一种海洋源锁掷孢酵母冻干制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种冻干制剂，尤其是涉及一种海洋源锁掷孢酵母冻干制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

海洋酵母是生活在海洋中酵母的统称，长期处于低温、高盐、高压的生态环境中，更能耐受果蔬采后复杂的贮运环境，是一种新型的生物拮抗菌来源。海洋源锁掷孢酵母（sporidioboluspararoseus）是分离自海洋中的一株对果蔬采后常见病原菌灰葡萄孢霉具有拮抗作用的酵母。研究表明，海洋源锁掷孢酵母安全稳定、不产毒素、能在果蔬表面生长定植、能够耐受低温贮藏环境，对果蔬采后病害具有良好的生物防治效果。因此，海洋源锁掷孢酵母是一株具有发展潜力的生物防治菌株，制备成生防制剂将推进其在果蔬采后病害防治中的应用。

生防菌通常制备成液体型制剂和固体型制剂，液体型制剂制备方法简单方便、不需要干燥，但是不便于保存和运输，而固体型制剂虽然干燥成本高，但保存时间长、不易染杂菌、贮存和运输成本低，目前国际市场上商业化的生防产品都是固体型制剂。其中，真空冷冻干燥是目前研究较多的活性拮抗菌固体制剂的制备方法，真空冷冻干燥可以将溶液或湿的物料在低温下冻结成固态，然后在真空条件下使水分子直接升华成气态，最终达到脱水干燥的目的。然而，菌株在冻干的过程中容易丧失活性，为了增强菌株在冻干过程中的存活性能，在冷冻干燥时加入适宜的保护剂，可以在很大程度上减轻或避免冷冻干燥对细胞的损伤，提高存活率。然而，添加单一的保护剂不足以保护菌体避免冷冻干燥过程中的损伤，若能将一些合适的保护剂复配使用，添加到海洋源锁掷孢酵母悬浮液中，制备出高活性的冻干制剂，将有助于实现海洋源锁掷孢酵母开发成商业化的生防菌剂。随着人们对果蔬农药残留和食品安全的关注，为了确保果蔬的卫生和安全，生物防治作为一种安全有效、绿色环保的病害防治技术的应用愈发重要，因此，存活率高、生物防治效果佳的海洋源锁掷孢酵母冻干制剂的开发必然会推动生物防治技术的应用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种菌株存活率高、生物防治效果佳的海洋源锁掷孢酵母冻干制剂及其制备方法和应用，用于减少果蔬采后的病害，有效降低苹果黑腐病、青霉病和灰霉病的发生率。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海洋源锁掷孢酵母冻干制剂，由含有保藏编号为cgmccno.15618的海洋源锁掷孢酵母（sporidioboluspararoseus）zmy-1的酵母悬浮液、脱脂乳粉、聚乙二醇和海藻糖组成，所述的脱脂乳粉添加量为酵母悬浮液质量的0.75-2.25%，所述的聚乙二醇的添加量为酵母悬浮液质量的0.1875-0.2500%，所述的海藻糖的添加量为酵母悬浮液质量的3.75-5.25%。

优选的，所述的脱脂乳粉添加量为酵母悬浮液质量的1.50%，所述的聚乙二醇的添加量为酵母悬浮液质量的0.1875%，所述的海藻糖的添加量为酵母悬浮液质量的5.25%。

优选的，所述的酵母悬浮液中海洋源锁掷孢酵母的浓度为1×10⁸cells/ml。

上述海洋源锁掷孢酵母冻干制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将保藏编号为cgmccno.15618的海洋源锁掷孢酵母（sporidioboluspararoseus）接种于nydb培养基中，28℃，200rpm振荡培养48小时，获得发酵液；

（2）将步骤（1）所得的发酵液离心取沉淀，用质量浓度0.9%的nacl溶液制成浓度为1×10⁸cells/ml的酵母悬浮液，加入酵母悬浮液质量0.75-2.25%的脱脂乳粉、0.1875-0.2500%的聚乙二醇和3.75-5.25%的海藻糖，混合后经过冷冻干燥工艺，即获得海洋源锁掷孢酵母冻干制剂。

上述冷冻干燥工艺过程如下：首先置于-80℃预冷冻3h，然后置于真空冷冻干燥机中进行冻干，设置真空度15pa，冷冻干燥温度为-50℃，真空冷冻干燥12h。

上述海洋源锁掷孢酵母冻干制剂在制备苹果黑腐病防治药剂方面的应用。

上述海洋源锁掷孢酵母冻干制剂在制备苹果青霉病防治药剂方面的应用。

上述海洋源锁掷孢酵母冻干制剂在制备苹果灰霉病防治药剂方面的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种海洋源锁掷孢酵母冻干制剂及其制备方法和应用，该制备方法工艺简便，所得的锁掷孢酵母冻干制剂具有菌株存活率高、生防效果好的优点，应用在水果上可有效减少苹果采后的多种病害，黑腐病的发生率减少了26.7%，青霉病的发生率减少了95.6%，灰霉病的发生率减少了73.3%。本发明的海洋源锁掷孢酵母冻干制剂可应用于减少果蔬采后的病害，减少或者取代化学杀菌剂的使用，减少农药残留。

上述海洋源锁掷孢酵母菌株，该菌株zmy-1株，分类命名为锁掷孢酵母（sporidioboluspararoseus），于2018年04月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.15618。

附图说明

图1为冻干保护剂配方的单因素实验结果；

图2为单一冻干保护剂和复配保护剂的冻干存活率的比较结果图；

图3为海洋源锁掷孢酵母和其他菌株在添加本发明的复配保护剂冷冻干燥后的存活率比较结果图；

图4为海洋源锁掷孢酵母冻干制剂对苹果病害的防治作用的结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

一种海洋源锁掷孢酵母冻干制剂，由含有保藏编号为cgmccno.15618的海洋源锁掷孢酵母sporidioboluspararoseuszmy-1的悬浮液、脱脂乳粉、聚乙二醇和海藻糖组成，脱脂乳粉添加质量为酵母悬浮液的0.75-2.25%，聚乙二醇的添加质量为酵母悬浮液的0.1875-0.2500%，海藻糖的添加质量为酵母悬浮液的3.75-5.25%。其中酵母悬浮液中海洋源锁掷孢酵母的浓度为1×10⁸cells/ml，其制备方法包括以下步骤：

（1）将保藏编号为cgmccno.15618的海洋源锁掷孢酵母接种于nydb培养基中，28℃，200rpm振荡培养48小时，获得发酵液；

（2）将步骤（1）所得的发酵液离心取沉淀，用质量浓度0.9%的nacl溶液制成浓度为1×10⁸cells/ml的酵母悬浮液，加入酵母悬浮液质量0.75-2.25%的脱脂乳粉、0.1875-0.2500%的聚乙二醇和3.75-5.25%的海藻糖，混合后经过冷冻干燥工艺，即获得海洋源锁掷孢酵母冻干制剂。

二、对比试验

1、冻干保护剂的单因素试验

海洋源锁掷孢酵母冻干制剂的制备方法同上述具体实施例一，其区别在于：

脱脂乳粉组：固定聚乙二醇添加质量为0.25%、海藻糖添加质量为2.25%，添加不同质量浓度的脱脂乳粉，添加的质量浓度水平分别为0%、0.75%、1.50%、2.25%、3.00%、3.75%。

聚乙二醇组：固定脱脂乳粉添加质量为1.50%、海藻糖添加质量为2.25%，添加不同质量浓度的聚乙二醇，添加的质量浓度水平分别为0%、0.0625%、0.125%、0.1875%、0.25%。

海藻糖组：固定脱脂乳粉添加质量为1.5%、聚乙二醇添加质量为0.2500%，添加不同质量浓度的海藻糖，添加的质量浓度水平分别为0%、0.75%、1.50%、2.25%、3.00%、3.75%、4.50%、5.25%。

按照单因素设计的试验得到加入不同浓度保护剂的混合悬浮液，进行冷冻干燥，首先置于-80℃预冷冻3h，然后置于真空冷冻干燥机中进行冻干，设置真空度15pa，冷冻干燥温度为-50℃，真空冷冻干燥12h。

将单因素实验组制备的海洋源锁掷孢酵母冻干粉进行存活率测定，用平板法测定冻干后锁掷孢酵母的活菌数，计算各实验组冻干粉的存活率。冻干存活率（%）=冻干后活菌数/冻干前活菌数×100。结果如图1所示，单因素试验中脱脂乳粉、聚乙二醇和海藻糖这3种保护剂复合对海洋源锁掷孢酵母冷冻干燥的存活率起到明显的改善作用，提高了其冷冻干燥的存活率。图1a表明，当固定聚乙二醇浓度为0.25%、海藻糖浓度为2.25%时，脱脂乳粉的浓度在0-3.75%之间，只有脱脂乳粉浓度为1.50%时，海洋源锁掷孢酵母冻干存活率最高，达59.6%。图1b表明，当固定脱脂乳粉浓度为1.50%、海藻糖浓度为2.25%时，聚乙二醇的浓度从0-0.25%变化时，聚乙二醇浓度为0.1875%时海洋源锁掷孢酵母的冻干存活率最高，达45.8%。图1c表明，当固定脱脂乳粉浓度为1.50%、聚乙二醇浓度为0.25%时，海藻糖添加浓度为0-5.25%，海洋源锁掷孢酵母的冻干存活率随着海藻糖浓度的升高而升高，当海藻糖添加量为4.50%时，存活率保持平稳，达到64.3%，与添加5.25%浓度的海藻糖无显著差异。因此，单因素试验筛选出了这3种保护剂的最适浓度如下：脱脂乳粉最适浓度为1.50%、聚乙二醇的最适浓度为0.1875%、海藻糖的最适浓度为4.5%。

2、正交试验设计

根据单因素试验的结果，选取脱脂乳粉、聚乙二醇、海藻糖这3个因素最适的3个水平（表1），设计一个3因素3水平的正交试验，l9（3⁴）正交试验表如表2所示。按照表2设计，配置不同浓度的保护剂，与酵母悬浮液混合，进行冷冻干燥，首先置于-80℃预冷冻3h，然后置于真空冷冻干燥机中进行冻干，设置真空度15pa，冷冻干燥温度为-50℃，真空冷冻干燥12h，并测定和计算冻干存活率。

表1复配保护剂的因素水平表

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表2正交实验设计及实验结果

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如表2所示，通过正交试验得到最佳复合保护剂配方组合是a2b1c3，即1.50%脱脂乳粉+0.1875%聚乙二醇+5.25%海藻糖，加入该复合保护剂进行对海洋源锁掷孢酵母进行冷冻干燥，冻干存活率可达93.9%。当采用单一的1.50%脱脂乳粉、0.1875%聚乙二醇或5.25%海藻糖，作为保护剂对海洋源锁掷孢酵母进行冷冻干燥，冻干存活率结果如图2所示，其中5.25%浓度的海藻糖表现出较好的保护效果，冷冻干燥的酵母存活率可以达到33.7%；而1.5%浓度的脱脂乳粉和0.1875%的聚乙二醇保护效果较差，都＜1%，结果表明1.50%脱脂乳粉+0.1875%聚乙二醇+5.25%海藻糖作为复合保护剂时，冻干存活率远大于3种单一成分单独使用时的存活率之和。

3、专一性对比

本研究对比了其他的冻干保护剂配方，制成的海洋源锁掷孢酵母的存活率如表3所示，许多已报道的保护剂配方并不适合海洋源锁掷孢酵母sporidioboluspararoseuszmy-1。本发明中采用1.50%的脱脂乳粉、0.1875%的聚乙二醇和5.25%的海藻糖混合后制成的复合保护剂进行冷冻干燥，sporidioboluspararoseuszmy-1冻干存活率可达93.9%。

表3采用不同的冻干保护剂冷冻干燥时海洋源锁掷孢酵母的存活率

备注：以上添加量以酵母悬浮液为质量百分数基数。

进一步将上述脱脂乳粉1.50%、聚乙二醇0.1875%、海藻糖5.25%组合的复合保护剂应用于其他的微生物，如酵母和乳酸菌，供试的菌株添加该复合保护剂后的采用同一工艺进行冷冻干燥，其冻干存活率如下图3所示，其中隐球酵母的冻干存活率为82.6%，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的冻干存活率分别为83%和59%。

三、应用实施例

将本发明中的制备的海洋源锁掷孢酵母冻干制剂通过复水应用在水果上，结果表明其和冻干前的酵母表现出同样的生防效力。

如图4所示，对照组为水；保护剂组为按照冻干保护剂的配方脱脂乳粉1.50wt%、聚乙二醇0.1875wt%和海藻糖5.25wt%组合配置的水溶液；海洋源锁掷孢酵母冻干制剂能有效的抑制苹果采后多种病害包括黑腐病、青霉病和灰霉病的发生与发展，使黑腐病的发生率减少了26.7%，青霉病的发生率减少了95.6%，灰霉病的发生率减少了73.3%，显著降低了果实的发病率（如图4a）和病斑直径（如图4b），具有很好的生物防治效果，冻干前后的酵母在生防效力上没有显著性差异。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。