骨质疏松诊治用生物标志物的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及骨质疏松诊治用生物标志物，具体的该生物标志物为loc101927627。

背景技术：

骨质疏松症是一种系统性骨骼疾病，其特征在于骨组织中的低骨量和微结构退化，导致骨骼脆性增加和骨折风险增加。骨质疏松性骨折导致生活质量显著下降，发病率，死亡率和残疾增加。

根据骨质疏松症的发病原因，将其分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。原发性骨质疏松症与衰老过程有关，伴随着性激素的降低。骨骼在微结构方面已经恶化，导致骨矿物质密度的丧失和骨折的风险增加。继发性骨质疏松症可能是内分泌及代谢紊乱(如性腺功能减退，皮质醇增多症，甲状旁腺功能亢进，甲状腺功能亢进症，厌食症)，淋巴组织增生性疾病，肠道吸收不良，类风湿性关节炎，肾功能衰竭等的后果。此外，一些药物的使用也可引起骨质疏松症，如糖皮质激素，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，抗凝血剂和抗糖尿病药物(societaitalianadelfosteoporosidmmedmds.[guidelinesforthediagnosis,preventionandtreatmentofosteoporosis.italianosteoporosis,mineralmetabolismandskeletaldiseasessociety].minervaendocrinol.2013；38(1suppl1):1-30.)，其他药物如化疗药物，质子泵抑制剂和噻唑烷类药物对骨质疏松影响的研究较少，故上述几种药物的使用尚不能完全确定为引起继发性骨质疏松症的危险因素。骨质疏松症的发生可以归结于很多种病因，然而不论何种病因，所有骨质疏松症的患者都存在着一个共同的特征:即骨形成和骨吸收间的失平衡现象，成骨细胞的骨形成率往往是正常的，而破骨细胞的骨吸收率增加(akessonk.newapproachestopharmacologicaltreatmentofosteoporosis.bullworldhealthorgan.2003；81(9):657-64.)。

虽然目前研究认为骨质疏松的发病与年龄、性别有关，且与遗传因素和环境因素等密切相关，但骨质疏松的发病机制仍不明确，骨质疏松的早期诊断、治疗效果监测和预后评估对于骨质疏松的防治具有重要作用。近年来，随着生物技术的发展，遗传因素的研究成为骨质疏松诊治领域的热门课题，寻找与骨质疏松相关的基因对于揭示骨质疏松发病机制，实现骨质疏松的早期诊断和治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于骨质疏松早期诊断的分子标志物，以期实现骨质疏松的特异性诊断和预防。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了loc101927627基因的应用，用于制备诊断骨质疏松的产品。

进一步，所述产品包括检测样本中loc101927627表达水平的试剂。

进一步，loc101927627在骨质疏松中表达上调。

进一步，所述试剂通过rt-pcr、实时定量pcr、原位杂交或芯片检测loc101927627表达水平的试剂。

在本发明中，“样本”是包含细胞或细胞物质的可从中获取核酸、多肽、或其它分析物的样本。生物样本的示例非限定性地包括：尿、血液、血清、血浆、脑脊髓液、胸膜液、支气管灌洗、痰、腹腔液、膀胱冲洗、分泌物(例如，乳腺分泌物)、口腔冲洗、拭子(例如，口腔拭子)、分离细胞、组织样本、触碰准备物、以及细针穿刺物。

本发明提供了一种诊断骨质疏松的产品，包括制剂、芯片或试剂盒，其中，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测loc101927627表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括特异性扩增loc101927627的引物。

进一步，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

本发明提供了loc101927627基因的应用，用于制备治疗骨质疏松的药物。

进一步，所述药物包括loc101927627的抑制剂。

进一步，所述抑制剂下调loc101927627的表达水平。

进一步，所述抑制剂为sirna。

进一步，所述sirna的序列如seqidno.5～8所示。

本发明提供了一种治疗骨质疏松的药物，所述药物包括loc101927627的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为sirna。

进一步，所述sirna的序列如seqidno.5～8所示。

术语

术语“生物标志物”也称为“分子标志物”，是在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因。

本文包含用于检测分子标志物表达的现有技术中任何可用方法。本发明分子标志物的表达可在核酸水平上被检测(如，rna转录物)表达水平。通过“检测表达”旨在确定rna转录物或其分子标志物基因的表达产物的数量或存在。因此，“检测表达”包含一分子标志物被确定不能被表达、不能被检测表达，表达在低水平、表达在正常水平或过表达的实例。为了确定过表达，被检测的所述身体样本能够与相应的来自健康人的身体样本比较。那就是说，所述表达的“正常”水平是分子标志物的表达水平。这个样本可以以标准化形式呈现。在一些实施例中，分子标志物过表达的确定需比较身体样本和相应来自健康人的身体样本。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。loc101927627位于13号染色体上，基因id为101927627，包括loc101927627基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的loc101927627，以及源自细胞中加工的任何形式的loc101927627。该术语涵盖loc101927627的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的人loc101927627的基因序列序列如xr_001750012.1所示。

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是dna、rna或其中的任何排列。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对疾病检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定疾病检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的疾病检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是dna，也可以是rna，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过pn、lna、ena、gna、tna等人工核酸置换得到的多核苷酸。

术语“试剂盒”包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。

在本发明中，术语“包括”用于指短语“包括但不限于”，并与短语“包括但不限于”可以互换使用。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了分子标志物loc101927627与骨质疏松发生发展相关，通过检测受试者loc101927627的变化，诊断患者是否患有骨质疏松以及患有骨质疏松的风险，从而实现骨质疏患者的早发现早治疗，提高患者的生活质量。

本发明首次发现分子标志物loc101927627与成骨细胞的增殖存在相关性，在骨质疏松的治疗中可以作为分子靶标进行干预。

附图说明

图1是不同样本中loc101927627基因的表达情况图；其中图a是血液样本，图b是组织样本；

图2是loc101927627在成骨细胞中的表达情况图；

图3是loc101927627的干扰情况图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1qpcr检测loc101927627在骨质疏松中的表达情况

1、样品收集

选取进行髋关节置换手术的患者80例，年龄50-75岁，其中骨质疏松患者47例，正常对照33例，收集患者的血液样本和组织样本。

骨质疏松患者的纳入和排除标准：

纳入标准：患者经诊断确定需要进行髋关节置换手术；患者年龄50-75岁，经双能x线骨密度检查确定为骨质疏松症的患者。

排除标准：患者近6个月内服用过影响骨代谢药物，患者还同时患有其他疾病。

对照组的纳入和排除标准：

纳入标准：患者经诊断确定需要进行髋关节置换手术；患者年龄50-75岁，经双能x线骨密度检查确定为非骨质疏松症的患者。

排除标准：患者近6个月内服用过影响骨代谢药物，患者还同时患有其他疾病。

2、rna样品的制备及质量分析

2.1组织样本rna的提取

使用trizol法提取组织rna，步骤如下：

1)用剪刀组织剪碎，加入1mltrizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解；

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min，4℃，11000rpm离心15min；

3)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇，颠倒混匀后，常温静置10min，4℃，11000rpm离心15min；

4)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次，4℃，8000rpm离心5min；

5)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min；

6)检测rna浓度，鉴定rna的产量和纯度。

2.2血液样本rna的提取

1)向血液中加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min；

2)10000rpm离心1min，吸弃上清，收集白细胞沉淀；

3)每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mltrizol；

4)4℃12,000rpm离心10分钟，取上清，其余步骤与2.1中的2)～6)相同。

3、逆转录

采用tiangen公司的fastquantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行mrna反转录

在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，然后置于冰上放置。

将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min之后放于冰上。

4、qpcr

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

1)引物设计

根据genebank中loc101927627基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，具体引物序列如下：

loc101927627基因：

正向引物为5’-atgttgttgctattctct-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-aatgtggttattattgttgt-3’(seqidno.2)。

管家基因gapdh的引物序列为：

正向引物：5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’(seqidno.3)

反向引物：5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seqidno.4)

2)按照表1配制20μlpcr反应体系：

表1pcr反应体系

3)pcr反应条件：：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃30s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量，每个样进行3次重复实验。

5、结果

如图1所示，与对照组相比，loc101927627基因在骨质疏松患者中表达显著上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，其中，血液样本中，有48例样本表达上调，32例表达无显著差异，上调样本中，骨质疏松患者占44例，正常对照占4例，无显著差异的样本中，骨质疏松患者占3例，正常对照占29例；组织样本中，有49例表达上调，31例无显著性差异，上调样本中，骨质疏松患者占46例，正常对照占3例，无显著差异的样本中，骨质疏松患者占1例，正常对照占27例。

实施例2loc101927627在细胞中的表达情况

1、成骨细胞的分离和培养

从髋关节置换术取下的人股骨头中取松质骨，剔除多余的骨膜和软组织，生理盐水反复冲洗骨质，冲洗液澄清后，用pbs液冲洗摇荡3遍，并使用已灭菌的咬骨钳和剪刀将股骨颈剪成1mm³的碎片，采用酶消化法分离并纯化成骨细胞。

将酶消化所得的细胞悬浮液用血球计数板计数，将浓度稀释为5×10⁷ml-1，将其接种于无菌培养皿中，放入co2培养箱(5％co2，湿度95％，温度37℃)培养48h，换液，每隔两天换液，细胞接近融合传代(胰蛋白酶:0.2％edta＝1:2)。

2、细胞总rna的提取

取对数期生长良好的成骨细胞进行细胞总rna的提取，使用trizol法提取细胞rna。

3、逆转录同实施例1

4、qpcr同实施例1

5、结果

结果如图2所示，相比正常组的成骨细胞(con)，骨质疏松组的成骨细胞(op)中loc101927627的表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例3loc101927627对成骨细胞的影响

1、设计合成针对loc101927627的sirna，sirna-loc101927627以及通用阴性对照sirna-nc购自上海吉码基因化学技术有限公司，针对loc101927627的干扰rna的序列如下所示。

sirna1的序列：

正义链为5’-uuugaucuuuaucuagaaggc-3’(seqidno.5)

反义链为5’-cuucuagauaaagaucaaacc-3’(seqidno.6)

sirna2的序列：

正义链为5’-acaacaucauuauaaccagau-3’(seqidno.7)

反义链为5’-cugguuauaaugauguuguga-3’(seqidno.8)

2、细胞培养

将con组和op组成骨细胞培养至对数生长期，并对其进行浓度测定和稀释，转染前24h将培养对数期的细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板，并加入相应的培养基，使其终体积为2m1，放入37℃，5％co2培养箱中进行培养。

3、转染

使用invitrogen公司的lipofectamin^tm2000试剂盒进行转染，转染方法按照说明书操作，空白对照组仅用无血清培养基。转染6h后，将6孔板中的液体换成新鲜配置的培养基，继续培养48h。

4、qpcr实验检测sirna的干扰效果

提取细胞总rna，步骤同实施例2；然后进行逆转录和qpcr，步骤同实施例1。

结果如图3所示，相比未进行转染的对照组(op)，转染sirna-nc的骨质疏松的成骨细胞中的loc101927627的表达水平无显著变化，而转染sirna1与sirna2的骨质疏松的成骨细胞中loc101927627的表达水平显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)，其中sirna1能够更有效的抑制loc101927627的表达，因此选择sirna1进行后续的实验。

5、mtt检测细胞增殖

对转染后的细胞进行24h、48h、72h的培养，使用mtt比色法检测转染细胞的增殖。

将实验分为3组，组1：正常人成骨细胞转染sirna-nc；组2：骨质疏松患者成骨细胞转染sirna-nc；组3：骨质疏松患者成骨细胞转染sirna1。

胰酶消化转染后的成骨细胞，制成细胞悬液，以2×10⁴/ml浓度接种于96孔板，每孔200μl，每组设6个复孔。转染24h、48h、72h，在每孔中加入mtt(5mg/m1)20μl，置培养箱中继续培养4h，小心弃上清液，加入二甲基亚砜150μl，置于水平振荡器上振荡10min，使结晶物充分溶解，将96孔板置于酶联免疫检测仪中，选择490nm波长，将空白孔调成零，检测各孔吸光度值并记录结果。

结果如表2所示，与组2相比，组3的细胞增殖较为明显，且组3的细胞较组1无显著变化，说明loc101927627的过表达抑制了骨质疏松患者成骨细胞的增殖，干扰loc101927627的表达之后骨质疏松细胞增殖较为明显，提示可以把loc101927627作为分子靶标应用于骨质疏松的治疗。

表2成骨细胞mtt实验测定od值

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>北京市创伤骨科研究所

<120>骨质疏松诊治用生物标志物

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgttgttgctattctct18

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aatgtggttattattgttgt20

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggagcgagatccctccaaaat21

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggctgttgtcatacttctcatgg23

<210>5

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

uuugaucuuuaucuagaaggc21

<210>6

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cuucuagauaaagaucaaacc21

<210>7

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

acaacaucauuauaaccagau21

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cugguuauaaugauguuguga21