本发明属于乳液分析检测技术领域，具体涉及一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法。
背景技术：
在水包油型乳液制备过程中天然蛋白质如植物蛋白(大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白等)和动物蛋白(乳清蛋白、酪蛋白、胶原蛋白等)被广泛用作稳定乳液结构的乳化剂。在制备水包油型乳液的过程中，这些蛋白质会吸附在油滴表面降低乳液界面张力，并在油滴表面形成一层薄膜，从而防止乳液油滴聚集分层。目前研究表明，水包油型乳液制品的产品品质及结构特性明显受不同界面蛋白的理化或结构性质的影响。因此，对乳液中界面蛋白的吸附行为及结构变化的研究就显得十分必要。
对水包油型乳液界面蛋白特性的研究关键在于界面蛋白的提取。目前，研究普遍认为提取界面蛋白首先要分离水包油乳液的油水两相，然后分别收集分离得到的油相和水相。最后采用不同的方法从油相中提取得到界面蛋白。有机溶剂法是较为普遍的的提取方法，油相与异丙醇、氯仿或甲醇按不同比例混合洗涤两到三次，去除油脂后通过高速离心法得到界面蛋白沉淀。但是有机试剂不仅污染环境，而且危害操作人员的身体健康。因此，在目前已知的研究基础上，我们采用吐温20作为提取剂建立一种实用、有效、环保、健康的水包油型乳液界面蛋白的提取方法。为水包油型乳液界面特性及结构稳定性的研究提供一种有效的研究手段。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有提取水包油型乳状液中界面蛋白方法对环境和操作人员危害大的不足，提供一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法。本发明首先对样品进行离心分离油水两相，然后对油相中的界面蛋白进行提取，并对提取后的界面蛋白进行定量测量，利用bca试剂盒检测样品中界面蛋白的提取量。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法，所述方法为：
步骤一：乳清分离蛋白(wpi)稳定的水包油型乳状液制备，将wpi粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中(10mm,ph7.0)，磁力搅拌2h，25℃,600r/min，然后将蛋白溶液置于4℃水合12h，油水比例为90％(v/v)wpi蛋白溶液和10％(v/v)的大豆油，乳液预乳化采用高速匀浆机在13600rpm，均浆2min，粗乳液再经过二次均质处理得到水包油型乳状液；
步骤二：乳液油水两相的分离，8ml新鲜乳液置于10ml螺口离心管中在15000×g，20℃条件下离心60min，倒出水相溶液将油相置于离心管中，为了除去水相中剩余的小油滴将水相溶液按上述离心条件再次离心30min，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，分别收集水相和油相；
步骤三：界面蛋白的提取，约1ml油相加入7mltween20溶液(0.5％，v/v)漩涡震荡30s，然后在15000×g，20℃的离心条件下离心60min除去上层油脂，此时混合液体为界面蛋白溶液和tween20，将混合溶液按上述条件再次离心30min除去上层剩余油脂，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，对照组采用有机试剂异丙醇处理；
步骤四：取步骤三得到的5ml混合溶液用磷酸盐缓冲溶液(10mm,ph7.0)稀释4倍后，采用超滤离心管纯化界面蛋白溶液除去tween20，离心条件为6000×g，20℃，45min；
步骤五：将纯化的浓缩界面蛋白溶液稀释至1ml(不是原来的5ml，是因为界面蛋白浓度太低，若稀释至5ml则低于bca蛋白试剂盒的检出线)；
步骤六：采用bca蛋白试剂盒对得到的界面蛋白溶液进行检测，检测方法参考bca试剂盒说明书。
本发明相对于现有技术的有益效果为：
(1)采用非离子性表面活性剂tween20作为提取剂相比于传统提取方式具有无毒无害的优点；
(2)本发明所开发的提取方法能够满足两种制备方式(高压均质及超声均质)及不同初始蛋白浓度制备的水包油型乳状液中界面蛋白的提取，有利于后续研究的需要。
附表说明
表1提取界面蛋白实测含量表
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法。
步骤一：wpi稳定的水包油型乳状液制备，将wpi粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中(10mm,ph7.0)，磁力搅拌2h，25℃,600r/min，然后将蛋白溶液置于4℃水合12h，油水比例为90％(v/v)wpi蛋白溶液和10％(v/v)的大豆油，乳液预乳化采用高速匀浆机在13600rpm，均浆2min，粗乳液再经过二次均质处理得到水包油型乳状液；
步骤二：乳液油水两相的分离，8ml新鲜乳液置于10ml螺口离心管中在15000×g，20℃条件下离心60min，倒出水相溶液将油相置于离心管中，为了除去水相中剩余的小油滴将水相溶液按上述离心条件再次离心30min，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，分别收集水相和油相；
步骤三：界面蛋白的提取，约1ml油相加入7mltween20溶液(0.5％，v/v)漩涡震荡30s，然后在15000×g，20℃的离心条件下离心60min除去上层油脂，此时混合液体为界面蛋白溶液和tween20，将混合溶液按上述条件再次离心30min除去上层剩余油脂，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，对照组采用有机试剂异丙醇处理；
步骤四：取步骤三得到的5ml混合溶液用磷酸盐缓冲溶液(10mm,ph7.0)稀释4倍后，采用超滤离心管纯化界面蛋白溶液除去tween20，离心条件为6000×g，20℃，45min；
步骤五：将纯化的浓缩界面蛋白溶液稀释至1ml；
步骤六：采用bca蛋白试剂盒对得到的界面蛋白溶液进行检测，检测方法参考bca试剂盒说明书。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法，步骤一中，所述wpi稳定的水包油型乳状液制备，二次均质指的是粗乳液再次采用高压均质(20mpa，循环2次)或是超声均质法(200w,20khz，5min)进行均质处理制备成品乳液。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法，步骤三中，所述对照组异丙醇处理方法(1ml油相加入7ml异丙醇漩涡震荡30s，然后在15000g，20℃的离心条件下离心60min，将上清液除去，将沉淀蛋白复溶于异丙醇溶剂中按上述条件再次离心30min，蛋白沉淀采用氮吹仪吹5min，最后，将蛋白复溶于1ml磷酸盐缓冲溶液中，过0.45和0.20μm水相滤膜待测)。
具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法，步骤四中，所述超滤离心管规格为15ml，3000da。
实施例1：
一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法，所述方法为：
步骤一：wpi稳定的水包油型乳状液制备，将wpi粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中(10mm,ph7.0)，磁力搅拌2h，25℃,600r/min，然后将蛋白溶液置于4℃水合12h，wpi初始浓度为10mg/ml，油水比例为90％(v/v)wpi蛋白溶液和10％(v/v)的大豆油，乳液预乳化采用高速匀浆机在13600rpm，均浆2min，粗乳液采用高压均质法制备得到乳状液成品(20mpa，循环2次)；
步骤二：乳液油水两相的分离，8ml新鲜乳液置于10ml螺口离心管中在15000×g，20℃条件下离心60min，倒出水相溶液将油相置于离心管中，为了除去水相中剩余的小油滴将水相溶液按上述离心条件再次离心30min，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，分别收集水相和油相；
步骤三：界面蛋白的提取，约1ml油相加入7mltween20溶液(0.5％，v/v)漩涡震荡30s，然后在15000×g，20℃的离心条件下离心60min除去上层油脂，此时混合液体为界面蛋白溶液和tween20，将混合溶液按上述条件再次离心30min除去上层剩余油脂，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，对照组采用有机试剂异丙醇处理；
步骤四：取步骤三得到的5ml混合溶液用磷酸盐缓冲溶液(10mm,ph7.0)稀释4倍后，采用超滤离心管纯化界面蛋白溶液除去tween20，离心条件为6000×g，20℃，45min；
步骤五：将纯化的浓缩界面蛋白溶液稀释至1ml；
步骤六：采用bca蛋白试剂盒对得到的界面蛋白溶液进行检测，检测方法参考bca试剂盒说明书。
实施例2：
一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法，所述方法为：
步骤一：wpi稳定的水包油型乳状液制备，将wpi粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中(10mm,ph7.0)，磁力搅拌2h，25℃,600r/min，然后将蛋白溶液置于4℃水合12h，wpi初始浓度为10mg/ml，油水比例为90％(v/v)wpi蛋白溶液和10％(v/v)的大豆油，乳液预乳化采用高速匀浆机在13600rpm，均浆2min，粗乳液采用超声均质法(200w,20khz，5min)，间歇时间为5s制备成品乳状液；
步骤二：乳液油水两相的分离，8ml新鲜乳液置于10ml螺口离心管中在15000×g，20℃条件下离心60min，倒出水相溶液将油相置于离心管中，为了除去水相中剩余的小油滴将水相溶液按上述离心条件再次离心30min，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，分别收集水相和油相；
步骤三：界面蛋白的提取，约1ml油相加入7mltween20溶液(0.5％，v/v)漩涡震荡30s，然后在15000×g，20℃的离心条件下离心60min除去上层油脂，此时混合液体为界面蛋白溶液和tween20，将混合溶液按上述条件再次离心30min除去上层剩余油脂，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，对照组采用有机试剂异丙醇处理；
步骤四：取步骤三得到的5ml混合溶液用磷酸盐缓冲溶液(10mm,ph7.0)稀释4倍后，采用超滤离心管纯化界面蛋白溶液除去tween20，离心条件为6000×g，20℃，45min；
步骤五：将纯化的浓缩界面蛋白溶液稀释至1ml；
步骤六：采用bca蛋白试剂盒对得到的界面蛋白溶液进行检测，检测方法参考bca试剂盒说明书。
实施例3：
一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法，所述方法为：
步骤一：wpi稳定的水包油型乳状液制备，将wpi粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中(10mm,ph7.0)，磁力搅拌2h，25℃,600r/min，然后将蛋白溶液置于4℃水合12h，wpi初始浓度为20mg/ml，油水比例为90％(v/v)wpi蛋白溶液和10％(v/v)的大豆油，乳液预乳化采用高速匀浆机在13600rpm，均浆2min，粗乳液采用高压均质法制备得到乳状液成品(20mpa，循环2次)；
步骤二：乳液油水两相的分离，8ml新鲜乳液置于10ml螺口离心管中在15000×g，20℃条件下离心60min，倒出水相溶液将油相置于离心管中，为了除去水相中剩余的小油滴将水相溶液按上述离心条件再次离心30min，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，分别收集水相和油相。
步骤三：界面蛋白的提取，约1ml油相加入7mltween20溶液(0.5％，v/v)漩涡震荡30s，然后在15000×g，20℃的离心条件下离心60min除去上层油脂，此时混合液体为界面蛋白溶液和tween20，将混合溶液按上述条件再次离心30min除去上层剩余油脂，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，对照组采用有机试剂异丙醇处理；
步骤四：取步骤三得到的5ml混合溶液用磷酸盐缓冲溶液(10mm,ph7.0)稀释4倍后，采用超滤离心管纯化界面蛋白溶液除去tween20，离心条件为6000×g，20℃，45min；
步骤五：将纯化的浓缩界面蛋白溶液稀释至1ml；
步骤六：采用bca蛋白试剂盒对得到的界面蛋白溶液进行检测，检测方法参考bca试剂盒说明书。
实施例4：
一种环境友好型提取水包油乳状液中界面蛋白的新方法，所述方法为：
步骤一：wpi稳定的水包油型乳状液制备，将wpi粉末溶于磷酸盐缓冲溶液中(10mm,ph7.0)，磁力搅拌2h，25℃,600r/min，然后将蛋白溶液置于4℃水合12h，wpi初始浓度为20mg/ml，油水比例为90％(v/v)wpi蛋白溶液和10％(v/v)的大豆油，乳液预乳化采用高速匀浆机在13600rpm，均浆2min，粗乳液采用超声均质法(200w,20khz，5min)，间歇时间为5s制备成品乳状液；
步骤二：乳液油水两相的分离，8ml新鲜乳液置于10ml螺口离心管中在15000×g，20℃条件下离心60min，倒出水相溶液将油相置于离心管中，为了除去水相中剩余的小油滴将水相溶液按上述离心条件再次离心30min，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，分别收集水相和油相；
步骤三：界面蛋白的提取，约1ml油相加入7mltween20溶液(0.5％，v/v)漩涡震荡30s，然后在15000×g，20℃的离心条件下离心60min除去上层油脂，此时混合液体为界面蛋白溶液和tween20，将混合溶液按上述条件再次离心30min除去上层剩余油脂，然后过0.45和0.20μm水相滤膜，对照组采用有机试剂异丙醇处理；
步骤四：取步骤三得到的5ml混合溶液用磷酸盐缓冲溶液(10mm,ph7.0)稀释4倍后，采用超滤离心管纯化界面蛋白溶液除去tween20，离心条件为6000×g，20℃，45min；
步骤五：将纯化的浓缩界面蛋白溶液稀释至1ml；
步骤六：采用bca蛋白试剂盒对得到的界面蛋白溶液进行检测，检测方法参考bca试剂盒说明书。
对不同初始蛋白浓度以及不同均质方式制备的水包油型乳液样品分别按照本发明方法以及异丙醇提取法对样品中界面蛋白进行提取测定，如表1，由表1可看出经过bca法测定界面蛋白提取量受不同均质方式和初始蛋白浓度制备乳液的影响。本发明方法所提取的界面蛋白含量与传统有机试剂异丙醇法提取的界面蛋白含量没有显著差异，且本发明方法适用于高压均质、超声均质和不同初始蛋白浓度制备的水包油型乳状液中界面蛋白的提取。
表1