(例如癌症干细胞)，tk病毒杀灭此癌细胞群体的能力很可能受损，正如化学疗法在很大程度上无效。在一些实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体保留病毒合成机制(包括tk)且可在静息癌细胞中繁殖。在此类实施方案中，本公开的病毒修饰可允许病毒具有高选择性而不缺失tk或其他dna代谢酶(例如核糖核苷酸还原酶)且在具有低代谢速率的肿瘤中可更有效。在一些实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体包含功能性tk基因(例如，野生型tk基因)。在其他实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体包含tk基因中的缺失或功能损失型突变。
[0326]
类似地，痘苗病毒的血凝素(ha)基因的不活化会使得病毒衰减。在一些实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体包含功能性ha基因(例如，野生型ha基因)。在其他实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体包含ha基因中的缺失或功能损失型突变。
[0327]
在一个特定实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体包含功能性tk基因(例如，野生型tk基因)和功能性ha基因(例如，野生型ha基因)。在另一特定实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体包含功能性tk基因(例如，野生型tk基因)及ha基因中的缺失或功能损失型突变。在另一特定实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体包含tk基因中的缺失或功能损失型突变及功能性ha基因(例如，野生型ha基因)。在另一特定实施方案中，本公开中描述的修饰的病毒载体包含tk基因中的缺失或功能损失型突变及ha基因中的缺失或功能损失型突变。
[0328]
5.2.3.重组正痘病毒基因组
[0329]
一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'反向末端重复序列(itr)中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；及(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[0330]
在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施
方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0331]
在一些实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0332]
在优选实施方案中，本公开中侧接核苷酸序列的内源基因(即，核苷酸序列的侧接内源基因)为最接近核苷酸序列的两个内源基因(一个在核苷酸序列的上游且另一个在下游)。内源基因可为部分基因或全长基因。
[0333]
在特定实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段包含伊匹单抗的6个互补决定区(cdr)。在特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[0334]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及(d)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。在特定实施方案中，核酸进一步包含b8r基因中的缺失。
[0335]
在某些实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0336]
在一些实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，侧接内源性痘苗病
毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0337]
在特定实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段包含伊匹单抗的6个互补决定区(cdr)。在特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[0338]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；及(c)第二转基因，其包含编码白介素12(il
‑
12)多肽的第二核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[0339]
在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0340]
在一些实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0341]
在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、il
‑
12p40(例如人il
‑
12p40)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的且包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)，以及跨膜结构域和细胞质结构域(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l的跨膜结构域和细胞质结构域)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方
案中，第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[0342]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及(d)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。在特定实施方案中，核酸进一步包含b8r基因中的缺失。
[0343]
在某些实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在一个特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0344]
在一些实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0345]
在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、il
‑
12p40(例如人il
‑
12p40)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的且包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)，以及跨膜结构域和细胞质结构域(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l的跨膜结构域和细胞质结构域)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[0346]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；及(c)第三转基因，其包含编码fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[0347]
在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操
作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0348]
在一些实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0349]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0350]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0351]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0352]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0353]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0354]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9
或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0355]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0356]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0357]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构
域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0358]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0359]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；及(d)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。在特定实施方案中，核酸进一步包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0360]
在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0361]
在一些实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0362]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定
实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域及细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0363]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0364]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0365]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细
胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0366]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0367]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0368]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0369]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、
细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0370]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0371]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0372]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[0373]
在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0374]
在某些实施方案中，所述核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于
第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0375]
在一些实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0376]
在特定实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段包含伊匹单抗的6个互补决定区(cdr)。在特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[0377]
在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、il
‑
12p40(例如人il
‑
12p40)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的且包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)，以及跨膜结构域和细胞质结构域(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l的跨膜结构
域和细胞质结构域)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[0378]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；和/或(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。在特定实施方案中，核酸进一步包含b8r基因中的缺失。
[0379]
在某些实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0380]
在某些实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在一个特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0381]
在一些实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性
痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0382]
在特定实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段包含伊匹单抗的6个互补决定区(cdr)。在特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[0383]
在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、il
‑
12p40(例如人il
‑
12p40)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的且包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)，以及跨膜结构域和细胞质结构域(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l的跨膜结构域和细胞质结构域)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[0384]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[0385]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0386]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特
定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0387]
在一些实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0388]
在特定实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段包含伊匹单抗的6个互补决定区(cdr)。在特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[0389]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸
序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0390]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0391]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0392]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0393]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9
或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0394]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0395]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0396]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、
17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0397]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0398]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0399]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；和/或(ii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子。在特定实施方案中，核酸进一步包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0400]
在某些实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0401]
在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0402]
在一些实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0403]
在特定实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段包含伊匹单抗的6个互补决定区(cdr)。在特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[0404]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举
例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0405]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0406]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0407]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0408]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少
25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0409]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0410]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0411]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸
序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0412]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0413]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0414]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[0415]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0416]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r
启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0417]
在一些实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0418]
在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、il
‑
12p40(例如人il
‑
12p40)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的且包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)，以及跨膜结构域和细胞质结构域(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l的跨膜结构域和细胞质结构域)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序
列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[0419]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域及细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0420]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0421]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0422]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨
基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0423]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0424]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0425]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至
20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0426]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0427]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0428]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0429]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于所述第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子；和/或(ii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子。在特定实施方案中，核酸进一步包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子
包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0430]
在某些实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在一个特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0431]
在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0432]
在一些实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内
源性痘苗基因为b13r基因。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、il
‑
12p40(例如人il
‑
12p40)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的且包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)，以及跨膜结构域和细胞质结构域(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l的跨膜结构域和细胞质结构域)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[0433]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域及细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0434]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0435]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中
所列的flt3l序列。
[0436]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0437]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0438]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0439]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少
85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0440]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0441]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0442]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0443]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及(e)第三转基因，其包含编
码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[0444]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0445]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0446]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0447]
在一些实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧
接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0448]
在特定实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段包含伊匹单抗的6个互补决定区(cdr)。在特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[0449]
在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、il
‑
12p40(例如人il
‑
12p40)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的且包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)，以及跨膜结构域和细胞质结构域(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l的跨膜结构域和细胞质结构域)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[0450]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例
如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0451]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0452]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0453]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0454]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％
或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0455]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0456]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0457]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、
13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0458]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0459]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0460]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列,其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子；和/或(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子。在特定实施方案中，核酸进一步包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实
施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0461]
在某些实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0462]
在某些实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在一个特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0463]
在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在某些实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0464]
在一些实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒
基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。
[0465]
在特定实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段包含伊匹单抗的6个互补决定区(cdr)。在特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。在特定实施方案中，第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[0466]
在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、il
‑
12p40(例如人il
‑
12p40)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽为膜结合的且包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)或il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)，以及跨膜结构域和细胞质结构域(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l的跨膜结构域和细胞质结构域)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。在特定实施方案中，第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[0467]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细
胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域及细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0468]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0469]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0470]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0471]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0472]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、
细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0473]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0474]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0475]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14
或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0476]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0477]
在一个特定实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在又一特定实施方案中，第三转基因在第二转基因的上游。
[0478]
在本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，b8r基因中的缺失为至少30％的b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少40％的b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少50％的b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少60％的b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少70％的b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少80％的b8r基因序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为30％至90％、30％至85％、40％至90％、40％至85％、50％至90％、50％至85％、60％至90％、60％至85％、70％至90％、70％至85％、75％至90％、75％至85％或80％至85％的b8r基因序列的缺失。在一个特定实施方案中，b8r基因中的缺失为约75％的b8r基因序列的缺失。在另一特定实施方案中，b8r基因中的缺失为约80％的b8r基因序列的缺失。在另一特定实施方案中，b8r基因中的缺失为约82％的b8r基因序列的缺失。
[0479]
举例来说，在一些实施方案中，b8r基因中的缺失为至少30％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少40％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少50％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少60％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少70％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少80％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为30％至90％、30％至85％、40％至90％、40％至85％、50％至90％、50％至85％、60％至90％、60％至85％、70％至90％、70％至85％、75％至90％、75％至85％或80％至85％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少75％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在另一特定实施方案中，b8r基因中的缺失为约80％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。在另一特定实施方案中，b8r基因中的缺失为约82％的seq id no:591核苷酸序列的缺失。
[0480]
在另一实例中，在一些实施方案中，b8r基因中的缺失为至少30％核苷酸序列acaacaccatgagatatattataattctcgcagttttgttcattaatagtatacacgctaaaataactagttataagtt
tgaatccgtcaattttgattccaaaattgaatggactggggatggtctatacaatatatcccttaaaaattatggcatcaagacgtggcaaacaatgtatacaaatgtaccagaaggaacatacgacatatccgcatttccaaagaatgatttcgtatctttctgggttaaatttgaacaaggcgattataaagtggaagagtattgtacgggactatgcgtcgaagtaaaaattggaccaccgactgtaacattgactgaatacgacgaccatatcaatttgtacatcgagcatccgtatgctactagaggtagcaaaaagattcctatttacaaacgcggtgacatgtgtgatatctacttgttgtatacggctaacttcacattcggagattctgaagaaccagtaacatatgatatcgatgactacgattgcacgtctacaggttgcagcatagactttgccacaacagaaaaagtgtgcgtgacagcacagggagccacagaagggtttctcgaaaaaattactccatggagttcggaagtatgtctgacacctaaaaagaatgtatatacatgtgcaattagatccaaagaagatgttcccaatttcaaggacaaaatggccagagttatcaagagaaaatttaataaacagtctcaatcttatttaactaaatttctcggtagcacatcaaatgatgttaccacttttcttagcatgcttaacttgactaaatattcataa(seq id no:550)的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少40％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少50％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少60％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少70％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为至少80％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。在其他实施方案中，b8r基因中的缺失为30％至90％、30％至85％、40％至90％、40％至85％、50％至90％、50％至85％、60％至90％、60％至85％、70％至90％、70％至85％、75％至90％、75％至85％或80％至85％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。在一个特定实施方案中，b8r基因中的缺失为至少75％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。在另一特定实施方案中，b8r基因中的缺失为约80％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。在另一特定实施方案中，b8r基因中的缺失为约82％的seq id no:550核苷酸序列的缺失。
[0481]
在某些实施方案中，b8r基因中的缺失不干扰痘苗基因组的b9r基因的功能。在某些实施方案中，b8r基因中的缺失不干扰b9r基因的表达。在某些实施方案中，b8r基因中的缺失不会移除b9r基因的启动子。在某些实施方案中，b8r基因中的缺失不会移除b9r基因的转录调控序列。在一个特定实施方案中，在缺失之后保留的b8r基因的唯一序列为适当b9r功能和/或表达所需的序列。在一个特定实施方案中，b8r基因中的缺失不会移除包含aaaatttaataaaca(seq id no:551)的核苷酸序列。在另一特定实施方案中，b8r基因中的缺失不会移除核苷酸序列aaaatttaataaaca(seq id no:551)。在一个特定实施方案中，保留的b8r基因的唯一序列为核苷酸序列gatgttcccaatttcaaggacaaaatggccagagttatcaagagaaaatttaataaacagtctcaatcttatttaactaaatttctcggtagcacatcaaatgatgttaccacttttcttagcatgcttaacttgactaaatattcataa(seq id no:552)。
[0482]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，重组痘苗病毒基因组来源于copenhagen株痘苗病毒的基因组。在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，重组痘苗病毒基因组来源于genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)。在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)。
[0483]
在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种核苷酸多态性。在本文所提供的实施方
案和方面的一些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的1至3、1至5、2至4、2至5、1至9、2至8、4至8、6至8、1至9、2至9、4至9、6至9、7至9、1至10、2至10、5至10或8至10种核苷酸多态性。在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种核苷酸多态性。在本文所提供的实施方案和方面的一些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的11至20、12至15、15至20或18至20种核苷酸多态性。在本文所提供的实施方案和方面的某些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的1至20、1至15、5至20或10至20种核苷酸多态性。在本文所提供的一些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的所有核苷酸多态性。在某些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在一些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在某些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在一些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r以及以下基因于3'反向末端重复序列(itr)中的缺失：b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。
[0484]
在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的为同义变体的1、2、3或4种核苷酸多态性。在本文所提供的实施方案和方面的一些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的不在蛋白质编码区中的1、2、3、4、5、6或7种核苷酸多态性。在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的引起氨基酸
序列改变的1、2、3、4、5、6或7种核苷酸多态性在本文所提供的实施方案和方面的一些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的引起框移的1或2种核苷酸多态性。在某些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在一些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在某些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在一些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r以及以下基因于3'反向末端重复序列(itr)中的缺失：b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。
[0485]
在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的1、2、3、4、5、6或7个基因中发现的核苷酸多态性。在本文所提供的一些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的8、9、10、11、12、12或13个基因中发现的核苷酸多态性。在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的所有基因中发现的核苷酸多态性。在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中鉴别的1至5、5至10、1至13、5至13或10至13个基因中发现的核苷酸多态性。在某些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在一些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个缺失以及本文所述
的一个、两个或三个转基因的插入。在某些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在一些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r以及以下基因于3'反向末端重复序列(itr)中的缺失：b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。
[0486]
在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中针对痘苗基因c14l、c2l、c1l、n2l、f3l、f13l、f16l、g7l、l3l、j3r、d6r、a41l或a46r鉴别的核苷酸多态性。在本文所提供的一些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中针对痘苗基因c14l、c2l、c1l、n2l、f3l、f13l、f16l、g7l、l3l、j3r、d6r、a41l及a46r鉴别的核苷酸多态性。在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中针对以下痘苗基因中的1、2、3、4、5、6或7个鉴别的核苷酸多态性：c14l、c2l、c1l、n2l、f3l、f13l、f16l、g7l、l3l、j3r、d6r、a41l或a46r。在本文所提供的某些实施方案和方面中，重组痘苗病毒基因组包含与genbank登录号m35027.1的核苷酸序列(seq id no:590)相同的核苷酸序列，例外之处在于所述核苷酸序列包含表46中针对以下痘苗基因中的8、9、10、11、12或13个鉴别的核苷酸多态性：c14l、c2l、c1l、n2l、f3l、f13l、f16l、g7l、l3l、j3r、d6r、a41l及a46r。在某些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在一些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在某些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含本文中鉴别的痘苗病毒基因(例如c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r)中的21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个缺失以及本文所述的一个、两个或三个转基因的插入。在一些此类实施方案中，重组痘苗病毒基因组可被工程改造以包含c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r以及以下基因于3'反向末端重复序列(itr)中的缺失：b19r及b20r、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；以及本文所述的一个、
两个或三个转基因的插入。
[0487]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含seq id no:210的核苷酸序列。在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含除表46中鉴别的1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种核苷酸多态性以外与seq id no:210的核苷酸序列相同的核苷酸序列。
[0488]
在某些实施方案中，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列；及(b)以下中的一个、两个或三个：(i)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列(例如，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的核苷酸序列)；(ii)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列(例如，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的核苷酸序列)；及(iii)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列(例如，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的核苷酸序列)。
[0489]
在某些实施方案中，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列；及(b)以下中的两个或三个：(i)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列(例如，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的核苷酸序列)；(ii)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列(例如，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的核苷酸序列)；及(iii)第三转基因，其包含编码flt3l中第三核苷酸序列(例如，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的核苷酸序列)。
[0490]
在某些实施方案中，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列；及(b)：(i)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列(例如，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的核苷酸序列)；(ii)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列(例如，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的核苷酸序列)；及(iii)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列(例如，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的核苷酸序列)。
[0491]
在其中核酸包含第一转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的h5r启动子。在其中核酸包含第二转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的晚期启动子，其中所述晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在其中核酸包含第三转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的b8r启动子。在其中核酸包含第三转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的b19r启动子。在其中核酸包含第三转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的b8r启动子和b19r启动子。在以上中的特定实施方案中，侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因具有相同取向，且第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在以上中的特定实施方案中，侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因具有相同取
向，且第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在以上中的特定实施方案中，侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因具有相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在以上中的特定实施方案中，核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因，且第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0492]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含seq id no:624的核苷酸序列。在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含除表46中鉴别的1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种核苷酸多态性以外与seq id no:624的核苷酸序列相同的核苷酸序列。
[0493]
在某些实施方案中，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:624的痘苗病毒核苷酸序列；及(b)以下中的一个、两个或三个：(i)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列(例如，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的核苷酸序列)；(ii)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列(例如，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的核苷酸序列)；及(iii)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列(例如，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的核苷酸序列)。在特定实施方案中，核酸进一步包含诸如本文所描述可操作地连接于第一核苷酸序列的启动子、诸如本文所描述可操作地连接于第二核苷酸序列的启动子或诸如本文所描述可操作地连接于第三启动子的启动子。在特定实施方案中，核酸进一步包含诸如本文所描述可操作地连接于第一核苷酸序列的启动子、诸如本文所描述可操作地连接于第二核苷酸序列的启动子及诸如本文所描述可操作地连接于第三启动子的启动子。在特定实施方案中，第一转基因、第二转基因和/或第三转基因插入到本文所述的一个或多个基因座中。
[0494]
在某些实施方案中，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:624的痘苗病毒核苷酸序列；及(b)以下中的两个或三个：(i)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列(例如，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的核苷酸序列)；(ii)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列(例如，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的核苷酸序列)；及(iii)第三转基因，其包含编码flt3l中第三核苷酸序列(例如，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的核苷酸序列)。在特定实施方案中，核酸进一步包含诸如本文所描述可操作地连接于第一核苷酸序列的启动子、诸如本文所描述可操作地连接于第二核苷酸序列的启动子或诸如本文所描述可操作地连接于第三启动子的启动子。在特定实施方案中，两个或三个转基因插入到本文所述的一个或多个基因座中。
[0495]
在某些实施方案中，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:624的痘苗病毒核苷酸序列；及(b)：(i)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列(例如，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的核苷酸序列)；(ii)第二转基
因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列(例如，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的核苷酸序列)；及(iii)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列(例如，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的核苷酸序列)。在特定实施方案中，核酸进一步包含诸如本文所描述可操作地连接于第一核苷酸序列的启动子、诸如本文所描述可操作地连接于第二核苷酸序列的启动子或诸如本文所描述可操作地连接于第三启动子的启动子。在特定实施方案中，核酸进一步包含诸如本文所描述可操作地连接于第一核苷酸序列的启动子、诸如本文所描述可操作地连接于第二核苷酸序列的启动子及诸如本文所描述可操作地连接于第三启动子的启动子。在特定实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入到本文所述的一个或多个基因座中。
[0496]
在其中核酸包含第一转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的h5r启动子。在其中核酸包含第二转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的晚期启动子，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在其中核酸包含第三转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的b8r启动子。在其中核酸包含第三转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的b19r启动子。在其中核酸包含第三转基因的以上特定实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的b8r启动子和b19r启动子。在以上中的特定实施方案中，侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因具有相同取向，且第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在以上中的特定实施方案中，侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因具有相同取向，且第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在以上中的特定实施方案中，侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因具有相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在特定实施方案中，核酸进一步包含b8r基因中的缺失。在以上中的一个特定实施方案中，核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因，且进一步包含b8r基因中的缺失，且第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0497]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动
子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在特定实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在特定实施方案中，第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在特定实施方案中，第三转基因在第二转基因的上游。在特定实施方案中，第三转基因在第二转基因的下游。在一个特定实施方案中，核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0498]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0499]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中
的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0500]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0501]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；且其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含b8r基因中的缺失。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0502]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列列举于seq id no:214中；(c)第二转基因，其包含编码白介素12(il
‑
12)多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于阐述于中seq id no:215中；及(d)第三转基因，其包含编码fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0503]
在一些实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第一核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第一核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基
因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第一核苷酸序列与邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第一核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第二核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第二核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第二核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第二核苷酸序列与邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第二核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在一些实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列与侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相同取向时，第三核苷酸序列相对于侧接内源性痘苗病毒基因呈相反取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的5'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在其他实施方案中，当第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因具有相对取向时，第三核苷酸序列与更靠近重组痘苗病毒基因组的3'端的侧接内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c2l和f3l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为c3l和f4l基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b14r和b29r基因。在另一特定实施方案中，第三核苷酸序列的侧接内源性痘苗病毒基因为b13r和b29r基因。在又一实施方案中，第三核苷酸序列与邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因呈相同取向。在一个特定实施方案中，邻近于第三核苷酸序列的内源性痘苗基因为b13r基因。在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的所述至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子(例如早期h5r启动子、晚期h5r启动子或早期h5r启动子及晚期h5r启动子)。
[0504]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。在另一实施方案
中，f17r启动子包含seq id no:563的核苷酸序列。在又一实施方案中，d13l启动子包含seq id no:562的核苷酸序列。
[0505]
在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子和/或b2r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，e3l启动子包含seq id no:567的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，f11l启动子包含seq id no:568的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b2r启动子包含seq id no:569的核苷酸序列。
[0506]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。在特定实施方案中，第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在特定实施方案中，第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在特定实施方案中，第三转基因在第二转基因的上游。在特定实施方案中，第三转基因在第二转基因的下游。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0507]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其
中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[0508]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564
的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[0509]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[0510]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三
核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[0511]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[0512]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其
中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[0513]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[0514]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基
因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[0515]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包
含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[0516]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[0517]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二
转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[0518]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，
h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[0519]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[0520]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接所述第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序
列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[0521]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[0522]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核
苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。在特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。在特定实施方案中，h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。在特定实施方案中，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[0523]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。在特定实施方案中，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。在特定实施方案中，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[0524]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；(c)第二转基因，其
包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。在特定实施方案中，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。在特定实施方案中，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[0525]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。在特定实施方案中，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。在特定实施方案中，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[0526]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4(例如人ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基
因插入seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中；及(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；其中所述核酸进一步包含：(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在特定实施方案中，ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。在特定实施方案中，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。在特定实施方案中，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[0527]
在其中核酸包含第一转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处。在另一实施方案中，第一转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间。在其中核酸包含第一转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因插入邻近b13r基因处。
[0528]
在其中核酸包含第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第二转基因插入所述部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处。在另一实施方案中，第二转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间。在其中核酸包含第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第二转基因下插入邻近b13r基因处。
[0529]
在其中核酸包含第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处。在另一实施方案中，第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间。在其中核酸包含第三
转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第三转基因下插入邻近b13r基因处。
[0530]
在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第一转基因和第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间。在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因和第二转基因插入邻近b13r基因处。
[0531]
在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第一转基因和第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间。在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因和第三转基因插入邻近b13r基因处。
[0532]
在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第一转基因和第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间。在其中核酸包含第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因和第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘
苗b14r基因处。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第二转基因和第三转基因插入邻近b13r基因处。
[0533]
在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因插入到b8r基因的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近于部分痘苗c2l基因处，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近于部分痘苗f3l基因处，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因和第二转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近b13r基因处。
[0534]
在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因及插入邻近b13r基因处。
[0535]
在其中核酸包含第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗
c2l基因处，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座，且第二转基因插入邻近b13r基因处。
[0536]
在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处。在另一实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处。在另一实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所
述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因、第二转基因和第三转基因插入邻近b13r基因处。
[0537]
在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因插入的痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一
转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因和第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗f3l基因处，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案
和方面的其他实施方案中，第二转基因和第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，且第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因和第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因和第三转基因插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第三转基因插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第二转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第二转基因插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因和第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近部分痘苗b29r
基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第一转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处。在另一实施方案中，第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近部分痘苗b29r基因处。在其中b14r至b29r基因缺失的特定实施方案中，第二转基因和第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近b13r基因处。
[0538]
在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第一转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第一转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第二转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第二转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，第三转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、
插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，第一转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。在其中核酸包含第一转基因、第二转基因和第三转基因的本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，第三转基因插入部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。在另一实施方案中，第三转基因插入邻近部分痘苗c2l基因处、插入邻近部分痘苗f3l基因处或插入痘苗基因c3l与f4l之间，第二转基因插入到b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因插入邻近部分痘苗b14r基因处、插入邻近部分痘苗b29r基因处或当b14r至b29r基因缺失时插入邻近b13r基因处。
[0539]
在本文所述的各种实施方案和方面中，其中核酸包含seq id no:210的核苷酸序列，部分c2l和f3l痘苗基因为seq id no:210中的部分c2l和f3l痘苗基因。在本文所述的各种实施方案和方面中，其中核酸包含seq id no:210的核苷酸序列，部分b14r和b29r痘苗基因为seq id no:210中的部分b14r和b29r痘苗基因。
[0540]
在本文所述的各种实施方案和方面中，其中核酸包含seq id no:624的核苷酸序列，部分c2l和f3l痘苗基因为seq id no:624中的部分c2l和f3l痘苗基因。在其中核酸包含seq id no:624的核苷酸序列的本文所述的各种实施方案和方面中，部分b14r和b29r痘苗基因为seq id no:624中的部分b14r和b29r痘苗基因。
[0541]
在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，插入到部分c2l痘苗基因及部分f3l痘苗基因中插入存在于重组痘苗病毒基因组中之5p缺失的边界内。在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，插入部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间为插入存在于重组痘苗病毒基因组中之3p缺失的边界内。
[0542]
在本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段为全长抗体(例如，全长人抗体、全长人源化抗体或全长小鼠抗体)。在一个特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含通过裂解肽，例如自裂解肽，诸如2a自裂解肽(例如t2a肽)连接的伊匹单抗的重链和轻链的多肽。在另一特定实施方案中，第一核苷酸序列编码包含通过裂解肽，例如自裂解肽，诸如2a自裂解肽(例如t2a肽)连接的伊匹单抗的重链信号肽与重链及轻链信号肽与轻链的多肽。在本文所述的各种实施方案和方面的其他实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段为单链抗体(例如，单链人抗体、单链人源化抗体或单链小鼠抗体，诸如9d9)。
[0543]
在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在本文所述的各种实施方案和方面的另一特定实施方案中，可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。
[0544]
在本文所述的各种实施方案和方面的一些实施方案中，由第二核苷酸序列编码的il
‑
12肽为细胞因子的膜结合形式。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)和跨膜结构域。在一个特定实施方案中，il
‑
12多肽由il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)和跨膜结构域(il12
‑
tmp35)组成。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例
如人il
‑
12p35)、跨膜结构域及细胞质结构域。在一个特定实施方案中，il
‑
12多肽由il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)、跨膜结构域及细胞质结构域组成。跨膜结构域可来源于任何膜结合蛋白(例如b7
‑
1、膜结合tnfα或膜结合flt3l)。细胞质结构域可来源于含有细胞质结构域的任何蛋白(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l)。在一个特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)以及来自b7
‑
1抗原(一种哺乳动物表面呈现的常用元件)的b7细胞质和膜结构域。在一个特定实施方案中，il
‑
12多肽由il
‑
12p35(例如人il
‑
12p35)以及来自b7
‑
1抗原的b7细胞质和膜结构域组成。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)和跨膜结构域，所述il
‑
12p70包含p40亚单位(例如人il
‑
12p40)和p35亚单位(例如人il
‑
12p35)。在一个特定实施方案中，il
‑
12多肽由il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)和跨膜结构域(il12
‑
tmp70或p40
‑
p35
‑
tm)组成，所述il
‑
12p70包含p40亚单位(例如人il
‑
12p40)和p35亚单位(例如人il
‑
12p35)。在特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)以及跨膜结构域和细胞质结构域，所述il
‑
12p70包含p40亚单位(例如人il
‑
12p40)和p35亚单位(例如人il
‑
12p35)。在一个特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)以及跨膜结构域和细胞质结构域，所述il
‑
12p70包含p40亚单位(例如人il
‑
12p40)和p35亚单位(例如人il
‑
12p35)。跨膜结构域可来源于任何膜结合蛋白(例如b7
‑
1、膜结合tnfα或膜结合flt3l)。细胞质结构域可来源于含有细胞质结构域的任何蛋白(例如b7
‑
1、tnfα或flt3l)。在一个特定实施方案中，il
‑
12多肽包含il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)以及来自b7
‑
1抗原的b7细胞质和膜结构域，所述il
‑
12p70包含p40亚单位(例如人il
‑
12p40)和p35亚单位(例如人il
‑
12p35)。在一个特定实施方案中，il
‑
12多肽由il
‑
12p70(例如人il
‑
12p70)以及来自b7
‑
1抗原的b7细胞质和膜结构域组成，所述il
‑
12p70包含p40亚单位(例如人il
‑
12p40)和p35亚单位(例如人il
‑
12p35)。在某些实施方案中，il
‑
12多肽为人il
‑
12多肽(例如，人il12
‑
tmp35或人il12
‑
tmp70)。在某些实施方案中，il
‑
12多肽为小鼠il
‑
12多肽(例如，小鼠il12
‑
tmp35或小鼠il12
‑
tmp70)。
[0545]
在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的至少一个启动子为具有seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子。在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的至少一个启动子为具有seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子和b8r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。
[0546]
在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为flt3l的可溶形式。在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为人flt3l的可溶形式。在某些实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的可溶形式。举例来说，在特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)。在其他实例中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域(例如genbank登录号u03858.1中所列的人flt3l的跨膜结构域)的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少
90％或至少95％及整个flt3l细胞质结构域。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％以及flt3l细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域和flt3l细胞质结构域的1、2、3或4个n端氨基酸残基。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域及细胞质结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0547]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0548]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域和细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0549]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0550]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺
乏flt3l跨膜结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、整个细胞质结构域及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0551]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0552]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0553]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏整个flt3l跨膜结构域、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域
属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0554]
在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在另一实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l缺乏flt3l跨膜结构域的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、细胞质结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15个n端氨基酸残基及自flt3l细胞外结构域的羧基端起的1至5、1至10、5至10、10至20、15至20、1至20、5至20或10至20个氨基酸。在某些实施方案和方面中，跨膜结构域、细胞质结构域及细胞外结构域属于genbank登录号u03858.1中所列的flt3l序列。
[0555]
在一个特定实施方案中，由第三核苷酸序列编码的flt3l为x7同种型，且第三核苷酸序列缺乏如lyman等人,1994,blood 83:2795
‑
2801中所描述的179
‑
核苷酸序列。在特定实施方案中，flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。在特定实施方案中，第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[0556]
在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。在本文所述的各种实施方案和方面的一个特定实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。在一个特定实施方案中，b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列。在一个特定实施方案中，b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[0557]
本发明亦设想如本文所述的核酸，其进一步包含第四转基因，所述第四转基因包含编码可检测标记物，例如荧光标记物(例如，绿色荧光蛋白(gfp)，诸如增强gfp(egfp))的第四核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码荧光标记物的第四核苷酸序列的至少一个启动子。在某些实施方案中，编码荧光标记物的第四核苷酸序列连接第一、第二及第三核苷酸序列中的一个且在其下游。
[0558]
在一个特定实施方案中，可操作地连接于编码荧光标记物的第四核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。在另一特定实施方案中，可操作地连接于编码荧光标记物的第四核苷酸序列的至少一个启动子为p7.5启动子。
[0559]
在特定实施方案中，本文提供一种载体，其包含具有表45中鉴别、插入到表45中鉴别的基因座中且可操作地连接于表45中所鉴别的启动子的转基因的seq id no:210或seq id no:624的核苷酸序列。在特定实施方案中，本文提供如表45中所描述的载体。
[0560]
还预期第一转基因、第二转基因、第三转基因和/或第四转基因可插入到tk基因座中。其他转基因(如果存在)可插入其他基因座处，例如部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间、b8r基因中的缺失的基因座、部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间和/或ha
基因座。在一些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含tk基因中的缺失。在一个特定实施方案中，第一转基因、第二转基因、第三转基因和/或第四转基因插入到tk基因中的缺失的基因座中。在其他实施方案中，tk基因未缺失，但第一转基因、第二转基因、第三转基因和/或第四转基因插入到tk基因中且干扰tk基因的功能。
[0561]
在其他实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含功能性(例如野生型)tk基因，且转基因均不插入到tk基因座中。野生型tk基因包括天然见于痘苗病毒基因组中的tk基因。
[0562]
还预期第一转基因、第二转基因、第三转基因和/或第四转基因可插入到ha基因座中。其他转基因(如果存在)可插入其他基因座处，例如部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间、b8r基因中的缺失的基因座、部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间和/或tk基因座。在一些实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含ha基因中的缺失。在一个特定实施方案中，第一转基因、第二转基因、第三转基因和/或第四转基因插入到ha基因中的缺失的基因座中。在其他实施方案中，ha基因未缺失，但第一转基因、第二转基因、第三转基因和/或第四转基因插入到ha基因中且干扰ha基因的功能。
[0563]
在其他实施方案中，重组痘苗病毒基因组包含功能性(例如野生型)ha基因，且转基因均不插入到ha基因座中。野生型ha基因包括天然地发现于痘苗病毒基因组中的ha基因。
[0564]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，至少一个启动子可操作地连接于第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和/或第三核苷酸序列，其中至少一个启动子为早期启动子、晚期启动子或早期/晚期启动子。在特定实施方案中，至少一个启动子为早期启动子及晚期启动子。在特定实施方案中，晚期启动子可包含taaat核苷酸序列(seq id no.631)。
[0565]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的至少一个启动子为早期启动子、晚期启动子或早期/晚期启动子。在特定实施方案中，至少一个启动子为早期启动子及晚期启动子。在特定实施方案中，晚期启动子可包含taaat核苷酸序列(seq id no.631)。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子(例如包含核苷酸序列aaaaatgaaaataaa(seq id no.630)或taaaaaatgaaaataaatacaaaggttctt(seq id no.553)，任选地具有在该序列的上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r晚期启动子(例如包含核苷酸序列taaat(seq id no.631)、tcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.632)或aaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.554)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子(例如包含核苷酸序列aaaaatgaaaataaa(seq id no.630)或taaaaaatgaaaataaatacaaaggttctt(seq id no.553)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)及h5r晚期启动子(例如包含核苷酸序列taaat(seq id no.631)、tcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.632)或aaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.554)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。当h5r晚期启动子包含核苷酸
序列taaat(seq id no.631)时，在一个实施方案中，核酸包含taaat与atg翻译起始密码子之间的介入序列(例如，长度约10、20、30或40个核苷酸的插入序列)；在另一实施方案中，taaat与atg翻译起始密码子之间不存在介入序列(例如，taaat之最后两个核苷酸为atg翻译起始密码子之前两个核苷酸)。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps早期启动子(例如包含核苷酸序列aaaattgaaatttta(seq id no.555))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps晚期启动子(例如包含核苷酸序列ttttattttttttttttggaatataaata(seq id no.556))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps早期/晚期启动子(例如包含核苷酸序列aaaattgaaattttattttttttttttggaatataaata(seq id no.557))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为leo早期启动子(例如包含核苷酸序列ttttattttttttttttggaatataaata(seq id no.556))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为leo晚期启动子(例如包含核苷酸序列aaaattgaaaaaata(seq id no.558))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为leo早期/晚期启动子(例如包含核苷酸序列ttttattttttttttttggaatataaatatccggtaaaattgaaaaaata(seq id no.559))。
[0566]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。在一个特定实施方案中，晚期启动子包含核苷酸序列ttnttttttntttttttnnnntataaat(seq id no:560，其中n为任何核苷酸)。在另一特定实施方案中，晚期启动子包含核苷酸序列ttgtattttcttttgttggcatataaat(seq id no:561)。在另一特定实施方案中，晚期启动子为d13l启动子(例如包含核苷酸序列tttattgtaagctttttccattttaaat(seq id no.562))。在另一特定实施方案中，晚期启动子为f17r启动子(例如包含核苷酸序列tcattttgtttttttctatgctataaat(seq id no.563))。
[0567]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为早期启动子、晚期启动子或早期/晚期启动子。在一个特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子(例如包含核苷酸序列taaaaatttaaaatatattatcacttcagt(seq id no.564))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子(例如包含核苷酸序列aaaaaactgatattatataaatattttagt(seq id no.565))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子包含核苷酸序列nnaaaantgaaaanatannnnnnnnnnnnn(seq id no.566，其中n为任何核苷酸)。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子(例如包含核苷酸序列aaaaaaatgataaagtaggttcagttttat(seq id no.567))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为f11l启动子(例如包含核苷酸序列taaaaagtgaaaaacaatattatttttatc(seq id no.568))。在另一特定实施方案中，可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b2r启动子(例如包含核苷酸序列aaaattaaaaaataacttaatttattattg(seq id no.569))。
[0568]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，启动子序列与该启动子以
可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约100个核苷酸重迭或在该约100个核苷酸内。在一个特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约80个核苷酸内。在一个特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约70个核苷酸内。在一个特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约60个核苷酸内。在一个特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约50个核苷酸内。在另一特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约40个核苷酸内。在另一特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约30个核苷酸内。在另一特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约20个核苷酸内。在另一特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约10个核苷酸内。在另一特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的约5个核苷酸内。在另一特定实施方案中，启动子序列在该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子的2个核苷酸内。在另一特定实施方案中，启动子序列与该启动子以可操作方式连接的转基因的翻译起始密码子重迭。
[0569]
在其中核酸包含有包含核苷酸序列的转基因的本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，核酸可进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于所述核苷酸序列之非翻译区(utr)，例如h5r utr或其部分，例如h5r utr的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一个特定实施方案中，h5r utr或其部分包含h5r早期启动子(例如包含核苷酸序列aaaaatgaaaataaa(seq id no.630)或taaaaaatgaaaataaatacaaaggttctt(seq id no.553)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。在另一特定实施方案中，h5r utr或其部分包含h5r晚期启动子(例如包含核苷酸序列taaat(seq id no.631)、tcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.632)或aaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.554)，任选地具有该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。在另一特定实施方案中，h5r utr或其部分包含h5r早期启动子(例如包含核苷酸序列aaaaatgaaaataaa(seq id no.630)或taaaaaatgaaaataaatacaaaggttctt(seq id no.553)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)及h5r晚期启动子(例如包含核苷酸序列taaat(seq id no.631)、tcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.632)或aaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.554)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。在另一特定实施方案中，h5r utr包含核苷酸序列ttaaagttacaaacaactaggaaattggtttatgatgtataatttttttagtttttatagattctttattctatacttaaaaaatgaaaataaatacaaaggttcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaattatttcattatcgcgatatccgttaagtttgtatcgta(seq id no.626)。
[0570]
在其中核酸包含有包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列的第一转基因的本文所述的各种实施方案和方面的特定实施方案中，核酸可进一步包含编码非翻译区(utr)的核苷酸序列。举例来说，utr可包含可操作地连接于第一核苷酸序列之h5r utr或其部分(例如h5r utr的至少80％、至少85％、至少90％或至少
95％)。在一个特定实施方案中，h5r utr包含h5r早期启动子(例如包含核苷酸序列aaaaatgaaaataaa(seq id no.630)或taaaaaatgaaaataaatacaaaggttctt(seq id no.553)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。在另一特定实施方案中，h5r utr包含h5r晚期启动子(例如包含核苷酸序列taaat(seq id no.631)、tcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.632)或aaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.554)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。在另一特定实施方案中，h5r utr包含h5r早期启动子(例如包含核苷酸序列aaaaatgaaaataaa(seq id no.630)或taaaaaatgaaaataaatacaaaggttctt(seq id no.553)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)及h5r晚期启动子(例如包含核苷酸序列taaat(seq id no.631)、tcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.632)或aaattgaaagcgagaaataatcataaat(seq id no.554)，任选地具有在该序列上游和/或下游的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸)。在另一特定实施方案中，h5r utr包含核苷酸序列ttaaagttacaaacaactaggaaattggtttatgatgtataatttttttagtttttatagattctttattctatacttaaaaaatgaaaataaatacaaaggttcttgagggttgtgttaaattgaaagcgagaaataatcataaattatttcattatcgcgatatccgttaagtttgtatcgta(seq id no.626)。
[0571]
在本文所述的各种实施方案和方面的某些实施方案中，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、二十个、三十个、四十个、五十个、六十个、七十个、八十个、九十个或一百个或所有以下基因并未自重组痘苗病毒基因组缺失：c3l、c4l、c5l、c6l、c7l、c8l、c9l、c10l、c11r、c12l、c13l、c14l、c15l(在5'itr中)、c16l(在5'itr中)、c17l(在5'itr中)、c18l(在5'itr中)、c19l(在5'itr中)、c20l(在5'itr中)、c21l(在5'itr中)、c22l(在5'itr中)、c23l(在5'itr中)、f4l、f5l、f6l、f7l、f8l、f9l、f10l、f11l、f12l、f13l、f14l、f15l、f16l、f17r、e1l、e2l、e3l、e4l、e5r、e6r、e7r、e8r、e9l、e10r、e11l、o1l、o2l、i1l、i2l、i3l、i4l、i5l、i6l、i7l、i8r、g1l、g2r、g3l、g4l、g5r、g6r、g7l、g8r、g9r、l1r、l2r、l3l、l4r、l5r、j1r、j2r、j3r、j4r、j5l、j6r、h1l、h2r、h3l、h4l、h5r、h6r、h7r、d1r、d2l、d3r、d4r、d5r、d6r、d7r、d8l、d9r、d10r、d11l、d12l、d13l、a1l、a2l、a3l、a4l、a5r、a6l、a7l、a8r、a9l、a10l、a11r、a12l、a13l、a14l、a15l、a16l、a17l、a18r、a19l、a20r、a21l、a22r、a23r、a24r、a25l、a26l、a27l、a28l、a29l、a30l、a31r、a32l、a33r、a34r、a35r、a36r、a37r、a38l、a39r、a40r、a41l、a42r、a43r、a44l、a45r、a46r、a47l、a48r、a49r、a50r、a51r、a52r、a53r、a54l、a55r、a56r、a57r、b1r、b2r、b3r、b4r、b5r、b6r、b7r、b8r、b9r、b10r、b11r、b12r及b13r(关于基因的描述参见goebel等人,1990,virology 179(1):247
‑
266，其以引用的方式并入本文中以用于该描述)。
[0572]
另一方面，本文提供一种核酸，其包含表43中所描述的核酸序列。
[0573]
另一方面，本文提供在章节6的实施例中所描述的核酸。
[0574]
一方面，提供核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0575]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、
f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0576]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0577]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0578]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0579]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少7个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0580]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少8个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0581]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少9个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0582]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少10个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0583]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少11个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0584]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少12个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0585]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少13个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0586]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少14个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0587]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少15个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0588]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少16个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、
f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0589]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少17个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0590]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少18个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0591]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少19个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0592]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少20个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0593]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少21个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0594]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少22个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0595]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0596]
一方面，提供核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0597]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少2个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0598]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0599]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0600]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0601]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0602]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[0603]
一方面，提供核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、
k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0604]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少2个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0605]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0606]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0607]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0608]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0609]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少7个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0610]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少8个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0611]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少9个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0612]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少10个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0613]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少11个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0614]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少12个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0615]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少13个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0616]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少14个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、
f2l及f3l基因。
[0617]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少15个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0618]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0619]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码参与宿主相互作用的蛋白质的基因的缺失。举例来说，在一些实施方案中，所述蛋白质影响与细胞外基质的非钙依赖性粘着。在一些实施方案中，所述蛋白质为nf
‑
κb抑制剂，例如由选自由以下组成的组的基因编码的nf
‑
κb抑制剂：c2l、n1l、m2l、k1l及k7r基因。在一些实施方案中，所述蛋白质为细胞凋亡抑制剂，例如凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂(诸如由f1l基因编码的抑制剂)、bcl
‑
2样蛋白(诸如由n1l编码的蛋白质)。在一些实施方案中，所述蛋白质为干扰素调控因子3(irf3)抑制剂(诸如由n2l或k7r编码的抑制剂)、丝氨酸蛋白酶抑制剂、防止细胞融合的蛋白质(诸如由k2l编码的蛋白质)、rna活化蛋白激酶(pkr)抑制剂(诸如由k1l或k3l编码的抑制剂)、毒力因子(诸如由f3l编码的毒力因子)、il
‑1‑
β抑制剂(诸如由b16r编码的抑制剂)或分泌ifnα螯合剂(诸如由b19r编码的螯合剂)。
[0620]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码参与dna复制的蛋白质的基因的缺失。举例来说，在一些实施方案中，所述蛋白质为dna修饰核酸酶(例如由k4l编码的蛋白质)或脱氧尿苷三磷酸酶(dutpase)(例如由f2l编码的蛋白质)。
[0621]
在一些实施方案中，至少一个缺失基因的整个核苷酸序列缺失。在一些实施方案中，至少一个缺失基因仅部分缺失，且部分缺失足以使得所述部分缺失基因在引入宿主细胞中之后无功能。
[0622]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含反向末端重复序列(itr)的至少两个拷贝。
[0623]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组缺乏itr的任何拷贝。
[0624]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含选自由以下组成的组的itr的至少一个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[0625]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含itr的至少所有以下拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[0626]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含b8r基因中的缺失。
[0627]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含完整b8r基因。
[0628]
一方面，提供核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含：(i)以下每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r及b8r基因；及(ii)以下itr的各拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[0629]
一方面，提供核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包
含：(i)以下每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；及(ii)以下itr的各拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr，其中所述重组正痘病毒基因组包含完整b8r基因。
[0630]
在一些实施方案中，提供核酸，其进一步包含至少一个选自由以下组成的组的转基因：编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。在一些实施方案中，提供核酸，其进一步包含至少两个选自由以下组成的组的转基因：编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。在一些实施方案中，提供核酸，其进一步包含编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。
[0631]
举例来说，在一些实施方案中，提供核酸，其包含编码免疫检查点抑制剂的转基因。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[0632]
举例来说，在一些实施方案中，提供核酸，其包含编码白介素(il)的转基因。在一些实施方案中，所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。在一些实施方案中，所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。在一些实施方案中，所述白介素为膜结合的。在一些实施方案中，所述白介素为膜结合il
‑
12p70。在一些实施方案中，所述白介素为膜结合il
‑
12p35。
[0633]
举例来说，在一些实施方案中，提供核酸，其包含编码细胞因子的转基因。在一些实施方案中，所述细胞因子为干扰素(ifn)。在一些实施方案中，所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[0634]
在一些实施方案中，所述细胞因子为tnf超家族成员蛋白。在一些实施方案中，tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[0635]
在一些实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及c
‑
kit。在一些实施方案中，细胞因子为flt3配体。
[0636]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组包含b8r基因中的缺失，且至少一个转基因插入到b8r基因中的缺失中。在一些实施方案中，至少两个转基因插入到b8r基因中的缺失中。在一些实施方案中，至少三个转基因插入到b8r基因中的缺失中。在一些实施方案中，至少一个转基因插入不在b8r基因中的缺失处的基因座中，例如正痘病毒基因组的5'端处的缺失的边界处的基因座或正痘病毒基因组的3'端处的缺失的边界处的基因座。
[0637]
一方面，提供核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含：(i)以下每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、
no:572)。在另一特定实施方案中，2a自裂解肽为p2a肽。在一个特定实施方案中，p2a肽包含氨基酸序列gsgatnfsllkqagdveenpgp(seq id no:573)。在另一特定实施方案中，p2a肽包含氨基酸序列atnfsllkqagdveenpgp(seq id no:574)。在另一特定实施方案中，2a自裂解肽为e2a肽。在一个特定实施方案中，e2a肽包含氨基酸序列gsgqctnyallklagdvesnpgp(seq id no:575)。在另一特定实施方案中，e2a肽包含氨基酸序列qctnyallklagdvesnpgp(seq id no:576)。在另一特定实施方案中，2a自裂解肽为f2a肽。在一个特定实施方案中，f2a肽包含氨基酸序列gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seq id no:577)。在另一特定实施方案中，f2a肽包含氨基酸序列vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seq id no:578)。抗体的重链和轻链通过2a自裂解肽的连接使得抗体转基因能够在一个开放阅读框架中翻译且自裂解以共翻译发生，产生等量的共表达重链和轻链。在一个特定实施方案中，由本文所描述的核苷酸序列编码的抗ctla
‑
4抗体包含seq id no:211的氨基酸序列。
[0647]
在各种实施方案中，本文提供的核酸为重组核酸。
[0648]
5.2.4.修饰的正痘病毒
[0649]
一方面，本文提供一种病毒，其包含章节5.2.3中所描述的核酸。在一个特定实施方案中，本文提供一种病毒，其包含章节5.2.3中所描述的核酸，其中核酸包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含第二转基因，所述第二转基因包含编码膜结合il
‑
12多肽的第二核苷酸序列。
[0650]
另一方面，本文提供章节6的实施例中所描述的病毒。
[0651]
另一方面，提供包含核酸的病毒，所述核酸包含本文所述的重组正痘病毒基因组。在一些实施方案中，a)重组正痘病毒基因组包含至少2个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；b)所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；或c)所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[0652]
在一些实施方案中，所述病毒来源于痘苗病毒。在一些实施方案中，所述痘苗病毒来源于选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
‑
1、修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)、dairen i、glv
‑
1h68、ihd
‑
j、l
‑
ivp、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
‑
1。在一些实施方案中，所述痘苗病毒来源于选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、tian tan、wyeth及lister。在一些实施方案中，所述痘苗病毒来源于copenhagen株痘苗病毒。
[0653]
在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组进一步包含胸苷激酶(tk)基因。在一些实施方案中，所述重组正痘病毒基因组进一步包含核糖核苷酸还原酶基因。
[0654]
在所提供病毒的一些实施方案中，在使细胞(例如哺乳动物细胞)群体与所述病毒接触后，所述细胞(例如哺乳动物细胞)群体相对于与不包含所述缺失的病毒的形式接触的相同类型的细胞(例如哺乳动物细胞)群体展现增加的合胞体形成。
[0655]
在所提供病毒的一些实施方案中，在使细胞(例如哺乳动物细胞)群体与所述病毒接触后，所述细胞(例如哺乳动物细胞)群体相对于与不包含所述缺失的病毒的形式接触的相同类型的细胞(例如哺乳动物细胞)群体展现增加的病毒传播。
[0656]
在所提供病毒的一些实施方案中，所述重组正痘病毒载体相对于所述病毒不包含缺失的形式对细胞(例如哺乳动物细胞)群体施加增加的细胞毒性效应。
[0657]
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞为人细胞。
[0658]
在一些实施方案中，所述人细胞为癌细胞。
[0659]
在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞来自选自由以下组成的组的细胞系：u2os、293、293t、vero、hela、a549、bhk、bsc40、cho、ovcar
‑
8、786
‑
0、nci
‑
h23、u251、sf
‑
295、t
‑
47d、skmel2、bt
‑
549、sk
‑
mel
‑
28、mda
‑
mb
‑
231、sk
‑
ov
‑
3、mcf7、m14、sf
‑
268、caki
‑
1、hpav、ovcar
‑
4、hct15、k
‑
562及hct
‑
116。
[0660]
在所提供病毒的一些实施方案中，病毒进一步包含编码肿瘤相关抗原(例如表3至表30中的任一个中列举的肿瘤相关抗原)的转基因。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原为选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原：cd19、cd33、epcam、cea、psma、egfrviii、cd133、egfr、cdh19、enpp3、dll3、msln、ror1、her2、hlaa2、epha2、epha3、mcsp、cspg4、ng2、ron、flt3、bcma、cd20、fapα、frα、ca
‑
9、pdgfrα、pdgfrβ、fsp1、s100a4、adam12m、ret、met、fgfr、insr及ntrk。
[0661]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含mage
‑
a3或其一个或多个片段。
[0662]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含ny
‑
eso
‑
1或其一个或多个片段。
[0663]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含一个或多个人乳头瘤病毒(hpv)蛋白或其片段。在一些实施方案中，hpv蛋白或其片段包含以下中的一个或多个：(i)hpv16的e6和e7蛋白或其片段，及(ii)hpv18的e6和e7蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述hpv蛋白或片段的序列公开于内容以引用的方式并入本文中的国际专利公布wo/2014/127478中。
[0664]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含短尾蛋白或其一个或多个片段。
[0665]
在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包含前列腺酸性磷酸酶或其一个或多个片段。
[0666]
在某些实施方案中，本文提供的病毒被分离。在某些实施方案中，本文提供的病毒被纯化。
[0667]
在各种实施方案中，本文提供的病毒为重组病毒。
[0668]
在某些实施方案中，本文所提供的病毒不会在向患者(例如哺乳动物患者)施用时引起痘病变形成。在某些实施方案中，本文提供的病毒能够体外和/或在向患者(例如哺乳动物患者)施用时复制。在某些实施方案中，本文提供的病毒能够体外和/或在向患者(例如哺乳动物患者)施用时表达本文所述的转基因。在某些实施方案中，本文提供的病毒能够体外和/或在向患者(例如哺乳动物患者)施用时杀灭靶肿瘤细胞(例如展现癌症细胞毒性)。关于例示性测定参见章节6的实施例，这些测定可用于确定痘病变形成、复制、转基因表达或靶肿瘤细胞的杀灭(例如癌症细胞毒性)。
[0669]
5.2.5.用于测量病毒特征的测定
[0670]
在某些实施方案中，已使用本领域中已知的方法测试本文所述的病毒复制/传播的能力、活力、转基因表达和/或杀灭靶肿瘤细胞的能力(例如癌症细胞毒性)。关于例示性测定参见章节6的实施例，这些测定可用于确定复制/传播、活力、转基因表达或靶肿瘤细胞的杀死(例如癌症细胞毒性)。
[0671]
本领域中已知用以测量肿瘤播散及病毒毒力的测定包括(但不限于)测量溶菌斑大小、合胞体形成和/或彗星测定(eev)。本领域中已知用以测量病毒的免疫刺激活性的测
定包括(但不限于)nk活化(以cd69表达％测量)、nk脱粒(以cd107a的增加倍数测量)和/或t细胞引发测定。本领域中已知用以测量病毒的选择性的测定包括(但不限于)尾部痘病变、生物分布和/或身体质量测量。
[0672]
5.2.6.细胞、细胞系及包装细胞系
[0673]
一方面，本文提供一种细胞，其包含章节5.2.3中所描述的核酸。另一方面，本发明提供一种细胞，其包含章节5.2.4中所描述的病毒。在某些实施方案中，本文提供的细胞为哺乳动物细胞(例如人细胞)。在某些实施方案中，本文提供的细胞为宿主细胞(例如章节5.4中所描述的宿主细胞)。
[0674]
一方面，本文提供一种细胞系，其包含章节5.2.3中所描述的核酸。另一方面，本文提供一种细胞系，其包含章节5.2.4中所描述的病毒。在某些实施方案中，本文提供的细胞系为哺乳动物细胞系(例如人细胞系)。
[0675]
一方面，本文提供一种包装细胞系，其包含章节5.2.3中所描述的核酸。另一方面，本文提供一种包装细胞系，其包含章节5.2.4中所描述的病毒。包装细胞系可为适合于包装正痘病毒(例如痘苗病毒)的任何细胞系。在某些实施方案中，本文提供的包装细胞系为哺乳动物包装细胞系(例如人包装细胞系)。
[0676]
可用以培养本文所述的病毒的例示性细胞包括例如hela细胞、u2os细胞、293t细胞、nih3t3细胞、jurkat细胞、293细胞、cos细胞、cho细胞、saos细胞、pc12细胞及鸡胚成纤维细胞(cef)。可用以包装本文所述的病毒的例示性包装细胞系包括例如hela细胞系、u2
‑
os细胞系、hek293t细胞系、786
‑
o细胞系、a549细胞系或粘着性人癌细胞系。在某些实施方案中，细胞还表达或被工程改造以表达痘苗病毒的复制和/或包装所需的一个或多个因子。
[0677]
在某些实施方案中，本文提供的细胞、细胞系或包装细胞系为章节6的实施例中所描述的细胞、细胞系或包装细胞系。
[0678]
5.2.7.由正痘病毒基因编码的蛋白质的实例
[0679]
由本公开中描述的正痘病毒基因编码的例示性蛋白质再现于下表31至表40中。如下文所用，术语“位置”是指基因相对于本文所述的例示性正痘病毒载体中的缺失核酸的位置。针对各种基因，提供氨基酸序列信息和蛋白质登录id编号。
[0680]
5.3.基因修饰方法
[0681]
用于插入核酸或使核酸自靶基因组缺失的方法包括本文所描述及本领域中已知的那些方法。据信用于实现本发明的组合物的表达的核酸递送的方法包括如本文所描述或本领域普通技术人员应知晓的可借以将核酸(例如dna，包括病毒和非病毒载体)引入细胞器、细胞、组织或生物体中的几乎任何方法。此类方法包括(但不限于)诸如通过注射直接递送dna(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466及5,580,859，其各自以引用的方式并入本文中)，包括显微注射(harland和weintraub，1985；美国专利号5,789,215，以引用的方式并入本文中)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，以引用的方式并入本文中)；通过磷酸钙沈淀(graham和van der eb,1973；chen和okayama,1987；rippe等人,1990)；通过使用deae
‑
葡聚糖、接着使用聚乙二醇(gopal,1985)；通过直接声波加载(fechheimer等人,1987)；通过脂质体介导的转染(nicolau和sene,1982；fraley等人,1979；nicolau等人,1987；wong等人,1980；kaneda等人,1989；kato等人,1991)；通过微弹轰击(pct申请号wo 94/09699号和第95/06128号；美国
专利号5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877及5,538,880，且各自以引用的方式并入本文中)；通过用碳化硅纤维搅拌(kaeppler等人,1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，各自以引用的方式并入本文中)；通过农杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，各自以引用的方式并入本文中)；或通过peg介导的原生质体转化(omirulleh等人,1993；美国专利号4,684,611和4,952,500，各自以引用的方式并入本文中)；通过干燥/抑制介导的dna摄取(potrykus等人,1985)。经由应用诸如这些方法的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可稳定或暂时地转化。
[0682]
下文描绘缺失的基因簇及其在copmd5p、copmd3p和copmd5p3p病毒中的功能。itr基因(在表2中用
“‑
itr”和“*”表示)在一个拷贝(基因组的右itr)中缺失。然而，这些基因具有在左itr中的第二拷贝，其在这些病毒中保持完整。通过全基因组测序确认缺失。大部分缺失基因参与阻断宿主对病毒感染的反应或具有未知功能。
[0683]
表2：痘苗病毒中的缺失基因
[0684]
[0685][0686]
在各种实施方案中，正痘病毒进一步被基因修饰以含有b8r基因中的缺失。痘苗病毒b8r基因编码与γ干扰素受体(ifn
‑
γ)具有同源性的分泌蛋白。在体外，b8r蛋白结合至若干种γ干扰素(包括人和大鼠γ干扰素)并抵消其抗病毒活性；然而，其不显著结合至鼠类ifn
‑
γ。缺失b8r基因防止ifn
‑
γ在人中的损伤。在各种实施方案中，一个、两个或三个转基因插入到缺失b8r基因的基因座中。在一些病毒株中，除存在于b8r缺失的位点处的转基因以外，病毒株还具有正痘病毒上的并非缺失b8r基因的基因座的额外基因座，至少一个转基因插入到所述额外基因座中。在各种实施方案中，至少一个转基因插入到5p缺失的边界中，至少一个转基因插入到3p缺失的边界中，或这两种情况。在各种实施方案中，至少三个、四个、五个或更多个转基因插入到修饰的正痘病毒基因组中。
[0687]
在各种实施方案中，修饰的正痘病毒载体的序列为下文在表43中描绘为seq id no:210的序列。在一些实施方案中，修饰的正痘病毒载体的序列为seq id no:210的衍生物。举例来说，如本文中所指出，修饰的正痘病毒载体可修饰的以表达如本文所论述的一个或多个转基因。
[0688]
在各种实施方案中，修饰的正痘病毒载体的序列为下文在表43中描绘为seq id no:624的序列。在一些实施方案中，修饰的正痘病毒载体的序列为seq id no:624的衍生物。举例来说，如本文中所指出，修饰的正痘病毒载体可含有b8r序列的缺失和/或可修饰的以表达如本文所论述的一个或多个转基因。
[0689]
在各种实施方案中，修饰的正痘病毒表达三个转基因中的至少一个：il
‑
12
‑
tm、flt3
‑
l及抗clta4抗体。这些转基因的序列和/或由其编码的氨基酸序列的非限制性实例描述如下：
[0690]
[0691]
[0692]
[0693]
[0694]
[0695]
[0696]
[0697][0698]
关于产生本文所述的重组痘苗病毒的例示性方法，参见章节6.32中的实施例32。
[0699]
5.4.病毒繁殖
[0700]
本发明的特征在于重组正痘病毒，包括相较于野生型构建有一个或多个基因缺失，使得病毒展现针对癌细胞使用的所需特性，同时对非癌细胞毒性较小或无毒的那些重组正痘病毒。此章节概述例如用于产生本文所述的重组正痘病毒的各种方案，诸如用于经由使用重组dna技术产生突变病毒的方法。
[0701]
举例来说，为了在正痘病毒基因组中产生突变，原生和修饰的多肽可由包含于载
pharmaceutical sciences第16版,osol,a.编.(1980)；以引用的方式并入本文中)且以所需形式(例如以冻干制剂或水溶液形式)制备。
[0709]
为了诱导肿瘤细胞溶解、杀灭细胞、抑制生长、抑制癌转移、减少肿瘤大小及以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，使用本发明的方法和组合物，可例如通过借助于例如本文所述的一种或多种施用途径向患有癌症的患者施用正痘病毒来使肿瘤与修饰的正痘病毒接触。施用途径可随癌症的位置和性质变化，且可包括例如皮内、经皮、胃肠外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、局部(例如接近肿瘤，尤其肿瘤的脉管或邻近脉管)、经皮肤、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、瘤内、吸入、灌注、灌洗及经口施用和配制。在特定实施方案中，本文所提供的药物组合物被配制使得其适合于所采用的施用途径。
[0710]
术语“血管内”应理解为是指递送至患者的脉管中，意谓递送至患者的一个或多个血管中、内或在一个或多个血管中递送。在某些实施方案中，施用是施用于视为静脉的血管中(静脉内)，而在其他实施方案中，施用是施用于视为动脉的血管中。静脉包括(但不限于)内颈静脉、周边静脉、冠状静脉、肝静脉、门静脉、大隐静脉、肺静脉、上腔静脉、下腔静脉、胃静脉、脾静脉、肠系膜下静脉、肠系膜上静脉、头静脉和/或股静脉。动脉包括(但不限于)冠状动脉、肺动脉、肱动脉、内颈动脉、主动脉弧、股动脉、周边动脉和/或睫动脉。预期递送可经由小动脉或毛细管进行或递送至小动脉或毛细管。
[0711]
肿瘤内注射或直接注射至肿瘤脉管中特别适合离散性固体可接近肿瘤。局部、区域或全身施用也可为适当的。病毒颗粒可有利地通过向肿瘤施用多次注射(隔开例如大致1cm的间隔)来进行接触。在手术干预的情况下，本发明可在手术前使用，以便使得不可手术的肿瘤可进行切除。也可在适当时应用连续施用，例如通过将导管植入肿瘤中或肿瘤脉管中。此类连续灌注可在治疗开始后例如约1
‑
2个小时至约2
‑
6个小时、至约6
‑
12个小时或约12
‑
24小时的时段内进行。一般来说，经由连续灌注给予的治疗组合物的剂量可等效于通过单次或多次注射(在进行灌注的时间段内进行调整)给予的剂量。进一步预期可使用肢体灌注来施用本发明的治疗组合物，尤其是在黑色素瘤和肉瘤的治疗中。
[0712]
治疗方案可变化，且通常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进展及患者的健康状况和年龄。某些类型的肿瘤将需要更具侵袭性的治疗，而同时，某些患者无法忍受负担更重的方案。临床医师将最适合于基于治疗制剂的已知功效和毒性(如果存在的话)作出此类决策。在某些实施方案中，所治疗的肿瘤至少在最初可能为不可切除的。使用本发明的治疗剂的治疗可归因于边缘收缩或通过消除某些尤其具侵袭性的部分而增大肿瘤的可切除性。治疗之后，切除可能是可行的。切除之后的额外治疗将用以消除肿瘤位点处的微量残存疾病。
[0713]
治疗可包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为含有预定量的治疗组合物。待施用之量以及特定途径及制剂在熟习临床技术的技术者的技能范围内。单位剂量不必以单次注射形式施用，而是可包含设定时间段内的连续输注。本发明的单位剂量可适宜地依据用于病毒构建体的空斑形成单位(pfu)进行描述。单位剂量的范围可为103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
至10
13
pfu及更高。另外或替代地，取决于病毒种类和可达到的滴度，可将1至100、10至50、100至1000或至多约或至少约1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
或1
×
10
15
或更多个感染性病毒颗粒(vp)(包括其间的所有值及范围)递送至肿瘤或肿瘤位点。
[0714]
将本文所公开的重组正痘病毒基因组递送至癌症或肿瘤细胞的另一方法可为经
由瘤内注射。然而，本文所公开的药物组合物可替代地如美国专利号5,543,158、美国专利号5,641,515和美国专利号5,399,363(各自特别以引用的方式整体并入本文中)中所描述胃肠外、静脉内、皮内、肌肉内、经皮或甚至腹膜内施用。核酸构建体的注射剂可通过注射器或任何其他用于注射溶液的方法递送，只要表达构建体可穿过注射所需的特定规格的针头即可。可用于施用本文所述的重组正痘病毒的例示性无针注射系统例示于美国专利号5,846,233中。此系统的特征在于界定用于容纳溶液的安瓿室的喷嘴及用于将溶液自喷嘴推送至递送位点的能量装置。另一例示性注射器系统为允许在任何深度精确地多次注射预定量的溶液的注射器系统(美国专利号5,846,225)。
[0715]
本文所述的病毒颗粒或核酸的混合物可在适当地与一种或多种赋形剂、载剂或稀释剂混合的水中制备。也可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中及在油中制备分散液。在普通的储存及使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。适合于注射使用的医药形式包括无菌水溶液或分散液以及用于即用型制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利号5,466,468，特别以引用的方式整体并入本文中)。在所有情况下，该形式可为无菌的，且就存在易于注射性而言，可为流体。其在制造及储存条件下可为稳定的，且必须保护其免遭微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。载剂可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液态聚乙二醇等)、其适合混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用表面活性剂来维持。预防微生物的作用可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)实现。在许多情况下，将优选地包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
[0716]
对于水溶液中的胃肠外施用而言，举例来说，溶液可在必要时经适当缓冲，且首先用充足盐水或葡萄糖赋予液体稀释剂等张性。这些特定水溶液尤其适合于静脉内、肌肉内、皮下、瘤内及腹膜内施用。在此方面，可采用的无菌水性介质将为本领域技术人员根据本发明已知的。举例来说，可将一个剂量溶解于1ml等张nacl溶液中且添加至1000ml皮下灌注流体或在所提出的输注位点注射。取决于所治疗受试者的病况，将必然出现一些剂量变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定个别受试者的适当剂量。此外，对于人施用而言，制剂应符合fda生物制剂办公室(fda office of biologics)标准所要求的无菌性、发热性、一般安全性及纯度标准。
[0717]
如本文所用，“载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、媒剂、包衣、稀释剂、抗细菌及抗真菌剂、等张及吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和试剂用于医药活性物质的用途为本领域中熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则涵盖其于治疗组合物中的用途。补充活性成分也可并入组合物中。短语“药学上可接受”或“药理学上可接受”是指当施用人时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备在本领域中已充分了解。通常，此类组合物系以呈液体溶液或悬浮液的可注射剂形式制备；还可制备适合于在注射之前形成于液体中的溶液或于液体中的悬浮液的固体形式。
[0718]
5.5.2.治疗方法
[0719]
本文还提供了治疗患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)的细胞增殖病症(诸如
癌症)的方法。
[0720]
一方面，本文提供一种治疗患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)的细胞增殖病症(诸如癌症)的方法，所述方法包括向患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)施用治疗有效量的章节5.2.4中所描述的病毒。
[0721]
另一方面，本文提供一种治疗患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)的细胞增殖病症(诸如癌症)的方法，所述方法包括向患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)施用治疗有效量的章节5.5.1中所描述的药物组合物。
[0722]
在本文所述的治疗方法一特定实施方案中，哺乳动物患者为人患者。
[0723]
在本文所述的治疗方法的某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌及咽喉癌。
[0724]
在本文所述的治疗方法的某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：急性淋巴母细胞白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、肾上腺皮质癌、aids相关淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文氏肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性赘瘤、结肠癌、肝外胆管癌、乳腺管原位癌(dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆氏肿瘤及其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤t细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、上皮卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西氏肉瘤、横纹肌肉瘤、塞泽里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂及输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌及华氏巨球蛋白血症。
[0725]
在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，病毒和药物组合物不与用于治疗细胞增殖病症(诸如癌症)的另一试剂组合施用。
[0726]
在本文所述的治疗方法的其他实施方案中，病毒或药物组合物与一种或多种用于治疗细胞增殖病症(诸如癌症)的额外试剂(例如章节5.5.3中所描述的一种或多种额外试剂)组合施用。
[0727]
可向患有细胞增殖病症(诸如癌症)的受试者(例如哺乳动物受试者，诸如人)施用本文所公开的重组正痘病毒和药物组合物，例如以直接通过肿瘤细胞溶解杀灭癌细胞和/
或以增强适应性免疫反应针对目标癌细胞的有效性。在一些实施方案中，细胞增殖病症为癌症，诸如白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌或咽喉癌。在特定情况下，细胞增殖病症可为选自由以下组成的组的癌症：急性淋巴母细胞白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性骨髓性白血病(cml)、肾上腺皮质癌、aids相关淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文氏肉瘤家族、骨肉瘤及恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性赘瘤、结肠癌、肝外胆管癌、乳腺管原位癌(dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆氏肿瘤及其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤t细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、上皮卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西氏肉瘤、横纹肌肉瘤、塞泽里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌及华氏巨球蛋白血症。
[0728]
本领域的普通医师可易于确定用于向有需要的受试者，例如哺乳动物受试者(例如人)施用的重组正痘病毒载体的有效量。举例来说，医师可以低于为达成所需治疗效果的水平的处方剂量的重组正痘病毒载体开始，且逐渐增加剂量直至达成所需效果为止。或者，医师可通过施用一剂量的重组正痘病毒载体来开始治疗方案且随后逐渐地施用较低剂量直至达成治疗效果(例如一个或多个肿瘤的体积减小)为止。一般来说，本发明的重组正痘病毒载体的适合的每日剂量将为可有效产生治疗效果的最低剂量重组正痘病毒载体的量。本发明的重组正痘病毒载体的治疗组合物的每日剂量可能以单次剂量形式或以在一天、一周、一月或一年中以适当时间间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或超过六个剂量形式施用，任选地以单位剂型施用。虽然本发明的重组正痘病毒载体可单独施用，但其也可能以与赋形剂、载剂及任选的额外治疗剂组合的医药制剂形式施用。
[0729]
可通过各种本领域中已知方法中的任一种监测本发明的重组正痘病毒载体缓解细胞增殖疾病(诸如癌症)的进展的能力。举例来说，医师可通过分析患者的一个或多个肿瘤的体积来监测受试者，例如哺乳动物受试者(例如人)对使用本发明的重组正痘病毒载体的治疗的反应。或者，医师可通过分析特定受试者的淋巴中的t
‑
reg细胞群体来监测受试者(例如人)对使用本发明的重组正痘病毒载体的治疗的反应。举例来说，医师可从受试者，例如哺乳动物受试者(例如人)中抽取样本且使用现有程序(诸如荧光活化细胞分选)确定癌
细胞之量或密度。发现样本中癌细胞之量相对于施用重组正痘病毒之前获自受试者的样本中的癌细胞之量减少(例如减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)，其可指示正痘病毒施用有效地治疗癌症。
[0730]
5.5.3.组合疗法
[0731]
本文所述的重组正痘病毒载体可与一种或多种额外试剂(诸如免疫检查点抑制剂)一起施用。举例来说，重组正痘病毒载体可与免疫检查点抑制剂同时施用、与免疫检查点抑制剂混合或与免疫检查点抑制剂分开施用。与本发明的组合物和方法结合使用的例示性免疫检查点抑制剂包括(但不限于)ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。另外或替代地，本发明的载体可与白介素(il)同时施用、与白介素(il)混合或与白介素(il)分开施用。举例来说，重组正痘病毒载体可与白介素同时施用、与白介素混合或与白介素分开施用。与本发明的组合物和方法结合使用的例示性白介素包括(但不限于)il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。另外或替代地，本发明的载体可与干扰素同时施用、与干扰素混合或与干扰素分开施用。举例来说，重组正痘病毒载体可与干扰素同时施用、与干扰素混合或与干扰素分开施用。与本发明的组合物和方法结合使用的例示性干扰素包括(但不限于)ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。另外或替代地，本发明的载体可与tnf超家族成员蛋白同时施用、与tnf超家族成员蛋白混合或与tnf超家族成员蛋白分开施用。举例来说，重组正痘病毒载体可与tnf超家族成员蛋白同时施用、与tnf超家族成员蛋白混合或与tnf超家族成员蛋白分开施用。与本发明的组合物和方法结合使用的例示性tnf超家族成员蛋白包括(但不限于)trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。另外或替代地，本发明的载体可与细胞因子同时施用、与细胞因子混合或与细胞因子分开施用。举例来说，重组正痘病毒载体可与细胞因子同时施用、与细胞因子混合或与细胞因子分开施用。与本发明的组合物和方法结合使用的例示性细胞因子包括(但不限于)gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、抗tgf
‑
β、抗vegf
‑
r2及cgas(脒基腺苷酸环化酶)。
[0732]
另外或替代地，免疫检查点抑制剂可表达于正痘病毒自身中。举例来说，重组正痘病毒载体可包括编码免疫检查点抑制剂的转基因。通过本发明的组合物和方法的正痘病毒表达的例示性免疫检查点抑制剂包括(但不限于)ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。另外或替代地，白介素可表达于正痘病毒自身中。举例来说，重组正痘病毒载体可包括编码白介素的转基因。通过本发明的组合物和方法的正痘病毒表达的例示性免疫检查点抑制剂包括(但不限于)il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。另外或替代地，干扰素可表达于正痘病毒自身中。举例来说，重组正痘病毒载体可包括编码干扰素的转基因。通过本发明的组合物和方法的正痘病毒表达的例示性干扰素包括(但不限于)ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。另外或替代地，tnf超家族成员蛋白可表达于
正痘病毒自身中。举例来说，重组正痘病毒载体可包括编码tnf超家族成员蛋白的转基因。通过本发明的组合物和方法的正痘病毒表达的例示性tnf超家族成员蛋白包括(但不限于)trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。另外或替代地，细胞因子可表达于正痘病毒自身中。举例来说，重组正痘病毒载体可包括编码细胞因子的转基因。通过本发明的组合物和方法的正痘病毒表达的例示性细胞因子包括(但不限于)gm
‑
csf、fms相关酪氨酸激酶3(flt3)配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及c
‑
kit。
[0733]
另外或替代地，肿瘤相关抗原可表达于正痘病毒自身中。举例来说，重组正痘病毒载体可包括编码肿瘤相关抗原的转基因。通过本发明的组合物和方法的正痘病毒表达的例示性肿瘤相关抗原包括(但不限于)cd19、cd19、cd33、epcam、cea、psma、egfrviii、cd133、egfr、cdh19、enpp3、dll3、msln、ror1、her2、hlaa2、epha2、epha3、mcsp、cspg4、ng2、ron、flt3、bcma、cd20、fapα、frα、ca
‑
9、pdgfrα、pdgfrβ、fsp1、s100a4、adam12m、ret、met、fgfr、insr、ntrk、mage
‑
a3、ny
‑
eso
‑
1、一种或多种人乳头瘤病毒(hpv)蛋白、hpv16的e6和e7蛋白、hpv18的e6和e7蛋白、短尾蛋白、或前列腺酸磷酸酶、或其一个或多个片段。与本文所述的组合物和方法结合使用的肿瘤相关抗原的额外实例包括(但不限于)表3至表30中列举的那些。
[0734]
在本文所述的治疗方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括向患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)施用免疫检查点抑制剂。在特定实施方案中，免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。在一个特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段。在一个特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为伊匹单抗。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为曲美单抗(tremelimumab)。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为纳武单抗(nivolumab)。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为派立珠单抗(pembrolizumab)。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为赛咪单抗(cemiplimab)。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为阿特珠单抗(atezolizumab)。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为阿维鲁单抗(avelumab)。在另一特定实施方案中，免疫检查点抑制剂为德瓦鲁单抗(durvalumab)。
[0735]
在本文所述的治疗方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括向患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)施用白介素。在特定实施方案中，白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。在特定实施方案中，白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。在特定实施方案中，白介素为膜结合的。
[0736]
在本文所述的治疗方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括向患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)施用干扰素。在特定实施方案中，干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[0737]
在本文所述的治疗方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括向患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)施用细胞因子。在特定实施方案中，细胞因子为tnf超家族成员蛋白。在一个特定实施方案中，tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。在特定实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及ckit。在一个特定实施方案中，细胞因子为flt3配体。
[0738]
5.6.试剂盒
[0739]
本文还提供试剂盒，其可根据本发明使用。
[0740]
一方面，本文提供一种试剂盒，其包含章节5.2.3中所描述的核酸和指导试剂盒的使用者在宿主细胞中表达核酸的药品说明书。
[0741]
另一方面，本文提供一种试剂盒，其包含章节5.2.4中所描述的病毒和指导试剂盒的使用者在宿主细胞中表达病毒的药品说明书。
[0742]
另一方面，本文提供一种试剂盒，其包含章节5.2.4中所描述的病毒和指导使用者向患有癌症的患者(例如哺乳动物患者，诸如人患者)施用治疗有效量的病毒从而治疗癌症的药品说明书。在某些实施方案中，哺乳动物患者为人患者。待治疗的癌症可为章节5.5中所描述的癌症。
[0743]
在优选实施方案中，核酸或病毒储存于适合于储存核酸或病毒的一个或多个容器中。在某些实施方案中，本文所提供的试剂盒进一步包含适合于其预期用途的对照物。
[0744]
5.7.说明性实施方案
[0745]
5.7.1.组1
[0746]
1.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个基因的缺失，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0747]
2.如实施方案1的核酸，其中所述缺失包含至少3个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0748]
3.如实施方案2的核酸，其中所述缺失包含至少4个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0749]
4.如实施方案3的核酸，其中所述缺失包含至少5个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0750]
5.如实施方案4的核酸，其中所述缺失包含至少6个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0751]
6.如实施方案5的核酸，其中所述缺失包含至少7个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0752]
7.如实施方案6的核酸，其中所述缺失包含至少8个基因，各基因独立地选自由以
下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0753]
8.如实施方案7的核酸，其中所述缺失包含至少9个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0754]
9.如实施方案8的核酸，其中所述缺失包含至少10个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0755]
10.如实施方案9的核酸，其中所述缺失包含至少11个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0756]
11.如实施方案10的核酸，其中所述缺失包含至少12个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0757]
12.如实施方案11的核酸，其中所述缺失包含至少13个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0758]
13.如实施方案12的核酸，其中所述缺失包含至少14个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0759]
14.如实施方案13的核酸，其中所述缺失包含至少15个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0760]
15.如实施方案14的核酸，其中所述缺失包含至少16个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0761]
16.如实施方案15的核酸，其中所述缺失包含至少17个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0762]
17.如实施方案16的核酸，其中所述缺失包含至少18个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0763]
18.如实施方案17的核酸，其中所述缺失包含至少19个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0764]
19.如实施方案18的核酸，其中所述缺失包含至少20个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0765]
20.如实施方案19的核酸，其中所述缺失包含至少21个基因，各基因独立地选自由
以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0766]
21.如实施方案20的核酸，其中所述缺失包含所述f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r基因中的每个。
[0767]
22.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0768]
23.如实施方案1至22中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0769]
24.如实施方案23的核酸，其中所述缺失包含至少2个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0770]
25.如实施方案24的核酸，其中所述缺失包含至少3个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0771]
26.如实施方案25的核酸，其中所述缺失包含至少4个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0772]
27.如实施方案26的核酸，其中所述缺失包含至少5个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0773]
28.如实施方案27的核酸，其中所述缺失包含所述b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因中的每个。
[0774]
29.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0775]
30.如实施方案1至29中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0776]
31.如实施方案30的核酸，其中所述缺失包含至少2个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0777]
32.如实施方案31的核酸，其中所述缺失包含至少3个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0778]
33.如实施方案32的核酸，其中所述缺失包含至少4个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0779]
34.如实施方案33的核酸，其中所述缺失包含至少5个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0780]
35.如实施方案34的核酸，其中所述缺失包含至少6个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0781]
36.如实施方案35的核酸，其中所述缺失包含至少7个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0782]
37.如实施方案36的核酸，其中所述缺失包含至少8个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0783]
38.如实施方案37的核酸，其中所述缺失包含至少9个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0784]
39.如实施方案38的核酸，其中所述缺失包含至少10个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0785]
40.如实施方案39的核酸，其中所述缺失包含所述c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l基因中的每个。
[0786]
41.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂的基因的缺失。
[0787]
42.如实施方案1至41中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂的基因的缺失。
[0788]
43.如实施方案41或42的核酸，其中编码凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂的所述基因为f1l。
[0789]
44.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码bcl
‑
2抑制剂的基因的缺失。
[0790]
45.如实施方案1至44中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码bcl
‑
2抑制剂的基因的缺失。
[0791]
46.如实施方案44或45的核酸，其中编码bcl
‑
2抑制剂的所述基因为n1l。
[0792]
47.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码dutpase的基因的缺失。
[0793]
48.如实施方案1至47中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码dutpase的基因的缺失。
[0794]
49.如实施方案46或47的核酸，其中编码dutpase的所述基因为f2l。
[0795]
50.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码ifn
‑
α/β受体样分泌糖蛋白的基因的缺失。
[0796]
51.如实施方案1至50中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码ifn
‑
α/β受体样分泌糖蛋白的基因的缺失。
[0797]
52.如实施方案50或51的核酸，其中编码ifn
‑
α/β受体样分泌糖蛋白的所述基因为b19r。
[0798]
53.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码il
‑1‑
β抑制剂的基因的缺失。
[0799]
54.如实施方案1至53中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码il
‑1‑
β抑制剂的基因的缺失。
[0800]
55.如实施方案53或54的核酸，其中编码il
‑1‑
β抑制剂的所述基因为b16r。
[0801]
56.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码磷脂酶
‑
d的基因的缺失。
[0802]
57.如实施方案1至56中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码磷脂酶
‑
d的基因的缺失。
[0803]
58.如实施方案56或57的核酸，其中编码磷脂酶
‑
d的所述基因为k4l。
[0804]
59.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码pkr抑制剂的基因的缺失。
[0805]
60.如实施方案1至59中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码pkr抑制剂的基因的缺失。
[0806]
61.如实施方案59或60的核酸，其中编码pkr抑制剂的所述基因为k3l。
[0807]
62.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因的缺失。
[0808]
63.如实施方案1至62中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因的缺失。
[0809]
64.如实施方案62或63的核酸，其中编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的所述基因为k2l。
[0810]
65.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码tlr信号传导抑制剂的基因的缺失。
[0811]
66.如实施方案1至65中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码tlr信号传导抑制剂的基因的缺失。
[0812]
67.如实施方案65或66的核酸，其中编码tlr信号传导抑制剂的所述基因为n2l。
[0813]
68.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码kelch样蛋白的基因的缺失。
[0814]
69.如实施方案1至68中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码kelch样蛋白的基因的缺失。
[0815]
70.如实施方案69的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个各自编码kelch样蛋白的基因的缺失。
[0816]
71.如实施方案68至70中任一项的核酸，其中编码kelch样蛋白的所述基因独立地选自由f3l和c2l组成的组。
[0817]
72.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码单甘油酯脂肪酶的基因的缺失。
[0818]
73.如实施方案1至72中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码单甘油酯脂肪酶的基因的缺失。
[0819]
74.如实施方案73的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个各自编码单甘油酯脂肪酶的基因的缺失。
[0820]
75.如实施方案72至74中任一项的核酸，其中编码单甘油酯脂肪酶的所述基因独立地选自由k5l和k6l组成的组。
[0821]
76.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码nf
‑
κb抑制剂的基因的缺失。
[0822]
77.如实施方案1至76中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码nf
‑
κb抑制剂的基因的缺失。
[0823]
78.如实施方案77的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个各自编码nf
‑
κb抑制剂的基因的缺失。
[0824]
79.如实施方案78的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少3个各自编码nf
‑
κb抑制剂的基因的缺失。
[0825]
80.如实施方案76至79中任一项的核酸，其中编码nf
‑
κb抑制剂的所述基因独立地选自由k7r、k1l及m2l组成的组。
[0826]
81.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码锚蛋白重复序列蛋白的基因的缺失。
[0827]
82.如实施方案1至81中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码锚蛋白重复序列蛋白的基因的缺失。
[0828]
83.如实施方案82的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个各自编码锚蛋白重复序列蛋白的基因的缺失。
[0829]
84.如实施方案83的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少3个各自编码锚蛋白重复序列蛋白的基因的缺失。
[0830]
85.如实施方案81至84中任一项的核酸，其中编码锚蛋白重复序列蛋白的所述基因独立地选自由b18r、b20r及m1l组成的组。
[0831]
86.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由b15r、b17r及b14r组成的组的基因的缺失。
[0832]
87.如实施方案1至86中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由b15r、b17r及b14r组成的组的基因的缺失。
[0833]
88.如实施方案87的核酸，其中所述缺失包含至少2个各独立地选自由b15r、b17r及b14r组成的组的基因。
[0834]
89.如实施方案88的核酸，其中所述缺失包含所述b15r、b17r及b14r基因中的每个。
[0835]
90.如实施方案1至89中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的itr基因的组的基因的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0836]
91.如实施方案90的核酸，其中所述缺失包含至少2个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0837]
92.如实施方案91的核酸，其中所述缺失包含至少3个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0838]
93.如实施方案92的核酸，其中所述缺失包含至少4个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0839]
94.如实施方案93的核酸，其中所述缺失包含至少5个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0840]
95.如实施方案94的核酸，其中所述缺失包含至少6个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0841]
96.如实施方案95的核酸，其中所述缺失包含至少7个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0842]
97.如实施方案96的核酸，其中所述缺失包含至少8个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0843]
98.如实施方案97的核酸，其中所述缺失包含所述b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r基因中的每个。
[0844]
99.
[0845]
100.
[0846]
102.如实施方案101的核酸，其中所述痘苗病毒为选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
‑
1、修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)、dairen i、glv
‑
1h68、ihd
‑
j、l
‑
ivp、lc16m8、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
‑
1。
[0847]
103.如实施方案101的核酸，其中所述痘苗病毒为选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、tian tan、wyeth及lister。
[0848]
104.如实施方案101的核酸，其中所述痘苗病毒为copenhagen株痘苗病毒。
[0849]
105.如实施方案1至104中任一项的核酸，其中所述缺失中的每个为编码对应基因的整个多核苷酸的缺失。
[0850]
106.如实施方案1至104中任一项的核酸，其中所述缺失中的每个为编码对应基因的多核苷酸的一部分的缺失，且其中所述缺失足以致使所述基因在引入宿主细胞中之后无功能。
[0851]
107.如实施方案1至106中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含编码肿瘤相关抗原的转基因。
[0852]
108.如实施方案107的核酸，其中所述肿瘤相关抗原为表3至表30中的任一个中列举的肿瘤相关抗原。
[0853]
109.如实施方案107的核酸，其中所述肿瘤相关抗原为选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原：cd19、cd33、epcam、cea、psma、egfrviii、cd133、egfr、cdh19、enpp3、dll3、msln、ror1、her2、hlaa2、epha2、epha3、mcsp、cspg4、ng2、ron、flt3、bcma、cd20、fapα、frα、ca
‑
9、pdgfrα、pdgfrβ、fsp1、s100a4、adam12m、ret、met、fgfr、insr及ntrk。
[0854]
110.如实施方案107的核酸，其中所述肿瘤相关抗原包含mage
‑
a3或其一个或多个片段。
[0855]
111.如实施方案107的核酸，其中所述肿瘤相关抗原包含ny
‑
eso
‑
1或其一个或多个片段。
[0856]
112.如实施方案107的核酸，其中所述肿瘤相关抗原包含一种或多种人乳头瘤病毒(hpv)蛋白或其片段。
[0857]
113.如实施方案107的核酸，其中所述肿瘤相关抗原包含(i)hpv16的e6和e7蛋白或其片段及(ii)hpv18的e6和e7蛋白或其片段。
[0858]
114.如实施方案107的核酸，其中所述肿瘤相关抗原包含短尾蛋白或其一个或多个片段。
[0859]
115.如实施方案107的核酸，其中所述肿瘤相关抗原包含前列腺酸磷酸酶或其一个或多个片段。
[0860]
116.一种产生如实施方案107至115中任一项的核酸的方法，所述方法包括：
[0861]
a.将转座子插入位点引入如实施方案1至106中任一项的核酸中；
[0862]
b.使(a)中形成的核酸与包含编码所述肿瘤相关抗原的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述核酸中；及
[0863]
c.回收(b)中形成的核酸。
[0864]
117.如实施方案1至115中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含编码免疫检查点抑制剂的转基因。
[0865]
118.如实施方案117的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。
[0866]
119.如实施方案117的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[0867]
120.如实施方案117的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。
[0868]
121.如实施方案117的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[0869]
122.一种产生如实施方案117至121中任一项的核酸的方法，所述方法包括：
[0870]
a.将转座子插入位点引入如实施方案1至116中任一项的核酸中；
[0871]
b.使(a)中形成的核酸与包含编码所述免疫检查点抑制剂的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述核酸中；及
[0872]
c.回收(b)中形成的核酸。
[0873]
123.如实施方案1至115及117至121中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含编码白介素(il)的转基因。
[0874]
124.如实施方案123的核酸，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。
[0875]
125.如实施方案123的核酸，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。
[0876]
126.如实施方案125的核酸，其中所述白介素为膜结合的。
[0877]
127.一种产生如实施方案123至126中一项的核酸的方法，所述方法包括：
[0878]
a.将转座子插入位点引入如实施方案1至115及117至121中任一项的核酸中；
[0879]
b.使(a)中形成的核酸与包含编码所述白介素的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述核酸中；及
[0880]
c.回收(b)中形成的核酸。
[0881]
128.如实施方案1至115、117至121及123至126中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含编码干扰素(ifn)的转基因。
[0882]
129.如实施方案128的核酸，其中所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[0883]
130.一种产生如实施方案128或129的核酸的方法，所述方法包括：
[0884]
a.将转座子插入位点引入如实施方案1至115、117至121及123至126中任一项的核酸中；
[0885]
b.使(a)中形成的核酸与包含编码所述干扰素的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述核酸中；及
[0886]
c.回收(b)中形成的核酸。
[0887]
131.如实施方案1至115、117至121、123至126、128及129中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含编码tnf超家族成员蛋白的转基因。
[0888]
132.如实施方案131的核酸，其中所述tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[0889]
133.一种产生如实施方案131或132的核酸的方法，所述方法包括：
[0890]
a.将转座子插入位点引入如实施方案1至115、117至121、123至126、128及129中任一项的核酸中；
[0891]
b.使(a)中形成的核酸与包含编码所述tnf超家族成员蛋白的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述核酸中；及
[0892]
c.回收(b)中形成的核酸。
[0893]
134.如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131及132中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含编码细胞因子的转基因。
[0894]
135.如实施方案134的核酸，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、抗tgf
‑
β、抗vegf
‑
r2及cgas(脒基腺苷酸环化酶)。
[0895]
136.如实施方案134的核酸，其中所述细胞因子为flt3配体。
[0896]
137.一种产生如实施方案135或136的核酸的方法，所述方法包括：
[0897]
a.将转座子插入位点引入如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131及132中任一项的核酸中；
[0898]
b.使(a)中形成的核酸与包含编码所述细胞因子的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述核酸中；及
[0899]
c.回收(b)中形成的核酸。
[0900]
138.如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132及134至136中任一项的核酸，其中所述核酸进一步包含编码微rna(mirna)的转基因。
[0901]
139.如实施方案138的核酸，其中所述mirna为mir
‑
6。
[0902]
140.一种产生如实施方案138或139的核酸的方法，所述方法包括：
[0903]
a.将转座子插入位点引入如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132及134至136中任一项的核酸中；
[0904]
b.使(a)中形成的核酸与包含编码所述mirna的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述核酸中；及
[0905]
c.回收(b)中形成的核酸。
[0906]
141.一种重组正痘病毒载体，其包含至少2个基因的缺失，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0907]
142.如实施方案141的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少3个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0908]
143.如实施方案142的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少4个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0909]
144.如实施方案143的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少5个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、
b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0910]
145.如实施方案144的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少6个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0911]
146.如实施方案145的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少7个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0912]
147.如实施方案146的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少8个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0913]
148.如实施方案147的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少9个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0914]
149.如实施方案148的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少10个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0915]
150.如实施方案149的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少11个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0916]
151.如实施方案150的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少12个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0917]
152.如实施方案151的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少13个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0918]
153.如实施方案152的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少14个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0919]
154.如实施方案153的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少15个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0920]
155.如实施方案154的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少16个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0921]
156.如实施方案155的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少17个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0922]
157.如实施方案156的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少18个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、
b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0923]
158.如实施方案157的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少19个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0924]
159.如实施方案158的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少20个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0925]
160.如实施方案159的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含至少21个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r。
[0926]
161.如实施方案160的重组正痘病毒载体，其中所述缺失包含所述f1l、n1l、b14r、m2l、k1l、k7r、c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r、b19r、k4l、k5l、k6l、f2l、b15r、b17l、b18r及b20r基因中的每个。
[0927]
162.一种重组正痘病毒载体，其包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0928]
163.如实施方案141至162中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0929]
164.如实施方案163的载体，其中所述缺失包含至少2个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0930]
165.如实施方案164的载体，其中所述缺失包含至少3个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0931]
166.如实施方案165的载体，其中所述缺失包含至少4个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0932]
167.如实施方案166的载体，其中所述缺失包含至少5个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r。
[0933]
168.如实施方案167的载体，其中所述缺失包含b14r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r中的每个。
[0934]
169.一种重组正痘病毒载体，其包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0935]
170.如实施方案141至169中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0936]
171.如实施方案170的载体，其中所述缺失包含至少2个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0937]
172.如实施方案171的载体，其中所述缺失包含至少3个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0938]
173.如实施方案172的载体，其中所述缺失包含至少4个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0939]
174.如实施方案173的载体，其中所述缺失包含至少5个基因，各基因独立地选自
由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0940]
175.如实施方案174的载体，其中所述缺失包含至少6个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0941]
176.如实施方案175的载体，其中所述缺失包含至少7个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0942]
177.如实施方案176的载体，其中所述缺失包含至少8个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0943]
178.如实施方案177的载体，其中所述缺失包含至少9个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0944]
179.如实施方案178的载体，其中所述缺失包含至少10个基因，各基因独立地选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l。
[0945]
180.如实施方案179的载体，其中所述缺失包含c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、k1l、k2l、k3l、k4l、k7r及f2l中的每个。
[0946]
181.一种重组正痘病毒载体，其包含至少1个编码凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂的基因的缺失。
[0947]
182.如实施方案141至181中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂的基因的缺失。
[0948]
183.如实施方案181或182的载体，其中编码凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂的所述基因为f1l。
[0949]
184.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码bcl
‑
2抑制剂的基因的缺失。
[0950]
185.如实施方案141至184中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码bcl
‑
2抑制剂的基因的缺失。
[0951]
186.如实施方案184或185的载体，其中编码bcl
‑
2抑制剂的所述基因为n1l。
[0952]
187.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码dutpase的基因的缺失。
[0953]
188.如实施方案141至187中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码dutpase的基因的缺失。
[0954]
189.如实施方案187或188的载体，其中编码dutpase的所述基因为f2l。
[0955]
190.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码ifn
‑
α/β受体样分泌糖蛋白的基因的缺失。
[0956]
191.如实施方案141至190中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码ifn
‑
α/β受体样分泌糖蛋白的基因的缺失。
[0957]
192.如实施方案190或191的载体，其中编码ifn
‑
α/β受体样分泌糖蛋白的所述基因为b19r。
[0958]
193.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码il
‑1‑
β抑制剂的基因的缺失。
[0959]
194.如实施方案141至193中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码il
‑1‑
β抑制剂的基因的缺失。
[0960]
195.如实施方案193或194的载体，其中编码il
‑1‑
β抑制剂的所述基因为b16r。
[0961]
196.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码磷脂酶
‑
d的基因的缺失。
[0962]
197.如实施方案141至196中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码磷脂酶
‑
d的基因的缺失。
[0963]
198.如实施方案196或197的载体，其中编码磷脂酶
‑
d的所述基因为k4l。
[0964]
199.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码pkr抑制剂的基因的缺失。
[0965]
200.如实施方案141至199中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码pkr抑制剂的基因的缺失。
[0966]
201.如实施方案199或200的载体，其中编码pkr抑制剂的所述基因为k3l。
[0967]
202.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因的缺失。
[0968]
203.如实施方案141至202中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因的缺失。
[0969]
204.如实施方案202或203的载体，其中编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的所述基因为k2l。
[0970]
205.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码tlr信号传导抑制剂的基因的缺失。
[0971]
206.如实施方案141至205中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码tlr信号传导抑制剂的基因的缺失。
[0972]
207.如实施方案205或206的载体，其中编码tlr信号传导抑制剂的所述基因为n2l。
[0973]
208.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码kelch样蛋白的基因的缺失。
[0974]
209.如实施方案141至208中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码kelch样蛋白的基因的缺失。
[0975]
210.如实施方案209的载体，其中所述载体包含至少2个各自编码kelch样蛋白的基因的缺失。
[0976]
211.如实施方案208至210中任一项的载体，其中编码kelch样蛋白的所述基因独立地选自由f3l和c2l组成的组。
[0977]
212.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码单甘油酯脂肪酶的基因的缺失。
[0978]
213.如实施方案141至212中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码单甘油酯脂肪酶的基因的缺失。
[0979]
214.如实施方案213的载体，其中所述载体包含至少2个各自编码单甘油酯脂肪酶的基因的缺失。
[0980]
215.如实施方案212至214中任一项的载体，其中编码单甘油酯脂肪酶的所述基因独立地选自由k5l和k6l组成的组。
[0981]
216.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码nf
‑
κb抑制剂的基因的缺失。
[0982]
217.如实施方案141至216中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码nf
‑
κb抑制剂的基因的缺失。
[0983]
218.如实施方案217的载体，其中所述缺失包含至少2个各自编码nf
‑
κb抑制剂的基因的缺失。
[0984]
219.如实施方案218的载体，其中所述缺失包含至少3个各自编码nf
‑
κb抑制剂的基因的缺失。
[0985]
220.如实施方案216至219中任一项的载体，其中编码nf
‑
κb抑制剂的所述基因独立地选自由k7r、k1l及m2l组成的组。
[0986]
221.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码锚蛋白重复序列蛋白的基因的缺失。
[0987]
222.如实施方案141至221中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个编码锚蛋白重复序列蛋白的基因的缺失。
[0988]
223.如实施方案222的载体，其中所述缺失包含至少2个各自编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。
[0989]
224.如实施方案223的载体，其中所述缺失包含至少3个各自编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。
[0990]
225.如实施方案中任一项221至224的重组正痘病毒载体，其中编码锚蛋白重复序列蛋白的所述基因独立地选自由b18r、b20r及m1l组成的组。
[0991]
226.一种重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个选自由b15r、b17r及b14r组成的组的基因的缺失。
[0992]
227.如实施方案1至226中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个选自由b15r、b17r及b14r组成的组的基因的缺失。
[0993]
228.如实施方案227的载体，其中所述缺失包含至少2个基因，各基因独立地选自由b15r、b17r及b14r组成的组。
[0994]
229.如实施方案228的载体，其中所述缺失包含所述b15r、b17r及b14r基因中的每个。
[0995]
230.如实施方案141至229中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体包含至少1个选自由以下组成的itr基因的组的基因的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0996]
231.如实施方案230的载体，其中所述缺失包含至少2个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0997]
232.如实施方案231的载体，其中所述缺失包含至少3个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0998]
233.如实施方案232的载体，其中所述缺失包含至少4个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[0999]
234.如实施方案233的载体，其中所述缺失包含至少5个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[1000]
235.如实施方案234的载体，其中所述缺失包含至少6个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[1001]
236.如实施方案235的载体，其中所述缺失包含至少7个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[1002]
237.如实施方案236的载体，其中所述缺失包含至少8个基因，各基因独立地选自由以下组成的itr基因的组：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r。
[1003]
238.如实施方案237的载体，其中所述缺失包含b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r中的每个。
[1004]
239.
[1005]
242.如实施方案241的重组正痘病毒载体，其中所述痘苗病毒为选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
‑
1、修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)、dairen i、glv
‑
1h68、ihd
‑
j、l
‑
ivp、lc16m8、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
‑
1。
[1006]
243.如实施方案241的重组正痘病毒载体，其中所述痘苗病毒为选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、tian tan、wyeth及lister。
[1007]
244.如实施方案241的重组正痘病毒载体，其中所述痘苗病毒为copenhagen株痘苗病毒。
[1008]
245.如实施方案141至244中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述缺失为编码对应基因的整个多核苷酸的缺失。
[1009]
246.如实施方案141至244中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述缺失中的每个为编码对应基因的多核苷酸的一部分的缺失，且其中所述缺失足以致使所述基因在引入宿主细胞中之后无功能。
[1010]
247.如实施方案14141至246中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述载体进一步包含编码肿瘤相关抗原的转基因。
[1011]
248.如实施方案141至247中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体进一步包含编码肿瘤相关抗原的转基因。
[1012]
249.如实施方案248的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤相关抗原为表3至表30中的任一个中列举的肿瘤相关抗原。
[1013]
250.如实施方案248的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤相关抗原为选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原：cd19、cd33、epcam、cea、psma、egfrviii、cd274、egfr、cdh19、enpp3、dll3、msln、ror1、her2、hlaa2、epha2、epha3、mcsp、cspg4、ng2、ron、flt3、bcma、cd20、fapα、frα、ca
‑
9、pdgfrα、pdgfrβ、fsp1、s100a4、adam12m、ret、met、fgfr、insr及ntrk。
[1014]
251.如实施方案248的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤相关抗原包含mage
‑
a3或其一个或多个片段。
[1015]
252.如实施方案248的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤相关抗原包含ny
‑
eso
‑
1或其一个或多个片段。
[1016]
253.如实施方案248的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤相关抗原包含一种或多种人乳头瘤病毒(hpv)蛋白或其片段。
[1017]
254.如实施方案248的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤相关抗原包含(i)hpv16
的e6和e7蛋白或其片段及(ii)hpv18的e6和e7蛋白或其片段。
[1018]
255.如实施方案248的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤相关抗原包含短尾蛋白或其一个或多个片段。
[1019]
256.如实施方案248的重组正痘病毒载体，其中所述肿瘤相关抗原包含前列腺酸磷酸酶或其一个或多个片段。
[1020]
257.一种产生如实施方案248至256中任一项的重组正痘病毒载体的方法，所述方法包括：
[1021]
d.将转座子插入位点引入如实施方案141至247中任一项的重组正痘病毒载体中；
[1022]
e.使(a)中形成的重组正痘病毒载体与包含编码所述肿瘤相关抗原的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述重组正痘病毒载体中；及
[1023]
f.回收(b)中形成的重组正痘病毒载体。
[1024]
258.如实施方案141至256中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体进一步包含编码免疫检查点抑制剂的转基因。
[1025]
259.如实施方案258的重组正痘病毒载体，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。
[1026]
260.如实施方案258的重组正痘病毒载体，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1027]
261.如实施方案258的重组正痘病毒载体，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。
[1028]
262.如实施方案258的重组正痘病毒载体，其中所述免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1029]
263.一种产生如实施方案258至262中任一项的重组正痘病毒载体的方法，所述方法包括：
[1030]
d.将转座子插入位点引入如实施方案141至257中任一项的重组正痘病毒载体中；
[1031]
e.使(a)中形成的重组正痘病毒载体与包含编码所述免疫检查点抑制剂的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述重组正痘病毒载体中；及
[1032]
f.回收(b)中形成的重组正痘病毒载体。
[1033]
264.如实施方案141至256及258至262中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体进一步包含编码白介素(il)的转基因。
[1034]
265.如实施方案264的重组正痘病毒载体，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。
[1035]
266.如实施方案264的重组正痘病毒载体，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。
[1036]
267.如实施方案266的重组正痘病毒载体，其中所述白介素为膜结合的。
[1037]
268.一种产生如实施方案264至267中之一项的重组正痘病毒载体的方法，所述方法包括：
[1038]
d.将转座子插入位点引入如实施方案141至256及258至262中任一项的重组正痘病毒载体中；
[1039]
e.使(a)中形成的重组正痘病毒载体与包含编码所述白介素的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述重组正痘病毒载体中；及
[1040]
f.回收(b)中形成的重组正痘病毒载体。
[1041]
269.如实施方案141至256、258至262及264至267中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体进一步包含编码干扰素(ifn)的转基因。
[1042]
270.如实施方案269的重组正痘病毒载体，其中所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[1043]
271.一种产生如实施方案269或270的重组正痘病毒载体的方法，所述方法包括：
[1044]
d.将转座子插入位点引入如实施方案141至256、258至262及264至267中任一项的重组正痘病毒载体中；
[1045]
e.使(a)中形成的重组正痘病毒载体与包含编码所述干扰素的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述重组正痘病毒载体中；及
[1046]
f.回收(b)中形成的重组正痘病毒载体。
[1047]
272.如实施方案141至256、258至262、264至267、269及270中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体进一步包含编码tnf超家族成员蛋白的转基因。
[1048]
273.如实施方案272的重组正痘病毒载体，其中所述tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[1049]
274.一种产生如实施方案272或273的重组正痘病毒载体的方法，所述方法包括：
[1050]
d.将转座子插入位点引入如实施方案141至256、258至262、264至267、269及270中任一项的重组正痘病毒载体中；
[1051]
e.使(a)中形成的重组正痘病毒载体与包含编码所述tnf超家族成员蛋白的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述重组正痘病毒载体中；及
[1052]
f.回收(b)中形成的重组正痘病毒载体。
[1053]
275.如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272及273中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体进一步包含编码细胞因子的转基因。
[1054]
276.如实施方案275的重组正痘病毒载体，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、抗tgf
‑
β、抗vegf
‑
r2及cgas(脒基腺苷酸环化酶)。
[1055]
277.如实施方案275的重组正痘病毒载体，其中所述细胞因子为flt3配体。
[1056]
278.一种产生如实施方案276或277的重组正痘病毒载体的方法，所述方法包括：
[1057]
d.将转座子插入位点引入如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272及273中任一项的重组正痘病毒载体中；
[1058]
e.使(a)中形成的重组正痘病毒载体与包含编码所述细胞因子的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述重组正痘病毒载体中；及
[1059]
f.回收(b)中形成的重组正痘病毒载体。
[1060]
279.如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273及275至277中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述重组正痘病毒载体进一步包含编码微rna(mirna)的转基因。
[1061]
280.如实施方案279的重组正痘病毒载体，其中所述mirna为mir
‑
6。
[1062]
281.一种产生如实施方案279或280的重组正痘病毒载体的方法，所述方法包括：
[1063]
d.将转座子插入位点引入如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273及275至277中任一项的重组正痘病毒载体中；
[1064]
e.使(a)中形成的重组正痘病毒载体与包含编码所述mirna的基因的转座元件接触，从而将所述基因引入所述重组正痘病毒载体中；及
[1065]
f.回收(b)中形成的重组正痘病毒载体。
[1066]
282.如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138及139中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273、275至277、279及280中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述核酸或所述重组正痘病毒载体包含胸苷激酶(tk)基因。
[1067]
283.如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138、139及282中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273、275至277、279、280及282中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述核酸或所述重组正痘病毒载体包含核糖核苷酸还原酶基因。
[1068]
284.如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138、139、282及283中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273、275至277、279、280、282及283中任一项的重组正痘病毒载体，其中在使哺乳动物细胞群体与所述核酸或所述重组正痘病毒载体接触后，细胞相对于与不包含所述缺失的正痘病毒载体的形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体展现增加的合胞体形成。
[1069]
285.如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138、139及282至284中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273、275至277、279、280及282至284中任一项的重组正痘病毒载体，其中在使哺乳动物细胞群体与所述核酸或所述重组正痘病毒载体接触后，细胞相对于与不包含所述缺失的正痘病毒载体的形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体展现增加的正痘病毒载体扩散。
[1070]
286.如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138、139及282至285中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273、275至277、279、280及282至285中任一项的重组正痘病毒载体，其中所述核酸或所述重组正痘病毒载体相对于不包含所述缺失的正痘病毒载体形式对哺乳动物细胞群体发挥增加的细胞毒性效应。
[1071]
287.如实施方案284至286中任一项的核酸或重组正痘病毒载体，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
[1072]
288.如实施方案287的核酸或重组正痘病毒载体，其中所述人细胞为癌细胞。
[1073]
289.如实施方案284至286中任一项的核酸或重组正痘病毒载体，其中所述哺乳动物细胞来自选自由以下组成的组的细胞系：u2os、293、293t、vero、hela、a549、bhk、bsc40、cho、ovcar
‑
8、786
‑
0、nci
‑
h23、u251、sf
‑
295、t
‑
47d、skmel2、bt
‑
549、sk
‑
mel
‑
28、mda
‑
mb
‑
231、sk
‑
ov
‑
3、mcf7、m14、sf
‑
268、caki
‑
1、hpav、ovcar
‑
4、hct15、k
‑
562及hct
‑
116。
[1074]
290.一种包装细胞系，其包含如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138、139及282至289中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至
262、264至267、269、270、272、273、275至277、279、280及282至289中任一项的重组正痘病毒载体。
[1075]
291.一种治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138、139及282至289中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273、275至277、279、280及282至289中任一项的重组正痘病毒载体。
[1076]
292.如实施方案291的方法，其中所述哺乳动物患者为人患者。
[1077]
293.如实施方案291或292的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌及咽喉癌。
[1078]
294.如实施方案291或292的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：急性淋巴母细胞白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、肾上腺皮质癌、aids相关淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文氏肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性赘瘤、结肠癌、肝外胆管癌、乳腺管原位癌(dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆氏肿瘤及其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤t细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、上皮卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西氏肉瘤、横纹肌肉瘤、塞泽里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌及华氏巨球蛋白血症。
[1079]
295.如实施方案291至294中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用免疫检查点抑制剂。
[1080]
296.如实施方案295的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。
[1081]
297.如实施方案295的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1082]
298.如实施方案295的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。
[1083]
299.如实施方案295的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1084]
300.如实施方案291至299中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用白介素。
[1085]
301.如实施方案300的方法，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。
[1086]
302.如实施方案300的方法，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。
[1087]
303.如实施方案301或302的方法，其中所述白介素为膜结合的。
[1088]
304.如实施方案291至303中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用干扰素。
[1089]
305.如实施方案304的方法，其中所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[1090]
306.如实施方案291至305中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用tnf超家族成员蛋白。
[1091]
307.如实施方案306的方法，其中所述tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[1092]
308.如实施方案291至307中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用细胞因子。
[1093]
309.如实施方案308的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、抗tgf
‑
β、抗vegf
‑
r2及cgas(脒基腺苷酸环化酶)。
[1094]
310.如实施方案308的方法，其中所述细胞因子为flt3配体。
[1095]
311.如实施方案291至310中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用mirna。
[1096]
312.如实施方案311的方法，其中所述mirna为mir
‑
6。
[1097]
313.一种试剂盒，其包含如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138、139及282至289中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273、275至277、279、280及282至289中任一项的重组正痘病毒载体和指导所述试剂盒的使用者在宿主细胞中表达所述核酸或所述载体的药品说明书。
[1098]
314.一种试剂盒，其包含如实施方案1至115、117至121、123至126、128、129、131、132、134至136、138、139及282至289中任一项的核酸或如实施方案141至256、258至262、264至267、269、270、272、273、275至277、279、280及282至289中任一项的重组正痘病毒载体和指导使用者向患有癌症的哺乳动物患者施用治疗有效量的所述核酸或重组正痘病毒载体从而治疗所述癌症的药品说明书。
[1099]
315.如实施方案314的试剂盒，其中所述哺乳动物患者为人患者。
[1100]
316.如前述实施方案中任一项的正痘病毒，其中所述b8r基因是缺失的。
[1101]
317.如实施方案316的正痘病毒，其中至少一个转基因插入到缺失b8r基因的基因
座中。
[1102]
318.如实施方案317的正痘病毒，其中至少两个转基因插入到缺失b8r基因的基因座中。
[1103]
319.如实施方案318的正痘病毒，其中至少三个转基因插入到缺失b8r基因的基因座中。
[1104]
320.如实施方案316至319中任一项的正痘病毒，其中至少一个额外转基因插入到并非b8r基因的基因座的基因座处。
[1105]
321.如实施方案320的正痘病毒，其中所述基因座为5p缺失的边界。
[1106]
322.如实施方案321的正痘病毒，其中所述基因座为3p缺失的边界。
[1107]
323.如实施方案316至322的正痘病毒，其中插入以下转基因中的至少一个：il
‑
12tm、flt3
‑
l或抗clta
‑
4抗体。
[1108]
324.如实施方案323的正痘病毒，其中il
‑
12
‑
tm及flt3
‑
l基因插入到缺失b8r基因的基因座中。
[1109]
325.如实施方案323至324中任一项的正痘病毒，其中抗clta
‑
4抗体插入5p缺失的边界内。
[1110]
326.如实施方案323至325中任一项的正痘病毒，其中所述病毒包含seq id.no:210的序列。
[1111]
326.如实施方案323至325中任一项的正痘病毒，其中所述抗clta抗体为seq id no:211。
[1112]
327.如实施方案323至326中任一项的正痘病毒，其中所述il
‑
12
‑
tm为seq id no:212。
[1113]
328.如实施方案323至327中任一项的正痘病毒，其中所述flt3
‑
l为seq id no:213。
[1114]
329.一种正痘病毒，其包含一核酸序列，其中所述核酸序列为seq id no:210的衍生物，
[1115]
其中所述衍生物包含seq id no:210的b8r基因的缺失，
[1116]
其中il
‑
12
‑
tm和flt3
‑
l转基因插入到所述缺失b8r基因的基因座中，
[1117]
其中编码抗clta
‑
4抗体的重链和轻链的基因插入seq id no:210中存在的5p缺失的边界内；
[1118]
其中il
‑
12
‑
tm为seq id no:212；
[1119]
其中flt3
‑
l为seq id no:213；且
[1120]
其中抗clta4抗体是由seq id no:211编码。
[1121]
5.7.2.组2
[1122]
1.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1123]
2.如实施方案1的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1124]
3.如实施方案2的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1125]
4.如实施方案3的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1126]
5.如实施方案4的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1127]
6.如实施方案5的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少7个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1128]
7.如实施方案6的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少8个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1129]
8.如实施方案7的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少9个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1130]
9.如实施方案8的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少10个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1131]
10.如实施方案9的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少11个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1132]
11.如实施方案10的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少12个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1133]
12.如实施方案11的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少13个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1134]
13.如实施方案12的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少14个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1135]
14.如实施方案13的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少15个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1136]
15.如实施方案14的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少16个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1137]
16.如实施方案15的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少17个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1138]
17.如实施方案16的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少18个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1139]
18.如实施方案17的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少19个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1140]
19.如实施方案18的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少20个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1141]
20.如实施方案19的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少21个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1142]
21.如实施方案20的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少22个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1143]
22.如实施方案21的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1144]
23.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1145]
24.如实施方案23的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1146]
25.如实施方案24的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1147]
26.如实施方案25的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1148]
27.如实施方案26的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1149]
28.如实施方案27的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1150]
29.如实施方案28的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1151]
30.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1152]
31.如实施方案30的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个基因的缺
失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1153]
32.如实施方案31的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1154]
33.如实施方案32的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1155]
34.如实施方案33的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1156]
35.如实施方案34的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1157]
36.如实施方案35的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少7个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1158]
37.如实施方案36的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少8个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1159]
38.如实施方案37的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少9个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1160]
39.如实施方案38的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少10个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1161]
40.如实施方案39的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少11个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1162]
41.如实施方案40的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少12个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1163]
42.如实施方案41的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少13个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1164]
43.如实施方案42的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少14个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1165]
44.如实施方案43的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少15个基因的缺
失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1166]
45.如实施方案44的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1167]
46.如实施方案1至45中任一项的包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码参与宿主相互作用的蛋白质的基因的缺失。
[1168]
47.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质影响与细胞外基质的非钙依赖性粘着。
[1169]
48.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为nf
‑
κb抑制剂。
[1170]
49.如实施方案48的核酸，其中所述蛋白质是由选自由以下组成的组的基因编码：c2l、n1l、m2l、k1l及k7r基因。
[1171]
50.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为细胞凋亡抑制剂。
[1172]
51.如实施方案47的核酸，其中所述细胞凋亡抑制剂为凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂。
[1173]
52.如实施方案51的核酸，其中所述凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂是由f1l基因编码。
[1174]
53.如实施方案50的核酸，其中所述细胞凋亡抑制剂为bcl
‑
2样蛋白。
[1175]
54.如实施方案53的核酸，其中所述bcl
‑
2样蛋白是由n1l编码。
[1176]
55.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为干扰素调控因子3(irf3)抑制剂。
[1177]
56.如实施方案55的核酸，其中所述irf3抑制剂是由n2l或k7r编码。
[1178]
57.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为丝氨酸蛋白酶抑制剂。
[1179]
58.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质防止细胞融合。
[1180]
59.如实施方案58的核酸，其中所述蛋白质是由k2l编码。
[1181]
60.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为rna活化蛋白激酶(pkr)抑制剂。
[1182]
61.如实施方案60的核酸，其中所述蛋白质是由k1l或k3l编码。
[1183]
62.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为毒力因子。
[1184]
63.如实施方案63的核酸，其中所述蛋白质是由f3l编码。
[1185]
64.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为il
‑1‑
β抑制剂。
[1186]
65.如实施方案64的核酸，其中所述蛋白质是由b16r编码。
[1187]
66.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为分泌ifnα螯合剂。
[1188]
67.如实施方案67的核酸，其中所述蛋白质是由b19r编码。
[1189]
68.如实施方案1至67中任一项的包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码参与dna复制的蛋白质的基因的缺失。
[1190]
69.如实施方案68的核酸，其中所述蛋白质为dna修饰核酸酶。
[1191]
70.如实施方案69的核酸，其中所述蛋白质是由k4l编码。
[1192]
71.如实施方案70的核酸，其中所述蛋白质为脱氧尿苷三磷酸酶(dutpase)。
[1193]
72.如实施方案71的核酸，其中所述dutpase是由f2l编码。
[1194]
73.如实施方案1至72中任一项的核酸，其中至少一个缺失基因的整个核苷酸序列缺失。
[1195]
74.如实施方案1至72中任一项的核酸，其中至少一个缺失基因为仅部分缺失的，且其中部分缺失足以致使所述部分缺失基因在引入宿主细胞中之后无功能。
[1196]
75.如实施方案1至74中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含反向末
端重复序列(itr)的至少两个拷贝。
[1197]
76.如实施方案1至74中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组缺乏itr的任何拷贝。
[1198]
77.如实施方案1至74中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含选自由以下组成的组的itr的至少一个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[1199]
78.如1至74实施方案中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含itr的至少所有以下拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[1200]
79.如实施方案1至78中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含b8r基因中的缺失。
[1201]
80.如实施方案1至78中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含完整b8r基因。
[1202]
81.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含
[1203]
(i)以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r及b8r基因；及
[1204]
(ii)以下itr的每个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[1205]
82.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含
[1206]
(i)以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；及
[1207]
(ii)以下itr的每个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr，
[1208]
其中所述重组正痘病毒基因组包含完整b8r基因。
[1209]
83.如实施方案1至82中任一项的核酸，其进一步包含至少一个选自由以下组成的组的转基因：编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。
[1210]
84.如实施方案83的核酸，其中所述核酸包含至少两个选自由以下组成的组的转基因：编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。
[1211]
85.如实施方案84的核酸，其中所述核酸包含编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。
[1212]
86.如实施方案83或84中任一项的核酸，其中所述核酸包含编码免疫检查点抑制剂的转基因。
[1213]
87.如实施方案85或86的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。
[1214]
88.如实施方案87的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd
‑
l1抗体或其抗原结
合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1215]
89.如实施方案88的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。
[1216]
90.如实施方案88的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1217]
91.如实施方案83或84的核酸，其中所述核酸包含编码白介素(il)的转基因。
[1218]
92.如实施方案85或91的核酸，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。
[1219]
93.如实施方案92的核酸，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。
[1220]
94.如实施方案93的核酸，其中所述白介素为膜结合的。
[1221]
95.如实施方案94的核酸，其中所述白介素为膜结合il
‑
12p70。
[1222]
96.如实施方案83或84的核酸，其中所述核酸包含编码细胞因子的转基因。
[1223]
97.如实施方案96的核酸，其中所述细胞因子为干扰素(ifn)。
[1224]
98.如实施方案97的核酸，其中所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[1225]
99.如实施方案96的核酸，其中所述细胞因子为tnf超家族成员蛋白。
[1226]
100.如实施方案99的核酸，其中所述tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[1227]
101.如实施方案96的核酸，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及c
‑
kit。
[1228]
102.如实施方案101的核酸，其中所述细胞因子为flt3配体。
[1229]
103.如实施方案83至102的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含b8r基因中的缺失，且至少一个转基因插入到b8r基因中的缺失中。
[1230]
104.如实施方案103的核酸，其中至少两个转基因插入到b8r基因中的缺失中。
[1231]
105.如实施方案104的核酸，其中至少三个转基因插入到b8r基因中的缺失中。
[1232]
106.如实施方案103至105中任一项的核酸，其中至少一个转基因插入并非在b8r基因中的缺失处的基因座中。
[1233]
107.如实施方案106的核酸，其中所述基因座在正痘病毒基因组的5'端处的缺失的边界处。
[1234]
108.如实施方案106的核酸，其中所述基因座在正痘病毒基因组的3'端处的缺失的边界处。
[1235]
109.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含
[1236]
(i)以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r及b8r基因；
[1237]
(ii)以下itr的每个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr；
[1238]
(iii)插入b8r基因的缺失中的il
‑
12
‑
tm转基因；
[1239]
(iv)插入b8r基因的缺失中的flt3配体转基因；及
[1240]
(v)以下中的一个：
[1241]
(a)编码单链抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段的转基因，
[1242]
或
[1243]
(b)(i)编码抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段的重链的转基因，及
[1244]
(ii)编码抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段的轻链的转基因，
[1245]
其中部分(v)中的转基因插入重组正痘病毒基因组中存在的5p缺失的边界内，且
[1246]
其中抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段能够结合ctla
‑
4。
[1247]
110.如实施方案109的核酸，其中正痘病毒基因组来源于seq id no:210的序列，其中
[1248]
(a)所述衍生序列包含b8r基因的缺失以及il
‑
12
‑
tm转基因、flt3配体转基因及编码单链或双链抗ctla
‑
4抗体的转基因；
[1249]
(b)il
‑
12
‑
tm转基因编码包含seq id no:212的氨基酸序列的蛋白质；
[1250]
(c)flt3配体转基因编码包含seq id no:213的氨基酸序列的蛋白质；且
[1251]
(d)抗ctla
‑
4抗体包含seq id no:211的氨基酸序列。
[1252]
111.一种病毒，其包含如实施方案1至110中任一项的包含重组正痘病毒基因组的核酸。
[1253]
112.如实施方案111的病毒，其中
[1254]
a)所述重组正痘病毒基因组包含至少2个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；
[1255]
b)所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；或
[1256]
c)所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1257]
113.如实施方案111或112的病毒，其中所述病毒来源于痘苗病毒。
[1258]
114.如实施方案113的病毒，其中所述痘苗病毒来源于选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
‑
1、修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)、dairen i、glv
‑
1h68、ihd
‑
j、l
‑
ivp、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
‑
1。
[1259]
115.如实施方案114的病毒，其中所述痘苗病毒来源于选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、tian tan、wyeth及lister。
[1260]
116.如实施方案115的病毒，其中所述痘苗病毒来源于copenhagen株痘苗病毒。
[1261]
117.如实施方案111至116中任一项的病毒，其中所述重组正痘病毒基因组进一步包含胸苷激酶(tk)基因。
[1262]
118.如实施方案111至117中任一项的病毒，其中所述重组正痘病毒基因组进一步包含核糖核苷酸还原酶基因。
[1263]
119.如实施方案111至118中任一项的病毒，其中在使哺乳动物细胞群体与所述病毒接触后，所述哺乳动物细胞群体相对于与不包含所述缺失的病毒的形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体展现增加的合胞体形成。
[1264]
120.如实施方案111至119中任一项的病毒，其中在使哺乳动物细胞群体与所述病毒接触后，所述哺乳动物细胞群体相对于与不包含所述缺失的病毒的形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体展现增加的病毒传播。
[1265]
121.如实施方案111至120中任一项的病毒，其中所述病毒相对于不包含所述缺失的病毒的形式对哺乳动物细胞群体发挥增加的细胞毒性效应。
[1266]
122.如实施方案119至121中任一项的病毒，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
[1267]
123.如实施方案122的病毒，其中所述人细胞为癌细胞。
[1268]
124.如实施方案119至121中任一项的病毒，其中所述哺乳动物细胞来自选自由以下组成的组的细胞系：u2os、293、293t、vero、hela、a549、bhk、bsc40、cho、ovcar
‑
8、786
‑
0、nci
‑
h23、u251、sf
‑
295、t
‑
47d、skmel2、bt
‑
549、sk
‑
mel
‑
28、mda
‑
mb
‑
231、sk
‑
ov
‑
3、mcf7、m14、sf
‑
268、caki
‑
1、hpav、ovcar
‑
4、hct15、k
‑
562及hct
‑
116。
[1269]
125.如实施方案1至110中任一项的核酸或如实施方案111至124中任一项的病毒，其中所述核酸或所述病毒进一步包含编码肿瘤相关抗原的转基因。
[1270]
126.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原为表3至表30中的任一个中列举的肿瘤相关抗原。
[1271]
127.如实施方案126的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原为选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原：cd19、cd33、epcam、cea、psma、egfrviii、cd133、egfr、cdh19、enpp3、dll3、msln、ror1、her2、hlaa2、epha2、epha3、mcsp、cspg4、ng2、ron、flt3、bcma、cd20、fapα、frα、ca
‑
9、pdgfrα、pdgfrβ、fsp1、s100a4、adam12m、ret、met、fgfr、insr及ntrk。
[1272]
128.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含mage
‑
a3或其一个或多个片段。
[1273]
129.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含ny
‑
eso
‑
1或其一个或多个片段。
[1274]
130.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含一种或多种人乳头瘤病毒(hpv)蛋白或其片段。
[1275]
131.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述hpv蛋白或其片段包含以下中的一个或多个：(i)hpv16的e6和e7蛋白或其片段，及(ii)hpv18的e6和e7蛋白或其片段。
[1276]
132.如实施方案131的核酸或病毒，其中所述hpv蛋白或片段的序列公开于国际专利公布wo/2014/127478中，所述公布的内容以引用的方式并入本文中。
[1277]
133.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含短尾蛋白或其一个或多个片段。
[1278]
134.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含前列腺酸磷酸酶或其一个或多个片段。
[1279]
135.一种包装细胞系，其包含如实施方案1至110中任一项的核酸或如实施方案111至124中任一项的病毒。
[1280]
136.一种治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如实施方案111至134中任一项的病毒。
[1281]
137.如实施方案136的方法，其中所述哺乳动物患者为人患者。
[1282]
138.如实施方案136或137的方法，其中所述病毒在初免
‑
加强治疗中用作初免剂。
[1283]
139.如实施方案136或137的方法，其中所述病毒在初免
‑
加强治疗中用作加强剂。
[1284]
140.如实施方案136至139中任一项的方法，其中所述哺乳动物患者患有癌症。
[1285]
141.如实施方案140的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌及咽喉癌。
[1286]
142.如实施方案140的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：急性淋巴母细胞白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、肾上腺皮质癌、aids相关淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文氏肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性赘瘤、结肠癌、肝外胆管癌、乳腺管原位癌(dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆氏肿瘤及其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤t细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、上皮卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西氏肉瘤、横纹肌肉瘤、塞泽里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌及华氏巨球蛋白血症。
[1287]
143.如实施方案136至142中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用免疫检查点抑制剂。
[1288]
144.如实施方案143的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。
[1289]
145.如实施方案144的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1290]
146.如实施方案145的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。
[1291]
147.如实施方案145的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1292]
148.如实施方案136至147中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用白介素。
[1293]
149.如实施方案148的方法，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。
[1294]
150.如实施方案149的方法，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。
[1295]
151.如实施方案149或150的方法，其中所述白介素为膜结合的。
[1296]
152.如实施方案136至151中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用干扰素。
[1297]
153.如实施方案152的方法，其中所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[1298]
154.如实施方案136至153中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用细胞因子。
[1299]
155.如实施方案154的方法，其中所述细胞因子为tnf超家族成员蛋白。
[1300]
156.如实施方案155的方法，其中所述tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[1301]
157.如实施方案154的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及ckit。
[1302]
158.如实施方案157的方法，其中所述细胞因子为flt3配体。
[1303]
159.一种试剂盒，其包含如实施方案1至110中任一项的核酸或如实施方案111至134中任一项的病毒和指导所述试剂盒的使用者在宿主细胞中表达所述核酸或所述病毒的药品说明书。
[1304]
160.一种试剂盒，其包含如实施方案111至134中任一项的病毒和指导使用者向患有癌症的哺乳动物患者施用治疗有效量的所述病毒从而治疗所述癌症的药品说明书。
[1305]
161.如实施方案160的试剂盒，其中所述哺乳动物患者为人患者。
[1306]
162.如实施方案94的核酸，其中所述白介素为膜结合il
‑
12p35。
[1307]
5.7.3.组3
[1308]
1.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1309]
2.如实施方案1的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1310]
3.如实施方案2的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1311]
4.如实施方案3的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1312]
5.如实施方案4的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、
f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1313]
6.如实施方案5的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少7个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1314]
7.如实施方案6的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少8个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1315]
8.如实施方案7的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少9个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1316]
9.如实施方案8的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少10个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1317]
10.如实施方案9的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少11个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1318]
11.如实施方案10的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少12个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1319]
12.如实施方案11的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少13个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1320]
13.如实施方案12的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少14个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1321]
14.如实施方案13的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少15个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1322]
15.如实施方案14的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少16个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1323]
16.如实施方案15的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少17个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1324]
17.如实施方案16的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少18个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1325]
18.如实施方案17的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少19个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、
k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1326]
19.如实施方案18的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少20个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1327]
20.如实施方案19的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少21个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1328]
21.如实施方案20的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少22个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1329]
22.如实施方案21的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1330]
23.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1331]
24.如实施方案23的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1332]
25.如实施方案24的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1333]
26.如实施方案25的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1334]
27.如实施方案26的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1335]
28.如实施方案27的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1336]
29.如实施方案28的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因。
[1337]
30.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1338]
31.如实施方案30的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少2个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1339]
32.如实施方案31的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少3个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1340]
33.如实施方案32的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少4个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1341]
34.如实施方案33的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少5个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1342]
35.如实施方案34的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少6个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1343]
36.如实施方案35的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少7个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1344]
37.如实施方案36的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少8个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1345]
38.如实施方案37的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少9个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1346]
39.如实施方案38的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少10个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1347]
40.如实施方案39的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少11个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1348]
41.如实施方案40的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少12个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1349]
42.如实施方案41的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少13个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1350]
43.如实施方案42的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少14个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1351]
44.如实施方案43的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少15个基因的缺失，各基因选自由以下组成的组：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1352]
45.如实施方案44的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1353]
46.如实施方案1至45中任一项的包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码参与宿主相互作用的蛋白质的基因的缺失。
[1354]
47.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质影响与细胞外基质的非钙依赖性粘着。
[1355]
48.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为nf
‑
κb抑制剂。
[1356]
49.如实施方案48的核酸，其中所述蛋白质是由选自由以下组成的组的基因编码：c2l、n1l、m2l、k1l及k7r基因。
[1357]
50.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为细胞凋亡抑制剂。
[1358]
51.如实施方案47的核酸，其中所述细胞凋亡抑制剂为凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂。
[1359]
52.如实施方案51的核酸，其中所述凋亡蛋白酶
‑
9抑制剂是由f1l基因编码。
[1360]
53.如实施方案50的核酸，其中所述细胞凋亡抑制剂为bcl
‑
2样蛋白。
[1361]
54.如实施方案53的核酸，其中所述bcl
‑
2样蛋白是由n1l编码。
[1362]
55.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为干扰素调控因子3(irf3)抑制剂。
[1363]
56.如实施方案55的核酸，其中所述irf3抑制剂是由n2l或k7r编码。
[1364]
57.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为丝氨酸蛋白酶抑制剂。
[1365]
58.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质防止细胞融合。
[1366]
59.如实施方案58的核酸，其中所述蛋白质是由k2l编码。
[1367]
60.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为rna活化蛋白激酶(pkr)抑制剂。
[1368]
61.如实施方案60的核酸，其中所述蛋白质是由k1l或k3l编码。
[1369]
62.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为毒力因子。
[1370]
63.如实施方案63的核酸，其中所述蛋白质是由f3l编码。
[1371]
64.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为il
‑1‑
β抑制剂。
[1372]
65.如实施方案64的核酸，其中所述蛋白质是由b16r编码。
[1373]
66.如实施方案46的核酸，其中所述蛋白质为分泌ifnα螯合剂。
[1374]
67.如实施方案67的核酸，其中所述蛋白质是由b19r编码。
[1375]
68.如实施方案1至67中任一项的包含重组正痘病毒基因组的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含至少1个编码参与dna复制的蛋白质的基因的缺失。
[1376]
69.如实施方案68的核酸，其中所述蛋白质为dna修饰核酸酶。
[1377]
70.如实施方案69的核酸，其中所述蛋白质是由k4l编码。
[1378]
71.如实施方案70的核酸，其中所述蛋白质为脱氧尿苷三磷酸酶(dutpase)。
[1379]
72.如实施方案71的核酸，其中所述dutpase是由f2l编码。
[1380]
73.如实施方案1至72中任一项的核酸，其中至少一个缺失基因的整个核苷酸序列缺失。
[1381]
74.如实施方案1至72中任一项的核酸，其中至少一个缺失基因为仅部分缺失的，且其中部分缺失足以致使所述部分缺失基因在引入宿主细胞中之后无功能。
[1382]
75.如实施方案1至74中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含反向末端重复序列(itr)的至少两个拷贝。
[1383]
76.如实施方案1至74中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组缺乏itr的任何拷贝。
[1384]
77.如实施方案1至74中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含选自由以下组成的组的itr的至少一个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[1385]
78.如1至74实施方案中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含itr的至少所有以下拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[1386]
79.如实施方案1至78中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含b8r基因中的缺失。
[1387]
80.如实施方案1至78中任一项的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含完整b8r基因。
[1388]
81.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含
[1389]
(i)以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r及b8r基因；及
[1390]
(ii)以下itr的每个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr。
[1391]
82.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含
[1392]
(i)以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；及
[1393]
(ii)以下itr的每个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr，
[1394]
其中所述重组正痘病毒基因组包含完整b8r基因。
[1395]
83.如实施方案1至82中任一项的核酸，其进一步包含至少一个选自由以下组成的组的转基因：编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。
[1396]
84.如实施方案83的核酸，其中所述核酸包含至少两个选自由以下组成的组的转基因：编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。
[1397]
85.如实施方案84的核酸，其中所述核酸包含编码免疫检查点抑制剂的转基因、编码白介素(il)的转基因及编码细胞因子的转基因。
[1398]
86.如实施方案83或84中任一项的核酸，其中所述核酸包含编码免疫检查点抑制剂的转基因。
[1399]
87.如实施方案85或86的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。
[1400]
88.如实施方案87的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1401]
89.如实施方案88的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。
[1402]
90.如实施方案88的核酸，其中所述免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1403]
91.如实施方案83或84的核酸，其中所述核酸包含编码白介素(il)的转基因。
[1404]
92.如实施方案85或91的核酸，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。
[1405]
93.如实施方案92的核酸，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。
[1406]
94.如实施方案93的核酸，其中所述白介素为膜结合的。
[1407]
95.如实施方案94的核酸，其中所述白介素为膜结合il
‑
12p70。
[1408]
96.如实施方案83或84的核酸，其中所述核酸包含编码细胞因子的转基因。
[1409]
97.如实施方案96的核酸，其中所述细胞因子为干扰素(ifn)。
[1410]
98.如实施方案97的核酸，其中所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[1411]
99.如实施方案96的核酸，其中所述细胞因子为tnf超家族成员蛋白。
[1412]
100.如实施方案99的核酸，其中所述tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[1413]
101.如实施方案96的核酸，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及c
‑
kit。
[1414]
102.如实施方案101的核酸，其中所述细胞因子为flt3配体。
[1415]
103.如实施方案83至102的核酸，其中所述重组正痘病毒基因组包含b8r基因中的缺失，且至少一个转基因插入到b8r基因中的缺失中。
[1416]
104.如实施方案103的核酸，其中至少两个转基因插入到b8r基因中的缺失中。
[1417]
105.如实施方案104的核酸，其中至少三个转基因插入到b8r基因中的缺失中。
[1418]
106.如实施方案103至105中任一项的核酸，其中至少一个转基因插入并非在b8r基因中的缺失处的基因座中。
[1419]
107.如实施方案106的核酸，其中所述基因座在正痘病毒基因组的5'端处的缺失的边界处。
[1420]
108.如实施方案106的核酸，其中所述基因座在正痘病毒基因组的3'端处的缺失的边界处。
[1421]
109.一种核酸，其包含重组正痘病毒基因组，其中所述重组正痘病毒基因组包含
[1422]
(i)以下中的每个的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r及b8r基因；
[1423]
(ii)以下itr的每个拷贝中的缺失：b21r
‑
itr、b22r
‑
itr、b23r
‑
itr、b24r
‑
itr、b25r
‑
itr、b26r
‑
itr、b27r
‑
itr、b28r
‑
itr及b29r
‑
itr；
[1424]
(iii)插入b8r基因的缺失中的il
‑
12
‑
tm转基因；
[1425]
(iv)插入b8r基因的缺失中的flt3配体转基因；及
[1426]
(v)以下中的一者：
[1427]
(a)编码单链抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段的转基因，
[1428]
或
[1429]
(b)(i)编码抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段的重链的转基因，及
[1430]
(ii)编码抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段的轻链的转基因，
[1431]
其中部分(v)中的转基因插入重组正痘病毒基因组中存在的5p缺失的边界内，且
[1432]
其中抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段能够结合ctla
‑
4。
[1433]
110.如实施方案109的核酸，其中正痘病毒基因组来源于seq id no:210的序列，
其中
[1434]
(a)所述衍生序列包含b8r基因的缺失以及il
‑
12
‑
tm转基因、flt3配体转基因及编码单链或双链抗ctla
‑
4抗体的转基因；
[1435]
(b)il
‑
12
‑
tm转基因编码包含seq id no:212的氨基酸序列的蛋白质；
[1436]
(c)flt3配体转基因编码包含seq id no:213的氨基酸序列的蛋白质；且
[1437]
(d)抗ctla
‑
4抗体包含seq id no:211的氨基酸序列。
[1438]
111.一种病毒，其包含如实施方案1至110中任一项的包含重组正痘病毒基因组的核酸。
[1439]
112.如实施方案111的病毒，其中
[1440]
a)所述重组正痘病毒基因组包含至少2个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；
[1441]
b)所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因；或
[1442]
c)所述重组正痘病毒基因组包含至少1个选自由以下组成的组的基因的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因。
[1443]
113.如实施方案111或112的病毒，其中所述病毒来源于痘苗病毒。
[1444]
114.如实施方案113的病毒，其中所述痘苗病毒来源于选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、wyeth、lister、em63、acam2000、lc16m8、cv
‑
1、修饰的安卡拉痘苗病毒(mva)、dairen i、glv
‑
1h68、ihd
‑
j、l
‑
ivp、lc16mo、tashkent、tian tan及wau86/88
‑
1。
[1445]
115.如实施方案114的病毒，其中所述痘苗病毒来源于选自由以下组成的组的病毒株：copenhagen、western reserve、tian tan、wyeth及lister。
[1446]
116.如实施方案115的病毒，其中所述痘苗病毒来源于copenhagen株痘苗病毒。
[1447]
117.如实施方案111至116中任一项的病毒，其中所述重组正痘病毒基因组进一步包含胸苷激酶(tk)基因。
[1448]
118.如实施方案111至117中任一项的病毒，其中所述重组正痘病毒基因组进一步包含核糖核苷酸还原酶基因。
[1449]
119.如实施方案111至118中任一项的病毒，其中在使哺乳动物细胞群体与所述病毒接触后，哺乳动物细胞群体相对于与不包含所述缺失的病毒的形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体展现增加的合胞体形成。
[1450]
120.如实施方案111至119中任一项的病毒，其中在使哺乳动物细胞群体与所述病毒接触后，所述哺乳动物细胞群体相对于与不包含所述缺失的病毒的形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体展现增加的病毒传播。
[1451]
121.如实施方案111至120中任一项的病毒，其中所述病毒相对于不包含所述缺失的病毒的形式对哺乳动物细胞群体发挥增加的细胞毒性效应。
[1452]
122.如实施方案119至121中任一项的病毒，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
[1453]
123.如实施方案122的病毒，其中所述人细胞为癌细胞。
[1454]
124.如实施方案119至121中任一项的病毒，其中所述哺乳动物细胞来自选自由以
下组成的组的细胞系：u2os、293、293t、vero、hela、a549、bhk、bsc40、cho、ovcar
‑
8、786
‑
0、nci
‑
h23、u251、sf
‑
295、t
‑
47d、skmel2、bt
‑
549、sk
‑
mel
‑
28、mda
‑
mb
‑
231、sk
‑
ov
‑
3、mcf7、m14、sf
‑
268、caki
‑
1、hpav、ovcar
‑
4、hct15、k
‑
562及hct
‑
116。
[1455]
125.如实施方案1至110中任一项的核酸或如实施方案111至124中任一项的病毒，其中所述核酸或所述病毒进一步包含编码肿瘤相关抗原的转基因。
[1456]
126.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原为表3至表30中的任一个中列举的肿瘤相关抗原。
[1457]
127.如实施方案126的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原为选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原：cd19、cd33、epcam、cea、psma、egfrviii、cd133、egfr、cdh19、enpp3、dll3、msln、ror1、her2、hlaa2、epha2、epha3、mcsp、cspg4、ng2、ron、flt3、bcma、cd20、fapα、frα、ca
‑
9、pdgfrα、pdgfrβ、fsp1、s100a4、adam12m、ret、met、fgfr、insr及ntrk。
[1458]
128.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含mage
‑
a3或其一个或多个片段。
[1459]
129.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含ny
‑
eso
‑
1或其一个或多个片段。
[1460]
130.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含一种或多种人乳头瘤病毒(hpv)蛋白或其片段。
[1461]
131.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述hpv蛋白或其片段包含以下中的一个或多个：(i)hpv16的e6和e7蛋白或其片段，及(ii)hpv18的e6和e7蛋白或其片段。
[1462]
132.如实施方案131的核酸或病毒，其中所述hpv蛋白或片段的序列公开于国际专利公布wo/2014/127478中，所述公布的内容以引用的方式并入本文中。
[1463]
133.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含短尾蛋白或其一个或多个片段。
[1464]
134.如实施方案125的核酸或病毒，其中所述肿瘤相关抗原包含前列腺酸磷酸酶或其一个或多个片段。
[1465]
135.一种包装细胞系，其包含如实施方案1至110中任一项的核酸或如实施方案111至124中任一项的病毒。
[1466]
136.一种治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的如实施方案111至134中任一项的病毒。
[1467]
137.如实施方案136的方法，其中所述哺乳动物患者为人患者。
[1468]
138.如实施方案136或137的方法，其中所述病毒在初免
‑
加强治疗中用作初免剂。
[1469]
139.如实施方案136或137的方法，其中所述病毒在初免
‑
加强治疗中用作加强剂。
[1470]
140.如实施方案136至139中任一项的方法，其中所述哺乳动物患者患有癌症。
[1471]
141.如实施方案140的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌及咽喉癌。
[1472]
142.如实施方案140的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：急性淋巴母细胞白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、肾上腺皮质癌、aids相关淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、
非典型性畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤文氏肉瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性赘瘤、结肠癌、肝外胆管癌、乳腺管原位癌(dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、睾丸生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金氏淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、威尔姆氏肿瘤及其他儿童肾脏肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤t细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、上皮卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西氏肉瘤、横纹肌肉瘤、塞泽里综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌及华氏巨球蛋白血症。
[1473]
143.如实施方案136至142中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用免疫检查点抑制剂。
[1474]
144.如实施方案143的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。
[1475]
145.如实施方案144的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1476]
146.如实施方案145的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。
[1477]
147.如实施方案145的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[1478]
148.如实施方案136至147中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用白介素。
[1479]
149.如实施方案148的方法，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。
[1480]
150.如实施方案149的方法，其中所述白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。
[1481]
151.如实施方案149或150的方法，其中所述白介素为膜结合的。
[1482]
152.如实施方案136至151中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用干扰素。
[1483]
153.如实施方案152的方法，其中所述干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、
ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[1484]
154.如实施方案136至153中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者施用细胞因子。
[1485]
155.如实施方案154的方法，其中所述细胞因子为tnf超家族成员蛋白。
[1486]
156.如实施方案155的方法，其中所述tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[1487]
157.如实施方案154的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及ckit。
[1488]
158.如实施方案157的方法，其中所述细胞因子为flt3配体。
[1489]
159.一种试剂盒，其包含如实施方案1至110中任一项的核酸或如实施方案111至134中任一项的病毒和指导所述试剂盒的使用者于宿主细胞中表达所述核酸或所述病毒的药品说明书。
[1490]
160.一种试剂盒，其包含如实施方案111至134中任一项的病毒和指导使用者向患有癌症的哺乳动物患者施用治疗有效量的所述病毒从而治疗所述癌症的药品说明书。
[1491]
161.如实施方案160的试剂盒，其中所述哺乳动物患者为人患者。
[1492]
162.如实施方案94的核酸，其中所述白介素为膜结合il
‑
12p35。
[1493]
5.7.4.组4
[1494]
1.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1495]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1496]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中；
[1497]
(c)第二转基因，其包含编码白介素12(il
‑
12)多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中；及
[1498]
(d)第三转基因，其包含编码fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[1499]
2.如实施方案1的核酸，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[1500]
3.如实施方案1或2的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的至少一个启动子。
[1501]
4.如实施方案3的核酸，其中可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。
[1502]
5.如实施方案3的核酸，其中可操作地连接于编码抗ctla
‑
4抗体的第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。
[1503]
6.如实施方案1至5中任一项的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的至少一个启动子。
[1504]
7.如实施方案6的核酸，其中可操作地连接于编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。
[1505]
8.如实施方案7的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[1506]
9.如实施方案7的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[1507]
10.如实施方案1至9中任一项的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子。
[1508]
11.如实施方案10的核酸，其中可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。
[1509]
12.如实施方案10的核酸，其中可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[1510]
13.如实施方案10的核酸，其中可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[1511]
14.如实施方案10的核酸，其中可操作地连接于编码flt3l的第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1512]
15.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。
[1513]
16.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。
[1514]
17.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[1515]
18.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1516]
19.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1517]
20.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1518]
21.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1519]
22.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1520]
23.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1521]
24.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[1522]
25.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1523]
26.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1524]
27.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[1525]
28.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1526]
29.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1527]
30.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[1528]
31.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1529]
32.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1530]
33.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1531]
34.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1532]
35.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1533]
36.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1534]
37.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1535]
38.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1536]
39.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[1537]
40.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1538]
41.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1539]
42.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于seq id no:210中的部
分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1540]
43.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1541]
44.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[1542]
45.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1543]
46.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1544]
47如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1545]
48.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1546]
49.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[1547]
50.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[1548]
51.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因、第二转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。
[1549]
52.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因、第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1550]
53.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因、第二转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1551]
54.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1552]
55.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1553]
56.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第二转基因存在于b8r基因
中的缺失的基因座中。
[1554]
57.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1555]
58.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1556]
59.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1557]
60.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1558]
61.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1559]
62.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1560]
63.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1561]
64.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1562]
65.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1563]
66.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1564]
67.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1565]
68.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1566]
69.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与
部分b29r痘苗基因之间。
[1567]
70.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1568]
71.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1569]
72.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1570]
73.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1571]
74.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1572]
75.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第二转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1573]
76.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1574]
77.如实施方案1至14中任一项的核酸，其中第三转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[1575]
78.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1576]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1577]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中；
[1578]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中；及
[1579]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举
于seq id no:216中；
[1580]
其中所述核酸进一步包含：
[1581]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1582]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1583]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1584]
79.如实施方案78的核酸，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[1585]
80.如实施方案78或79的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1586]
81.如实施方案78或79的核酸，其中第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[1587]
82.如实施方案80或81的核酸，其中第三转基因在第二转基因的上游。
[1588]
83.如实施方案80或81的核酸，其中第三转基因在第二转基因的下游。
[1589]
84.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1590]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1591]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1592]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1593]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1594]
其中所述核酸进一步包含：
[1595]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1596]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1597]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1598]
85.如实施方案84的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1599]
86.如实施方案85的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1600]
87.如实施方案84至86中任一项的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1601]
88.如实施方案87的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1602]
89.如实施方案88的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1603]
90.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1604]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1605]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1606]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1607]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1608]
其中所述核酸进一步包含：
[1609]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1610]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1611]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1612]
91.如实施方案90的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动
子为b8r启动子和b19r启动子。
[1613]
92.如实施方案91的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1614]
93.如实施方案90至92中任一项的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1615]
94.如实施方案93的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1616]
95.如实施方案94的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1617]
96.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1618]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1619]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210中的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1620]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1621]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1622]
其中所述核酸进一步包含：
[1623]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1624]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1625]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1626]
97.如实施方案96的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1627]
98.如实施方案97的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1628]
99.如实施方案96至98中任一项的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1629]
100.如实施方案99的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动
子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1630]
101.如实施方案100的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1631]
102.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1632]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1633]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1634]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1635]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1636]
其中所述核酸进一步包含：
[1637]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1638]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1639]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1640]
103.如实施方案102的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1641]
104.如实施方案103的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1642]
105.如实施方案102至104中任一项的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1643]
106.如实施方案105的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1644]
107.如实施方案106的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1645]
108.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1646]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1647]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1648]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1649]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1650]
其中所述核酸进一步包含：
[1651]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；
[1652]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1653]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1654]
109.如实施方案108的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1655]
110.如实施方案109的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1656]
111.如实施方案108至110中任一项的核酸，其中ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[1657]
112.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1658]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1659]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1660]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1661]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因
呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1662]
其中所述核酸进一步包含：
[1663]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；
[1664]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1665]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1666]
113.如实施方案112的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1667]
114.如实施方案113的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1668]
115.如实施方案112至114中任一项的核酸，其中ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[1669]
116.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1670]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1671]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1672]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1673]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1674]
其中所述核酸进一步包含：
[1675]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；
[1676]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1677]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1678]
117.如实施方案116的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1679]
118.如实施方案117的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1680]
119.如实施方案116至118中任一项的核酸，其中ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[1681]
120.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1682]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1683]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1684]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1685]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1686]
其中所述核酸进一步包含：
[1687]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；
[1688]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1689]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1690]
121.如实施方案120的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1691]
122.如实施方案121的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1692]
123.如实施方案120至122中任一项的核酸，其中ps的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[1693]
124.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1694]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1695]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中
第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1696]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1697]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1698]
其中所述核酸进一步包含：
[1699]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1700]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及
[1701]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1702]
125.如实施方案124的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1703]
126.如实施方案125的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1704]
127.如实施方案124至126中任一项的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1705]
128.如实施方案127的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1706]
129.如实施方案128的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1707]
130.如实施方案124至129中任一项的核酸，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[1708]
131.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1709]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1710]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1711]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病
毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1712]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1713]
其中所述核酸进一步包含：
[1714]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1715]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及
[1716]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1717]
132.如实施方案131的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1718]
133.如实施方案132的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1719]
134.如实施方案131至133中任一项的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1720]
135.如实施方案134的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1721]
136.如实施方案135的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1722]
137.如实施方案131至136中任一项的核酸，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[1723]
138.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1724]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1725]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1726]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1727]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺
失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1728]
其中所述核酸进一步包含：
[1729]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1730]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及
[1731]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子或b19r启动子。
[1732]
139.如实施方案138的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1733]
140.如实施方案139的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1734]
141.如实施方案138至140中任一项的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1735]
142.如实施方案141的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1736]
143.如实施方案142的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1737]
144.如实施方案138至143中任一项的核酸，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[1738]
145.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1739]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1740]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1741]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1742]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1743]
其中所述核酸进一步包含：
[1744]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1745]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中
可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及
[1746]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1747]
146.如实施方案145的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1748]
147.如实施方案146的核酸，其中b8r启动子包含seq id no:564的核苷酸序列，且b19r启动子包含seq id no:565的核苷酸序列。
[1749]
148.如实施方案145至147中任一项的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1750]
149.如实施方案148的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1751]
150.如实施方案149的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1752]
151.如实施方案145至150中任一项的核酸，f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[1753]
152.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1754]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1755]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1756]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1757]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1758]
其中所述核酸进一步包含：
[1759]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1760]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1761]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。
[1762]
153.如实施方案152的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启
动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1763]
154.如实施方案153的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1764]
155.如实施方案154的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1765]
156.如实施方案152至155中任一项的核酸，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[1766]
157.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1767]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1768]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1769]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1770]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1771]
其中所述核酸进一步包含：
[1772]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1773]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1774]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。
[1775]
158如实施方案157的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1776]
159.如实施方案158的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1777]
160.如实施方案159的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1778]
161.如实施方案157至160中任一项的核酸，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[1779]
162.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1780]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1781]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1782]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1783]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1784]
其中所述核酸进一步包含：
[1785]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1786]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1787]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。
[1788]
163.如实施方案162的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1789]
164.如实施方案163的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1790]
165.如实施方案164的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1791]
166.如实施方案162至165中任一项的核酸，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[1792]
167.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1793]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1794]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1795]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病
毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1796]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1797]
其中所述核酸进一步包含：
[1798]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[1799]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[1800]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。
[1801]
168.如实施方案167的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子或h5r晚期启动子。
[1802]
169.如实施方案168的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r早期启动子和h5r晚期启动子。
[1803]
170.如实施方案169的核酸，其中h5r早期启动子包含seq id no:553的核苷酸序列，且h5r晚期启动子包含seq id no:554的核苷酸序列。
[1804]
171.如实施方案167至170中任一项的核酸，e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[1805]
172.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1806]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1807]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1808]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1809]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1810]
其中所述核酸进一步包含：
[1811]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中
可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；
[1812]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及
[1813]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。
[1814]
173.如实施方案172的核酸，其中ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[1815]
174.如实施方案172或173的核酸，其中f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[1816]
175.如实施方案172至174中任一项的核酸，其中e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[1817]
176.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1818]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1819]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[1820]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1821]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1822]
其中所述核酸进一步包含：
[1823]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；
[1824]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及
[1825]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。
[1826]
177.如实施方案176的核酸，其中ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[1827]
178.如实施方案176或177的核酸，其中f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[1828]
179.如实施方案176至178中任一项的核酸，其中e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[1829]
180.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1830]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1831]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1832]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1833]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[1834]
其中所述核酸进一步包含：
[1835]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；
[1836]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及
[1837]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。
[1838]
181.如实施方案180的核酸，其中ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[1839]
182.如实施方案170或181的核酸，其中f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[1840]
183.如实施方案180至182中任一项的核酸，其中e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[1841]
184.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1842]
(a)seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列，其包含部分c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因且其包含b8r基因中的缺失；
[1843]
(b)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中，且其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第一转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[1844]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中，且其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中；及
[1845]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三转基因存在于seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列的b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；
[1846]
其中所述核酸进一步包含：
[1847]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为ps启动子；
[1848]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为f17r启动子；及
[1849]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为e3l启动子。
[1850]
185.如实施方案184的核酸，其中ps启动子的核苷酸序列包含seq id no:555、seq id no:556或seq id no:557的核苷酸序列。
[1851]
186.如实施方案174或185的核酸，其中f17r启动子的核苷酸序列包含seq id no:563的核苷酸序列。
[1852]
187.如实施方案184至186中任一项的核酸，其中e3l启动子的核苷酸序列包含seq id no:567的核苷酸序列。
[1853]
188.一种病毒，其包含如实施方案1至187中任一项的包含重组痘苗病毒基因组的核酸。
[1854]
189.一种包装细胞系，其包含如实施方案1至187中任一项的核酸。
[1855]
190.一种包装细胞系，其包含如实施方案188的病毒。
[1856]
191.一种药物组合物，其包含如实施方案188的病毒及生理学上可接受的载剂。
[1857]
192.一种试剂盒，其包含如实施方案1至187中任一项的核酸及指导试剂盒的使用者于宿主细胞中表达核酸的药品说明书。
[1858]
193.一种试剂盒，其包含如实施方案188的病毒及指导试剂盒的使用者于宿主细胞中表达病毒的药品说明书。
[1859]
194.一种试剂盒，其包含如实施方案188的病毒及指导使用者向患有癌症的哺乳动物患者施用治疗有效量的病毒从而治疗癌症的药品说明书。
[1860]
195.如实施方案194的试剂盒，其中哺乳动物患者为人患者。
[1861]
196.一种治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物患者施用治疗有效量的如实施方案188的病毒。
[1862]
197.一种治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物患者施用治疗有效量的如实施方案191之药物组合物。
[1863]
198.如实施方案196或197的方法，其中哺乳动物患者为人患者。
[1864]
199.如实施方案196至198中任一项的方法，其中癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌及咽喉癌。
[1865]
200.如实施方案199的方法，其中所述方法进一步包括向哺乳动物患者施用抗pd1
抗体或抗pd
‑
l1抗体。
[1866]
5.7.5.组5
[1867]
1.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1868]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；
[1869]
(b)在以下基因中于3'反向末端重复序列(itr)中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；及
[1870]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；
[1871]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[1872]
2.如实施方案1的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子。
[1873]
3.如实施方案2的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。
[1874]
4.如实施方案2的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。
[1875]
5.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1876]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[1877]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[1878]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及
[1879]
(d)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；
[1880]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[1881]
6.如实施方案5的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。
[1882]
7.如实施方案1至6中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[1883]
8.如实施方案1至7中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。
[1884]
9.如实施方案1至8中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。
[1885]
10.如实施方案1至8中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[1886]
11.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1887]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、
k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；
[1888]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；及
[1889]
(c)第二转基因，其包含编码白介素12(il
‑
12)多肽的第二核苷酸序列；
[1890]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[1891]
12.如实施方案11的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子。
[1892]
13.如实施方案12的核酸，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。
[1893]
14.如实施方案13的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[1894]
15.如实施方案13的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[1895]
16.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1896]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[1897]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[1898]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及
[1899]
(d)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子；
[1900]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[1901]
17.如实施方案16的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[1902]
18.如实施方案16的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[1903]
19.如实施方案11至18中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[1904]
20.如实施方案11至19中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽为膜结合的。
[1905]
21.如实施方案11至20中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽包含il
‑
12p35或il
‑
12p70。
[1906]
22.如实施方案11至21中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。
[1907]
23.如实施方案11至22中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。
[1908]
24.如实施方案11至22中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[1909]
25.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1910]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；
[1911]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；及
[1912]
(c)第三转基因，其包含编码fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的第三核苷酸序列；
[1913]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[1914]
26.如实施方案25的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子。
[1915]
27.如实施方案26的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。
[1916]
28.如实施方案26的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[1917]
29.如实施方案26的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[1918]
30.如实施方案26的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1919]
31.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1920]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[1921]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[1922]
(c)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；及
[1923]
(d)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子；
[1924]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[1925]
32.如实施方案31的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[1926]
33.如实施方案31的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[1927]
34.如实施方案31的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1928]
35.如实施方案25至34中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[1929]
36.如实施方案25至35中任一项的核酸，其中flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。
[1930]
37.如实施方案25至36中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。
[1931]
38.如实施方案25至36中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[1932]
39.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1933]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；
[1934]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[1935]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及
[1936]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；
[1937]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[1938]
40.如实施方案39的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子。
[1939]
41.如实施方案40的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。
[1940]
42.如实施方案40的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。
[1941]
43.如实施方案39至42中任一项的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子。
[1942]
44.如实施方案43的核酸，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。
[1943]
45.如实施方案44的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[1944]
46.如实施方案44的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[1945]
47.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1946]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[1947]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[1948]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及
[1949]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；
[1950]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且
[1951]
其中所述核酸进一步包含：
[1952]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；和/或
[1953]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。
[1954]
48.如实施方案47的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动
子为h5r启动子。
[1955]
49.如实施方案47或48的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[1956]
50.如实施方案47或48的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[1957]
51.如实施方案39至50中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[1958]
52.如实施方案39至51中任一项的核酸，其中所述il
‑
12多肽为膜结合的。
[1959]
53.如实施方案39至52中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽包含il
‑
12p35或il
‑
12p70。
[1960]
54.如实施方案39至53中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。
[1961]
55.如实施方案39至54中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。
[1962]
56.如实施方案39至54中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[1963]
57.如实施方案39至56中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。
[1964]
58.如实施方案39至57中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。
[1965]
59.如实施方案39至57中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[1966]
60.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1967]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；
[1968]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[1969]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及
[1970]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[1971]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[1972]
61.如实施方案60的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子。
[1973]
62.如实施方案61的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。
[1974]
63.如实施方案61的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。
[1975]
64.如实施方案60至63中任一项的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序
列包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子。
[1976]
65.如实施方案64的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。
[1977]
66.如实施方案64的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[1978]
67.如实施方案64的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[1979]
68.如实施方案64的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1980]
69.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[1981]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[1982]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[1983]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；及
[1984]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[1985]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且
[1986]
其中所述核酸进一步包含：
[1987]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；和/或
[1988]
(ii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。
[1989]
70.如实施方案69的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。
[1990]
71.如实施方案69或70的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[1991]
72.如实施方案69或70的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[1992]
73.如实施方案69或70的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[1993]
74.如实施方案60至73中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[1994]
75.如实施方案60至74中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。
[1995]
76.如实施方案60至75中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。
[1996]
77.如实施方案60至75中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[1997]
78.如实施方案60至77中任一项的核酸，其中flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。
[1998]
79.如实施方案60至78中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。
[1999]
80.如实施方案60至78中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[2000]
81.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2001]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；
[2002]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2003]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及
[2004]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[2005]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[2006]
82.如实施方案81的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子。
[2007]
83.如实施方案82的核酸，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。
[2008]
84.如实施方案83的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[2009]
85.如实施方案83的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[2010]
86.如实施方案81至85中任一项的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子。
[2011]
87.如实施方案86的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。
[2012]
88.如实施方案86的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[2013]
89.如实施方案86的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[2014]
90.如实施方案86的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2015]
91.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2016]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[2017]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2018]
(c)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及
[2019]
(d)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[2020]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且
[2021]
其中所述核酸进一步包含：
[2022]
(i)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子；和/或
[2023]
(ii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。
[2024]
92.如实施方案91的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[2025]
93.如实施方案91的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[2026]
94.如实施方案91至93中任一项的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[2027]
95.如实施方案91至93中任一项的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[2028]
96.如实施方案91至93中任一项的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2029]
97.如实施方案81至96中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[2030]
98.如实施方案81至97中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽为膜结合的。
[2031]
99.如实施方案81至98中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽包含il
‑
12p35或il
‑
12p70。
[2032]
100.如实施方案81至99中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。
[2033]
101.如实施方案81至100中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。
[2034]
102.如实施方案81至100中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[2035]
103.如实施方案81至102中任一项的核酸，其中flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。
[2036]
104.如实施方案81至103中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。
[2037]
105.如实施方案81至103中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[2038]
106.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2039]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b8r、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r；
[2040]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2041]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列；
[2042]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及
[2043]
(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[2044]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失。
[2045]
107.如实施方案106的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子。
[2046]
108.如实施方案107的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子。
[2047]
109.如实施方案107的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。
[2048]
110.如实施方案106至109中任一项的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子。
[2049]
111.如实施方案110的核酸，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子。
[2050]
112.如实施方案111的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[2051]
113.如实施方案111的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[2052]
114.如实施方案106至113中任一项的核酸，其进一步包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子。
[2053]
115.如实施方案114的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。
[2054]
116.如实施方案114的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[2055]
117.如实施方案114的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[2056]
118.如实施方案114的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2057]
119.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2058]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[2059]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2060]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第
一核苷酸序列；
[2061]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及
[2062]
(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[2063]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且
[2064]
其中所述核酸进一步包含：
[2065]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子、ps启动子或leo启动子；
[2066]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为晚期启动子；和/或
[2067]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子、b19r启动子、e3l启动子、f11l启动子或b2r启动子。
[2068]
120.如实施方案119的核酸，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子。
[2069]
121.如实施方案119或120的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列、f17r启动子或d13l启动子。
[2070]
122.如实施方案119或120的核酸，其中晚期启动子包含seq id no:561的核苷酸序列。
[2071]
123.如实施方案119至122中任一项的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子。
[2072]
124.如实施方案119至122中任一项的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b19r启动子。
[2073]
125.如实施方案119至122中任一项的核酸，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2074]
126.如实施方案106至125中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[2075]
127.如实施方案106至126中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽为膜结合的。
[2076]
128.如实施方案106至127中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽包含il
‑
12p35或il
‑
12p70。
[2077]
129.如实施方案106至128中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列编码包含seq id no:211中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。
[2078]
130.如实施方案106至129中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列包含seq id no:214中所列的序列。
[2079]
131.如实施方案106至129中任一项的核酸，其中第一核苷酸序列列举于seq id no:214中。
[2080]
132.如实施方案106至131中任一项的核酸，其中il
‑
12多肽包含seq id no:212中所列的氨基酸序列。
[2081]
133.如实施方案106至132中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列包含seq id no:215中所列的序列。
[2082]
134.如实施方案106至132中任一项的核酸，其中第二核苷酸序列列举于seq id no:215中。
[2083]
135.如实施方案106至134中任一项的核酸，其中flt3l包含seq id no:213中所列的氨基酸序列。
[2084]
136.如实施方案106至135中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列包含seq id no:216中所列的序列。
[2085]
137.如实施方案106至135中任一项的核酸，其中第三核苷酸序列列举于seq id no:216中。
[2086]
138.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2087]
139.如实施方案138的核酸，其中第三转基因在第二转基因的上游。
[2088]
140.如实施方案1至10、39至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。
[2089]
141.如实施方案11至24、39至59及81至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间。
[2090]
142.如实施方案25至38及60至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[2091]
143.如实施方案1至10、39至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2092]
144.如实施方案11至24、39至59及81至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2093]
145.如实施方案25至38及60至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2094]
146.如实施方案1至10、39至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2095]
147.如实施方案11至24、39至59及81至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2096]
148.如实施方案25至38及60至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2097]
149.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[2098]
150.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2099]
151.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2100]
152.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基
因存在于部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[2101]
153.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2102]
154.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2103]
155.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[2104]
156.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2105]
157.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2106]
158.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2107]
159.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2108]
160.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2109]
161.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2110]
162.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2111]
163.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2112]
164.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[2113]
165.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2114]
166.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2115]
167.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2116]
168.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2117]
169.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2l痘苗基
因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2118]
170.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2119]
171.如实施方案39至59及106至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2120]
172.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2121]
173.如实施方案60至80及106至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2122]
174.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[2123]
175.如实施方案81至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[2124]
176.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因、第二转基因和第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与f3l痘苗基因之间。
[2125]
177.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因、第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2126]
178.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因、第二转基因和第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2127]
179.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2128]
180.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2129]
181.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2130]
182.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2131]
183.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2132]
184.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2133]
185.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[2134]
186.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2135]
187.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因和第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与b29r痘苗基因之间。
[2136]
188.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2137]
189.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2138]
190.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2139]
191.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因和第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2140]
192.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2141]
193.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因和第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2142]
194.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2143]
195.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2144]
196.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2145]
197.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2lr痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2146]
198.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2147]
199.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2lr痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第三转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2148]
200.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第二转基因存在于部分c2lr痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2149]
201.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2lr痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第一转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第二转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2150]
202.如实施方案106至137中任一项的核酸，其中第三转基因存在于部分c2lr痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间。
[2151]
203.如实施方案1至202中任一项的核酸，其中b8r基因中的缺失为b8r基因序列的至少50％的缺失。
[2152]
204.如实施方案1至202中任一项的核酸，其中b8r基因中的缺失为b8r基因序列的至少60％的缺失。
[2153]
205.如实施方案1至202中任一项的核酸，其中b8r基因中的缺失为b8r基因序列的至少70％的缺失。
[2154]
206.如实施方案1至202中任一项的核酸，其中b8r基因中的缺失为b8r基因序列的至少80％的缺失。
[2155]
207.如实施方案1至202中任一项的核酸，其中b8r基因中的缺失为b8r基因序列的约75％的缺失。
[2156]
208.如实施方案1至202中任一项的核酸，其中b8r基因中的缺失为b8r基因序列的约80％的缺失。
[2157]
209.如实施方案1至208中任一项的核酸，其中重组痘苗病毒基因组来源于copenhagen株痘苗病毒的基因组。
[2158]
210.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2159]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[2160]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2161]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第
一核苷酸序列；
[2162]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列；及
[2163]
(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[2164]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且
[2165]
其中所述核酸进一步包含：
[2166]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[2167]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[2168]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2169]
211.如实施方案210的核酸，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向。
[2170]
212.如实施方案210或211的核酸，其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2171]
213.如实施方案210或211的核酸，其中第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间，且第二转基因和第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中。
[2172]
214.如实施方案212或213的核酸，其中第三转基因在第二转基因的上游。
[2173]
215.如实施方案212或213的核酸，其中第三转基因在第二转基因的下游。
[2174]
216.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2175]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[2176]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2177]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[2178]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中；及
[2179]
(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；
[2180]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失；且
[2181]
其中所述核酸进一步包含：
[2182]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[2183]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[2184]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2185]
217.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2186]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[2187]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2188]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第一转基因存在于部分c2l痘苗基因与部分f3l痘苗基因之间；
[2189]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中；及
[2190]
(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[2191]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；且
[2192]
其中所述核酸进一步包含：
[2193]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[2194]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[2195]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2196]
218.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2197]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[2198]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2199]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同
取向，且其中第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[2200]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中；及
[2201]
(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[2202]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的上游；且
[2203]
其中所述核酸进一步包含：
[2204]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[2205]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[2206]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2207]
219.一种核酸，其包含重组痘苗病毒基因组，所述重组痘苗病毒基因组包含：
[2208]
(a)在以下基因中的缺失：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r，及任选地，在b8r基因中的缺失；
[2209]
(b)在以下基因中于3'itr中的缺失：b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r；
[2210]
(c)第一转基因，其包含编码特异性结合至ctla
‑
4的抗体或其抗原结合片段的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列与侧接第一核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第一转基因存在于部分b14r痘苗基因与部分b29r痘苗基因之间；
[2211]
(d)第二转基因，其包含编码il
‑
12多肽的第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列与侧接第二核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，且其中第二转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中；及
[2212]
(e)第三转基因，其包含编码flt3l的第三核苷酸序列；
[2213]
其中c2l、f3l、b14r及b29r痘苗基因中的缺失为部分缺失，其中第三核苷酸序列与侧接第三核苷酸序列的内源性痘苗病毒基因呈相同取向，其中第三转基因存在于b8r基因中的缺失的基因座中，且其中第三转基因在第二转基因的下游；且
[2214]
其中所述核酸进一步包含：
[2215]
(i)包含可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第一核苷酸序列的至少一个启动子为h5r启动子；
[2216]
(ii)包含可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其中可操作地连接于第二核苷酸序列的至少一个启动子为包含seq id no:561的核苷酸序列的晚期启动子；及
[2217]
(iii)包含可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子的核苷酸序列，其
中可操作地连接于第三核苷酸序列的至少一个启动子为b8r启动子和b19r启动子。
[2218]
220.如实施方案1至219中任一项的核酸，其中重组痘苗病毒基因组包含seq id no:624的痘苗病毒核苷酸序列。
[2219]
221.如实施方案1至105中任一项的核酸，其中重组痘苗病毒基因组包含seq id no:210的痘苗病毒核苷酸序列。
[2220]
222.一种病毒，其包含如实施方案1至221中任一项的包含重组痘苗病毒基因组的核酸。
[2221]
223.一种包装细胞系，其包含如实施方案1至221中任一项的核酸。
[2222]
224.一种包装细胞系，其包含如实施方案222的病毒。
[2223]
225.一种药物组合物，其包含如实施方案222的病毒及生理学上可接受的载剂。
[2224]
226.一种试剂盒，其包含如实施方案1至221中任一项的核酸及指导试剂盒的使用者于宿主细胞中表达核酸的药品说明书。
[2225]
227.一种试剂盒，其包含如实施方案222的病毒及指导试剂盒的使用者于宿主细胞中表达病毒的药品说明书。
[2226]
228.一种试剂盒，其包含如实施方案222的病毒及指导使用者向患有癌症的哺乳动物患者施用治疗有效量的病毒从而治疗癌症的药品说明书。
[2227]
229.如实施方案228的试剂盒，其中所述哺乳动物患者为人患者。
[2228]
230.一种治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物患者施用治疗有效量的如实施方案222的病毒。
[2229]
231.一种治疗哺乳动物患者的癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物患者施用治疗有效量的如实施方案225的药物组合物。
[2230]
232.如实施方案230或231的方法，其中所述哺乳动物患者为人患者。
[2231]
233.如实施方案230至232中任一项的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌及咽喉癌。
[2232]
234.如实施方案230至233中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向哺乳动物患者施用免疫检查点抑制剂。
[2233]
235.如实施方案234的方法，其中免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ox40配体、icos配体、抗cd47抗体或其抗原结合片段、抗cd40/cd40l抗体或其抗原结合片段、抗lag3抗体或其抗原结合片段、抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段、抗pd1抗体或其抗原结合片段及抗tim
‑
3抗体或其抗原结合片段。
[2234]
236.如实施方案234的方法，其中免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段或者抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[2235]
237.如实施方案234的方法，其中免疫检查点抑制剂为抗pd1抗体或其抗原结合片段。
[2236]
238.如实施方案234的方法，其中免疫检查点抑制剂为抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段。
[2237]
239.如实施方案234的方法，其中免疫检查点抑制剂为抗pd
‑
l1抗体或其抗原结合
片段。
[2238]
240.如实施方案219至228中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向哺乳动物患者施用白介素。
[2239]
241.如实施方案240的方法，其中白介素选自由以下组成的组：il
‑
1α、il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p35、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21及il
‑
23。
[2240]
242.如实施方案240的方法，其中白介素选自由以下组成的组：il
‑
12p35、il
‑
12p40及il
‑
12p70。
[2241]
243.如实施方案240至242中任一项的方法，其中白介素为膜结合的。
[2242]
244.如实施方案230至243中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向哺乳动物患者施用干扰素。
[2243]
245.如实施方案244的方法，其中干扰素选自由以下组成的组：ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
δ、ifn
‑
ε、ifn
‑
τ、ifn
‑
ω、ifn
‑
ζ及ifn
‑
γ。
[2244]
246.如实施方案230至245中任一项的方法，其中所述方法进一步包括向哺乳动物患者施用细胞因子。
[2245]
247.如实施方案246的方法，其中细胞因子为tnf超家族成员蛋白。
[2246]
248.如实施方案247的方法，其中tnf超家族成员蛋白选自由以下组成的组：trail、fas配体、light(tnfsf
‑
14)、tnf
‑
α及4
‑
1bb配体。
[2247]
249.如实施方案246的方法，其中细胞因子选自由以下组成的组：gm
‑
csf、flt3配体、cd40配体、tgf
‑
β、vegf
‑
r2及ckit。
[2248]
250.如实施方案246的方法，其中细胞因子为flt3配体。
[2249]
5.8.在申请中参考的表3至表45
[2250]
表3.卵巢癌
[2251]
[2252]
[2253]
[2254]
[2255]
[2256]
[2257]
[2258]
[2259][2260]
表4.乳腺癌
[2261]
[2262]
[2263]
[2264]
[2265]
[2266]
[2267][2268]
表5.睾丸癌
[2269][2270]
表6.胰腺癌
[2271]
[2272][2273]
表7.肝癌
[2274]
[2275]
[2276]
[2277][2278]
表8.结肠直肠癌
[2279]
[2280]
[2281]
[2282]
[2283][2284]
表9.甲状腺癌
[2285]
[2286]
[2287]
[2288][2289]
表10.肺癌
[2290]
[2291]
[2292]
[2293]
[2294]
[2295][2296]
表11.前列腺癌
[2297]
[2298]
[2299]
[2300]
[2301]
[2302][2303]
表12.肾癌
[2304]
[2305][2306]
表13.黑色素瘤
[2307]
[2308]
[2309]
[2310]
[2311]
[2312]
[2313]
[2314]
[2315]
[2316][2317]
表14.鳞状细胞癌
[2318][2319]
表15.慢性骨髓性白血病
[2320][2321]
表16.急性淋巴母细胞白血病
[2322][2323]
表17.急性骨髓性白血病
[2324][2325][2326]
表18.慢性淋巴细胞性白血病
[2327][2328]
表19.前髓细胞白血病
[2329][2330]
表20.多发性骨髓瘤
[2331]
[2332]
[2333]
[2334][2335]
表21.b细胞淋巴瘤
[2336][2337]
表22.膀胱癌
[2338]
[2339]
[2340]
[2341][2342]
表23.头颈癌
[2343]
[2344]
[2345][2346]
表24.食道癌
[2347]
[2348]
[2349]
[2350][2351]
表25.脑癌
[2352]
[2353][2354]
表26.咽癌
[2355][2356]
表27.舌肿瘤
[2357][2358]
表28.滑膜肉瘤
[2359]
[2360]
[2361]
[2362][2363]
表29.成神经细胞瘤
[2364]
[2365]
[2366][2367]
表30.子宫癌
[2368]
[2369]
[2370]
[2371][2372]
表31.由copmd5p载体中缺失的copenhagen痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2373]
[2374]
[2375]
[2376]
[2377]
[2378][2379]
表32.由等效于copmd5p载体中缺失的那些基因的western reserve痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2380]
[2381]
[2382]
[2383]
[2384][2385]
表33.由等效于copmd5p载体中缺失的那些基因的tian tan痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2386]
[2387]
[2388]
[2389]
[2390][2391]
表34.由等效于copmd5p载体中缺失的那些基因的wyeth痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2392]
[2393]
[2394]
[2395]
[2396][2397]
表35.由等效于copmd5p载体中缺失的那些基因的lister痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2398]
[2399]
[2400]
[2401]
[2402][2403]
表36.由copmd3p载体中缺失的copenhagen痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2404]
[2405]
[2406]
[2407]
[2408][2409]
表37.由等效于copmd3p载体中缺失的那些基因的western reserve痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2410]
[2411]
[2412]
[2413]
[2414]
[2415][2416]
表38.由等效于copmd3p载体中缺失的那些基因的tian tan痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2417]
[2418]
[2419][2420]
表39.由等效于copmd3p载体中缺失的那些基因的wyeth痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2421]
[2422]
[2423]
[2424]
[2425]
[2426]
[2427][2428]
表40.由等效于copmd3p载体中缺失的那些基因的lister痘苗基因编码的蛋白质的实例
[2429]
[2430]
[2431][2432]
[2433]
表41.基因比对
[2434]
下文展示所选正痘病毒基因的例示性比对。5个痘苗病毒病毒株：copenhagen(“cop”)、western reserver(“wr”)、tian tan(“tian”)、wyeth和lister的各个基因比对如下：
[2435]
c2l
[2436]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2437]
[2438][2439]
c1l
[2440]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2441][2442]
n1l
[2443]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2444][2445]
n2l
[2446]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2447][2448]
m1l
[2449]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2450][2451]
m2l
[2452]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2453][2454]
k1l
[2455]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2456]
[2457]
k2l
[2458]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2459][2460]
k orf a
[2461]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2462][2463]
k3l
[2464]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2465][2466]
k4l
[2467]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2468][2469]
k5l
[2470]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2471][2472]
k6l
[2473]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2474][2475]
k7r
[2476]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2477][2478]
f1l
[2479]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2480][2481]
f2l
[2482]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2483][2484]
f3l
[2485]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2486]
[2487][2488]
b14r
[2489]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2490][2491]
b15r
[2492]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2493][2494]
b orf e
[2495]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2496]
b16r
[2497]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2498][2499]
a seq id no:111表示“x”前的氨基酸序列，且seq id no:625表示“x”后的氨基酸序列。
[2500]
b orf f
[2501]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2502][2503]
b17l
[2504]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2505][2506]
b18r
[2507]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2508][2509][2510]
b19r
[2511]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2512][2513][2514]
b21r
[2515]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2516][2517]
b22r
[2518]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2519][2520]
b23r
[2521]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2522][2523]
b24r
[2524]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2525][2526]
b25r
[2527]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2528][2529]
b26r
[2530]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2531][2532]
b27r
[2533]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2534][2535]
b28r
[2536]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2537][2538]
c23l/b29r
[2539]
clustal o(1.2.4)多序列比对
[2540]
表42.野生型copenhagen株痘苗病毒基因组的核苷酸序列和代表性基因的编码序列(cds)
[2541]
[2542]
[2543]
[2544]
[2545]
[2546]
[2547]
[2548]
[2549]
[2550]
[2551]
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[2581]
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[2583]
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[2599]
[2600]
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[2645]
[2646]
[2647]
[2648]
[2649]
[2650]
[2651]
[2652][2653]
表43.重组痘苗病毒基因组的核苷酸序列
[2654]
[2655]
[2656]
[2657]
[2658]
[2659]
[2660]
[2661]
[2662]
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[2679]
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[2689]
[2690]
[2691]
[2692]
[2693]
[2694]
[2695]
[2696]
[2697]
[2698]
[2699]
[2700]
[2701]
[2702]
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[2704]
[2705]
[2706]
[2707]
[2708]
[2709]
[2710]
[2711]
[2712]
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[2715]
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[2717]
[2718]
[2719]
[2720]
[2721]
[2722]
[2723]
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[2725]
[2726]
[2727]
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[2729]
[2730]
[2731]
[2732]
[2733]
[2734]
[2735]
[2736]
[2737]
[2738]
[2739]
[2740]
[2741]
[2742]
[2743]
[2744]
[2745]
[2746]
[2747]
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[2749]
[2750]
[2751]
[2752]
[2753]
[2754]
[2755]
[2756]
[2757]
[2758]
[2759]
[2760]
[2761]
[2762]
[2763]
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[2765]
[2766]
[2767]
[2768]
[2769]
[2770]
[2771]
[2772]
[2773]
[2774]
[2775]
[2776]
[2777]
[2778]
[2779]
[2780]
[2781]
[2782]
[2783]
[2784]
[2785][2786]
表44.表43及表45中使用的某些缩写的命名法
[2787][2788]
表45.载体表
[2789]
[2790]
[2791]
[2792]
[2793]
[2794]
[2795]
[2796]
[2797]
[2798]
[2799]
[2800][2801]
*癌细胞以moi 0.01被病毒感染。
[2802]
表46.copenhagen病毒基因组中的核苷酸多态性
[2803]
[2804][2805]
6.实施例
[2806]
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供对如何进行、制备及评估本文所要求保护的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹为本发明的示例且并不意图限制本发明人视为其发明的范围。
[2807]
6.1.实施例1
‑
oncovac的发现
[2808]
来自59个痘病毒株的开放阅读框架(orf)聚集成直向同源物并在氨基酸水平下进行比对(系统发育分析参见图1)。进行贝叶斯分析(bayesian analysis)以确定所有病毒株的相关性。痘病毒在基因含量和宿主范围方面极为不同。存在若干种彼此不同的天然存在的痘苗野生型病毒株。
[2809]
图33示出了各种痘病毒基因组中在copmd5p3p(表2)中缺失的基因的百分比。图表上的每个点表示一个痘病毒基因组。使用同源性搜寻来查询来自其他进化枝的具有来自copenhagen基因组的表2基因的氨基酸序列的痘病毒。存在于其他痘病毒中的缺失基因之量随着其分异度增加而降低。
[2810]
以相等空斑形成单元计数混合痘苗野生型病毒株且使用ngs(输入池)进行测序。所得混合物在不同癌细胞系中传代三次。使用illumina ngs测序来对最终群体进行测序。基于序列同一性将读段(短dna片段)指派给各种病毒株并用于计算各病毒株在最终群体中的百分比。图2中展示不同病毒株在于不同肿瘤类型中传代5个痘苗病毒之后的丰度。copenhagen株能够比其他病毒株长得快且因此更快地复制。
[2811]
还使用不同痘苗野生型病毒株以低pfu(1
×
104)感染各种患者肿瘤核心。平均分4次重复实验感染各病毒株，每次重复实验含有三个2
×
2mm的肿瘤核心。经由病毒滴度评定复制，且复制表述为如图3中所示的空斑形成单位(pfu)。copenhagen株生长至比其他病毒株高的滴度，且因此在患者体外样本中复制较快。患者体外核心为患者的3d肿瘤的良好模拟物。
[2812]
随后在具有3％cmc覆盖层的u2
‑
os细胞上对痘苗野生型病毒株进行空斑分析。在感染后两天，测量各病毒株的20至30个空斑的大小。图4中展示copenhagen、western reserve、wyeth、lister及tian tan的空斑大小测量。空斑形成受病毒复制、扩散及杀死的能力影响。针对copenhagen株观测到的较大空斑大小表明，此病毒株在对于溶瘤病毒的发育来说重要的能力方面较优。
[2813]
最后，使用来自图1的所有59个痘病毒基因组发现orf且聚集成直向同源组。基于基因在copenhagen基因组中的位置(x轴)和组的大小(y轴)标绘含有copenhagen基因的组。当所有59个物种共用相同基因时，视为100％保守。发现为主要缺失copmd5p和copmd3p的部分的基因对于病毒复制而言较不重要，因为其缺失不会影响适合性。
[2814]
已通过使先前未表征的a47l基因缺失而发现新型表型。使a47l缺失诱导copenhagen病毒产生较大空斑。
[2815]
illumina ngs深度测序揭露在空斑纯化过程期间存在主要缺失。copmd5p和copmd3p表示经空斑纯化的克隆，且发现其具有主要基因组缺失。使用这些2个克隆以高moi(moi 10)共感染单层hela细胞以诱导重组。随机空斑挑选及pcr揭露存在含有两种基因组缺失的双重缺失copmd5p3p(参见图5)。因此，发现野生型copenhagen群体中的两个天然存在的缺失。组合且纯化这2个缺失，得到复制病毒，在本文中称为“copmd5p3p”，其展现c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因中的缺失，以及itr的b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r拷贝中的每个中的缺失。如本文所用，“copwt”是指野生型copenhagen痘苗病毒，“copmd5p”是指具有代表性5'基因(c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、
k6l、k7r、f1l、f2l及f3l)中的缺失的copenhagen痘苗病毒，且“copmd3p”是指具有代表性3'基因(b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r)中的缺失以及itr的b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r及b29r拷贝中的每个中的缺失的copenhagen痘苗病毒。
[2816]
6.2.实施例2
‑
癌细胞死亡
[2817]
以4次重复实验在24孔培养板中用copmd5p3p以一moi范围(1至0.01)感染癌细胞。病毒感染后两天，用结晶紫对培养板进行染色。将结晶紫染料溶解于sds中且通过分光光度法读取。数据表示为未感染细胞的吸光度百分比(参见图6)。此数据显示，大部分癌细胞系在暴露于copmd5p3p病毒时较快地死亡。
[2818]
图23、图24及图26至图32也示出了野生型copenhagen痘苗病毒和若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子诱导抗肿瘤免疫反应及在各种癌细胞系中繁殖的能力。
[2819]
6.3.实施例3
‑
癌细胞的生长
[2820]
一式三份地在24孔培养板中用copmd5p3p以低moi(0.001)感染四个癌细胞系，且在不同时间点收集病毒并测定滴度。时间0h表示输入。图7中展示hela、786
‑
o、ht
‑
29及mcf7的生长曲线。这些数据显示修饰的copmd5p3p病毒在体外生长的能力未减弱。此意谓所述病毒即使在干扰素反应存在下也为复制感受态。在哺乳动物细胞系中复制的能力提供另一重要优势。因而，可以提高的速度和效率制造病毒。
[2821]
6.4.实施例4
‑
患者肿瘤样本中的生长
[2822]
在手术后立即获得患者肿瘤样本，并切成2mm
×
2mm核心。用少量病毒(1
×
104pfu)(野生型copenhagen或copmd5p3p)感染三个核心。72h后，通过空斑测定评定病毒输出且最终病毒滴度表述为pfu(参见图8)。这些数据显示修饰的copmd5p3p病毒可在新鲜患者肿瘤样本中复制。患者肿瘤样本中的复制为患者3d肿瘤的复制的良好模型。
[2823]
6.5.实施例5
‑
u2
‑
os细胞中的合胞体
[2824]
用copenhagen野生型或copmd5p3p病毒感染单层u2
‑
os细胞。2h后，如针对空斑测定所进行，将介质变成覆盖介质(overlay medium)。感染后48h，用evos获取图像以评定空斑表型(参见图9)。认为细胞融合(也称为合胞体)有助于病毒传播，因为未感染细胞与受感染的细胞合并。另外，已显示融合的细胞具有免疫原性，且在癌细胞的情况下可有助于引发抗肿瘤免疫反应。
[2825]
6.6.实施例6
‑
786
‑
o细胞中的合胞体
[2826]
用copenhagen野生型或copmd5p3p病毒感染单层786
‑
o细胞。24h后，用evos以10
×
放大率获取图像(参见图10)。这是发生合胞体的额外证据。在图9中，展示空斑的表达型。在当前实验中，单层细胞被感染而无覆盖。大部分由copmd5p3p病毒感染的细胞已融合。
[2827]
6.7.实施例7
‑
小鼠模型中的肿瘤控制和体重减轻
[2828]
用ht
‑
29人结肠癌异种移植物对裸cd
‑
1小鼠进行接种。一旦已形成大约5mm
×
5mm大小的皮下肿瘤，即用1
×
107pfu的任一痘苗病毒间隔24h三次(虚线)静脉内处理小鼠。大约每隔一天测量小鼠的肿瘤大小和体重减轻(参见图11)。此实验显示copmd5p3p为安全得多的病毒，因为其在免疫功能降低的裸小鼠中不引起任何体重减轻或其他疾病病征。此实验还显示copmd5p3p类似于亲本copenhagen野生型病毒能够控制肿瘤生长。
[2829]
6.8.实施例8
‑
痘病变形成
[2830]
用1
×
107pfu的任一痘苗病毒静脉内处理裸cd
‑
1小鼠一次，每组六只小鼠。处理后
两周，使小鼠牺牲，且获取尾部图像。针对每一小鼠尾部手动计数尾部上的痘病变。代表性图像展示于图12中。此实验显示copmd5p3p为安全得多的病毒，因为其在免疫功能降低的裸小鼠中不引起任何痘病变。此为至关重要的，因为先前溶瘤痘苗临床数据显示患者在治疗后产生痘病变。胸苷激酶(tk)的基因敲除为增加ov(溶瘤病毒)的安全性的流行方式，目前存在于iii期溶瘤痘苗及经fda批准的溶瘤t
‑
vec中。数据显示，使tk缺失在此测定未起到关键作用，其中小鼠在用tk缺失病毒攻毒时产生痘病变，但使用具有完整tk的copmd5p3p时并未产生痘病变。
[2831]
6.9.实施例9
‑
在全身性施用后痘苗的ivis生物分布
[2832]
经由用psem1质粒转染受感染的细胞，从而用荧火虫荧光素酶(fluc)置换tk来对痘苗病毒野生型wyeth、野生型copenhagen及copmd5p3p进行工程改造以表达fluc。对病毒进行空斑纯化及扩增。所有病毒为tk基因敲除且编码其tk基因座中的功能性fluc。
[2833]
随后用ht
‑
29人结肠癌异种移植物对裸cd
‑
1小鼠进行接种。一旦形成大约5mm
×
5mm大小的皮下肿瘤，即使用1
×
107pfu的任一痘苗fluc编码病毒静脉内处理小鼠一次，每组四只小鼠。处理后四天，用荧光素为小鼠i.p.(腹膜内)注射且用ivis针对病毒的存在进行成像(参见图13)。此实验显示copmd5p3p为安全得多的病毒，因为其对肿瘤更具特异性。其他病毒在尾部、肌肉、脚爪及鼻腔内显示偏离目标的复制。copmd5p3p仅位于肿瘤中。如先前图12和图13中所示，相较于另一病毒株，copmd5p3p在尾部较不可检测。图14展示copmd5p3p相较于其他溶瘤痘苗在其他器官中也具有较低滴度。由于copmd5p3p在肿瘤中以与其他病毒相同的水平复制，但在非目标组织中以较低水平复制，copmd5p3p优选地拟合溶瘤病毒的特征曲线。
[2834]
图25中展示包括野生型copenhagen痘苗病毒和若干修饰的copenhagen痘苗病毒粒子的各种痘苗病毒载体的生物分布的额外实例。
[2835]
6.10.实施例10
‑
痘苗在人pbmc中的免疫原性
[2836]
从健康人供体(n＝2)的血液中分离pbmc。用任一痘苗培育pbmc 24h且使用流动式细胞测量术检查早期活化标记物(参见图15)。此实验显示copmd5p3p更具免疫原性且可更容易通过免疫细胞检测。认为此为期望性状，因为肿瘤组织中的ov复制需要活化免疫细胞以获得成功抗肿瘤免疫反应。
[2837]
6.11.实施例11
‑
痘苗在小鼠脾细胞中的免疫原性
[2838]
用1
×
107痘苗pfu痘苗病毒静脉内注射免疫感受态balb/c小鼠。一天或两天后，使小鼠牺牲，收集脾脏且使用流动式细胞测量术分析免疫活化(参见图16)。此实验显示copmd5p3p更具免疫原性且可更容易通过小鼠免疫细胞检测。这些数据很好地补充了先前的图15，因为在小鼠中进行了大部分体内实验。
[2839]
6.12.实施例12
‑
痘苗在人细胞中的免疫原性
[2840]
用任一病毒以moi 0.01感染人癌细胞786
‑
o。次日，收集细胞，且通过细胞分级分离细胞核和细胞质。自各级分提取蛋白质，且针对nf
‑
kb亚单位p65和p50进行印迹(参见图17)。一旦nf
‑
kb亚单位p65及p50易位至细胞核，nf
‑
kb免疫转录因子即起始免疫反应。一些病毒为免疫抑制的且阻断此易位，从而防止免疫反应。抑制nf
‑
kb功能对于与免疫治疗方法组合使用溶瘤病毒的目标是违反直觉的。因此，copmd5p3p是更有利的病毒，因为其特性类似于mg
‑
1。
[2841]
6.13.实施例13
‑
在侵袭性黑色素瘤模型中与免疫检查点抑制剂抗ctla
‑
4抗体的协同作用
[2842]
用b16
‑
f10黑色素瘤肿瘤为免疫感受态c57bl/6小鼠皮下接种(5
×
105个细胞)。一旦形成大约5mm
×
5mm大小的皮下肿瘤，便开始处理。用copmd5p3p病毒处理的小鼠相隔一天接受至肿瘤中(肿瘤内)的三个1
×
107pfu剂量。用抗ctla
‑
4处理的小鼠相隔一天腹膜内接受五次100μg剂量的抗体。一旦处理开始，每隔一天记录生存率(参见图18)。在此实验中，测试在侵袭性黑色素瘤鼠类模型中，copmd5p3p病毒的溶瘤效应是否可与熟知检查点抑制剂ctla
‑
4协同作用。用病毒和检查点处理的小鼠的中值生存率高于任何其他组。这表明copmd5p3p具有与检查点阻断免疫疗法协同作用的一些刺激特性。
[2843]
6.14.实施例14
‑
与免疫检查点抑制剂抗ctla
‑
4抗体的协同作用
[2844]
用ct26
‑
lacz肿瘤为免疫感受态balb/c小鼠皮下接种(5
×
105个细胞)。一旦形成大约5mm
×
5mm大小的皮下肿瘤，便开始处理。用痘苗病毒处理的小鼠接受三次(相隔24h，前三个虚线)至肿瘤中(肿瘤内)的1
×
107pfu剂量。用抗ctla
‑
4处理的小鼠i.p.接受五次(相隔24h，虚线)100μg剂量的抗体。一旦处理开始，每隔一天记录肿瘤大小和生存率(参见图19)。数据显示tk基因敲除痘苗病毒与抗ctla
‑
4一起的作用不如copmd5p3p与抗ctla
‑
4一起的作用。这表明copmd5p3p更具免疫原性且更能够产生抗肿瘤免疫反应。
[2845]
6.15.实施例15
‑
与免疫检查点抑制剂抗pd1抗体的协同作用
[2846]
用ct26
‑
lacz肿瘤为免疫感受态balb/c小鼠皮下接种(5
×
105个细胞)。一旦形成大约5mm
×
5mm大小的皮下肿瘤，便开始处理。用痘苗病毒处理的小鼠接受三次(相隔24h，前三个虚线)至肿瘤中(肿瘤内)的1
×
107pfu剂量。在最后一次剂量的痘苗病毒之后24h，用抗pd1处理的小鼠i.p.接受五次(相隔24h，最后五个虚线)100μg剂量的抗体。一旦处理开始，每隔一天记录肿瘤大小和生存率(参见图20)。数据显示tk基因敲除痘苗病毒与抗pd1一起的作用不如copmd5p3p与抗pd1一起的作用。这表明copmd5p3p更具免疫原性且更能够产生抗肿瘤免疫反应。
[2847]
6.16.实施例16
‑
与免疫检查点抑制剂抗pd1抗体和抗ctla
‑
4抗体的协同作用
[2848]
用ct26
‑
lacz肿瘤为免疫感受态balb/c小鼠皮下接种(5
×
105个细胞)。一旦形成大约5mm
×
5mm大小的皮下肿瘤，便开始处理。用痘苗病毒处理的小鼠接受三次(相隔24h，前三个虚线)至肿瘤中(肿瘤内)的1
×
107pfu剂量。用抗ctla
‑
4处理的小鼠i.p.接受五次(相隔24h，前五个虚线)100μg剂量的抗体。在最后一次剂量的痘苗病毒之后24h，用抗pd1处理的小鼠i.p.接受五次(相隔24h，最后五个虚线)100μg剂量的抗体。一旦处理开始，每隔一天记录肿瘤大小和生存率(参见图21)。在此实验中，测试如果同时阻断两个检查点，较低剂量(25μg代替100μg)的检查点抑制剂抗体是否可起到作用。在具有较低剂量(总计50μg)的检查点的此鼠类模型中，copmd5p3p仍实现治愈。由于检查点抑制剂具有剂量依赖性毒性，有利于的是极小剂量的检查点阻断剂仍可实现可观测的表达型。在其他实验中，copmd5p3p病毒能够治愈形成的肿瘤，且缺乏copmd5p3p的对应缺失的野生型病毒未观测到此作用。
[2849]
6.17.实施例17
‑
用于治疗受试者的施用
[2850]
使用本文所描述的方法，本领域的临床医师可向受试者(例如患者)施用含有本文所述的重组正痘病毒载体的药物组合物，以治疗癌症或肿瘤细胞。癌症可为例如白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆
囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌或咽喉癌等等。
[2851]
举例来说，本领域的临床医师可评定患者患有癌症或肿瘤且可向患者施用治疗有效量(例如足以减小肿瘤的大小的量)的含有本文所公开的重组正痘病毒载体的药物组合物。可每指定时间间隔(例如每周、每天或每小时)以一个或多个剂量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)向受试者施用药物组合物。可在各剂量之间评估患者以监测疗法的有效性及基于患者的反应增加或减少剂量。可向患者经口、胃肠外(例如局部)、静脉内、肌肉内、皮下或鼻内施用药物组合物。治疗可涉及药物组合物的单次给药。治疗可涉及药物组合物的持续给药(例如数天、数周、数月或数年)。治疗可进一步涉及使用另一治疗剂(例如免疫检查点抑制剂，诸如抗pd
‑
1或抗ctla
‑
4抗体或其抗原结合片段、il
‑
12或flt3配体以及其他试剂)。
[2852]
6.18.实施例18
‑
若干痘苗病毒株中copmd5p和copmd3p的目标缺失
[2853]
用于产生修饰的痘苗病毒载体的以下方案利用例如rintoul等人plos one.6(9)：e24643(2011)中描述的技术，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中。
[2854]
简言之，通过g
‑
block技术(idt,coralville iowa)合成copmd5p(具有5'基因(c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l及f3l基因)中的缺失的copenhagen痘苗病毒)及copmd3p(具有3'基因(b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r及b20r基因)中的缺失的copenhagen痘苗病毒)靶向重组构建体。在不含血清的dmem中用野生型痘苗病毒(wyeth、western reserve、tian tan、lister)以moi 0.01感染u2os细胞1.5小时。抽取病毒上清液，且于optimem(gibco)中通过lipofectamine 2000(invitrogen)用pcr扩增的copmd5p或copmd3p靶向g
‑
block转染u2os细胞。在转染之后30分钟将补充有10％fbs的dmem添加至细胞并静置过夜。第二天，抽取转染介质，且将新鲜dmem 10％fbs培养基添加至细胞。感染转染后48小时，收集u2os细胞且通过单一冷冻解冻循环溶解。将连续稀释溶解物涂铺至u2os细胞的汇合单层上，且分离egfp阳性(靶向copmd5p)或mcherry阳性(靶向copmd3p)空斑并经由5轮空斑纯化来进行纯化。
[2855]
通过针对u2os细胞中的各病毒以moi 5共感染copmd5p和copmd3p缺失痘苗病毒来产生双重主要缺失痘苗病毒。次日收集细胞，且通过一轮冷冻解冻溶解。连续稀释溶解物，且涂铺至u2os细胞的汇合单层上，所选双阳性空斑(egfp+mcherry)。通过5轮空斑纯化来纯化空斑。
[2856]
图22中展示用于产生本发明的修饰的正痘病毒载体(例如修饰的痘苗病毒载体，诸如修饰的copenhagen痘苗病毒载体)的例示性流程。
[2857]
6.19.实施例19
‑
skv(copmd5p3p
‑
b8r
‑
)与skv
‑
b8r+相比在肿瘤控制方面具有类似功效
[2858]
痘苗病毒痘苗病毒(vv)b8r基因编码与γ干扰素受体(ifn
‑
γ)具有同源性的分泌蛋白。在体外，b8r蛋白结合至若干种γ干扰素(包括人和大鼠γ干扰素)的抗病毒活性且抵消所述抗病毒活性；然而，其不显著结合至鼠类ifn
‑
γ。在此，描述缺乏b8r基因的重组vv的构建和特征化。靶向构建体与b8r基因座之间的同源重组引起75％的b8r基因经通过两个loxp位点侧接的egfp转基因置换(skv
‑
gfp)。
[2859]
b8r病毒显示与b8r+病毒类似的功效。图37.评定用skv或skv
‑
gfp处理的小鼠的生
存率。在第0天皮下接种5
×
105个ct26
‑
lacz细胞。在第14天、第16天及第18天，以107pfu的剂量肿瘤内注射skv或skv
‑
gfp来处理肿瘤。当注射的病毒具有b8r基因座的缺失时，发现功效未显著降低。
[2860]
6.20.实施例20
‑
skv
‑
b8r+病毒对正常细胞系与癌细胞系的感染
[2861]
将原代健康细胞活力与癌细胞的活力进行比较。以一定范围的moi(pfu/细胞)感染汇合正常细胞或癌细胞48小时，之后对活力进行定量。如图34中所指示，skv
‑
b8r+病毒优先感染癌细胞。
[2862]
6.21.实施例21
‑
skv
‑
b8r+不削弱干扰素信号传导。
[2863]
通过测定于多个正常细胞系和一个癌细胞系(786
‑
o)中被上调(诱导表达)或下调(抑制表达)的干扰素途径中的基因的数目来评定干扰素信号传导。图35用skv
‑
b8r+(copmd5p3p)或使tk基因失能的亲本copenhagen病毒以moi 3(3
×
106pfu)感染一百万个细胞的汇合单层18h。使用rna
‑
seq对rna进行测序，且在读取映射和表达归一化之后确定干扰素基因的基因表达。虽然skv
‑
b8r+(copmd5p3p)病毒大多诱导干扰素途径中的基因，但亲本copenhagen抑制基因。这表明skv
‑
b8r+(copmd5p3p)能够诱导在正常细胞的病毒清除方面至关重要的i型干扰素信号传导。
[2864]
6.22.实施例22
‑
被工程改造以表达flt3l、il
‑
12tm和抗hctla
‑
4的b8r阴性痘苗病毒
[2865]
如上文所描述的含有copmd5p3p和b8r缺失两者的修饰的痘苗病毒进一步被工程改造以表达免疫治疗转基因flt3l和il
‑
12
‑
tm以及hctla
‑
4的抗体，如图38中所示。将flt3l、il
‑
12tm及egfp转基因插入到copenhagen痘苗病毒基因组上的b8r基因座中。参见图36。靶向构建体与b8r基因座之间的同源重组引起75％的b8r基因经flt3
‑
lg、il
‑
12
‑
tm及egfp转基因置换(skv
‑
23)。此策略允许产生b8r基因敲除病毒，同时插入转基因代替b8r。通过靶向5p缺失的边界以插入由t2a蛋白质组基序分开的人抗ctla
‑
4抗体的重链与轻链来将抗ctla
‑
4igg插入到skv
‑
23主链中(skv
‑
123v2；参见图38)。
[2866]
评定这些被工程改造病毒表达膜结合il
‑
12转基因的能力。用经skv
‑
1sc23、skv
‑
3或skv
‑
gfp工程改造的痘苗基因感染细胞。如图42中所描绘，用il
‑
12p35特异性抗体对vero细胞染色。将vero细胞用麦胚凝集素(wga)结合荧光团作为对比染色来共标记，以观测细胞膜特异性染色图案。经由蛋白质印迹定量针对各种skv病毒表达转基因进一步定量hil
‑
12产生。参见图41。用表达三个转基因(抗hctla
‑
4、ftl3l、il
‑
12)的不同组合的各种痘苗skv以moi 0.1(1x10
5 pfu)感染1
×
106个hela细胞的单层。感染后48h之后，收集上清液和溶解物且探测il
‑
12p35亚单位的表达。被工程改造以表达具有跨膜结构域的il
‑
12p35亚单位的两种病毒skv
‑
123和skv
‑
3仅表达溶解物级分上的蛋白质，表明il
‑
12未分泌至上清液中。
[2867]
使用elisa方案测量抗hctla
‑
4和hflt3l的表达量。用表达全部三个转基因的skv
‑
123以moi 0.1(1
×
105pfu)感染1
×
106个hela细胞的单层。感染后48小时，收集上清液，且经由elisa分析人抗ctla
‑
4抗体和flt3配体的表达。如图40中所描绘，相比产生flt3配体可溶性蛋白，skv
‑
123病毒能够产生更多针对ctla
‑
4的抗体。
[2868]
就随时间的转基因表达动力学方面评估表达全部三个转基因的skv
‑
123病毒(图39)。用skv
‑
123病毒以moi 3(3
×
106pfu)感染786
‑
o人腺癌细胞系的汇合单层。使用rna
‑
seq对rna进行测序，且在读取映射和表达归一化之后确定插入的转基因的基因表达。数据
表明转基因表达在细胞感染发生后3至4小时达到峰值。
[2869]
在单独实验中，在以下三个其他癌细胞系中进一步评估三个转基因自skv
‑
123v2病毒的表达：hela人宫颈癌细胞(美国菌种保藏中心(atcc)目录号：ccl
‑
2)、ht
‑
29人结肠直肠癌细胞(atcc目录号：htb
‑
38)及ct26.wt鼠类结肠直肠癌细胞(atcc目录号：crl
‑
2638)。moi 0.1或1.0下的skv
‑
123病毒感染引起hela、ht
‑
29及ct26.wt癌细胞中的每个中的ctla
‑
4抗体、flt3l及il
‑
12转基因产物产生(图56至图59)。
[2870]
6.23.实施例23表达膜结合的鼠类il
‑
12p35的skv在控制鼠类肿瘤方面具有更大功效。
[2871]
评定用skv或skv
‑
3病毒(表达鼠类膜结合p35 il
‑
12)处理的小鼠的生存率。在第0天皮下接种5
×
106个ct26
‑
lacz细胞。在第14天、第16天及第18天，以1
×
107pfu的剂量肿瘤内注射skv或skv
‑
3来处理肿瘤。虽然skv病毒延长携带ct26结肠肿瘤的小鼠的生存期，但il
‑
12的skv
‑
3表达能够诱导促成持久治愈的缓解。参见图43。
[2872]
6.24.实施例24
‑
各种痘苗病毒株中被工程改造的大部分双重缺失增强体外癌细胞杀死
[2873]
用被工程改造的痘苗病毒的以下病毒株以moi 0.1感染hela细胞：(1)亲本野生型病毒(wt)；(2)5'主要缺失(5p)，(3)3'主要缺失(3p)，及(4)重组5'和3'主要双重缺失(5p3p)。感染后72小时通过alamar blue分析定量细胞活力。相较于其亲本野生型和3p主要缺失病毒株，5p和5p3p主要双重缺失痘苗病毒株两者在hela细胞中更具细胞毒性。参见图44至图47。
[2874]
6.25.实施例25
‑
skv在8个不同异种移植小鼠模型中对肿瘤体积和生存益处的功效
[2875]
这些功效研究的目标在于确定无胸腺裸小鼠中静脉内(iv)和/或瘤内(it)注射的包含copmd5p3p和b8r缺失两者的修饰的痘苗病毒(skv)的抗癌活性，将这些裸小鼠皮下植入(sc)mia paca
‑
2人胰脏肿瘤细胞、pc
‑
3人前列腺肿瘤细胞、u87mg人神经胶质瘤细胞、uacc
‑
62人黑色素瘤细胞、um
‑
uc
‑
3人膀胱肿瘤细胞、colo
‑
205人结肠肿瘤细胞、nci
‑
h460人肺肿瘤细胞或ht29人结肠腺癌细胞。
[2876]
培养细胞，且当获得所需细胞数目时，为总计45只雌性6至8周龄无胸腺裸小鼠接种肿瘤细胞(第0天)。用含一千万个细胞(1
×
107个细胞)的0.2ml的1:1matrigel
tm
于右侧腹对各小鼠进行sc注射。当25只小鼠具有大约100至200mg的肿瘤(目标组平均肿瘤重量为大约200mg)时，开始用痘苗病毒处理。
[2877]
向小鼠it(10只小鼠)和/或iv(10只小鼠)施用0.05ml skv(剂量1
×
107pfu)。向对照物(5只小鼠)施用0.05ml pbs。对于it注射，使用附接至无菌注射器的31g1/2"针头对各肿瘤进行注射。若肿瘤较大或形状不规则，则在每天注射时于不同区域对肿瘤进行注射。每日两次观测小鼠的死亡率和垂死率。从治疗第一天开始一周两次测量肿瘤。使用针对椭球球面的方程式(l
×
w2)/2＝mm3计算肿瘤体积(mm3)，其中l和w是指每次测量收集的较大和较小尺寸。
[2878]
在肿瘤植入后第60天或更早，所有濒死动物、所有体重过度减轻(从处理第一天开始，>体重的30％)的动物或所有总肿瘤负荷达到4,000mg的动物发生溃烂，或被丢弃、自研究移除。
[2879]
这些功效研究显示：当iv或it施用1
×
107pfu的剂量的skv时，mia paca
‑
2、pc
‑
3、u87mg、uacc
‑
62及um
‑
uc
‑
3异种移植模型中的肿瘤体积的可测量减小，如图48a至图48e中所示；以及当it施用1
×
107pfu的剂量的skv时，colo
‑
205、h460及ht29异种移植模型中的肿瘤体积的可测量减小，如图48f至图48h中所示。这些功效研究还显示相较于用单独的pbs处理的对照小鼠，当iv和/或it施用skv时，所有8个异种移植模型中的生存百分比(p<0.0001)显著增加，如图48a至图48h中所示。
[2880]
6.26.实施例26
‑
各种skv载体对同基因型小鼠模型中的肿瘤体积和生存益处的功效
[2881]
产生多个skv载体(参见上文表44和表45)。此研究的目的在于比较skv
‑
12m3v2
‑
egfp、伊匹单抗及skv于所有经编码转基因具有活性的同基因型小鼠模型中的功效。将mc38结肠直肠癌细胞(5
×
105)再悬浮于100μl的matrigel与不含血清的dmem培养基的1:1混合物中，且sc注射至表达人ctla
‑
4的转基因c57bl/6小鼠的右侧腹中。随后将动物随机分为5个处理组，且随后用pbs、pbs伊匹单抗、skv、抗pd
‑
1抗体、skv
‑
12m3v2
‑
egfp或skv
‑
12m3v2
‑
egfp加抗pd
‑
1抗体处理。skv
‑
12m3v2
‑
egfp为表达人抗ctla
‑
4抗体、人flt3配体及小鼠il
‑
12tm p35的skv。将病毒在pbs中稀释以在50μl中递送1
×
108pfu/小鼠，且随后将总体积注射至肿瘤中心，产生单一针迹。将抗体在无菌pbs中稀释(伊匹单抗20μg于100μl中稀释且抗pd
‑
1抗体250μg于100μl中稀释)至适当剂量且通过ip注射递送。用3次剂量的以下任一个处理携带sc mc38肿瘤的小鼠：a)1mg/kg的伊匹单抗，b)1
×
108pfu的skv，或c)1
×
108pfu的skv
‑
12m3v2
‑
egfp。测量肿瘤，记录体积，且在处理之前及随后在研究过程中(持续时间为21天)评定基本健康状况。研究结果展示于图49(平均肿瘤体积和生存曲线)和图50(个别肿瘤体积)中。单独的伊匹单抗引起肿瘤生长延迟及1例治愈(10％)；单独的skv显示功效及2例治愈(20％)；表达三个转基因的skv显著改善肿瘤控制、增加生存率且得到3例治愈(30％)；添加pd
‑
1抗体使治愈率倍增(30％至60％)；且单独的pd
‑
1抗体无作用(数据未示出)。
[2882]
相较于pbs处理组，在研究的第一人道终点时，回应于用伊匹单抗(p<0.05)、skv(p<0.05)、skv
‑
12m3v2
‑
egfp(p<0.05)及skv
‑
12m3v2
‑
egfp+抗pd
‑
1抗体(p<0.05)处理，观测到肿瘤控制。不同病毒之间或在添加抗pd
‑
1抗体的情况下，肿瘤控制不存在统计学上显著的差异。使用多个t测试用graphpad prism 8.2执行所有统计学测试。
[2883]
相较于pbs处理组(中值生存期19天)，用skv(p<0.005，中值生存期20＝5天、伊匹单抗(p<0.001，中值生存期30天)、skv
‑
12m3v2
‑
egfp(p<0.001，中值生存期33天)及skv
‑
12m3v2
‑
egfp+抗pd
‑
1抗体(p<0.001)的处理观测到增加的生存时间。在以下处理组中观测到完全肿瘤消退：伊匹单抗(n＝1)、skv(n＝2)、skv
‑
12m3v2
‑
egfp(n＝3)及skv
‑
12m3v2
‑
egfp(n＝6)。用skv
‑
12m3v2
‑
egfp+抗pd
‑
1抗体处理相较于用单独的skv(p<0.05)处理显示增加的生存益处；然而，当skv
‑
12m3v2
‑
egfp+抗pd
‑
1抗体与单独的skv
‑
12m3v2
‑
egfp进行比较时，生存期不存在统计学上显著的差异。使用log
‑
rank(mantel
‑
cox)测试用graphpad prism 8.2执行所有统计学测试。
[2884]
当在相对侧腹上用5
×
105个mc38细胞对skv
‑
12m3v2
‑
egfp+抗pd
‑
1抗体组中初始肿瘤完全消退的六只小鼠进行再攻毒时，2只小鼠呈现肿瘤生长，且4只小鼠对肿瘤生长仍具有抗性。
[2885]
6.27.实施例27
‑
表达膜结合il
‑
12p35
‑
tm亚单位的skv对比表现膜结合il12p70
‑
tm亚单位的skv对mc
‑
38小鼠模型的肿瘤体积的功效的比较
[2886]
此研究之目的在于比较mc38肿瘤模型中skv
‑
mil12p35相对于skv
‑
mil12p70和skv的功效，以评定2个il12亚单位在与免疫刺激潜能相关的肿瘤控制和生存率方面是否存在差异。将mc38结肠直肠癌细胞(5
×
105)再悬浮于100μl matrigel与不含血清的dmem培养基的1:1混合物中，sc注射至c57bl/6小鼠的右侧腹。使肿瘤生长7天，直至其为大约3
×
3mm为止。随后将动物随机分为4个处理组，且随后用pbs、skv、skv
‑
mil12p35或skv
‑
mil12p70处理。将病毒在pbs中稀释以在100μl中递送1
×
107pfu/小鼠，且随后将总体积注射至肿瘤中心，产生单一针迹。结果显示于图51中。skv、skv
‑
mil12p35及skv
‑
mil12p70处理的小鼠相较于pbs处理的对照小鼠皆显示肿瘤体积的减小。skv
‑
mil12p35和skv
‑
mil12p70处理两者皆比单独的skv处理更有效。skv
‑
mil12p35和skv
‑
mil12p70处理的小鼠显示相当的肿瘤体积减小。
[2887]
6.28.实施例28
‑
异源初免
‑
加强溶瘤疫苗方案中的skv
[2888]
初步结果显示skv可用于异源疫苗中的初免或加强免疫反应。卵白蛋白(ova)在异源初免
‑
加强组合中用作外来抗原。在第1天对动物进行初免，在第8至10天评定，且随后在第14天加强并在加强后于第21至24天再次评定。用pbs(对照)、表达ova的腺病毒、表达ova的野生型copenhagen株痘苗病毒或表达ova的copmd5p3p(skv主链)作为初免剂或加强剂处理健康c57黑小鼠。在第21天执行四聚体分析，评估ova特异性反应。在10天时评定小鼠，显示在于第1天用初免剂给药且随后在第14天免疫加强的c57bl/6小鼠中，copmd5p3p或skv主链在初免及加强环境两者中诱导免疫反应，但copenhagen病毒未诱导，如图52中所示。copmd5p3p(skv主链)可进行初免，且通过maraba mg1溶瘤棒状病毒加强初免反应。copmd5p3p(skv主链)可加强腺病毒初免反应。copmd5p3p(skv主链)在针对外来抗原的免疫反应的初免和加强两者中胜过亲本copenhagen病毒。
[2889]
6.29.实施例29
‑
it对比iv施用的skv
‑
123转基因的生物分布
[2890]
研究表述为用skv
‑
123处理的结果的不同施用途径(iv对比it)对于转基因(抗ctla
‑
4抗体、flt3l及il
‑
12
‑
tm)的生物分布的作用。为雌性balb/c小鼠移植ct26
‑
lacz肿瘤细胞(3
×
105个细胞)且在研究第1天、第3天及第5天通过iv注射或在研究第1天及第3天通过it注射在两周后相继给予skv
‑
123(剂量1
×
108pfu)。在第2天、第4天、第6天、第8天及第22天收集肿瘤携带组的血液和组织。在第28天和第43天收集非肿瘤携带组的脾脏。从血液样本中分离(自心脏穿刺收集)血清，且将组织均质化以用于flt3l和抗ctla
‑
4抗体表达的elisa。仅对通过pcr测试病毒基因组呈阳性的样本进行elisa。针对il
‑
12
‑
tm生物分布，在第2天、第4天、第8天、第22天、第28天及第43天收集组织。将组织均质化以用于il
‑
12
‑
tm转基因表达的蛋白质印迹分析。仅对通过pcr测试病毒基因组呈阳性的样本进行蛋白质印迹。将抗微管蛋白用作内对照物。在脾脏和尾部样本中可能未检测到微管蛋白，然而在转移之后用印迹的ponceau染色确认存在蛋白质。在第1天和第3天通过iv注射给予的skv
‑
123使得血清中的抗ctla
‑
4抗体和flt3l的含量可检测(图53a、图53b)且在第2天于小鼠肿瘤中的浓度较低(图53c、图53d)。在第2天亦可在脾脏和尾部检测到flt3l，且在iv处理后第4天仍可检测到(图53c、53d)。无论为iv抑或it处理，在第4天血清中的抗ctla
‑
4抗体仍可检测(图53a)。skv
‑
123的it处理在第4天于肿瘤中产生flt3l浓缩(图53f)，而抗ctla
‑
4抗体浓度较低但可检测(图53e)。已在鼠类肿瘤模型中证实肿瘤选择性转基因表达，其中在肿瘤内实现
治疗浓度(例如>7.5ng/ml flt3l)而在全身循环中不会检测到任何可检测转基因产物。
[2891]
用于il
‑
12
‑
tm的蛋白质印迹仅于肝脏中显示非特异性色带(图54a)，而动物的肿瘤、脾脏、肺或尾部中未检测到il
‑
12
‑
tm(图54a至图54d)。免疫感受态肿瘤携带小鼠中的skv
‑
123的生物分布受限于it处理的动物中的肿瘤，且在iv处理之后的前几天以极低程度受限于肿瘤及有限数目的其他组织。
[2892]
在所评定的时间点中的任一个处，于大脑、心脏、肾脏、卵巢、腹股沟淋巴结、骨髓或血清中未检测到病毒基因组。病毒基因组仅在第4天时间点于肿瘤样本中可检测，但在第9天时间点的一个样本除外。基因组主要在第2天及第4天时间点于一些尾部、肺、脾脏及肝脏样本中可检测。在来自第23天收集组的任何样本中，未检测到基因组。
[2893]
skv
‑
123病毒的病毒滴度在通过iv注射处理后第2天于尾部中最高，脾脏、肺及肝脏中具有可检测的低水平。在第4天，仅在iv注射组的尾部中检测到滴度。两种施用途径的肿瘤中皆检测到病毒滴度，相较于iv注射，it注射后发现较高滴度。对于两种施用途径，也以相当的水平在肺中检测到病毒。
[2894]
在此研究中检查的环境排出样本(血清、尿液、唾液)均不含有任何可检测病毒基因组或复制病毒。
[2895]
6.30.实施例30
‑
skv
‑
123v2在人源化小鼠模型中对肿瘤体积的功效
[2896]
研究skv
‑
123v2在人源化小鼠模型中对肿瘤生长的功效。nod scidγ(nsg)小鼠为可用人pbmc处理且因此产生类似人的免疫系统的一个免疫缺陷实验室小鼠品牌。为雌性nsg小鼠植入人pbmc且随后在2周后皮下移植1
×
107个um
‑
uc
‑
3异种移植人膀胱肿瘤细胞。使用针对椭球球面的方程式(l
×
w2)/2＝mm3计算肿瘤体积(mm3)，其中l及w是指每次测量收集的较大和较小尺寸。当肿瘤为最小的100mm3时，每两天通过iv注射用1
×
108pfu的skv
‑
123v2或生理盐水对照物处理小鼠三周。评定小鼠基本健康状况，且在研究过程中测量肿瘤体积。在植入第4天且随后自处理第一天开始一周两次测量肿瘤。在第21天，用skv
‑
123v2处理的动物具有对应于相对于用媒剂处理的对照的
‑
8.4％的差异的平均肿瘤体积164mm3，其中在第32天观测到最大作用，相对于对照具有
‑
53.2％的差异(图55)。
[2897]
6.31.实施例31
‑
skv
‑
123v2在肿瘤细胞和正常细胞的体外感染性比较
[2898]
在体外表征skv
‑
123v2病毒感染人正常(pbmc、prec)及癌症(786
‑
o、海拉)细胞之后的病毒复制、细胞毒性、转基因表达及细胞因子产生。人周边血液单核细胞(pbmc)是购自lonza(目录号：cc
‑
2702)。人前列腺上皮细胞(prec)是购自lonza(目录号：cc
‑
2555)。786
‑
o人肾脏腺癌细胞是购自atcc(目录号：crl
‑
1932)。hela人宫颈癌细胞是购自atcc(目录号：ccl
‑
2)。
[2899]
将细胞接种于24孔培养板上。在以下四个时间点评定细胞活力和细胞因子表达：感染后6小时、24小时、48小时及72小时。为测定各细胞悬浮液的每毫升活细胞数目和活力百分比，将细胞悬浮液分别置于0.6ml的vicell杯中，且将样本记录至仪器中。制备稀释液。当单层>80％汇合时(细胞接种后24小时)，感染细胞。在感染当天，将病毒稀释至如下表47中概述的适当剂量。在24孔培养板中进行感染。
[2900]
表47.用于24孔培养板的感染计算
[2901][2902]
在指示的时间点进行细胞因子剖析。将受感染的细胞上清液等分，储存于
‑
20℃，且送至eve technologies以供使用具有il
‑
18的人细胞因子阵列/趋化因子阵列42
‑
plex(hd42)(human cytokine array/chemokine array 42
‑
plex with il
‑
18(hd42))进行分析。使用elisa测定评定flt3l和伊匹单抗表达。在各收集时间点使用alamar blue表现细胞活力，在fluoroskan上读出以测定处理孔相对于未处理对照孔的活力％。测定病毒滴度以评定不同细胞系之间的复制动力学。
[2903]
在血清生长因子存在下且在缺乏接触抑制的情况下培养正常细胞，以便在感染时使细胞活力达到最大。在所测试条件下且在用于skv
‑
123v2感染实验的等效细胞密度下，prec(前列腺上皮细胞)证实与hela癌细胞几乎一样高的增殖速率。为了在于这些条件下培养时优选地界定所测试正常细胞系的表达型，在伴随研究中对prec细胞及pbmc进行测量brdu并入的增殖分析。在体外感染条件下，相较于癌细胞系和pbmc，观测到prec中与此正常细胞系的相对增殖速率相关的skv
‑
123v2的中等复制。
[2904]
结果显示786
‑
o和hela癌细胞系对skv
‑
123v2病毒感染敏感，如通过细胞活力以剂量依赖性及时间依赖性方式降低所证明(图56)。786
‑
o细胞活力在所测试的所有moi下随时间降低，而hela细胞活力在moi 1和0.1下的skv
‑
123v2病毒感染后降低。正常人pbmc对感染具有抗性，如通过在moi 1、0.1及0.01的skv
‑
123v2病毒感染之后的高细胞活力所证明(图56)。正常人prec相较于癌细胞系对skv
‑
123v2病毒感染较不敏感。直至感染后48小时，在任何moi(1、0.1及0.01)下未观测到细胞活力的降低。感染后72小时，在moi 1及0.1下的skv
‑
123v2病毒感染后注意到细胞活力降低(图56)。
[2905]
相较于在正常人prec中，skv
‑
123v2病毒以较高速率在癌细胞系中感染及复制(图57)。相较于在正常人prec中，其在786
‑
o和hela癌细胞系中感染及复制至大于10倍的水平。在moi 1、0.1及0.01下，skv
‑
123v2病毒在正常人pbmc中不复制(图59)。
[2906]
在各moi及时间点于细胞上清液中监测抗ctla
‑
4抗体及flt3l(通过经skv
‑
123v2病毒感染的细胞产生的两个转基因产物)产生。相较于在正常细胞(prec细胞或pbmc)中，skv
‑
123v2病毒感染促使在癌细胞中产生更多抗ctla
‑
4抗体和flt3l(图58及图59)。在pbmc细胞上清液中可能未检测到抗ctla
‑
4抗体或flt3l。flt3l及抗ctla
‑
4抗体转基因产物浓度与细胞对skv
‑
123v2感染的敏感性相关。
[2907]
在细胞因子剖析实验中，相比在正常细胞中，在被skv
‑
123v2病毒感染的癌细胞中观测到较高水平的细胞毒性。
[2908]
细胞系prec尤其对病毒感染具有反应，从而在自hela、786
‑
0及pbmc仅可检测低浓度或可忽略浓度的这些细胞因子的情形下，产生egf、g
‑
csf、il
‑
1a、il
‑
1ra、il
‑
4及il
‑
18。
prec及786
‑
0为回应于感染产生il
‑
8、tgf
‑
α及tnfα的仅有细胞系；而仅prec及pbmc产生ip
‑
10。prec显示egf的剂量依赖性产生，在较高moi的病毒感染下产量增加。在同一给药组内，对于经moi 1的病毒感染的细胞，egf浓度在24至72小时之间保持恒定，且在72小时处略微增加。在prec细胞中，il
‑
1a产生在感染后48小时大多保持与基线一致，且随后在72小时处增加，在moi 1下观测到最高浓度。同样，通过prec的il
‑
1ra及il
‑
18产生显示，在感染后72小时浓度急剧增加，在此时间点之前浓度低(在较高moi 0.1及1感染中于24小时处il
‑
1ra略微增加)或可忽略。虽然il
‑
1ra的产生在72小时处似乎为剂量依赖性的，但相较于moi 0.1的病毒，moi 1的病毒促成il
‑
18产生减少。相较于未处理的对照，在所有给药组中，prec在感染后6小时产生减少的il
‑
4。然而，此il
‑
4产生在感染后24小时增加至基线以上且在72小时保持较高。
[2909]
或者，除prec外的所有细胞系产生mcp
‑
1。在hela和786
‑
0细胞中，在基线下产生高浓度的mcp
‑
1且不受病毒感染影响。在pbmc中，通过以下高剂量的病毒诱导基线以上的mcp
‑
1：在感染后24小时，moi 1的病毒；及在72小时，moi 0.1和1的病毒。
[2910]
若干细胞因子在感染后24和72小时相对于基线增加，但在48小时未增加(或仅略增加)。在hela细胞中，这些细胞因子为fgf
‑
2(在moi 1下，而较低剂量仅能够在72小时诱导产生)和il
‑
6(仅moi 0.01和0.1；moi 1浓度随时间推移恒定)。在prec细胞中，这些细胞因子为g
‑
csf(仅在moi 0.01和0.1下；moi1浓度随时间推移恒定)、tgf
‑
α(仅在moi 0.01和0.1下；moi 1浓度随时间推移恒定)、tnfα(仅在moi 0.01和0.1下；moi 1随时间推移增加)及ip
‑
10(仅moi 0.1和0.1；moi 1产生低浓度)。在786
‑
0细胞中，这些细胞因子为fgf
‑
2(仅在moi 0.1和1下；最低剂量moi 0.01仅在72小时诱导产生)、il
‑
8(仅在moi0.01和0.1下；moi 1浓度随时间推移恒定)及tgf
‑
α(仅在moi 0.01和0.1下)、tnfα(仅moi 0.01和0.1；moi浓度随时间推移处于基线)。在pbmc中，细胞因子为ip
‑
10(仅在moi 1下)。
[2911]
hela及786
‑
0细胞中的ifnα2产生在感染后24小时达到峰值且随后随时间进程降低，而在prec细胞中，ifnα2产生在72小时最高。在全部三个细胞系中，moi 0.1或1下的较高剂量在给药组当中展现最低细胞因子产生。
[2912]
ifnγ产生在所有细胞系中皆较低，786
‑
0在24小时处展现峰值产生且随后随时间推移降低。
[2913]
6.32.实施例32
‑
重组痘苗病毒的产生
[2914]
此实例中所描述的方法和技术用于产生表45中所描述的载体。如表45中所概述，已证实各载体为复制感受态、表达载体中所含的转基因且如所指示于癌细胞系中展现细胞毒性。如下文所描述的分析用于产生表45中概述的数据。
[2915]
重组
[2916]
首先用待修饰的痘苗病毒(例如skv病毒)感染几乎汇合(80至90％)的u2os细胞的单层2小时。感染后，将靶向dna(图60)转染至受感染的细胞中。第二天(转染后12至18小时)，移除转染介质且将新鲜介质添加至细胞。第二天(转染后约48小时)，将细胞冷冻且解冻以用于空斑纯化。
[2917]
空斑纯化和扩增
[2918]
为了鉴别重组痘苗病毒，使用荧光标记物筛选空斑。将来自前一步骤的感染/转染混合物的连续稀释液(1:10)添加至u2os细胞的汇合单层，保持2小时，之后将介质置换为覆
盖介质以允许空斑形成。两天后，挑选荧光空斑，连续稀释且添加至新鲜u2os细胞单层，之后添加至覆盖介质。重复此空斑纯化过程直至所有空斑为荧光的为止。为了移除荧光标记物，如以上步骤(即，重组)中所概述用荧光病毒转染适当重组酶。随后继续空斑纯化过程以选择非荧光空斑。
[2919]
随后使用纯净重组病毒的空斑感染另一细胞系(例如hela细胞)的单层以扩增，在此步骤不添加覆盖层。一旦在感染细胞上发现可见细胞病变效应，即收集细胞溶解物，且通过病毒滴度来测定重组病毒浓度。
[2920]
转基因表达
[2921]
使用重组病毒以各种浓度(例如moi 0.01、0.1或1)感染各种癌细胞(例如hela、u2os、786
‑
o等)，持续各种时间量(例如感染后6小时、24小时、48小时及72小时)。将细胞溶解物(用于蛋白质印迹)及细胞上清液(用于elisa)冷冻且储存于
‑
80℃以用于与转基因产生相关的分析。对于编码可溶性蛋白(例如flt3l、抗ctla
‑
4抗体)的转基因，使用elisa试剂盒定量转基因产生。对于编码细胞受限(例如细胞内部或膜结合)蛋白产物(例如膜结合il
‑
12)的转基因，使用细胞溶解物的蛋白质印迹定量转基因产生。
[2922]
癌细胞系细胞毒性
[2923]
通过经光学显微镜观察到的在受感染细胞上可见的细胞病变效应测定癌细胞系的细胞毒性。可收集细胞溶解物，且通过病毒滴度确定重组病毒浓度。
[2924]
一些实施方案
[2925]
本说明书中提及的所有公布、专利及专利申请以引用的方式并入本文中，其引用程度如同每一独立公布或专利申请被特别及单独地指示以引用的方式并入一般。
[2926]
尽管本发明已结合其特定实施方案进行描述，但应了解，其能够进行进一步修改，且本技术旨在涵盖本发明的任何变化、使用或改编，其大体上遵循本发明的原理且包括在关于本发明的此项技术内已知或惯用实践范围内出现的与本发明的此类偏离，且可应用于上文阐述的基本特征，且遵循权利要求的范围。
[2927]
一些实施方案在权利要求内。