一种金黄杆菌DDW4-2菌株及其在降解四环素类抗生素中的应用的制作方法

本发明属于抗生素的生物降解技术领域，涉及一种降解微生物，具体涉及一种金黄杆菌ddw4-2菌株及其在降解四环素类抗生素中的应用。

背景技术：

四环素类抗生素是一类广谱抗生素，其结构均包含有并四苯基本骨架，其主要种类包括四环素、土霉素、金霉素、多西环素、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素等。四环素类抗生素由于其成本低廉、使用方便、抗菌谱广等原因在世界各国得到大量的使用，被广泛用于畜禽的疾病预防与治疗以及促进畜禽生长等方面。目前，四环素类抗生素是我国使用量最大的抗生素之一，据统计，2013年的使用量已高达12000吨。但由于这类药物吸收率较低，大量四环素类抗生素会以母体或活性代谢物的形式存在于畜禽粪便当中，并随之进入环境，其在畜禽粪便中仍具有较强的活性，对环境生物有生理毒性。研究发现，四环素的代谢产物的毒性有时甚至比母体化合物的毒性还要高。

据研究统计，我国近年来畜禽粪便的年产生量高达38亿吨，有效处理率却不到50％，如果直接将畜禽粪便施于农田或排入水环境中，在雨水冲淋、地表径流、渗滤等作用下，残留在畜禽粪便中的抗生素在土壤、地表水或地下水中迁移，对土壤环境和水环境均会造成威胁。鉴于四环素类药物的密集使用，它所造成的环境污染问题也日益严重，并且为环境中的耐药菌和耐药基因的传播提供了温床，严重威胁人类的健康，因此，四环素类药物的残留问题亟待解决。

当前，解决环境中四环素类抗生素累积的途径主要包括非生物降解和生物降解两种。非生物降解包括光降解、水解和氧化降解，但作用效果相对有限且过程缓慢。生物降解包括植物降解和微生物降解，但植物降解多集中在用某一植物来修复特定污染的环境，对于多种抗生素所引起的复合污染的降解能力尚待研究。微生物降解是利用微生物产生的各类生物酶的作用将四环素类抗生素降解转化为能源物质或对自身无毒害作用的其他代谢产物，从而降低甚至消除抗生素的生态风险。目前，从环境中筛选分离得到的能够降解四环素类抗生素的菌种，主要有光合细菌、乳酸菌、放线菌、酵母菌、发酵丝状菌、芽孢杆菌、枯草杆菌、硝化细菌、酵母等。但目前报道的四环素类抗生素降解微生物的种类仍然较少，亟需补充新的菌种资源，因此，挖掘更多的四环素类抗生素降解菌具有重要的应用价值。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株。

本发明的第二个目的是提供上述金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株在降解四环素类抗生素残留中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种降解四环素类抗生素的菌剂。

本发明的第四个目的是提供上述降解四环素类抗生素的菌剂在降解四环素类抗生素残留中的应用。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明的首要目的是提供一种金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株，所述ddw4-2菌株于2019年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:60821，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，所述ddw4-2菌株的16srdna具有如seqidno：3所示的核苷酸序列。

本发明用含四环素的lb琼脂培养基从猪场的污水样品中分离得到一个单菌落，该单菌落经16srdna鉴定为chryseobacteriumjejuense，并将其命名为ddw4-2。

本发明的第二个目的是提供上述金黄杆菌ddw4-2菌株在降解四环素类抗生素残留中的应用。

优选的，所述四环素类抗生素为四环素、金霉素、多西环素、米诺环素和伊拉瓦环素中的至少一种。四环素类药物的抑菌实验表明，金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2对金霉素、多西环素、米诺环素和伊拉瓦环素均具有一定的降解作用，初步判定其具有降解四环素类抗生素的能力，有望应用于降解四环素类抗生素的残留中。

更优选的，所述四环素类抗生素为四环素。进一步的研究表明，金黄杆菌ddw4-2菌株能够在16小时后降解48.4％的四环素，表现出良好的降解活性，有望用于处理环境中的四环素类抗生素残留问题。

优选的，所述四环素、金霉素、多西环素、米诺环素和伊拉瓦环素的浓度分别小于256ug/ml、128ug/ml、16ug/ml、32ug/ml和4ug/ml。最小抑菌浓度测定试验表明，四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素对金黄杆菌ddw4-2菌株的最小抑菌浓度分别为256ug/ml、128ug/ml、256ug/ml、16ug/ml、32ug/ml、8ug/ml和4ug/ml。

本发明的第三个目的是提供一种降解四环素类抗生素的菌剂，包括金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株。当然，为增加产品的适用范围，该菌剂还可以包括其他在降解四环素类抗生素领域能被接受的辅剂。

优选的，所述菌剂的制备方法为：将所述ddw4-2菌株用液体培养基(如lb肉汤、m9培养基等)进行培养，收集培养液即可得到菌剂。当然，也可以将该培养液进行干燥得到菌粉，也可以作为降解四环素类抗生素的菌剂使用。

本发明的第四个目的是提供上述降解四环素类抗生素的菌剂在降解四环素类抗生素残留中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一株新的金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株，该菌株的16srdna具有如seqidno：3所示的核苷酸序列，其对四环素类抗生素表现出良好的降解作用，能够在16小时后降解48.4％的四环素，为四环素类药物的残留问题提供了安全、环保的解决途径。

附图说明

图1为四环素类药物的抑菌实验结果；

图2为金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株降解四环素的lc-ms/ms测定结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株的分离、纯化和鉴定

(1)分离、纯化：2017年7月，从福建某猪场中采集一份污水样品，并吸取0.1ml新鲜样品加入到1ml0.9％的生理盐水中，涡旋混匀。吸取20ul混悬液至4mllb肉汤中，30℃、180rpm条件下培养12-16小时。随后，将上述培养液分区划线于含有64ug/ml四环素的lb琼脂培养基上，30℃条件下培养16-24小时。挑取纯化的单菌落，使用相同的lb琼脂培养基进行进一步的纯化，30℃条件下培养16-24小时，得到纯化后的单菌落。

(2)16srdna菌种鉴定：刮取一环上述纯化后的单菌落，参照天根细菌基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)的使用说明对该菌株的基因组进行提取。随后对16srdna基因进行pcr扩增，并将pcr产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳。pcr体系(25ul)如下：18.375ulddh2o，2.5ul10×buffer，2uldntps，0.5ul上游引物(seqidno：1)，0.5ul下游引物(seqidno：2)，0.125ulr-taq酶和1uldna模板。其中，16srdna引物由广州擎科生物技术有限公司合成，而其他pcr成份购自宝生物工程(大连)有限公司。pcr程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸90s，循环30次；72℃再延伸10min。

根据琼脂糖凝胶电泳结果，将pcr阳性样品送往广州擎科生物技术有限公司进行测序，得到该菌株的16srdna序列(其核苷酸序列如seqidno：3所示)，然后利用ncbi数据库对上述核苷酸序列进行比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)，比对结果表明该菌株为金黄杆菌(chryseobacteriumjejuense)，最后，将该菌命名为金黄杆菌(chryseobacteriumjejuense)ddw4-2。

实施例2金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株的菌落形态特征及生理生化特性

金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株属于金黄杆菌属(chryseobacterium)，为革兰阴性、短小杆菌，无鞭毛，无芽胞。专性需氧，最适生长温度为35℃，营养要求不高，普通培养基即可生长，在麦康凯培养基上生长较弱或完全不生长。经24h培养后，该菌在血平板上形成表面光滑、边缘整齐、湿润、黄色或橙色的菌落，不溶血。在金黄杆菌形成的菌落上加一滴3％koh溶液，黄橙色变为红色。

实施例3金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2的保藏

金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2的保藏信息如下：

保藏时间：2019年11月22日；

保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)；

保藏编号：gdmccno:60821；

保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；

分类命名：chryseobacteriumjejuense，缩写为c.jejuense。

实施例4四环素类抗生素对金黄杆菌ddw4-2菌株的最小抑菌浓度(mic)的测定

采用微量肉汤稀释法，以大肠杆菌atcc25922为质控菌株，参照美国临床和实验室标准协会的相关标准(clsi:m100-s26)，测定四环素、金霉素(cete)、土霉素、多西环素(dox)、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素(均购自美国sigma-aldrich公司)对金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株的mics。

表1的测定结果表明，金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株对四环素(tet)、金霉素(cete)、土霉素(otc)、多西环素(dox)、米诺环素(min)、替加环素(tgc)和伊拉瓦环素(era)均表现出不同水平的药物敏感性，其中，四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素对ddw4-2菌株的最小抑菌浓度分别为256ug/ml、128ug/ml、256ug/ml、16ug/ml、32ug/ml、8ug/ml和4ug/ml。

表1四环素类药物对金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株的mics

实施例5四环素类药物的抑菌实验(金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株对四环素类药物降解能力的初步判断)

1、实验材料：

(1)试验用四环素类药物：金霉素、多西环素、米诺环素和伊拉瓦环素。

(2)试验用培养基：将经高压灭菌的mh琼脂培养基(购买自广东环凯微生物科技有限公司)冷却至40℃，用移液枪取20ml至无菌培养皿中，自然晾干30min，制得mh琼脂培养基。

(3)试验用菌株：嗜热脂肪芽孢杆菌标准菌株atcc7953(购自中国微生物菌种保藏中心)：对四环素类药物敏感的菌株；

大肠杆菌标准菌株atcc25922(e.coliatcc25922，实验室保藏)：无使四环素类药物失活的酶；

金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2：能使四环素类药物失活。

2、试验前的准备工作：

(1)分别将金霉素、多西环素、米诺环素、伊拉瓦环素置于含有800ul无菌水的2ml离心管中，涡旋15s，制备成药物溶液，备用；

(2)将嗜热脂肪芽孢杆菌标准菌株atcc7953培养至对数期，使其终浓度为10⁸cfu/ml，然后涂布于mh琼脂培养基上，制备得到含有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基，备用；

(3)将大肠杆菌标准菌株atcc25922涂布于mh琼脂培养基上，培养至合适大小的菌苔，备用；

(4)将金黄杆菌ddw4-2涂布于mh琼脂培养基上，培养至合适大小的菌苔，备用；

(5)刮一接种环的金黄杆菌ddw4-2菌苔(待测菌株)、一接种环的e.coliatcc25922菌苔(阴性对照)分别放置在步骤(1)所述的离心管中后，再加入100ul的mh肉汤共同孵育8h。

3、四环素类药物降解试验：

以嗜热脂肪芽孢杆菌标准菌株atcc7953(购自中国微生物菌种保藏中心)为指示菌，采用打孔法进行四环素类药物降解试验，观察atcc7953出现的抑菌圈的大小。以mh琼脂培养基作为试验用培养基，并在mh琼脂培养基上挖4个6mm并封底的孔，每个药物试验均分为4组：(1)空白组：药物溶液+无菌水+mh肉汤(图1中的空白对照位置)；(2)阳性测试组：药物溶液+金黄杆菌ddw4-2菌苔+mh肉汤(图1中的“阳性测试”位置)；(3)两个阴性对照组：药物溶液+大肠杆菌标准菌株atcc25922菌苔+mh肉汤(图1中的“阴性对照”位置)。将上述各个试验组的混合液放入37℃恒温培养箱中孵育8h后，将孵育后的溶液分别吸取20ul加入至涂布有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基上对应的孔中，置于60℃恒温培养箱中孵育16小时后观察其抑菌圈大小。值得注意的是，60℃的温度为嗜热脂肪芽孢杆菌的最适生长温度，且嗜热脂肪芽孢杆菌处于常温不生长。

如图1的结果所示，阳性测试组在涂布有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基上没有出现明显的抑菌圈；阴性对照组及空白对照组在涂布有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基上出现了明显的抑菌圈；说明金黄杆菌(chryseobacteriumjejuense)ddw4-2对金霉素、多西环素、米诺环素和伊拉瓦环素均具有一定的降解作用。可见，金黄杆菌(chryseobacteriumjejuense)ddw4-2对四环素类药物表现出良好的降解活性。

实施例6金黄杆菌ddw4-2菌株对四环素类药物的降解效果验证

挑取纯化后的金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2单菌落，接种于4mlm9培养基(1×m9最小盐，2mm硫酸镁，100um氯化钙，0.1％l-阿拉伯糖，9g/l葡萄糖，100mg/l硫胺素和100mg/l亮氨酸；均购自sigma-aldrich公司)，37℃、180rpm条件下培养8小时。吸取40ul上述金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2培养液添加到含8ug/ml四环素且终体积为4ml的m9培养基中，在37℃、200rpm和避光条件下培养16小时。同时以仅添加四环素类抗生素的m9培养夜为对照组。随后，将细菌培养液以12000rpm的转速离心2min，并用0.22um孔径的滤头过滤。取过滤后的上清液，经10倍稀释后，参照传统方法(kevinj.forsberg等，2015，chemistry&biology)进行lc-ms/ms测定。上述实验组和对照组各设置6个平行。

图2的测定结果表明，金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株在16小时后对四环素的降解率达48.4％(理论最大值即四环素的初始添加量，8ug/ml；总体标准偏差为1.17％，p<0.01)。同时，四环素对照组自身的降解率在25％以下。证明金黄杆菌(c.jejuense)ddw4-2菌株对四环素表现出良好的降解活性。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种金黄杆菌ddw4-2菌株及其在降解四环素类抗生素中的应用

<141>2020-01-08

<160>3

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