本发明属于生物工程下游后处理领域，特别是聚羟基脂肪酸酯(pha)的生产与下游提取与纯化工艺。
背景技术：
：聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,pha)是一种可以由多种细菌积累的可降解聚酯，根据其单体组成，可分为短链/或中长链pha，也有均聚物和共聚物。pha是一种环境友好型材料，有着广泛的应用前景，可以作为传统石油基塑料的环保替代品。其中，聚-3-羟基丁酸(poly-3-hydroxybutyrate,phb)是目前pha家族成员中研究的最为清楚的，但它的应用却受到自身结晶度高、弹性低、柔韧度差等的限制。目前工业上经常使用生物发酵的方法7,8，来获得富含pha的细菌，然后进行复杂的提纯工作3,4,6。pha生产是以罗氏真氧杆菌(ralstoniaeutropha)、基因改造的大肠杆菌(e.coli)和嗜盐菌等来进行的。虽然发酵液中菌体富含pha，但是pha的提取和纯化除杂工艺很复杂，有些还用到有机溶剂，造成pha成本昂贵。pha的性能和其纯度有着非常大的关系。不同的用途对纯度的要求也各不相同。其中，医疗等领域对纯度要求非常高。但是，pha作为细菌内含物，胞内成分相当复杂，提取纯化难度很大。已有的提取工艺包括有机溶剂抽提法、机械破碎法、表面活性剂法和多种酶结合的方法等。但都有其局限性：有机溶剂抽提法溶剂回收困难，成本高昂，且操作环境危险，不适合大规模生产；机械破碎法主要包括超声波破壁或者高压匀浆破壁，能耗大，产品损失也很大，纯度低；表面活性剂法的缺点是表面活性剂对pha分子量破坏严重，且含有表面活性剂的废水处理难度大，加上表面活性剂的残留等2-5。cn1070534c公开了一种从细菌菌体内分离提取pha的方法，包括如下步骤：1)用含有表面活性剂的碱性溶液处理菌体；2)固液分离，分离出去大部分非pha成分；3)用碱性蛋白酶处理pha；4)分离提取pha颗粒；5)干燥得到pha产品。该方法反应条件温和，但是耗碱量大，表面活性剂添加量大，额外地增加了成本和污水处理成本，在工业化放大过程中有着明显的。cn1211489c公开了一种从细菌菌体内分离提取pha的方法，包括用有机溶剂五和/或四碳醇中的一种或几种破坏细胞壁并提取pha。cn109575264a涉及一种以有机溶剂戊内酯为溶剂提取pha的方法。cn109504715a公开了一种制备pha的方法，包括加入阴离子表面活性剂(sds)进行菌体细胞壁破壁裂解的步骤。现有的所有上述方法都涉及有机溶剂和/或表面活性剂的使用，具有提取步骤繁杂、添加化学物质成本高昂、下游污水难以处理等问题。因此，开发一种简单有效的pha下游提取纯化工艺对降低pha生产成本至关重要。技术实现要素：本发明的目的是提供一种制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法，该方法是从pha生产菌发酵液中高效低成本的提取pha的工艺方法，该方法工艺温和，成本低廉，对设备要求低，可实现大规模工业化生产。本发明人出人意料地发现，通过单独用热水、特别是过热水处理生产聚羟基脂肪酸酯(pha)的微生物菌体，可以获得菌体破壁裂解液，而避免了有机溶剂和/或表面活性剂的使用，从而克服了传统pha提取步骤繁杂、添加化学物质成本高昂、下游污水难以处理等问题。因此，本发明提供了一种从生产pha的微生物菌体中提取聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法，包括以下步骤：用热水或过热水处理所述微生物菌体，以获得菌体破壁裂解液。优选地，在进行菌体破壁时，所述方法不使用有机溶剂和/或表面活性剂(如阴离子表面活性剂)处理所述微生物菌体。所述菌体破壁裂解液富含pha颗粒，其可以进一步浓缩干燥，得到pha粉状体。相对于处理前的菌体中的pha含量，处理后得到的pha的纯度提高5-15wt％。除非另外指出，本发明中所述的微生物菌体是pha生产菌，可以为任何能够生产pha的微生物(野生型细菌菌株或基因改造细菌菌株)，其可以为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，包括但不限于罗氏真氧杆菌(ralstoniaeutropha)、基因改造的大肠杆菌(e.coli)和嗜盐菌(例如，盐单胞菌)等，诸如pseudomonasspp.、halomonasbluephagenesis、halomonascampaniensis。本文所提及的pha是指聚羟基脂肪酸酯，其根据单体组成可以分为均聚物和共聚物。根据单体的碳原子数，本发明的pha可以是短链pha(即，单体为c3-c5的羟基脂肪酸)或者中长链pha(即，单体为c6-c18的羟基脂肪酸)，但不限于此。在本发明的一些实施方式中，pha可以是均聚物，包括但不限于聚羟基丙酸酯、聚羟基丁酸酯(phb)、聚羟基戊酸酯等等，例如，聚-3-羟基丁酸酯(p3hb)、聚-4-羟基丁酸酯(p4hb)、聚-3-羟基丙酸酯(p3hp)或聚-3-羟基戊酸酯(p3hv)等。在本发明的方法的一个实施方案中，所述热水或过热水的温度为60℃-200℃，优选80℃-160℃，还优选100℃-140℃，更优选100℃-130℃，最优选大于100℃-125℃(例如，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125℃)。在本发明的方法的一个优选实施方案中，使用过热水处理所述微生物菌体，以获得菌体破壁裂解液。根据本发明，过热水是在压力下将水加热至高于100℃的温度的条件下而获得的。在本发明的方法的一个实施方案中，压力优选被设定为足够高的水平，从而使得水处于液态，并且不沸腾。优选地，用热水或过热水处理所述微生物菌体是在以下压力下进行：0.1-30mpa(例如0.12-0.15mpa)，优选0.5-20mpa，更优选1-10mpa(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10mpa)，最优选1.5-5mpa。在本发明的方法的一个实施方案中，其中在ph8-11下用热水或过热水处理所述微生物菌体。在本发明的方法的一个实施方案中，本发明所述的使用过热水处理所述微生物菌体是在高压反应釜(例如，高压灭菌锅)中进行的。在本发明的方法的一个实施方案中，高压反应釜(例如，高压灭菌锅)可以升温至100℃或大于100℃-200℃的范围内，压力可以小于等于2mp。优选地，所述处理过程是在恒温恒压下进行的。在本发明的一个优选实施方案中，通过将悬浮微生物菌体的水溶液(例如发酵液或菌体悬浮液)在高压反应釜(例如，高压灭菌锅)中升温，使得该水溶液中的水变为过热水，由此处理所述微生物菌体，进行破壁裂解。在本发明的方法的一个实施方案中，使用热水或过热水处理所述微生物菌体进行0.2～4小时，优选为0.5～1小时。在本发明的方法的一个实施方案中，可以在所述热水或过热水中加入0.01-5v/v％(例如，0.05v/v％，0.1v/v％，0.5v/v％，1v/v％，1.5v/v％，2v/v％，3v/v％，4v/v％，5v/v％，优选0.1-2v/v％)(按热水或过热水的体积计)的甘油以提高所述热水或过热水破坏微生物细胞(菌体破壁裂解)的效率。据信，所述热水或过热水以及甘油在本发明提取pha的方法中具有协同作用。在本发明的方法的一个实施方案中，进一步包括用蛋白酶处理所述菌体破壁裂解液，以进一步提高pha的纯度。在本发明的方法的一个实施方案中，其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：蛋白酶k、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、sumo蛋白酶、或它们的组合。如无特殊说明，上述蛋白酶均可从商业途径得到。与菌体破壁裂解液相比，优选的蛋白酶添加量为0.0001-1％(w/v)，更优选为0.0001-0.1％(w/v)。在本发明的方法的一个实施方案中，其还包括用漂白剂处理在用蛋白酶处理所述菌体破壁裂解液之后得到的溶液。漂白剂是用于氧化除去杂质，使pha纯度再次提高。按待处理的溶液重量计，优选的漂白剂添加量为0.0001-2wt％，更优选为0.001-0.1wt％。在本发明的方法的一个实施方案中，其中所述漂白剂选自由以下组成的组：过氧化氢、次氯酸钠、亚硫酸钠、二氧化硫脲、二氧化氯、或它们的组合。在本发明的方法的一个实施方案中，进一步包括洗涤、过滤、离心和/或干燥步骤，以得到纯化的聚羟基脂肪酸酯(pha)。在本发明的方法的一个实施方案中，其中所述聚羟基脂肪酸酯(pha)选自短链聚-3-羟基丁酸酯(phb)、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯(phbv)、3-羟基丁酸和-4-羟基丁酸共聚酯(p3hb4hb)、中长链pha(单体为c6-c18的羟基酯)以及短链和中长链pha共聚物。在本发明的一个优选实施方案中，提供一种利用水提纯聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法，该方法包括以下步骤：(1)对富含pha的菌体进行热水或过热水(>105℃)处理，任选地可加入一定量的甘油，以实现细胞壁破壁裂解并得到细菌破壁混合液，其中不使用任何阴离子表面活性剂，使pha纯度提高5-15％；(2)对步骤(1)中得到的pha破壁液加入一定量蛋白酶处理，可以进一步提高纯度；(3)对步骤(2)中的蛋白酶处理破壁液加入漂白剂进行处理，氧化除去杂质，使pha纯度再次提高；和(4)去除步骤(3)得到的混合液中的非pha成份，收集、干燥含pha浓缩液。在一个优选实施方案中，上述细菌的细胞壁破壁裂解包括以下步骤：(1)调节菌液温度至最适破壁温度(60℃-160℃，优选为80℃-140℃，更优选为101℃-130℃)；(2)调节菌液的ph至最适ph值，控制在ph8-11；(3)恒温恒压保持最适处理时间(如0.2-2小时)，控制压力在0.12-0.15mpa。在一个特别优选的实施方案中，菌体破壁仅需对菌体进行过热水处理，具体地，所需的温度为60℃-160℃，优选为80℃-140℃，菌液破壁所需时间为0.2-4小时，优选为0.5-1小时。在一个优选实施方案中，在用热水/过热水处理、甘油、蛋白酶处理、漂白剂处理之后，在得到的pha浓缩液中加入水，充分搅拌洗涤，然后离心去除洗涤液，任选地重复此过程1-6次，获得纯化的pha浓缩物，干燥或获得粉状pha。在一个特别优选的实施方案中，所述方法包括向破壁漂白后的pha浓缩液加入水，充分搅拌洗涤，然后离心去除洗涤液，重复此过程多次，直到pha满足纯化要求。优选地，在pha浓缩物加水洗涤过程中，加水量体积为浓缩液体积的1-10倍，更优选为1-5倍。与现有的pha提纯工艺相比，本发明的方法具有以下优点：(1)该工艺全过程不使用任何有机溶剂和/或表面活性剂，生产环境简单安全；(2)提取设备简单，仅需要高压加热设备即可实现；和(3)不添加任何辅助破壁的化学有害物质(可选加微量蛋白酶)，大大降低提取成本，降低了下游生产废水处理难度。具体实施方式本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了举例说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。除非另外指出，本文中所用术语具有本领域技术人员理解的一般技术含义。以下反应中所用的化学物质都是可商购的产品，除非另外指明。本文所提及的产品纯度，诸如p3hb4hb含量(wt％)，为p34hb的质量与参与酯化的冰干菌体质量的百分比，其中p34hb质量为酯化后得到的34hb总质量。本文所提及的产品回收率即破壁、纯化收集后冰干菌体的质量与发酵产物直接冰干后菌体的比值。实施例1：过热水法从含pha菌体的发酵液中提取纯化pha提取方法：(1)菌体的离心和重悬脱盐取含60％pha(p3hb、p34hb均可)的盐单胞菌1菌体的发酵液250ml，配平后对称置于高速离心机中，离心条件为：转速6000rpm，时间20min。离心结束后，小心移去上清液，注意尽量不要损失沉淀，然后加水恢复体积，搅拌均匀后继续离心，离心条件为：6000rpm，时间20min。离心结束后，弃掉上清，菌体恢复体积至250ml，搅拌均匀后，洗涤后的菌液倒入到500ml烧杯中，准备破壁。(2)菌液的细胞破壁与pha释放向装有250ml菌液的500ml烧杯中加入5mnaoh，调节菌液ph为9.5，将装有菌液的500ml烧杯放入盛有水的1000ml烧杯中，注意500ml烧杯不要倾倒，下半部分浸泡在水中。将两者一起在高压灭菌锅中，80-121℃反应30-60min。(3)pha的纯化收集破壁反应结束后，离心去除非pha杂质，离心条件为：4500rpm，10min。离心结束后，小心移去上清液，加水恢复体积，搅拌均匀后，继续离心，洗涤离心操作重复2次。洗涤离心后的pha与离心管粘着紧密，可完全弃掉上清液，pha固形物不会损失。(4)pha参数测量将装有pha沉淀物的离心管置于-80℃超低温冰箱中冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干后pha磨碎后混合均匀，使用气相色谱法测定pha质量和含量2,5。每组实验设三个平行样，结果取均值。实验结果见表1。表1：处理温度和破壁时间对pha纯度和回收率的影响实验序号破壁温度破壁时间破壁ph原料纯度产品纯度回收率1-180℃30min1060％87.98％90.17％1-280℃60min1060％88.16％86.83％1-3100℃30min1060％88.97％88.41％1-4100℃60min1060％89.71％86.76％1-5125℃30min1060％89.05％85.57％1-6125℃60min1060％91.06％83.91％实施例2：过热水蛋白酶法从含pha菌体的发酵液中提取纯化pha提取方法：(1)菌体的离心和重悬脱盐取含60％pha(p3hb、p34hb均可)的盐单胞菌1菌体的发酵液250ml，配平后对称置于高速离心机中，离心条件为：转速6000rpm，时间20min。离心结束后，小心移去上清液，注意尽量不要损失沉淀，然后加水恢复体积，搅拌均匀后继续离心，离心条件为：6000rpm，时间20min。离心结束后，弃掉上清，菌体恢复体积至250ml，搅拌均匀后，洗涤后的菌液倒入到500ml烧杯中，准备破壁。(2)菌液的细胞破壁与pha释放向装有250ml含pha菌体的发酵液的500ml烧杯中加入5mnaoh，调节菌液ph为9.5，将装有菌液的500ml烧杯放入盛有水的1000ml烧杯中，注意500ml烧杯不要倾倒，下半部分浸泡在水中。将两者一起在高压灭菌锅中，121℃反应90min(3)破壁液的蛋白酶处理将装有250ml含pha菌体的发酵液的500ml烧杯置于带磁力搅拌的加热装置中，待菌液温度恢复至60℃后，重新用浓盐酸将ph调至9.5，加入选用的蛋白酶0.1％(v/v)。维持60℃酶处理30-60min(4)pha的纯化收集破壁反应结束后，离心去除非pha杂质，离心条件为：4500rpm，10min。离心结束后，小心移去上清液，加水恢复体积，搅拌均匀后，继续离心，洗涤离心操作重复2次。洗涤离心后的pha与离心管粘着紧密，可完全弃掉上清液，pha固形物不会损失。(5)pha纯化参数测量将装有pha沉淀物的离心管置于-80℃超低温冰箱中冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干后pha磨碎后混合均匀，使用气象色谱法测定pha质量和含量2,5。每组实验设三个平行样，结果取均值。实验结果见表2。表2：过热水加蛋白酶法对pha纯度和回收率的影响购自macklin/麦克林公司的蛋白酶：蛋白酶k货号p6157，木瓜蛋白酶货号p815680，碱性蛋白酶货号p824138，酸性蛋白酶货号p832411。sumo蛋白酶购自源叶生物，货号s25841。实施例3：过热水、蛋白酶加漂白剂法从含pha菌体的发酵液中提取纯化pha提取方法：(1)菌体的离心和重悬脱盐取含60％pha(p3hb、p34hb均可)的盐单胞菌1菌体的发酵液250ml，配平后对称置于高速离心机中，离心条件为：转速6000rpm，时间20min。离心结束后，小心移去上清液，注意尽量不要损失沉淀，然后加水恢复体积，搅拌均匀后继续离心，离心条件为：6000rpm，时间20min。离心结束后，弃掉上清，菌体恢复体积至250ml，搅拌均匀后，将洗涤后的菌液倒入到500ml烧杯中，准备破壁。(2)菌液的细胞破壁与pha释放向装有250ml含pha菌体的发酵液的500ml烧杯中加入5mnaoh，调节菌液ph为9.5，将装有菌液的500ml烧杯放入盛有水的1000ml烧杯中，注意500ml烧杯不要倾倒，下半部分浸泡在水中。将两者一起在高压灭菌锅中，121℃反应90min。(3)破壁液的蛋白酶处理将装有250ml含pha菌体的发酵液的500ml烧杯置于带磁力搅拌的加热装置中，待菌液温度恢复至60℃后，重新用浓盐酸将ph调至9.5，加入选用的蛋白酶(碱性蛋白酶)0.1％(v/v)。维持60℃酶处理30-60min(4)酶处理后液体的漂白处理将装有250ml含pha菌体的发酵液的500ml烧杯置于带磁力搅拌的加热装置中，待菌液温度恢复至室温后，重新用浓盐酸将ph调至6左右，加入均选购自asone的漂白剂0.01％(v/v)。维持室温处理30-60min。漂白后的液体使用氢氧化钠溶液调至中性后，加入双氧水进行中和脱氯、脱硫。(5)pha的纯化收集破壁反应结束后，离心去除非pha杂质，离心条件为：4500rpm，10min。离心结束后，小心移去上清液，加水恢复体积，搅拌均匀后，继续离心，洗涤离心操作重复2次。洗涤离心后的pha与离心管粘着紧密，可完全弃掉上清液，pha固形物不会损失。(6)pha纯化参数测量将装有pha沉淀物的离心管置于-80℃超低温冰箱中冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干后pha磨碎后混合均匀，使用气象色谱法测定pha质量和含量2,5。最后测得产品纯度可达95.29％，回收率可达90％以上。每组实验设三个平行样，结果取均值。实验结果见表3。表3：过热水、蛋白酶加漂白剂法对pha纯度和回收率的影响实施例4：过热水、甘油法从含pha菌体的发酵液中提取纯化pha提取方法：(1)菌体的离心和重悬脱盐取含60％pha(p3hb、p34hb均可)的盐单胞菌1菌体的发酵液250ml，配平后对称置于高速离心机中，离心条件为：转速6000rpm，时间20min。离心结束后，小心移去上清液，注意尽量不要损失沉淀，然后加水恢复体积，搅拌均匀后继续离心，离心条件为：6000rpm，时间20min。离心结束后，弃掉上清，菌体恢复体积至250ml，搅拌均匀后，将洗涤后的菌液倒入到500ml烧杯中，准备破壁。(2)菌液的细胞破壁与pha释放向装有250ml含pha菌体的发酵液的500ml烧杯中加入5mnaoh，调节菌液ph为9.5，同时加入甘油0.01-1％(v/v)，将装有菌液的500ml烧杯放入盛有水的1000ml烧杯中，注意500ml烧杯不要倾倒，下半部分浸泡在水中。将两者一起在高压灭菌锅中，121℃反应90min。(3)pha的纯化收集破壁反应结束后，离心去除非pha杂质，离心条件为：4500rpm，10min。离心结束后，小心移去上清液，加水恢复体积，搅拌均匀后，继续离心，洗涤离心操作重复2次。洗涤离心后的pha与离心管粘着紧密，可完全弃掉上清液，pha固形物不会损失。(4)pha纯化参数测量将装有pha沉淀物的离心管置于-80℃超低温冰箱中冷冻2小时，然后置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干后pha磨碎后混合均匀，使用气象色谱法测定pha质量和含量2,5。每组实验设三个平行样，结果取均值。实验结果见表3。表4：过热水+甘油法对pha纯度和回收率的影响参考文献：1.陈国强，薛源生，谭丹，吴琼.一株盐单胞菌及其应用，cn102120973b.2.陈国强，吴琼.生物可降解塑料——聚羟基脂肪酸酯(pha)的生产技术研究[j].精细与专用化学品，2001(18)：22-25.3.陈国强，李蔓青，陈金春等.从细菌菌体中分离提纯细菌胞内聚羟基脂肪酸酯的方法，cn1070534c[p].4.陈国强，甘智雄.一种从细菌菌体内分离提取聚羟基脂肪酸酯的方法:，cn1211489c[p].5.魏大巧，陈国强.聚羟基脂肪酸酯的鉴定及检测方法研究进展[j].云南化工，2007(4):86-89.6.康世民，严明丽，谢秀卿等.一种以戊内酯为溶剂提取聚羟基脂肪酸酯的方法，cn109575264a[p].7.叶健文，汪东升，陈风义.一种制备聚羟基脂肪酸酯(pha)的方法cn109504715a[p].8.张梦颖，李雅慧，詹元龙等.嗜盐菌生物合成聚羟基脂肪酸酯(phas)的研究进展[j].生物技术通报，2019(6)：172-177.本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。当前第1页12