检测Neofusicoccummacroclavatum的LAMP引物及试剂盒的制作方法

本发明属于微生物检测技术领域，具体地说，涉及一种检测neofusicoccummacroclavatum的lamp引物及试剂盒。

背景技术：

葡萄座腔菌科真菌(botryosphaericeae)侵染引起的蓝莓茎溃疡病(blueberrystemblight)，目前在我国主要蓝莓产区已有发生报道，对中国蓝莓产业健康发展带来严重危害。该菌从蓝莓植株的伤口或自然孔口进行侵染，导致皮层和韧皮部的枯死在田间引起蓝莓枝条枯萎、木质部坏死及植株死亡等症状。目前，葡萄座腔菌科中已有多种能引发此病害(botryosphaeriacortices，botryosphaeriadothidea，fusicoccumaesculin，lasiodiplodiachinesis，lasiodiplodiaparaphysoides，lasiodiplodiatheobromae，lasiodiplodiavaccinii，neofusicoccumarbuti，neofusicoccumaustral，neofusicoccummacroclavatum，neofusicoccumparvum，neofusicoccumribis)，其中neofusicoccummacroclavatum是一种强致病菌，可在蓝莓枝条表面形成红褐色病斑，引起维管束坏死和整枝枯萎死亡，该菌主要在枝条病斑内越冬，在适宜条件下产生分生孢子，借助通过自然孔口或机械伤口侵入田间植株，侵染后，菌丝迅速扩展到维管组织，通过细胞间隙横向发展，最终，在愈伤组织、皮层、木质部、管胞或导管等各种类型的细胞中定殖。该菌有潜伏侵染的特性，通常作为腐生菌在土壤中或植物内生菌在健康的植株中存在，当遇到高温、积水、风害等逆境条件时便开始侵染植株。因此，对该类病菌的初侵染源早期进行适时监控，对于该病害的防控有重要意义，传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源早期适时采取综合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。

普通pcr技术需要精密变温设备和高级复杂的分析仪器，或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高，且反应时间长，不利于基层推广。自环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)建立以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原菌的检测研究。lamp技术作为—种恒温核酸扩增技术，其最大的优点在于反应速度快、设备简单，而且结果易于鉴定，尤其适用于基层检验检疫机构和医疗机构。目前尚未见利用lamp技术检测蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供—种检测蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)的lamp引物及试剂盒。

本发明的另一目的是提供基于lamp技术的蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)检测方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)的lamp引物，所述lamp引物为(seqidno：1-4)：

外侧正向引物f3：5'-aaagtttttccttccgctgc-3’；

外侧反向引物b3：5'-tgggacggccgttagc-3’；

内侧正向引物fip(f1c+f2)：5'-cgaccccaccaccaaaatgcctgggttcccgcactca-3’；

内侧反向引物bip(b1c+b2)：5'-ggctcggcaaaatctccgcatccatgcgtggcgtgtctg-3'

第二方面，本发明提供含有seqidno：1-4所示的lamp引物的检测试剂或试剂盒。

第三方面，本发明提供蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)检测试剂盒，所述试剂盒包含seqidno：1-4所示的lamp引物，还包含dntps、bstdna聚合酶、反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

第四方面，本发明提供seqidno：1-4所示的lamp引物、含有所述lamp引物的检测试剂或试剂盒在检测蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)中的应用。

第五方面，本发明提供蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品中的dna；

2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用seqidno：1-4所示的lamp引物进行lamp扩增反应(lamp-pcr)；

3)扩增结果判定。

其中，步骤2)所用反应体系为：

其中，所述反应体系中引物fip和bip按等量加入，引物f3和b3按等量加入，且引物fip、bip与引物f3、b3的总质量比为8∶1。

优选采用如下反应体系：

步骤2)所用反应条件为：61～65℃50～90分钟。优选采用如下反应条件：63℃60分钟，80℃2分钟。

步骤3)可以采用如下①～③中的任一种方法进行扩增结果判定：

①荧光染色法：向扩增产物中加入染料sybrgreeni，进行显色反应，若反应体系由橙色(橘黄色)变为绿色，表明待测样品中含有蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)；或者，在扩增反应前向反应体系中加入钙黄绿素(calcein)，扩增反应结束后，在紫外灯照射下反应体系显示荧光绿色，表明待测样品中含有蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)；或者，在扩增反应前向反应体系中加入羟基萘酚蓝(hnb)，扩增反应结束后，若反应体系由紫色变为天蓝色，表明待测样品中含有蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)；

②琼脂糖凝胶电泳法：若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带，表明待测样品中含有蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)；

③焦磷酸镁浊度检测法：通过肉眼观察反应后的浑浊情况(或产生乳白色沉淀)来判断是否发生了lamp扩增反应，或利用浊度仪检测其在400nm处的吸光度，实现实时定量检测。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明将lamp引物恒温扩增技术用于neofusicoccummacroclavatum病菌的快速检测，可从发病植物组织及苗木中复杂的病原菌环境准确地检测出该致病菌。该方法的特异性、灵敏度及可重复性均较常规pcr方法更高，检测灵敏度达0.808fg/ml，对蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可避免高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

附图说明

图1为本发明实施例2中表1涉及真菌的ef-1α区域的基因序列比对结果。

图2为本发明实施例2和3中lamp引物的特异性及灵敏度分析结果。

其中，a，b：引物组1的特异性检测的目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。1～8分别为neofusicoccummacroclavatum，neofusicoccumillicii，neofusicoccumsinense，botryosphaeriasinensia，botryosphaeriarosaceae，lasiodiplodiachinensis，alternariaalternata，nc(阴性对照)。

c，d：引物组1的灵敏度目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。1～8分别为稀释倍数10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍的neofusicoccummacroclavatumdna样品。

e，f：引物组2的特异性检测的目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。1～8分别为neofusicoccummacroclavatum，neofusicoccumillicii，neofusicoccumsinense，botryosphaeriasinensia，botryosphaeriarosaceae，lasiodiplodiachinensis，alternariaalternata，nc(阴性对照)。

g，h：引物组2的灵敏度目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。1～8分别为稀释倍数10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍的neofusicoccummacroclavatumdna样品。

i，j：引物组3的特异性检测的目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。1～8分别为neofusicoccummacroclavatum，neofusicoccumillicii，neofusicoccumsinense，botryosphaeriasinensia，botryosphaeriarosaceae，lasiodiplodiachinensis，alternariaalternata，nc(阴性对照)。

k，l：引物组3的灵敏度目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。1～8分别为稀释倍数10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍的neofusicoccummacroclavatumdna样品。

m，n：引物组4的特异性检测的目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。1～8分别为neofusicoccummacroclavatum，neofusicoccumillicii，neofusicoccumsinense，botryosphaeriasinensia，botryosphaeriarosaceae，lasiodiplodiachinensis，alternariaalternata，nc(阴性对照)。

其中，琼脂糖凝胶电泳图中m为dl2000dnamarker。

图3为本发明实施例4中lamp引物组1的田间患病病株检测实验。其中，a：患病病株病斑；b：lamp引物组1的检测结果(1为反应结果阳性，2为反应结果阴性)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于检测蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)的lamp引物的设计与合成

对于neofusicoccum而言，翻译延长因子(elongationfactors，ef)基因具有较高的变异速率，因此选择将ef基因用于种水平的鉴定和分子系统学研究。

根据蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)ef-1α区域的基因序列(图1)，分别设计了三组用于检测neofusicoccummacroclavatum的lamp引物，包括：

引物组1：

外侧正向引物f3：5′-gctgcgactccttcaacg-3′；

外侧反向引物b3：5′-ggcgtcaccagacttgatg-3′；

内侧正向引物fip：5′-cagtccaggacgggagcgtacccaggtcatcgtcctca-3′；

内侧正向引物bip：5′-gcttgcaagttctctgagctgccttggggctgttctcaatgg-3′。

引物组2：

外侧正向引物f3：5′-aaagtttttccttccgctgc-3′；

外侧反向引物b3：5′-tgggacggccgttagc-3′；

内侧正向引物fip：5′-cgaccccaccaccaaaatgcctgggttcccgcactca-3′；

内侧正向引物bip：5′-ggctcggcaaaatctccgcatccatgcgtggcgtgtctg-3′。

引物组3：

外侧正向引物f3：5′-tcctggactgccacactg-3′；

外侧反向引物b3：5′-gagggtactcggtgaaagc-3′；

内侧正向引物fip：5′-tctcaatggacttgccggtacgtgcttgcaagttctctgagc-3′；

内侧正向引物bip：5′-ttcatcaagtctggtgacgccgtcaacgcacatgggcttg-3′。

引物合成由深圳华大基因科技有限公司完成。

实施例2lamp引物检测neofusicoccummacroclavatum的特异性分析

1.1试剂和设备

lamp-pcr试剂盒购自广州华峰公司。

1.2样本来源

本实施例中采用的neofusicoccummacroclavatum，neofusicoccumillicii，neofusicoccumsinense，botryosphaeriasinensia，botryosphaeriarosaceae，lasiodiplodiachinensis，alternariaalternata等(表1)保存于中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室。这些菌种是公众可以得到的，无需进行保藏。

表1中涉及真菌的ef-1α区域的基因序列比对结果见图1。

表1用于lamp-pcr检测的样本来源

1.3dna提取

使用ctab植物基因组dna快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取植物组织dna，提取健康蓝莓茎的dna为对照。

供试菌株在mea培养基上于25℃培养3-5天，用ctab法提取菌丝dna，dna于-20℃保存备用。

1.4lamp-pcr反应

反应体系(25μl)：

1.5显色反应

反应结束后，向1.4所得反应体系中加入6μl的1000×sybrgreeni进行显色反应，根据反应体系颜色的变化，判定待测样品中是否含有蓝莓枝枯病病菌(neofusicoccummacroclavatum)。

1.6结果

图2a为lamp引物组1恒温扩增反应体系肉眼目测效果，管1为neofusicoccummacroclavatum病菌，反应体系显示荧光绿色，管2-7分别为neofusicoccumillicii，neofusicoccumsinense，botryosphaeriasinensia，botryosphaeriarosaceae，lasiodiplodiachinensis，alternariaalternata，反应体系均显示橘黄色。管nc为阴性对照。该结果表明本发明引物组的特异性强。

对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，图2b为本发明lamp引物组1恒温扩增结果；其中，泳道1为neofusicoccummacroclavatum病菌，扩增出梯状条带，泳道2-7分别为neofusicoccumillicii，neofusicoccumsinense，botryosphaeriasinensia，botryosphaeriarosaceae，lasiodiplodiachinensis，alternariaalternata，同属其他种以及葡萄座腔菌科其它真菌不产生条带，nc为阴性对照。

对比引物组2(图2e和图2f)、引物组3(图2i和图2j)的特异性检测结果，对比显示，引物组1的特异性最高，检测效果最好。

实施例3lamp引物组检测neofusicoccummacroclavatum的灵敏度分析

1.1dna样品浓度：

用nanodrop(赛默飞世尔科技公司)检测实施例2中提取的neofusicoccummacroclavatum样品的dna浓度，为10.4μg/ml。

1.2lamp引物组灵敏度检测：

将dna样品进行10倍梯度稀释，取10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀释的dna样品进行lamp恒温扩增反应。反应体系及反应条件同实施例2。

1.3结果：

图2c为lamp引物组1恒温扩增反应体系肉眼目测效果，反应管1-8分别为neofusicoccummacroclavatum病菌从10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀释的样品，反应管1-5反应体系显示荧光绿色，反应管6-8反应体系显示橘黄色。图2m为本发明lamp引物组1恒温扩增反应体系肉眼目测效果重复实验，其中反应管1-6反应体系显示荧光绿色，反应管7-8反应体系显示橘黄色。实验结果稳定。该结果表明本发明引物组可直接检测到稀释至10⁶倍的dna。

对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果如图2d所示，lamp能够检测出稀释10⁶倍的dna样品。当dna样品稀释至10⁶倍以上时，则无法确保检出。因此，本引物组的灵敏度可达0.808fg/ml，即可检出样品中约20.2fg的neofusicoccummacroclavatumdna。图2n为本发明lamp引物组1恒温扩增反应所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的重复实验结果。

对比引物组2(图2g和图2h)、引物组3(图2k和图2l)的灵敏度检测结果，对比显示，引物组1的灵敏度最高，检测效果最好。

实施例4利用lamp引物组1检测感染neofusicoccummacroclavatum的发病组织

1.1蓝莓茎溃疡病患病组织dna的提取

将供试neofusicoccummacroclavatum菌转至mea培养基平板上，25℃黑暗培养2-3天后，用打孔器从菌落边缘取菌落块(1cm×1cm)，针刺接种于蓝莓(四年生)茎部，接种7天后，发病效果如图3a所示。然后切取发病组织，使用ctab植物基因组dna快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取患病组织dna：取一段适量的病茎，经液氮冷冻充分研磨成粉末后使用ctab植物基因组dna快速提取试剂盒提取患病植物病斑及病健交界处组织dna。提取出的dna用于lamp-pcr扩增。

按相同方法提取健康蓝莓茎的dna为空白对照。

1.2lamp引物组对neofusicoccummacroclavatum病菌回接组织检测

lamp-pcr反应体系、反应条件、反应结果检测方法同实施例2。

1.3结果

lamp引物组恒温扩增反应体系显色反应目测效果如图3b所示，管1为感染了neofusicoccummacroclavatum病菌的病株样品，反应体系呈现出荧光绿色，显示反应为阳性；管2为健康植株对照，呈现橘黄色，显示反应为阴性。该结果表明本发明引物组的特异性强，可直接用于田间病害的检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京林业大学

<120>检测neofusicoccummacroclavatum的lamp引物及试剂盒

<130>pi201960607

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aaagtttttccttccgctgc20

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgggacggccgttagc16

<210>3

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgaccccaccaccaaaatgcctgggttcccgcactca37

<210>4

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggctcggcaaaatctccgcatccatgcgtggcgtgtctg39