IL-1a用于建立人牙龈成纤维细胞炎症模型的方法和应用与流程

本发明属于口腔清洁护理产品安全性和功效性检测技术领域，具体涉及一种il-1a在建立人牙龈成纤维细胞炎症模型的方法、il-1a建立人牙龈成纤维细胞炎症模型的应用及il-1a建立的人牙龈成纤维细胞炎症模型。

背景技术：

炎症是活体组织对损伤或感染产生的一种以防御反应为主的病理过程。在炎症过程中，一方面损伤因子会直接和间接造成组织和细胞的破坏，另一方面也会引起血管充血和渗出反应，以稀释、杀伤和包围损伤组织的形式存在。近十几年，随着生物技术的发展，人们注重皮肤等身体机能的老化时，口腔组织的炎症也受到了更多的关注。与此同时，具有抗炎功效的口腔类护理产品逐渐进入大众的视野，并且受众越来越年轻化，也是各大口腔类产品公司和研究机构的重要研究领域。

正常人体的口腔上皮固有定植一定数量的细菌,它们与宿主在长期进化过程中形成了一个能独立进行物质、能量交流的动态平衡的生态系统。正常菌群与宿主呈共栖关系,他们彼此之间保持着动态平衡，这种状态对维护宿主健康十分重要。口腔组织的结构及其炎症反应的主要牙周病、扁桃体炎、咽炎、口腔溃疡、舌炎等，主要的临床表现为口颊，舌边，上腭，齿龈等处发生溃疡，周围红肿作痛，溃面有糜烂的现象。其中，牙周病发病率很高，牙周炎牙周病中一种最常见的慢性炎症性疾病，其特征是牙齿支持组织，即牙周组织的逐渐破坏。

牙周病的研究集中在微生物和微生物产物引发的宿主免疫反应上，这些微生物和微生物产物是细胞因子、趋化因子和生长因子的强诱导剂，它们通过toll样受体(tlr)家族成员等先天免疫受体发挥作用。牙周组织细胞(包括上皮细胞、成纤维细胞和单核细胞)在受到刺激时表达tlrs并产生免疫和抗菌因子。

toll样受体(toll-likereceptors,tlr)能特异性识别病原微生物进化中保守的抗原分子——病原相关分子模式（(pamps)，其能够激活toll样受体2（tlr2）和toll样受体4(tlr4)，进一步激活nf-κb信号通路，nf-κb属于核转录因子，激活后进入细胞核内会启动炎症相关因子如白细胞介素1-a（il-1a）、白细胞介素6（il-6）、白细胞介素8（il-8）、肿瘤坏死因子-α（tnf-α）、前列腺素e2（pge2）、白细胞介素2（il-2）、白细胞介素4（il-4）等的合成，从而进入到炎症级联反应，机体表现出炎症症状。

目前用于构建口腔上皮细胞炎症模型的模式主以采用lps为主，其中lps常用的有两种来源，分别是大肠杆菌来源的lps，即ecoli.lps，一种是牙龈卟啉单孢菌来源的lps，即pg.lps。基可与toll样受体结合，并进一步激活nf-κb信号通路引起炎症反应而被广泛接受。但这两种lps在构建细胞炎症模型中有以下两点缺点：1.炎症模型的稳定性较差，实验重复率较低，导致常针对同一样本抗炎效果的评价相互矛盾从而无法准确评价口腔护理原料和产品抗炎效果的真实性。造成此种现象的原因可能与人牙龈组织中的存在脂联素及其受体有关，据研究报道，人口腔上皮细胞中的存在的脂联素可明显消除脂多糖（lps）诱导的细白细胞介素物质表达上调：如il-1b、il-6、il-8、mmp-1和mmp-3。并提示脂联素可拮抗lps体外建立炎症模型的效果。这也正解释了为什么我们常用的以lps建立口腔炎症模型的不稳定性。2.lps该物质不稳定、相对成本较高，货期较长，特别是pg.lps，且lps在保存方式上也存在较多弊端，如：lps配制时浓度必须大于2mg/ml，不然lps长期存放可粘附于管壁，有效成分降低而失去效力。后者，这些常给实验操作者及企业带来众多不便。因此，现急需要一种稳定性较强的刺激物及细胞系配合而构建广谱性、稳定性的细胞炎症模型，以便更为完善真实地评价口腔类产品的抗炎效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供一种il-1a在建立人牙龈成纤维细胞炎症模型中的应用、方法及il-1a建立的人牙龈成纤维细胞炎症模型。

为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面提供一种il-1a在建立人牙龈成纤维细胞炎症模型应用。

优选地，il-1a在建立牙龈成纤维细胞炎症模型应用的过程为：

将人牙龈成纤维细胞接种于多孔板中，加入培养液，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中培养，24h后弃去旧培养液，每孔加入含il-1a的细胞培养液，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育4-24h，检测细胞产生的炎性因子表达情况。

优选地，每孔中加入培养液的量为2ml，每孔加入含il-1a的培养液的量为2ml，所述含il-1a的细胞培养液中il-1a的终浓度为1-15ng/ml，例如1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、10ng/ml或15ng/ml。

优选地，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育时间为4-24h，例如4h、8h或20h。

优选地，所述人牙龈成纤维细胞接种于多孔板中的密度为1×10⁴-2×10⁵个细胞/孔。

本发明第二方面，提供建立人牙龈成纤维细胞炎症模型的方法，包括以下步骤：将人牙龈成纤维细胞接种于多孔板中，加入培养液，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中培养，24h后弃去旧培养液，每孔加入含il-1a的培养液，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育4-24h，检测细胞产生的炎性因子表达情况。

优选地，每孔中加入培养液的量为2ml，每孔加入含il-1a的培养液的量为2ml，所述含il-1a的培养液中il-1a的终浓度为il-1a的终浓度为1-15ng/ml，例如1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、10ng/ml或15ng/ml。

优选地，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育时间为4-24h，例如4h、、8h或24h。

优选地，所述人牙龈成纤维细胞接种于多孔板中的密度为1×10⁴-2×10⁵个细胞/孔。

本发明第三方面，提供一种人牙龈成纤维细胞炎症模型，所述人牙龈成纤维细胞炎症模型由以下方法制备而成：将人牙龈成纤维细胞接种于多孔板中，加入培养液，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中培养，24h后弃去旧培养液，每孔加入含il-1a的培养液，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育4-24h，获得所述人牙龈成纤维细胞炎症模型。

优选地，每孔中加入培养液的量为2ml，每孔加入含il-1a的培养液的量为2ml，所述含il-1a的培养液中il-1a的终浓度为il-1a的终浓度为1-15ng/ml，例如1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、10ng/ml或15ng/ml。

优选地，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育时间为4-24h，例如4h、、8h或24h。

优选地，所述人牙龈成纤维细胞接种于多孔板中的密度为1×10⁴-2×10⁵个细胞/孔。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

il-1a作为一种介导炎症组织破坏的多功能细胞因子，其是炎症反应的典型炎性因子，可以为诱导条件构建更加有效、稳定的体外口腔炎症模型，真实全面准确地反应口腔清洗护理原料及产品的抗炎效果的评价。

本发明所述的炎症模型是一种基于体外培养的人牙龈成纤维细胞，使用1-15ng/mlil-1a刺激人牙龈成纤维细胞，4-24h后通过检测炎症相关因子（il-6、il-8、tnf-α及pge2）含量来评价细胞炎症程度的口腔炎症模型，它模拟的是由于微生物及外界环境造成的炎性炎症。

附图说明

图1为不同浓度il-1a刺激下人牙龈成纤维细胞的相对细胞活力统计图；

图2为不同浓度il-1a刺激下人牙龈成纤维细胞的il-6表达量的影响；

图3为不同浓度il-1a刺激下人牙龈成纤维细胞的il-8表达量的影响；

图4为不同浓度il-1a刺激下人牙龈成纤维细胞的tnf-α表达量的影响；

图5为不同浓度il-1a刺激下人牙龈成纤维细胞的pge2表达量的影响。

具体实施例

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

一、实施方法

（1）不同浓度刺激物对人牙龈成纤维细胞细胞活力的影响：设置空白组、对照组与实验组。刺激物选以下三种物质：il-1a、ecoli.lps和pg.lps。其中三种物质分设3-4个浓度进行浓度摸索。具体浓度比如下表所示。il-1a设1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml；ecoli.lps设1ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml；pg.lps设1ug/ml、10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml。

（2）il-1a诱导人牙龈成纤维细胞产生炎症模型：设置对照组与实验组。将人牙龈成纤维细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于24孔板中，每孔加入2ml含10%fbs的high-dmem培养基，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中培养，24h时细胞铺板率达40%-60%之间，此时弃去旧培养液进行如下操作：空白对照组加入正常培养液（10%fbs的high-dmem培养基），实验组每孔加入1ml含不同浓度的il-1a、ecoli.lps和pg.lps的含10%fbs的high-dmem培养基，其中il-1a设1ng/ml和10ng/ml两个浓度，ecoli.lps设10ug/ml和100ug/ml两个浓度；pg.lps设1ug/ml、10ug/ml和100ug/ml三个浓度进行。以比较炎性模型的成功性和本发明物质的优越性。将24孔板置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育，培养24h后收集细胞培养液上清通过酶联免疫检测法（elisa）检测炎症相关因子il-6的含量来评价细胞炎症程度。

（3）il-1a诱导人牙龈成纤维细胞产生炎症模型：设置对照组与实验组。将人牙龈成纤维细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于24孔板中，每孔加入2ml含10%fbs的high-dmem培养基，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中培养，24h时细胞铺板率达40%-60%之间，此时弃去旧培养液进行如下操作：空白对照组加入正常培养液（10%fbs的high-dmem培养基），实验组每孔加入1ml含不同浓度的il-1a、ecoli.lps和pg.lps的含10%fbs的high-dmem培养基，其中il-1a设1ng/ml和10ng/ml两个浓度，ecoli.lps设10ug/ml和100ug/ml两个浓度；pg.lps设1ug/ml、10ug/ml和100ug/ml三个浓度进行。以比较炎性模型的成功性和本发明物质的优越性。将24孔板置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育，培养24h后收集细胞培养液上清通过酶联免疫检测法（elisa）检测炎症相关因子il-8含量来评价细胞炎症程度。

（4）il-1a诱导人牙龈成纤维细胞产生炎症模型：设置对照组与实验组。将人牙龈成纤维细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于24孔板中，每孔加入2ml含10%fbs的high-dmem培养基，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中培养，24h时细胞铺板率达40%-60%之间，此时弃去旧培养液进行如下操作：空白对照组加入正常培养液（10%fbs的high-dmem培养基），实验组每孔加入1ml含不同浓度的il-1a、ecoli.lps和pg.lps的含10%fbs的high-dmem培养基，其中il-1a设1ng/ml和10ng/ml两个浓度，ecoli.lps设10ug/ml和100ug/ml两个浓度；pg.lps设1ug/ml、10ug/ml和100ug/ml三个浓度进行。以比较炎性模型的成功性和本发明物质的优越性。将24孔板置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育，培养24h后收集细胞培养液上清通过酶联免疫检测法（elisa）检测炎症相关因子tnf-α含量来评价细胞炎症程度。

（5）il-1a诱导人牙龈成纤维细胞产生炎症模型：设置对照组与实验组。将人牙龈成纤维细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于24孔板中，每孔加入2ml含10%fbs的high-dmem培养基，置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中培养，24h时细胞铺板率达40%-60%之间，此时弃去旧培养液进行如下操作：空白对照组加入正常培养液（10%fbs的high-dmem培养基），实验组每孔加入1ml含不同浓度的il-1a、ecoli.lps和pg.lps的含10%fbs的high-dmem培养基，其中il-1a设1ng/ml和10ng/ml两个浓度，ecoli.lps设10ug/ml和100ug/ml两个浓度；pg.lps设1ug/ml、10ug/ml和100ug/ml三个浓度进行。以比较炎性模型的成功性和本发明物质的优越性。将24孔板置于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养箱中孵育，培养24h后收集细胞培养液上清通过酶联免疫检测法（elisa）检测炎症相关因子pge2含量来评价细胞炎症程度。

（6）所述实例例中数据均根据生物学软件graphpadprism5.0进行分析处理，数据表达为平均值+/-sd。处理之间通过t检验分析。p<0.05被认为具有显著差异，用*标记，p<0.01被认为具有极显著差异，用**标记。

二、实施结果

（1）不同浓度刺激物对人牙龈成纤维细胞细胞活力的影响

il-1a与两种lps对人牙龈成纤维细胞相对活力的影响如图1所示。对照组为正常培养基培养的细胞，以其细胞活力为100%，1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml的il-1a处理组细胞活力分别为89.18%、87.9%、87.48%与87.63%。随着il-1a浓度的升高，其对细胞活力的损伤作用逐渐增强，但整体所得，il-1a以上浓度所得细胞相对活力大于80%，可以用作后续建模研究。两种lps中，四个浓度的ecoli.lps和pg.lps对人牙龈成纤维细胞活力亦均大于80%，证明了众多研究中所使用此类物质建模的正确性。说明本发明所选il-1a和两类lps均为安全，故进一步针对三者的优越性进行对比。

（2）不同浓度刺激物对人牙龈成纤维细胞il-6表达量的影响

根据实施方法1所得结果，分别选取不同浓度il-1a、ecoli.lps和pg.lps分别对人牙龈成纤维细胞il-6表达量的进行比较。il-1a设1ng/ml和10ng/ml两个浓度，ecoli.lps设10ug/ml和100ug/ml两个浓度；pg.lps设1ug/ml、10ug/ml和100ug/ml三个浓度。

il-6是一种多功能的细胞因子，在促进炎症发展、刺激ｔ细胞分化、急性炎症等过程中扮演重要角色，其表达量的高低反映细胞炎症程度。il-6表达量越高表明细胞炎症程度越高。il-1a对il-6表达量的影响表现出了浓度依赖性。其中1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml时均显著增加。

（3）il-1a对人牙龈成纤维细胞il-8表达量的影响

il-8能刺激中性粒细胞、t淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化，促进中性粒细胞脱颗粒，释放弹性蛋白酶，损伤内皮细胞，使微循环血流淤滞，组织坏死，造成器官功能损伤。il-1a浓度与刺激时间对人牙龈成纤维细胞il-8表达量的影响如图3所示。il-8含量越高表明细胞炎性程度越高。5μg/ml、10μg/ml与20μg/mlil-1a对il-8含量的影响优于不同浓度的lps。

（4）il-1a对人牙龈成纤维细胞tnf-α表达量的影响

tnf-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。结果表明，il-1a浓度为1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml，可显著提高tnf-α的表达量，且il-1a对tnf-α含量的影响优于不同浓度的lps。

(5)il-1a对人牙龈成纤维细胞的pge2分泌的影响

il-1a浓度与刺激时间对人牙龈成纤维细胞pge2分泌的影响如图5所示。il-1a浓度为1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml，可显著提高pge2的表达量，且il-1a对pge2含量的影响优于不同浓度的lps。

三、实验结论

从实验结果可知，随着il-1a浓度和作用时间的增加，其对il-6、il-8、tnf-α及pge2四种炎症因子的分泌量都逐渐升高，细胞活力随着il-1a浓度升高而下降。其中，il-1a浓度为1ng/ml，处理时间为24h，炎症指标都显著高于对照组，且细胞相对活力较高（90.0%）。