一种毕赤酵母的固定化方法及其应用与流程

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种毕赤酵母的固定化方法及其应用。

背景技术：

植酸的化学名称为肌醇六磷酸酯(myo-inositolhexakisdihydrogenph-oshate)，是植物种子中肌醇和磷酸的最主要存在形式，在谷物等食用作物种子中含量高1％～3％，占植物含磷总量的40％～70％。磷是在动物体内功能最多的无机营养素之一。在动物饲喂过程中，饲料中必须供给足够的磷，才能维持禽畜的正常生命及生产活动，因此在饲养过程中必须要考虑饲料中磷添加量的问题。植酸酶是1907年由suzuki等在玉米糠中发现的一种单体蛋白质，之后相继在多种动物、植物及微生物中检测到植酸酶的存在。植物来源的植酸酶最适ph范围较窄，在单胃禽畜的胃肠环境中很难起作用，目前市场上所销售的植酸酶多数来源于微生物。现今养殖业所用的谷物性饲料所占比例很大，谷物中磷的存在形式主要为植酸和植酸盐，绝大多数单胃动物，如猪、鸡的消化道内缺乏分解植酸的酶，对谷物性饲料中植酸的利用率很低，且不能被动物吸收的磷排放到环境中会对环境造成污染。同时，植酸易与二价或三价阳离子结合，形成不溶性盐，阻碍动物小肠对矿物质元素的吸收，并且植酸会与蛋白质形成络合物，影响蛋白质的吸收。在禽畜的基础日粮中添加植酸酶，可以分解饲料中的植酸，提高动物对植酸的利用率，减少磷的排放，提高动物对矿物质元素和蛋白质的利用率。

巴斯德毕赤酵母作为甲醇营养型酵母，可通过基因改造后来表达外源蛋白，其中除了科研外还被用在工业生产当中，一年大概超过400种蛋白质已经被成功在毕赤酵母中表达，毕赤酵母作为良好的表达宿主主要有以下几个重要的原因：1，商水平表达外源蛋白，无论在细胞内表达还是分泌到细胞外，蛋白质的含量很高而且易于纯化；2，含有特有的强有为的aox启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；3，在基因的分子水平易于操作跟传统的酿酒酵母所差无几；4，遗传稳定，外源基因能高拷贝整合到毕赤酵母基因組中；5，它可对外源蛋白进行高级的加工修饰例如糖基化，形成二硫键，不正确的蛋白可水解处理。但是，在工业生产中，由于甲醇诱导时间长的问题使得发酵周期延长很多，发酵液也很粘稠，最终不利用产物的分离，菌体也容易老化。

如今，固定化的技术得到很多的关注，技术也越发成熟，从而广泛的应用于生物技术生产的各大领域。让菌体与一些适合固定化发酵的材料接触，菌体吸附在载体上，从而降低发酵液的浓度有利于营养物质的传递，此外，这些惰性的材料可以重复利用，即提高了发酵效率又有益于产物的分离，材料的重复利用，降低了生产成本的同时，也起到了环境保护的作用。

目前应用于毕赤酵母的固定方法常见的有包埋法和吸附法，但是国内仍然以包埋法为主。季更生等用3.0％的海藻酸钠包埋活化48h的酵母培养液，在连续发酵35d的运行中从未发现染菌现象，不仅增加了酵母质量浓度加快发酵，而且使达到连续发酵“稳态”时间也缩短了，发酵操作相对稳定。

但是，包埋法所用到的凝胶颗粒机械性能很差，在搅拌发酵的时候很容易发生破碎，同时，包埋法仍然会对颗粒中心的菌体的氧气和营养物质的传递造成阻碍，因此对毕赤酵母的生产效率有了一定的限制。为了更进一步提高植酸酶的生产效率，简化生产工艺，降低生产成本，仍需要寻找更加天然、高效的固定化材料。

近年来，以多孔纤维材料作为固定化介质的纤维床生物反应器作为一种新型固定化方法受到了广泛关注。用多孔纤维材料做固定材料，不仅工艺稳定，无毒，廉价易得，吸附效果好，重复使用率高，而且对细胞活性具有较好的保护作用，但是由于毕赤酵母表面较为亲水，且带有负电荷，在发酵过程中不易被纤维介质固定，从而严重影响发酵性能，因此很少有人采用吸附法作为毕赤酵母的固定方法。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种毕赤酵母的固定化方法及其应用，使毕赤酵母的固定化既简单又方便，且固定化的过程稳定高效。

发明思路：我们所建立的毕赤酵母的固定化过程就是，在众多的多孔纤维材料中，选择一种最优的进行改性(植物胶、电荷)，然后作为我们进行固定化的一种载体介质，将活化好的毕赤酵母接入相应的发酵培养基中(其中含有最优介质)，使菌体在生长的过程中吸附于载体上。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种毕赤酵母的固定化方法，具体步骤为将经植物胶预处理后的纤维材料作为固定化载体，将毕赤酵母活化后接入固定化发酵培养基中培养，使菌株在培养的过程中吸附于载体上。

其中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母accc21026。

其中，所述的植物胶为田菁胶、香豆胶、瓜尔胶中的任意一种或几种组合。

其中，所述的纤维材料为脱脂棉球、丝绸、纱布、棉纤维、细菌纤维素膜、活性炭纤维、纳米纤维、竹纤维、黏胶纤维、铜氨纤维、聚醚多元醇泡沫、聚乙烯醇纤维、醋酸纤维、聚氨酯泡沫、聚乙烯、聚丙烯酰胺、亚麻、苎麻、黄麻、聚酯纤维、丝瓜瓤中的任意一种或几种组合；优选聚酯纤维、聚乙烯、棉纤维、聚醚多元醇泡沫、竹纤维、聚丙烯酰胺和聚氨酯泡沫中任意一种或几种组合；更优选棉纤维和竹纤维；最优选棉纤维。

其中，所述的经植物胶预处理包括如下步骤：

(1)将纤维材料置于去离子水中清洗1～3h，再将清洗后的纤维材料置于质量分数为10～50％的naoh水溶液中浸泡1～6h，然后将纤维材料置于去离子水中清洗至1～3h，直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将经过步骤(1)处理后的纤维材料置于体积分数为0.1～10％的植物胶水溶液中，浸泡10～60min，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后置于120℃烘干，即得。

毕赤酵母细胞表面带有负电荷，而所选多孔纤维介质表面同样带有负电荷，在毕赤酵母固定化过程中会不利于吸附，所以要对多孔纤维材料进行相关处理，使载体表面带有正电荷，将材料表面接入适当密度的正电荷可有效增强细胞表面粘附蛋白吸附，从而促进细胞粘附，同时不会对细胞活性产生消极影响。

作为本发明优选的技术方案，将经过植物胶预处理后的纤维材料浸泡于甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(maeta)水溶液中进行二次预处理，再洗涤，干燥，即得。maeta分子中含有一个稳定携带正电荷的季铵基团，是常用的化学小分子，以促进细胞吸附到载体表面。

其中，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵水溶液的体积分数为2％～20％(优选5％)；浸泡的时间为10～60min(优选30min)。

其中，所述的纤维材料以20～30g/l的添加量置于固定化发酵培养基中。

其中，所述的固定化发酵培养基中各组分的质量百分比为：12.5g/l酵母粉，25g/l蛋白胨，13.4g/lynb，0.3g/l三水合磷酸氢二钾，1.18g/l磷酸二氢钾，10ml/l甲醇，0.4mg/l生物素，100ml/l10％的甘油，溶剂为水。

其中，所述的培养为28～30℃，200～300rpm(优选250rpm)摇床中培养96～120h，每隔20～30h(优选24h)添加0.5～2ml(优选1ml)甲醇。其中，甲醇是单一碳源，同时也是诱导剂诱导产酶。

上述方法制备得到的固定化的毕赤酵母也在本发明的保护范围之内。

上述毕赤酵母在产植酸酶中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的植酸酶包括步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装有种子培养基的于28～30℃，培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将6l的发酵换液培养基用蠕动泵泵入10l发酵罐中，温度28～30℃，罐压0.05mpa，通气量10～20l/min，流加甲醇，培养160～190h。中途测定产酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将发酵罐中的发酵液全部移出，再泵入新的发酵换液培养基进行下一批发酵，连续生产至酶活不再升高，结束发酵。

其中，种子液培养基成分：12.5g/l酵母粉，25g/l蛋白胨，13.4g/l无氨基酸酵母氮源(ynb)，0.3g/l三水合磷酸氢二钾，1.18g/l磷酸二氢钾，5ml/l甲醇，0.4mg/l生物素，溶剂为水。

其中，固定化培养基成分：12.5g/l酵母粉，25g/l蛋白胨，13.4g/lynb，0.3g/l三水合磷酸氢二钾，1.18g/l磷酸二氢钾，10ml/l甲醇，0.4mg/l生物素，100ml/l10％的甘油，溶剂为水。

其中，发酵换液培养基成分：12.5g/l酵母粉，25g/l蛋白胨，13.4g/lynb，0.3g/l三水合磷酸氢二钾，1.18g/l磷酸二氢钾，10ml/l甲醇，0.4mg/l生物素，100ml/l10％的甘油，溶剂为水。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、在本发明中，我们所选用的多孔纤维材料化学性质不活泼，材料性能稳定，在发酵过程中，发酵液不会对材质产生侵蚀影响而且不会对对细胞产生毒害作用，介质机械性能较好不受发酵过程中剪切力的影响，经过我们对其改性以后均匀度也很好，会使毕赤酵母在载体上适度的生长且分布均匀，此外，在发酵过程当中，细胞的死亡脱落及新细胞的吸附使吸附过程处于动态平衡状态，从而减少发酵过程中对细胞的损害，大大减少发酵的总时间以及发酵的成本，载体可重复利用。

2、选用的多孔纤维材料具有孔隙率高、比表面积大等优点，单位体积固定的细胞数目多，因此在发酵过程中被吸附的细胞多，在毕赤酵母本身具有高密度发酵优点的基础上更进一步，提高发酵水平。对比游离发酵，固定化发酵的产量明显提高，发酵周期缩短，发酵液中的菌体量明显减少，粘稠度低于游离发酵，有利于发酵后期产物的分离获取。

3、以棉纤维织物为固定化介质发酵，生产植酸酶，连续生产9批，酶活水平没有降低，发酵工艺稳定，而且对比以前，此改性的纤维介质进行固定化发酵，工艺相当的稳定。

4、本发明通过甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵处理，使载体表面带有正电荷，将材料表面接入适当密度的正电荷可有效增强细胞表面粘附蛋白吸附，从而促进细胞粘附，同时不会对细胞活性产生消极影响，以提高产物的酶活，酶活最高达到15221.85u/ml，缩短发酵总周期12～24h，降低发酵液的粘度。

附图说明

图1为游离发酵液里面的菌量和对比例1未处理载体固定化载体吸附的菌量。

图2为游离发酵液里面的菌量和实施例8～实施例14对载体亲水性处理后固定化载体吸附的菌量。

图3为实施例3、实施例15和实施例16的表面电荷修饰结果。

图4为游离、实施例17和实施例18产植酸酶，所得植酸酶的酶活。

图5为游离、实施例17(甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵)和对比例2(其他电荷处理剂处理后的棉纤维)产植酸酶，所得植酸酶的酶活。

图6为游离和实施例19(亲水+电荷改性后棉纤维)发酵罐发酵产植酸酶，所得植酸酶的酶活。

图7为未处理棉纤维的电镜图。

图8为经过亲水性修饰棉纤维的电镜图。

图9为经过亲水、电荷修饰棉纤维的电镜图。

图10为未经过改性载体发酵的结果。

图11为经过亲水改性后的载体发酵结果。

图12为游离发酵、以及原介质，亲水，亲水及电荷改性棉纤维发酵罐发酵结果。

图13为实施例1～实施例7不同介质改性后亲水性的变化。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明所描述的方法可以适用于所有的毕赤酵母菌，在以下所实施的方案当中，我们所选用的毕赤酵母菌株是工大高新所赠。

多孔纤维材料由于表面一般带有一定的亲水性，而毕赤酵母表面亲水性较弱，因此在一定程度上不利于了毕赤酵母吸附到多孔纤维材料表面，所以要对多孔纤维材料进行相关预处理，增强载体的表面亲水性，以促进细胞吸附到载体表面。上述多孔纤维材料的预处理方法所确定的一个具体实施方案：

(1)将纤维材料置于去离子水中清洗1～3h，再将清洗后的材料置于10～50％(质量分数)naoh水溶液中浸泡1～6h，之后将材料置于去离子水中清洗至1～3h，直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将经过步骤(1)处理后的多孔纤维材料置于0.1～10％(体积分数)的植物胶水溶液中，浸泡10～60min，再将多孔纤维材料置于去离子水中充分漂洗后置于120℃烘干，保存备用。其中，所述的植物胶为田菁胶、瓜尔胶、胡麻胶、香豆胶中的任意一种或几种。

实施例1：多孔纤维材料固定化介质的制备

(1)将聚酯纤维在去离子水中清洗1h，再将其置于25％(质量分数)naoh水溶液中浸泡3h，之后将聚酯纤维在去离子水中清洗3h直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将聚酯纤维置于6％(体积分数)的田菁胶水溶液中浸泡30min，再将聚酯纤维置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。

实施例2：多孔纤维材料固定化介质的制备

(1)将聚乙烯载体在去离子水中清洗1.5h，再将其置于25％(质量分数)naoh水溶液中浸泡2h，之后将聚乙烯在去离子水中清洗2h直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将聚乙烯置于3％(体积分数)的香豆胶水溶液中浸泡20min，再将聚乙烯置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。

实施例3：多孔纤维材料固定化介质的制备

(1)将棉纤维(其电镜图如图7所示)在去离子水中清洗2.5h，再将其置于25％(质量分数)naoh水溶液中浸泡4h，之后将棉纤维在去离子水中清洗3h直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将棉纤维置于2％(体积分数)的香豆胶水溶液中浸泡15min，再将棉纤维置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。其电镜图如图8所示。

实施例4：多孔纤维材料固定化介质的制备

(1)将聚醚多元醇泡沫在去离子水中清洗2.5h，再将其置于25％(质量分数)naoh水溶液中浸泡4h，之后将聚醚多元醇泡沫在去离子水中清洗3h直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将聚醚多元醇泡沫置于2％(体积分数)的田菁胶水溶液中浸泡15min，再将聚醚多元醇泡沫置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。

实施例5多孔纤维材料固定化介质的制备

(1)将竹纤维载体在去离子水中清洗1.5h，再将其置于25％(质量分数)naoh水溶液中浸泡2h，之后将竹纤维在去离子水中清洗2h直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将竹纤维置于5％(体积分数)的香豆胶水溶液中浸泡20min，再将竹纤维置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。

实施例6多孔纤维材料固定化介质的制备

(1)将聚丙烯酰胺在去离子水中清洗3h，再将其置于50％(质量分数)naoh水溶液中浸泡6h，之后将竹纤维在去离子水中清洗3h直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将聚丙烯酰胺置于10％(体积分数)的瓜尔胶水溶液中浸泡60min，再将聚丙烯酰胺置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。

实施例7多孔纤维材料固定化介质的制备

(1)将聚氨酯泡沫在去离子水中清洗1h，再将其置于10％(质量分数)naoh水溶液中浸泡1h，之后将竹纤维在去离子水中清洗1h直到naoh被清洗干净，载体表面呈中性；

(2)将聚氨酯泡沫置于0.1％(体积分数)的瓜尔胶水溶液中浸泡10min，再将聚氨酯泡沫置于去离子水中充分漂洗后120℃烘干，4℃保存备用。

实施例1～实施例7中，从图13中可以看出，预处理后的多孔纤维材料亲水性得到提升，对毕赤酵母细胞的亲和性更强，细胞在介质表面的固定化更容易。

实施例8：以聚酯纤维为固定化介质于摇瓶中发酵验证吸附性能

按照实施例1的方法将聚酯纤维进行预处理，将处理过的聚酯纤维以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分：12.5g/l酵母粉，25g/l蛋白胨，13.4g/lynb，0.3g/l三水合磷酸氢二钾，1.18g/l磷酸二氢钾，5ml/l甲醇，0.4mg/l生物素，溶剂为水。

固定化培养基成分：12.5g/l酵母粉，25g/l蛋白胨，13.4g/lynb，0.3g/l三水合磷酸氢二钾，1.18g/l磷酸二氢钾，10ml/l甲醇，0.4mg/l生物素，100ml/l10％的甘油，溶剂为水。

发酵换液培养基成分：12.5g/l酵母粉，25g/l蛋白胨，13.4g/lynb，0.3g/l三水合磷酸氢二钾，1.18g/l磷酸二氢钾，10ml/l甲醇，0.4mg/l生物素，100ml/l10％的甘油，溶剂为水。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装100ml种子培养基的500ml摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化发酵：取25ml过夜种子液离心收集菌体，用10ml固定化培养基重悬菌体，加入装100ml固定化培养基的500ml摇瓶中于28～30℃，250rpm摇床中培养，每隔24h添加1ml甲醇。

(4)测量多孔纤维介质吸附菌量：将发酵24～36h的介质取出，用100mlph6.8的pbs缓冲液充分冲洗3次，取2、3次冲洗的液体测od600取平均值，即介质吸附量。

实施例9：以聚乙烯为固定化介质于摇瓶中发酵验证吸附性能

按照实施例2的方法将聚乙烯进行预处理，将处理过的聚乙烯以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤同实施例8。

实施例10：以棉纤维为固定化介质于摇瓶中发酵验证吸附性能

按照实施例3的方法将棉纤维进行预处理，将处理过的棉纤维以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤同实施例8。

实施例11：以聚醚多元醇泡沫为固定化介质于摇瓶中发酵验证吸附性能

按照实施例4的方法将聚醚多元醇泡沫进行预处理，将处理过的聚醚多元醇泡沫以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤同实施例8。

实施例12：以竹纤维为固定化介质于摇瓶中发酵验证吸附性能

按照实施例5的方法将竹纤维进行预处理，将处理过的竹纤维以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤同实施例8。

实施例13：以聚丙烯酰胺为固定化介质于摇瓶中发酵验证吸附性能

按照实施例6的方法将聚丙烯酰胺进行预处理，将处理过的聚丙烯酰胺以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤同实施例8。

实施例14：以聚氨酯泡沫为固定化介质于摇瓶中发酵验证吸附性能

按照实施例7的方法将聚氨酯泡沫进行预处理，将处理过的聚氨酯泡沫以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤同实施例8。

对比例1：以实施例1～7中未经过预处理的介质作为固定化载体进行摇瓶发酵

将实施例1～7中未经处理的介质各以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤(1)～步骤(3)同实施例8。

(4)测量多孔纤维介质吸附菌量：将发酵24～36h的介质取出，用100mlph6.8的pbs缓冲液充分冲洗3次，取2、3次冲洗的液体测od600取平均值，即介质吸附量，结果如图1。

(5)中途测定植酸酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将瓶中的发酵液全部移出，再补入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。结果如图10。

综合图1、图10可知，棉纤维及竹纤维介质在摇瓶发酵过程中对毕赤酵母菌体的固定化效果比其它五种介质都好，而在产酶环节，棉纤维产酶最高酶活在发酵全程都高于其它介质，竹纤维酶活较棉纤维稍低，但也明显优于另外五种介质。因此，从原介质发酵及固定化性能角度看，棉纤维和竹纤维更优秀。

从图1中，可以看出，与游离发酵相比，未对亲水性进行改性的固定化载体的吸附量较低。从图2中可以看出(实施例8～实施例14)，棉纤维(实施例10，od600为7.065)和竹纤维(实施例12，od600为6.799)的菌体吸附能力比其他五种多孔纤维介质高约34％，固定化性能远远超过；此外，对比没有亲水改性的介质(图1未处理棉纤维，od600为5.665，竹纤维为5.599)棉纤维同比提高24.7％，竹纤维提高21.4％。说明对载体进行亲水性改性能够有效提高载体的固定化性能。

毕赤酵母细胞表面带有负电荷，而所选多孔纤维介质表面同样带有负电荷，在毕赤酵母固定化过程中会不利于吸附，所以要对多孔纤维材料进行相关处理，使载体表面带有正电荷，将材料表面接入适当密度的正电荷可有效增强细胞表面粘附蛋白吸附，从而促进细胞粘附，同时不会对细胞活性产生消极影响。maeta分子中含有一个稳定携带正电荷的季铵基团，是常用的化学小分子，以促进细胞吸附到载体表面。

上述多孔纤维材料的处理方法所确定的一个具体实施方案：

将经过植物胶改性处理后的多孔纤维材料置于0.1～10％(体积分数)的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(maetac)水溶液中，浸泡10～60min，再将多孔纤维材料置于去离子水中充分漂洗后置于120℃烘干，保存备用。

实施例15：对棉纤维介质进行表面电荷修饰

按照实施例3的方法对棉纤维介质进行处理，在处理后的介质基础上对介质进行表面电荷修饰。

将经过植物胶改性处理后的多孔纤维材料置于5％(体积分数)的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(maetac)水溶液中，浸泡30min，再将多孔纤维材料置于去离子水中充分漂洗后置于120℃烘干，保存备用。其电镜图如图9所示。

实施例16：对竹纤维介质进行表面电荷修饰

按照实施例5的方法对竹纤维介质进行处理，在处理后的介质基础上对介质进行表面电荷修饰。

将经过植物胶改性处理后的多孔纤维材料置于5％(体积分数)的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(maetac)水溶液中，浸泡30min，再将多孔纤维材料置于去离子水中充分漂洗后置于120℃烘干，保存备用。

实施例15和实施例16的表面电荷修饰结果如图3。ph值在4.0～8.0之间表面电位趋于稳定，相比于未电荷修饰的实施例13，在电荷修饰后，实施例15和实施例16的表面电荷均有所提高。其中，实施例15处理效果较好，ph值在4.0～8.0之间，表面电荷在3～4.5mv左右，实施例16约为0～1.8mv，都实现了介质表面正电荷修饰。

实施例17：以棉纤维为固定化介质于摇瓶中发酵产植酸酶

按照实施例15的方法将棉纤维进行处理，将处理过的棉纤维以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装100ml种子培养基的500ml摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将相同体积的发酵换液培养基补入摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养72～120h，每隔24h添加1ml甲醇，中途测定植酸酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将瓶中的发酵液全部移出，再补入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产10批，产酶水平基本没有下降。最终植酸酶最大酶活为1370.87u/ml。

实施例18：以竹纤维为固定化介质于摇瓶中发酵产植酸酶

按照实施例16的方法将竹纤维进行处理，将处理过的竹纤维以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装100ml种子培养基的500ml摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将相同体积的发酵换液培养基补入摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养72～96h，每隔24h添加1ml甲醇，中途测定产酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将瓶中的发酵液全部移出，再补入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产10批，产酶水平基本没有下降。最终植酸酶最大酶活为1223.75u/ml。

请补充酶活的定义为在温度37℃、ph5.50条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/l植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以u表示。

由实施例17、18结果可知(图4)，棉纤维经过植物胶亲水改性再经过表面电荷修饰后，有利于毕赤酵母吸附在介质表面，产酶酶活为1370.87u/ml比实施例18的1223.75u/ml高约12％，二者产酶酶活都远高于游离发酵(实施例17高约39.95％，实施例18高约24.93％)，并且最大酶活提前24h到达，发酵速率更高。

对比例2：以氨丙基三乙氧基硅烷对亲水改性后的棉纤维进行修饰并进行摇瓶发酵

按照实施例3的的方法对棉纤维介质进行处理，在处理后的介质基础上对介质进行表面电荷修饰。

将经过植物胶改性处理后的多孔纤维材料置于5％(体积分数)的氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，浸泡30min，再将多孔纤维材料置于去离子水中充分漂洗后置于120℃烘干备用。

将处理过的棉纤维以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装100ml种子培养基的500ml摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将相同体积的发酵换液培养基补入摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养72～120h，每隔24h添加1ml甲醇，中途测定植酸酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将瓶中的发酵液全部移出，再补入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。最终植酸酶最大酶活为1063.56u/ml，结果如图5。

结合图5和实施例17可知，由氨丙基三乙氧基硅烷修饰电荷的棉纤维比甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(maetac)修饰的吸附效果及产酶酶活低，实施例17比对比例2最大酶活1063.56u/ml高约25.02％，可以确定甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(maetac)为最优。

实施例19：以棉纤维为固定化介质在10l发酵罐生产植酸酶

按照实施例15的方法对棉纤维进行表面处理，将处理后的棉纤维以25g/l的量裁剪成规则的矩形，以适当的方式固定在发酵罐内部。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装有500ml种子培养基的3l摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将6l的发酵换液培养基用蠕动泵泵入10l发酵罐中，温度28～30℃，罐压0.05mpa，通气量10～20l/min，流加甲醇，培养160～190h。中途测定产酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将发酵罐中的发酵液全部移出，再泵入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产10批，酶活水平没有降低，发酵工艺稳定，最大植酸酶酶活15221.85u/ml。

对比例4：于摇瓶中游离发酵产植酸酶

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装100ml种子培养基的500ml摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)游离反复批次发酵：将相同体积的发酵换液培养基补入摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养72～120h，每隔24h添加1ml甲醇，中途测定植酸酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将瓶中的发酵液全部移出，再补入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。游离发酵在120h时达到最大酶活979.562u/ml。

对比例5：亲水改性后的固定化介质于摇瓶中发酵产植酸酶

将实施例1-7中经过亲水改性的介质，以25g/l的添加量置于摇瓶中，作为摇瓶中固定化发酵生产植酸酶的固定化介质。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装100ml种子培养基的500ml摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将相同体积的发酵换液培养基补入摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养72～120h，每隔24h添加1ml甲醇，中途测定植酸酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将瓶中的发酵液全部移出，再补入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。结果如图11。

对比例6：未经过处理的棉纤维在10l发酵罐中发酵生产植酸酶

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装500ml种子培养基的3l摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将6l的发酵换液培养基用蠕动泵泵入10l发酵罐中，温度28～30℃，罐压0.05mpa，通气量10～20l/min，流加甲醇，培养160～190h。中途测定产酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将发酵罐中的发酵液全部移出，再泵入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产10批，酶活水平没有降低，发酵工艺稳定，最大植酸酶酶活为14289.57u/ml。

对比例7：经过亲水改性处理的棉纤维在10l发酵罐中发酵生产植酸酶

按照实施例3的方法对棉纤维进行表面处理，将处理后的棉纤维以25g/l的量裁剪成规则的矩形，以适当的方式固定在发酵罐内部。

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装500ml种子培养基的3l摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将6l的发酵换液培养基用蠕动泵泵入10l发酵罐中，温度28～30℃，罐压0.05mpa，通气量10～20l/min，流加甲醇，培养160～190h。中途测定产酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将发酵罐中的发酵液全部移出，再泵入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产10批，酶活水平没有降低，发酵工艺稳定，最大植酸酶酶活为14701.85u/ml。原介质，亲水，亲水及电荷改性棉纤维发酵罐发酵结果如图12。

对比例3：在10l发酵罐中游离发酵生产植酸酶

种子液培养基成分、固定化培养基成分和发酵换液培养基成分同实施例8。

方法步骤如下：

(1)平板活化：将冻存保藏的毕赤酵母菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3～4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装500ml种子培养基的3l摇瓶中，于28～30℃，250rpm摇床中培养22～24h。

(3)固定化反复批次发酵：将6l的发酵换液培养基用蠕动泵泵入10l发酵罐中，温度28～30℃，罐压0.05mpa，通气量10～20l/min，流加甲醇，培养160～190h。中途测定产酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将发酵罐中的发酵液全部移出，再泵入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。连续生产10批，酶活水平没有降低，发酵工艺稳定，最大植酸酶酶活为12326.85u/ml。

发酵罐发酵结果如图6。采用植物胶及介质表面电荷改性后的棉纤维作为固定化发酵载体酶活更高(15221.85u/ml)，提前12～24h达到最高酶活，较游离发酵罐发酵最高酶活12326.57u/ml提高19.02％，说明经过改造的棉纤维介质在毕赤酵母固定化发酵中能够稳定、连续的发酵，缩短发酵周期，提高发酵速率，是一种优质的毕赤酵母固定化介质。

本发明提供了一种毕赤酵母的固定化方法及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。