一种高产L-高丝氨酸的重组菌及其制备方法与应用

一种高产l-高丝氨酸的重组菌及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高产l-高丝氨酸的重组菌及其制备方法与应用。


背景技术：

2.l-高丝氨酸(l-homoserine)是一种天然存在的非蛋白氨基酸，作为生物合成苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸共有的中间体而少量存在于很多物种中。由于l-高丝氨酸具有l-型-α氨基酸基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，因此，l-高丝氨酸及其衍生物作为医药中间体在药物学、生理学等方面有重要应用前景。高丝氨酸作为苏氨酸的前体物质，在代谢通路改造具有相似性。
3.目前，国内外生产l-高丝氨酸主要有化学法、酶催化和微生物发酵三种。化学法因为使用碘化物、生成硫化物，对环境不友好，且成本较高；酶催化法是利用丙酮酸和甲醛在缩醛酶和l-氨基酸脱氢酶的共同作用下生成高丝氨酸，该工艺主要问题仍然是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用价格昂贵的辅酶等；微生物发酵法具有成本低、条件温和、绿色环保等优点，但是因为高丝氨酸对于微生物生长有抑制作用，所以目前国内外仍没有较高产量高丝氨酸的报导。因此，通过代谢途径的改造获得高丝氨酸的高产菌株至关重要。
4.检索目前文章报道，利用大肠杆菌从草酰乙酸到天冬氨酸的合成途径，进一步过表达天冬氨酸激酶iii(metl)和高丝氨酸外泵蛋白rhta，经发酵优化，最终l-高丝氨酸产量达到39.54g/l(“metabolic engineering of escherichia coli w3110 for l-homoserineproduction.”process biochemistry.2016,volume 51,issue 12,pages 1973-1983)，这是目前文献报道的最高产量。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的提供一种重组菌。
6.本发明提供的重组菌，通过改造底盘宿主菌中的如下a)和b)的2个途径，得到的重组菌：
7.a)加强底盘宿主菌中富马酸到天冬氨酸的代谢途径，使从草酰乙酸到l-天冬氨酸和从富马酸到l-天冬氨酸这2个途径代谢流量1:1匹配，
8.b)加强所述底盘宿主菌中的天冬氨酸到高丝氨酸代谢途径；
9.所述a)是通过如下1)和2)的方式实现：1)提高所述底盘宿主菌中天冬氨酸氨基裂解酶aspa的活性或其编码基因的表达；2)降低或抑制所述底盘宿主菌中乙醛酸途径抑制蛋白iclr的活性或其编码基因的表达量；
10.所述底盘宿主菌为在具有天冬氨酸到苏氨酸通路的细菌中进行如下a-e全部的改造，其他基因不变得到的菌：
11.a、降低或抑制所述细菌中dna结合转录抑制因子laci的活性或其编码基因的表达
量；
12.b、降低或抑制所述细菌中高丝氨酸琥珀酰转移酶meta的活性或其编码基因的表达量；
13.c、降低或抑制所述细菌中二氨基庚酸脱羧酶lysa的活性或其编码基因的表达量；
14.d、降低或抑制所述细菌中的高丝氨酸激酶thrb的活性或其编码基因的表达量；
15.e、降低或抑制所述细菌中的可溶性吡啶核苷酸转移酶stha的活性或其编码基因的表达量。
16.上述具有天冬氨酸到苏氨酸通路的细菌可以为大肠杆菌，也可以为谷氨酸棒杆菌、芽孢杆菌和假单胞菌等，大肠杆菌具体可以为mg1655或其他k12系列的菌株，在本发明的实施例中采用的是大肠杆菌mg1655，基因型为k-12；f
_
λ
_
rph-1；mg1655菌株来源于w1485，是k12的衍生菌株，是一种经过较少改造，比较接近于“wt-野生型”的大肠杆菌工程菌株。
17.上述重组菌中，所述b是通过如下3)、4)和5)的方式实现：3)使所述底盘宿主菌表达天冬氨酸激酶i突变体thra*；4)提高所述底盘宿主菌中天冬氨酸半醛脱氢酶asd的活性或其编码基因的表达量；5)提高所述底盘宿主菌中高丝氨酸外泵蛋白rhtb的活性或其编码基因的表达量实现。
18.本发明还提供了一种重组菌，是通过将底盘宿主菌进行如下1)-5)中全部改造，得到重组菌：
19.1)提高底盘宿主菌中天冬氨酸氨基裂解酶aspa的活性或其编码基因的表达；2)降低或抑制所述底盘宿主菌中乙醛酸途径抑制蛋白iclr的活性或其编码基因的表达量；3)使所述底盘宿主菌表达天冬氨酸激酶i突变体thra*；4)提高所述底盘宿主菌中天冬氨酸半醛脱氢酶asd的活性或其编码基因的表达量；5)提高所述底盘宿主菌中高丝氨酸外泵蛋白rhtb的活性或其编码基因的表达量实现；
20.所述底盘宿主菌为在具有天冬氨酸到苏氨酸通路的细菌中进行如下a-e全部的改造，其他基因不变得到的菌：
21.a、降低或抑制所述细菌中dna结合转录抑制因子laci的活性或其编码基因的表达量；
22.b、降低或抑制所述细菌中高丝氨酸琥珀酰转移酶meta的活性或其编码基因的表达量；
23.c、降低或抑制所述细菌中二氨基庚酸脱羧酶lysa的活性或其编码基因的表达量；
24.d、降低或抑制所述细菌中的高丝氨酸激酶thrb的活性或其编码基因的表达量；
25.e、降低或抑制所述细菌中的可溶性吡啶核苷酸转移酶stha的活性或其编码基因的表达量。
26.上述重组菌中，
27.1)中，所述提高底盘宿主菌中天冬氨酸氨基裂解酶aspa的活性或其编码基因的表达为增加所述底盘宿主菌中天冬氨酸氨基裂解酶aspa编码基因的拷贝数；
28.或，2)中，所述降低或抑制底盘宿主菌中乙醛酸途径抑制蛋白iclr的活性或其编码基因的表达量为敲除所述底盘宿主菌中iclr编码基因；
29.或，3)中，所述使底盘宿主菌表达天冬氨酸激酶i突变体thra*为将所述thra*蛋白编码基因导入所述底盘宿主菌；
30.或，4)中，所述提高底盘宿主菌中天冬氨酸半醛脱氢酶asd的活性或其编码基因的表达量为增加所述底盘宿主菌中asd编码基因的拷贝数；
31.上述5)中，所述提高底盘宿主菌中高丝氨酸外泵蛋白rhtb的活性或其编码基因的表达量为将所述底盘宿主菌中rhtb编码基因的启动子替换为trc启动子，也可以替换为其他能够提高rhtb编码基因表达量的启动子。
32.或，a中，所述降低或抑制细菌中dna结合转录抑制因子laci的活性或其编码基因的表达量为敲除所述细菌中laci编码基因；
33.或，b中，所述降低细菌中高丝氨酸琥珀酰转移酶meta的活性或其编码基因的表达量为敲除所述细菌中meta编码基因；
34.或，c中，所述降低细菌中二氨基庚酸脱羧酶lysa的活性或其编码基因的表达量为敲除所述细菌中lysa编码基因；
35.或，d中，所述降低或抑制细菌中的高丝氨酸激酶thrb的活性或其编码基因的表达量为将所述细菌中thrb编码基因替换为含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc编码基因及其启动子的片段；
36.或，e中，所述降低或抑制细菌中的可溶性吡啶核苷酸转移酶stha的活性或其编码基因的表达量将所述细菌中stha编码基因替换为含有吡啶核苷酸转移酶pntab编码基因及其启动子的片段。
37.上述重组菌中，所述ppc编码基因的启动子具体可为trc启动子，也可为其他启动该基因表达的启动子；
38.所述pntab编码基因的启动子具体可为trc启动子，也可为其他启动该基因表达的启动子。
39.上述重组菌中，所述增加各个基因拷贝数或基因导入均是通过导入表达各自基因的质粒实现的；
40.或，所述敲除或所述替换均是通过crispr/cas9敲除实现的。
41.本发明另一个目的是提供一种重组菌。
42.本发明提供的重组菌为第一个目的重组菌中的底盘宿主菌。
43.本发明第3个目的是提供另一种重组菌。
44.本发明提供的另一种重组菌为将第一个目的重组菌进行如下改造：将所述重组菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因poxb替换为含有启动子的高丝氨酸激酶thrb和苏氨酸合成酶thrc片段。
45.上述片段中的启动子为trc启动子，也可以替换为其他能够启动高丝氨酸激酶thrb和苏氨酸合成酶thrc片段表达启动子。
46.本发明第4个目的是提供一种制备上述重组菌的方法。
47.本发明提供的第一个目的重组菌的方法，为按照第一个目的中的a和b的方式改造；
48.本发明提供的第二个目的重组菌的方法，为按照第一个目的中a-e全部方式改造.
49.本发明提供的第三个目的重组菌的方法，为按照第三个目的中进行改造。
50.上述重组菌在生产高丝氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
51.上述重组菌在生产苏氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
52.上述重组菌在催化葡萄糖生成高丝氨酸中的应用也是本发明保护的范围。
53.本发明第4个目的是提供一种生产高丝氨酸的方法。
54.本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌，得到高丝氨酸。
55.本发明第5个目的是提供一种生产苏氨酸的方法。
56.本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵第3个目的所述的重组菌，得到苏氨酸。
57.上述2个方法中，发酵采用的体系均为含有葡萄糖的发酵体系。
58.上述发酵采用的培养基为m9培养基或者无机盐发酵培养基，无机盐发酵培养基配方如下：1.7g/l柠檬酸，14g/l磷酸二氢钾，4g/l磷酸氢二胺，2g/l yeast extract，初始葡萄糖20g/l，硫酸镁0.6g/l，余量为水，氨水调节ph为7.0。
59.上述发酵方式为：发酵过程中维持溶氧含量在30％左右，利用氨水调节ph7.0，补料过程中葡萄糖含量控制在1g/l-0.5g/l之间；30℃条件下发酵82h；
60.葡萄糖含量低于0.5g/l时，开始流加600g/l葡萄糖溶液；葡萄糖溶液配方600g/l葡萄糖、1g/l赖氨酸、0.3g/l蛋氨酸、0.5g/l苏氨酸和2g/l硫酸镁，余量为水。
61.在大肠杆菌体内，存在两条途径可以生成l-高丝氨酸。第一条即常规草酰乙酸合成天冬氨酸路线，该途径在厌氧条件下，从葡萄糖到产物的理论转化率为1：2，但是缺少4个nadph的还原力；第二条途径即通过敲除乙醛酸循环的抑制基因iclr，增强了大肠杆菌乙醛酸循环，从而提高了富马酸的供给，过表达aspa基因，增强富马酸到天冬氨酸的合成能力，该途径从葡萄糖到l-高丝氨酸的理论转化率为1：1，且产生4个富余的nadh还原力；本发明是将上面2个途径进行整合，匹配两条途径的代谢通量为1:1，使工程菌内辅因子平衡，理论转化率可达到1.5摩尔l-高丝氨酸/1摩尔葡萄糖，从而提高l-高丝氨酸的产量(图1所示)。
62.本发明具有如下优点：1、敲除iclr基因，增强乙醛酸循环，提高富马酸供给来提高天冬氨酸族氨基酸的合成能力；2、使用l-高丝氨酸外排泵基因rthb，而非rtha基因，实现l-高丝氨酸的高水平发酵合成；3、精确调控l-天冬氨酸的2条合成途径，即从草酰乙酸oaa合成途径和从富马酸fum合成途径，使这两个合成通量达到1:1匹配，从而实现l-高丝氨酸发酵过程还原力平衡，从而使l-高丝氨酸产量最大化；本发明发现，单独增强草酰乙酸到天冬氨酸途径基因表达，不能显著提高l-高丝氨酸合成，进一步过表达高丝氨酸外泵蛋白rhtb，发酵罐上，82小时工程菌株的l-高丝氨酸的产量达到96.4g/l。
63.本发明也为生产天冬氨酸族氨基酸及其衍生物，如苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸等工业生产提供了借鉴思路，即可加强乙醛酸循环提高富马酸供给来提高天冬氨酸族氨基酸的合成能力。
附图说明
64.图1为高丝氨酸代谢途径改造流程图。
65.图2为无机盐发酵结果。
66.图3为高效液相色谱检测发酵液中氨基酸纯度。
67.图4为标准品高丝氨酸标准曲线。
68.图5为标准品苏氨酸标准曲线。
69.图6为mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd-aspa发酵液hplc检测结果。
具体实施方式
70.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
71.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
72.下述实施例中采用的crispr-cas敲除方法参考文献“multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system”；
73.下述实施例中的pcas、ptarget质粒和mg1655记载在如下参考文献“multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system；applied environmental microbiology.2015,81(7):2506-2514”。
74.ptrc99a、dh5α、卡那霉素、链霉素均购买自博迈德基因技术有限公司。其中，卡那霉素：50mg/ml，链霉素：50mg/ml。
75.下述实施例中的引物如表1所示：
76.表1基因敲除引物设计
77.[0078][0079]
实施例1、发明思路
[0080]
采用双通路1:1配比实现辅因子平衡，具体如下：
[0081]
在代谢通路改造过程中，辅因子平衡是非常重要的因素。辅因子不平衡会造成菌体生长缓慢和产物产量较低的弊端。在本发明中，以高丝氨酸和苏氨酸的代谢通路为例，在大肠杆菌体内，存在两条途径可以生成l-高丝氨酸和l-苏氨酸。第一条即常规草酰乙酸合成天冬氨酸路线，该途径在厌氧条件下，从葡萄糖到产物的理论转化率为1：2，但是缺少4个nadph的还原力：1 glucose+6 nadph+2 co2+2atp＝2 homoserine/threonine+2 nadh；第二条途径即通过敲除乙醛酸循环的抑制基因iclr，增强了大肠杆菌乙醛酸循环，从而提高了富马酸的供给，过表达aspa基因，增强富马酸到天冬氨酸的合成能力，该途径从葡萄糖到l-高丝氨酸的理论转化率为1：1，且产生4个富余的nadh还原力，1 glucose+2 nadph＝1 homoserine/threonine+2co2+5 nadh+fadh2+1 atp。本发明是将上面2个途径进行整合，匹配两条途径的代谢通量为1:1，使工程菌内辅因子平衡，理论转化率可达到1.5摩尔产物/1摩尔葡萄糖，从而提高l-高丝氨酸和l-苏氨酸的产量。在下述实施例中，敲除可溶性吡啶核苷酸转移酶stha，过表达吡啶核苷酸转移酶pntab，可以实现胞内多余nadh向nadph的转化，从而实现辅因子平衡。
[0082]
实施例2、底盘菌株的构建mg1655(
△
laci、
△
thrb::trc-ppc、
△
meta、
△
lysa、
△
stha::trc-pntab)
[0083]
利用crispr/cas9技术对mg1655染色体上基因敲除、替换或者插入，底盘菌株的构建主要包括：敲除苏氨酸代谢通路高丝氨酸激酶thrb、敲除蛋氨酸代谢旁路高丝氨酸琥珀酰转移酶meta、敲除赖氨酸代谢旁路二氨基庚酸脱羧酶lysa、敲除乙醛酸途径抑制蛋白iclr，过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc，敲除可溶性吡啶核苷酸转移酶stha，过表达吡啶核苷酸转移酶pntab，具体如下：
[0084]
一、敲除dna结合转录抑制因子laci(np_414879.3，提交日20181011)
[0085]
1、mg1655/pcas的构建
[0086]
将pcas质粒(卡那霉素抗性)导入mg1655中，因pcas质粒是温度敏感型质粒，30℃培养15h，筛选得到阳性克隆子mg1655/pcas。
[0087]
2、laci基因敲除grna质粒
[0088]
以ptarget为模板，ptarget-laci-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有laci基因识别n20的质粒，命名为ptarget-laci，该质粒中含有laci基因grna的编码基因，n20的核苷酸序列为ccgcttgctgcaactctctc。
[0089]
以mg1655基因组dna为模板，laci-up-f/r和laci-down-f/r引物扩增，分别得到538bp laci位点上游同源臂和524bp laci位点下游同源臂；再以上下游同源臂为模板进行overlappcr，pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30个循环数，扩增获得1062bp含有laci基因上下游同源臂的打靶片段(序列1)。
[0090]
将mg1655/pcas在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-laci质粒(链霉素抗性)和含有laci基因上下游同源臂的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为laci-up-f和laci-down-r，得到1062bp的为阳性克隆mg1655/pcas
△
laci；将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除。得到菌株mg1655/
△
laci。
[0091]
二、
△
thrb::trc-ppc(thrb的genbank号及提交日：np_414544.1 20181011)
[0092]
1、trc-ppc的制备
[0093]
以商业化质粒ptrc99a过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc具体方法为：
[0094]
以ncoi和hindiii对ptrc99a进行双酶切，得到4120bp的ptrc99a的酶切产物。
[0095]
以谷氨酸棒杆菌(cgmcc no.1.841)基因组dna为模板，用ppc-f：5
’-
catgccatgggtatgactgattttttacgcgatg-3’,ppc-r：5
’-
gggaagcttctagccggagttgcgcagcgcag-3’，扩增，获得2760bp的基因ppc片段(序列2)。
[0096]
上述pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃2min，72℃10min，16℃10min，30个循环数。
[0097]
将扩增获得ppc片段同样进行ncoi和hindiii双酶切，酶切结束后进行回收，将ppc片段的酶切产物与ptrc99a的酶切产物连接得到重组质粒ptrc99a-ppc。
[0098]
2、
△
thrb::trc-ppc
[0099]
以ptarget为模板，ptarget-thrb-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有thrb基因识别n20的质粒，命名为ptarget-thrb，该质粒中含有thrb基因grna的编码基因，n20核苷酸序列为gcgcacgggcgacatctggc。
[0100]
以mg1655基因组dna为模板，分别用thrb-up-f/r、thrb-down-f/r引物扩增，分别
得到515bp thrb位点上游同源臂和510bp thrb位点下游同源臂；以重组质粒ptrc99a-ppc为模板，用引物trc-ppc-f/r进行pcr扩增，得到3173bptrc-ppc表达阅读框；再以3个片段为模板进行overlappcr，pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30个循环数，扩增获得4198bp含有thrb上游-trc-ppc-thrb下游的打靶片段(序列3)。
[0101]
将上述一得到的mg1655/
△
laci在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-thrb质粒(链霉素抗性)和含有thrb上游-trc-ppc-thrb下游的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为thrb-up-f、thrb-down-r，得到4198bp的为阳性克隆mg1655/pcas
△
laci
△
thrb::trc-ppc。将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除，得到菌株mg1655/
△
laci
△
thrb::trc-ppc。
[0102]
三、
△
meta(genbank号及提交日aac76983.1 20180924)
[0103]
以ptarget为模板，ptarget-meta-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有meta基因识别n20的质粒，命名为ptarget-meta，该质粒中含有meta基因grna的编码基因，n20核苷酸序列为gtattttgcggatcattgtg。
[0104]
以mg1655基因组dna为模板，meta-up-f/r和meta-down-f/r引物扩增，分别得到553bp meta位点上游同源臂和561bp meta位点下游同源臂；再以上下游同源臂为模板进行overlappcr，pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30个循环数，扩增获得1114bp含有meta基因上下游同源臂的打靶片段(序列4)。
[0105]
将上述二得到的mg1655/
△
laci
△
thrb::trc-ppc在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-meta质粒(链霉素抗性)、含有meta基因上下游同源臂的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为meta-up-f和meta-down-r，得到1114bp的为阳性克隆mg1655/pcas
△
laci
△
thrb::trc-ppc
△
meta。将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除，得到菌株mg1655/
△
laci
△
thrb::trc-ppc
△
meta。
[0106]
四、
△
lysa(genbank号及提交日np_417315.1 20181011)
[0107]
以ptarget为模板，ptarget-lysa-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有lysa基因识别n20的质粒，命名为ptarget-lysa，该质粒中含有lysa基因grna的编码基因，n20核苷酸序列为aggctatttctgcgggcggt。
[0108]
以mg1655基因组dna为模板，lysa-up-f/r和lysa-down-f/r引物扩增，分别得到516bp lysa位点上游同源臂和543bp lysa位点下游同源臂；再以上下游同源臂为模板进行overlappcr，pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30个循环数，扩增获得1059bp含有lysa基因上下游同源臂的打靶片段(序列5)。
[0109]
将上述三得到的mg1655/
△
laci
△
thrb::trc-ppc
△
meta在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-lysa质粒(链霉素抗性)、含有lysa基因上下游同源臂的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为lysa-up-f和lysa-down-r，得到1059bp的为阳性克隆mg1655/
pcas
△
laci
△
thrb::trc-ppc
△
meta
△
lysa；将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除，得到菌株mg1655/
△
laci
△
thrb::trc-ppc
△
meta
△
lysa。
[0110]
五、
△
stha::trc-pntab(stha的genbank号及提交日np_418397.2；20181011)
[0111]
1、trc-pntab的制备
[0112]
以商业化质粒ptrc99a(购买自博迈德基因技术有限公司)过表达吡啶核苷酸转移酶pntab，具体方法为：
[0113]
以ncoi和hindiii对ptrc99a进行双酶切，得到4120bp的ptrc99a的酶切产物。
[0114]
以大肠杆菌mg1655基因组dna为模板，用：pntab-f：5
’-
catgccatgggtatgcgaattggcataccaagagaac-3’,pntab-r：5
’-
gggaagctt ttacagagctttcaggattgcatc-3’，扩增，获得2932bp的基因pntab片段(序列6)。
[0115]
上述pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃2min，72℃10min，16℃10min，30个循环数。
[0116]
将扩增获得pntab片段同样进行ncoi和hindiii双酶切，酶切结束后进行回收，将pntab片段的酶切产物与ptrc99a的酶切产物连接得到重组质粒ptrc99a-pntab。
[0117]
2、
△
stha::trc-pntab
[0118]
以ptarget为模板，ptarget-stha-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有thrb基因识别n20的质粒，命名为ptarget-stha，该质粒中含有stha基因grna的编码基因，n20核苷酸序列为gccactgttccagaagtgat。
[0119]
以mg1655基因组dna为模板，分别用stha-up-f/r、stha-down-f/r引物扩增，分别得到1186bp stha位点上游同源臂和1218bp stha位点下游同源臂；以重组质粒ptrc99a-pntab为模板，用引物trc-pntab-f/r进行pcr扩增，得到3345bptrc-pntab表达阅读框；再以3个片段为模板进行overlappcr，pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30个循环数，扩增获得5749bp含有stha上游-trc-pntab-stha下游的打靶片段(序列7)。
[0120]
将上述四得到的mg1655/
△
laci
△
thrb::trc-ppc
△
meta
△
lysa在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-stha质粒(链霉素抗性)和含有stha上游-trc-pntab-stha下游的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为stha-up-f、stha-down-r，得到5749bp的为阳性克隆mg1655/pcas
△
laci
△
thrb::trc-ppc
△
meta
△
lysa
△
stha::trc-pntab，将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除。得到菌株mg1655/
△
laci
△
thrb::trc-ppc
△
meta
△
lysa
△
stha::trc-pntab命名为mg1655/st03。
[0121]
mg1655/st03为敲除mg1655基因组中的laci、meta、lysa，且将thrb基因替换为trc-ppc，且将stha基因替换为trc-pntab，其他基因序列不变，得到的重组菌。
[0122]
七、检测高丝氨酸产量
[0123]
将mg1655/st03接入含有10g/l葡萄糖的lb培养基中，30℃条件下培养24h，收集发酵液。
[0124]
标准品为1mm、2.5mm、5mm、7.5mm、10mm的l-高丝氨酸溶液(该溶液由溶剂和溶质组
成，溶质l-高丝氨酸来自北京润泽康生物科技有限公司及产品目录号119736-88-8，溶剂为超纯水)，测定标准曲线。
[0125]
具体hplc检测方法为：25μl标准品，加入40μl 36.8mm dnfb(2,4-二硝基氟苯)，10μl 1m饱和碳酸氢钠，60℃反应30min，加入20μl 4m盐酸，离心过滤，360nm紫外光进行hplc检测。流动相为a：乙腈、b超纯水(含千分之一甲酸)。35％a65％b的配比进行检测，流速为1ml/min。
[0126]
标准品高丝氨酸出峰时间为5.458min，标准曲线如图4所示。
[0127]
取发酵液10000rpm离心收集发酵上清液，稀释相应倍数，按照上述hplc方法进行发酵上清液中高丝氨酸含量检测。
[0128]
结果在5.458min有出峰，表明发酵上清液中含有高丝氨酸，且mg1655/st03可产生0.06g/l(l表示上清液)高丝氨酸。
[0129]
实施例3、过表达thra*和asd的重组菌的制备及其提高高丝氨酸产量的应用
[0130]
一、过表达thra*和asd的重组菌的制备
[0131]
利用商业化质粒ptrc99a过表达天冬氨酸激酶i突变体thra*(1034c-t)和天冬氨酸半醛脱氢酶asd提高从天冬氨酸到高丝氨酸的通量；具体方法如下：
[0132]
以ncoi和hindiii对ptrc99a进行双酶切，收集4120bp的ptrc99a酶切产物。
[0133]
以mg165基因组dna为模板，用引物thra-f/r和asd-f/r(表2)分别扩增，得到2463bp的thra基因(核苷酸序列与序列8相比，仅1034位的碱基为c，其他碱基相同)和1104bp的asd基因(序列9)。
[0134]
将上述4120bp的ptrc99a酶切产物、2463bp的thra基因和1104bp的asd基因采用gibson无缝(gibson无缝连接试剂盒购自博迈德基因技术有限公司)连接的方法构建质粒ptrc99a-thra-asd。
[0135]
以ptrc99a-thra-asd为模板，利用quik-change pcr的方法，以引物thra-1034ct-f/r进行pcr扩增，得到质粒ptrc99a-thra*-asd，该质粒中的thra基因的1034位由胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t(命名为thra*，thra*的核苷酸序列为序列8)。
[0136]
表2
[0137][0138][0139]
将ptrc99a-thra*-asd质粒转入实施例1制备的mg1655/st03菌株中，得到重组菌mg1655/st03/ptrc99a-thra*-asd。
[0140]
该重组菌为将thra*-asd以质粒的形式在mg1655/st03菌株中过表达。
[0141]
二、发酵
[0142]
将mg1655/st03/ptrc99a-thra*-asd接入含有10g/l葡萄糖的lb培养基中，30℃条件下培养24h，得到发酵液。
[0143]
标准品为1mm、2.5mm、5mm、7.5mm、10mm的高丝氨酸溶液，测定标准曲线。
[0144]
具体hplc检测方法为：25μl标准品，加入40μl 36.8mm dnfb(2,4-二硝基氟苯)，10μl 1m饱和碳酸氢钠，60℃反应30min，加入20μl 4m盐酸，离心过滤，360nm紫外光进行hplc检测。流动相为a：乙腈、b超纯水(含千分之一甲酸)。35％a65％b的配比进行检测，流速为1ml/min。
[0145]
标准品高丝氨酸出峰时间为5.458min，标准曲线为图4。
[0146]
取发酵液10000rpm离心收集发酵上清液，稀释相应倍数，按照上述方法进行发酵上清液中高丝氨酸含量检测。
[0147]
结果在5.458min有出峰，表明发酵上清液中含有高丝氨酸，mg1655/st03/ptrc99a-thra*-asd可产生4.2g/l高丝氨酸。
[0148]
实施例4、敲除iclr和过表达aspa的重组菌的制备及其提高高丝氨酸产量的应用
[0149]
一、敲除乙醛酸途径抑制基因iclr(iclr的genbank号及提交日np_418442.220181011)得到mg1655/st04
[0150]
以ptarget为模板，ptarget-iclr-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有iclr基因识别n20的质粒，命名为ptarget-iclr，该质粒中含有iclr基因grna的编码基因，n20核苷酸序列为caatggcagtgtggcactca。
[0151]
以mg1655基因组dna为模板，iclr-up-f/r和iclr-down-f/r引物扩增，分别得到545bp iclr位点上游同源臂和525bp iclr位点下游同源臂；再以上下游同源臂为模板进行overlappcr，pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30个循环数，扩增获得1070bp含有iclr基因上下游同源臂的打靶片段(序列10)。
[0152]
将实施例2得到的mg1655/st03在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-iclr质粒(链霉素抗性)、含有iclr基因上下游同源臂的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为iclr-up-f和iclr-down-r，得到1068bp的为阳性克隆mg1655/pcas st03
△
iclr。将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除。得到菌株mg1655/st03
△
iclr。
[0153]
mg1655/st03/
△
iclr为在mg1655/st03的基础上敲除iclr，该重组菌记作mg1655/st04。
[0154]
二、ptrc99a-thra*-asd-aspa
[0155]
在好氧条件下，部分草酰乙酸流向乙醛酸途径，细胞内富马酸含量增加。
[0156]
以mg1655基因组dna为模板，以引物aspa-f/r(表3)进行pcr扩增，得到1437bp的aspa扩增产物(序列11)。
[0157]
以实施例2制备的ptrc99a-thra*-asd为模板，trc-aa-f/r(表3)为引物进行pcr扩增，得到7733bp的ptrc99a-thra*-asd线性化片段。
[0158]
将1437bp的aspa扩增产物和7733bp的ptrc99a-thra*-asd线性化扩增产物利用
gibson无缝连接的方法，成功构建质粒ptrc99a-thra*-asd-aspa。
[0159]
三、重组菌mg1655/st04/ptrc99a-thra*-asd-aspa
[0160]
将重组质粒ptrc99a-thra*-asd-aspa转入上述一制备的mg1655/st04中，得到重组菌mg1655/st04/ptrc99a-thra*-asd-aspa。
[0161]
重组菌mg1655/st04/ptrc99a-thra*-asd-aspa为将thra*-asd-aspa以质粒的形式在mg1655/st03菌株中过表达，且敲除mg1655/st03菌株中的iclr基因，其余基因不变。
[0162]
表3
[0163]
引物序列5
’-3’
aspa-fgatgcttcgtcaactggcgtaaaaggagatataccatgtcaaacaacattcgtatcaspa-rttctctcatccgccaaaacagccaagcttttactgttcgctttcatcagtatagtrc-aa-fctatactgatgaaagcgaacagtaaaagcttggctgttttggcggatgagagaatrc-aa-rgatacgaatgttgtttgacatggtatatctccttttacgccagttgacgaagcatc
[0164]
四、发酵
[0165]
将mg1655/st04/ptrc99a-thra*-asd-aspa接入含有10g/l葡萄糖的lb培养基中，30℃条件下培养24h，得到发酵液。
[0166]
标准品为1mm、2.5mm、5mm、7.5mm、10mm的高丝氨酸溶液，测定标准曲线。
[0167]
具体hplc检测方法为：25μl标准品，加入40μl 36.8mm dnfb(2,4-二硝基氟苯)，10μl 1m饱和碳酸氢钠，60℃反应30min，加入20μl 4m盐酸，离心过滤，360nm紫外光进行hplc检测。流动相为a：乙腈、b超纯水(含千分之一甲酸)。35％a65％b的配比进行检测，流速为1ml/min。
[0168]
标准品高丝氨酸出峰时间为5.458min，标准曲线为图4。
[0169]
取发酵液10000rpm离心收集发酵上清液，稀释相应倍数，按照上述方法进行发酵液中高丝氨酸含量检测。
[0170]
结果在5.458min有出峰，表明发酵上清液中含有高丝氨酸，mg1655/st04/ptrc99a-thra*-asd-aspa可产生8.4g/l高丝氨酸，高丝氨酸的产量提高2倍。
[0171]
实施例5、提高重组菌rhtb的表达量及其在提高高丝氨酸产量中的应用
[0172]
有文献报道，高丝氨酸对谷氨酸脱氢酶有抑制作用而影响细菌正常生长。为了降低高浓度l-高丝氨酸对菌体生长的影响，通过过表达l-高丝氨酸外泵蛋白rhtb来提高产物外泵效率，降低胞内l-高丝氨酸的含量，降低对菌体生长的抑制。
[0173]
一、提高重组菌rhtb的表达量制备重组菌mg1655/st05
[0174]
表4
[0175][0176][0177]
以葡萄糖作为唯一碳源时，mg1655/st04生长缓慢，高丝氨酸产量很低。利用crispr/cas9技术在mg1655/st04菌株染色体上进行高丝氨酸外泵蛋白rhtb的启动子替换，实现菌株正常生长。具体方法如下：
[0178]
以mg1655基因组dna为模板，以引物rhtb-f/r(表4)进行pcr扩增，得到621bp的rhtb扩增产物(序列12)。
[0179]
以ncoi和hindiii对ptrc99a进行双酶切，收集4120bp的ptrc99a酶切产物。
[0180]
将621bp的rhtb扩增产物和4120bp的ptrc99a酶切产物利用gibson无缝连接的方法连接，得到重组质粒ptrc99a-rhtb。
[0181]
以mg1655基因组dna为模板，分别用引物rhtb-up-f/r、rhtb-down-f/r进行扩增得到，514bp rhtb上游同源臂、547bp rhtb下游同源臂；以重组质粒ptrc99a-rhtb为模板，用引物trc-rhtb-f/r扩增，获得1034bp的trc-rhtb表达阅读框。将上述3段片段以overlappcr的方法制备得到2095bp rhtb-上游-trc-rhtb-rhtb下游打靶片段(序列13，其中trc启动子的核苷酸序列为序列13的515-1548位)。
[0182]
将pcas转入mg1655/st04中，得到mg1655/st04/pcas。
[0183]
将上述mg1655/st04/pcas在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-rhtb质粒(链霉素抗性)和rhtb-trc-rhtb打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为rhtb-up-f、rhtb-down-r，得到2095bp的为阳性克隆，将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除。得到菌株mg1655/st04
△
rhtb::trc-rhtb。
[0184]
mg1655/st04
△
rhtb::trc-rhtb为在mg1655/st04的基础上将rhtb启动子替换为trc，提高了rhtb的表达量，该重组菌记作mg1655/st05。
[0185]
将实施例3中制备的ptrc99a-thra*-asd-aspa转入mg1655/st05中，得到重组菌mg1655/st05/ptrc99a-thra*-asd-aspa。
[0186]
重组菌mg1655/st05/ptrc99a-thra*-asd-aspa为将thra*-asd-aspa以质粒的形
式在mg1655/st03菌株中过表达，且敲除mg1655/st03菌株中的iclr基因，将mg1655/st03菌株中rhtb基因的启动子替换为trc启动子，其余基因不变。
[0187]
二、发酵
[0188]
将mg1655/st05/ptrc99a-thra*-asd-aspa接入m9培养基中，30℃条件下培养24h，收集发酵液。
[0189]
标准品为1mm、2.5mm、5mm、7.5mm、10mm的高丝氨酸溶液，测定标准曲线。
[0190]
具体hplc检测方法为：25μl标准品，加入40μl 36.8mm dnfb(2,4-二硝基氟苯)，10μl 1m饱和碳酸氢钠，60℃反应30min，加入20μl 4m盐酸，离心过滤，360nm紫外光进行hplc检测。流动相为a：乙腈、b超纯水(含千分之一甲酸)。35％a65％b的配比进行检测，流速为1ml/min。
[0191]
标准品高丝氨酸出峰时间为5.458min，标准曲线为图4。
[0192]
取mg1655/st05/ptrc99a-thra*-asd-aspa发酵液10000rpm离心收集发酵上清液，稀释相应倍数。按照上述方法进行发酵样品中高丝氨酸含量检测。
[0193]
结果在5.458min有出峰，表明发酵上清液中含有高丝氨酸，高丝氨酸产量达到8.2g/l。
[0194]
将mg1655/st05/ptrc99a-thra*-asd-aspa发酵液稀释相应倍数，再600nm波长条件下，利用分光光度计测定生物量，记作od600，结果mg1655/st05/ptrc99a-thra*-asd-aspa菌体生物量(od600 5.2)比mg1655/st04(od600 1.3)提高了4倍。
[0195]
m9培养基成分为：10g/l葡萄糖、12.8g/l磷酸二氢钠、3.0g/l磷酸二氢钾、0.5g/l氯化钠、1.0g/l氯化铵、0.492g/l硫酸镁、0.022g/l氯化钙。
[0196]
实施例6、无机盐培养基发酵条件优化
[0197]
将实施例4得到的重组菌mg1655/st05/ptrc99a-thra*-asd-aspa在无机盐培养基进行发酵优化，发酵过程中维持溶氧含量在30％左右，利用氨水调节ph7.0。补料过程中葡萄糖含量控制在1g/l-0.5g/l之间；30℃条件下发酵82h，收集发酵液。
[0198]
无机盐发酵培养基配方如下：1.7g/l柠檬酸，14g/l磷酸二氢钾，4g/l磷酸氢二胺，2g/l yeast extract，初始葡萄糖20g/l，硫酸镁0.6g/l，余量为水，氨水调节ph为7.0。
[0199]
利用sba定糖仪检测发酵体系中葡萄糖含量低于0.5g/l时，开始流加600g/l葡萄糖溶液；葡萄糖溶液配方600g/l葡萄糖、1g/l赖氨酸、0.3g/l蛋氨酸、0.5g/l苏氨酸和2g/l硫酸镁，余量为水。
[0200]
l-高丝氨酸检测方法同实施例4，结果如图2所示，mg1655/st05/ptrc99a-thra*-asd-aspa产生的高丝氨酸产量达到96.4g/l。
[0201]
hplc检测发酵液中l-高丝氨酸的纯度，流动相为a：乙腈、b超纯水(含千分之一甲酸)；35％a65％b的配比进行检测，流速为1ml/min。
[0202]
结果如图3所示，高丝氨酸出峰时间为5.458min，纯度较高，未明显检测到其他氨基酸杂质，有利于简化下游的分离提纯工艺。
[0203]
在发酵过程中高丝氨酸的生产效率为1摩尔l-高丝氨酸/1摩尔葡萄糖。
[0204]
上述高丝氨酸的生产效率＝(高丝氨酸生成量g/其相对分子质量)/(葡萄糖添加量g/其相对分子质量)
[0205]
实施例7、高产l-苏氨酸菌株的构建和发酵条件优化
[0206]
一、敲除丙酮酸氧化酶基因poxb(poxb的genbank号及提交日np_415392.120181011)、过表达高丝氨酸激酶thrb(thrb的genbank号及提交日np_414544.120181011)和苏氨酸合成酶thrc(thrb的genbank号及提交日np_414545.1 20181011)得到mg1655/st06
[0207]
1、trc-thrbc的制备
[0208]
以商业化质粒ptrc99a过表达高丝氨酸激酶thrb和苏氨酸合成酶thrc的具体方法为：
[0209]
以ncoi和hindiii对ptrc99a进行双酶切，得到4120bp的ptrc99a的酶切产物。
[0210]
以大肠杆菌mg1655基因组dna为模板，用thrb-f：5
’-
catgccatgg atggttaaagtttatgccccgg-3’,thrc-r：5
’-
gggaagcttttactgatgattcatcatcaa-3’，扩增，获得2220bp的基因thrbc片段。
[0211]
上述pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃2min，72℃10min，16℃10min，30个循环数。
[0212]
将扩增获得thrbc片段同样进行ncoi和hindiii双酶切，酶切结束后进行回收，将thrbc片段的酶切产物与ptrc99a的酶切产物连接得到重组质粒ptrc99a-thrbc。
[0213]
2、
△
poxb::trc-thrbc
[0214]
以ptarget为模板，ptarget-poxb-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有poxb基因识别n20的质粒，命名为ptarget-poxb，该质粒中含有poxb基因grna的编码基因，n20核苷酸序列为ggcgctgaagcacaacttag。
[0215]
以mg1655基因组dna为模板，分别用poxb-up-f/r、poxb-down-f/r引物扩增，分别得到825bp poxb位点上游同源臂和830bp thrb位点下游同源臂；以重组质粒ptrc99a-thrbc为模板，用引物trc-thrbc-f/r进行pcr扩增，得到2633bptrc-thrbc表达阅读框；再以3个片段为模板进行overlappcr，pcr程序如下：98℃5min，98℃30s，55℃30s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30个循环数，扩增获得4288bp含有poxb上游-trc-thrbc-poxb下游的打靶片段(序列14，其中第826-943位为trc，第944-3163位为thrbc)。
[0216]
将mg1655/pcas/st05(将pcas质粒转入mg1655/st05得到的菌)在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-poxb质粒(链霉素抗性)和含有poxb上游-trc-thrbc-poxb下游的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为poxb-up-f、poxb-down-r，得到4198bp的为阳性克隆mg1655/pcas
△
poxb::trc-thrbc。将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除，得到菌株mg1655/
△
poxb::trc-thrbc。该菌株记作mg1655/st06。
[0217]
mg1655/st06为将大肠杆菌mg1655/st05基因组中的poxb基因替换为trc-thrbc，其他序列不变。
[0218]
表5
[0219]
引物序列5
’-3’
ptarget-poxb-factagtggcgctgaagcacaacttag gttttagagctagaaatagcaagptarget-poxb-rctaaaacctaagttgtgcttcagcgcc actagtattatacctaggactgagpoxb-up-fcagctgctccgccatccaggcagc
poxb-up-rtatttgccagaaccgttatgatgaaagggtggcatttcccgtcatatrc-thrbc-ftatgacgggaaatgccaccctttcatcataacggttctggcaaatatrc-thrbc-racattcaggagatggagaaccatttgtcctactcaggagagcgtpoxb-down-facgctctcctgagtaggacaaatggttctccatctcctgaatgtpoxb-down-rgcggtgattatctctggctttcg
[0220]
二、重组菌mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd
[0221]
将重组质粒ptrc99a-thra*-asd转入上述一制备的mg1655/st06中，得到重组菌mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd。
[0222]
重组菌mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd为将thra*-asd以质粒的形式在mg1655/st05菌株中过表达，且将大肠杆菌mg1655/st05基因组中的poxb基因替换为trc-thrbc，其他序列不变。
[0223]
三、重组菌mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd-aspa
[0224]
将重组质粒ptrc99a-thra*-asd-aspa转入上述一制备的mg1655/st06中，得到重组菌mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd-aspa。
[0225]
重组菌mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd-aspa为将thra*-asd-aspa以质粒的形式在mg1655/st05菌株中过表达，且将大肠杆菌mg1655/st05基因组中的poxb基因替换为trc-thrbc，其他序列不变。
[0226]
四、无机盐高密度发酵生产l-苏氨酸
[0227]
将mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd-aspa和mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd按照实施例6的方法进行无机盐高密度发酵，得到发酵液。
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发酵过程中维持溶氧含量在30％左右，利用氨水调节ph7.0。补料过程中葡萄糖含量控制在1g/l-0.5g/l之间；30℃条件下发酵82h，收集发酵液。
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无机盐发酵培养基配方如下：1.7g/l柠檬酸，14g/l磷酸二氢钾，4g/l磷酸氢二胺，2g/l yeast extract，初始葡萄糖20g/l，硫酸镁0.6g/l，余量为水，氨水调节ph为7.0。
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利用sba定糖仪检测发酵体系中葡萄糖含量低于0.5g/l时，开始流加600g/l葡萄糖溶液；葡萄糖溶液配方600g/l葡萄糖、1g/l赖氨酸、0.3g/l蛋氨酸、0.5g/l苏氨酸和2g/l硫酸镁，余量为水。
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标准品为1mm、2.5mm、5mm、7.5mm、10mm的苏氨酸溶液(该溶液由溶质和溶剂组成，溶质l-苏氨酸购买于北京伊诺凯科技有限公司，产品目录号cas：72-19-5，溶剂为水)，测定标准曲线。
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具体hplc检测方法为：25μl标准品，加入40μl 36.8mm dnfb(2,4-二硝基氟苯)，10μl 1m饱和碳酸氢钠，60℃反应30min，加入20μl 4m盐酸，离心过滤，360nm紫外光进行hplc检测。流动相为a：乙腈、b超纯水(含千分之一甲酸)。35％a65％b的配比进行检测，流速为1ml/min。
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标准品苏氨酸出峰时间为6.890min，标准曲线如下图5。
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取各个菌的发酵液分别10000rpm离心收集发酵上清液，稀释相应倍数，按照上述方法进行发酵液中高丝氨酸含量检测。
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结果均在6.890min有出峰，表明发酵上清液中均含有l-苏氨酸，mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd可产生68g/l l-苏氨酸，mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd-aspa可产
生91g/l l-苏氨酸。
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mg1655/st06/ptrc99a-thra*-asd-aspa发酵液hplc检测结果如图6所示，苏氨酸出峰时间为6.890min，纯度较高，未明显检测到其他氨基酸杂质，有利于简化下游的分离提纯工艺。在发酵过程中苏氨酸的生产效率为1摩尔l-苏氨酸/1摩尔葡萄糖。
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上述苏氨酸的生产效率＝(苏氨酸生成量g/其相对分子质量)/(葡萄糖添加量g/其相对分子质量)
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实施例中l-高丝氨酸和l-苏氨酸的产量提升均证明了代谢途径中辅因子平衡的重要性，按照设计的1:1等量辅因子通路，可实现产物的高产。