产芝麻香菌株及其在白酒生产中的应用的制作方法

本申请是申请号为cn201910023715.1，申请日为2019年1月10日，发明名称为“产芝麻香菌株及其在白酒生产中的应用”的分案申请。

本发明涉及产芝麻香菌株及其在白酒生产中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

芝麻香型白酒起源于20世纪60年代，是在传承我国白酒千百年酿造技术的基础上创新开发出的白酒新香型。芝麻香型白酒集成了浓、清、酱3种香型白酒生产技术，具有“芝麻香突出，诸味协调，丰满细腻，回味悠长”的风格特点。其典型的炒芝麻的香气特征受到消费者的喜爱。前期研究发现硫化物与构成芝麻香型白酒典型香气特征有关，包括糠硫醇等。

但是，目前对芝麻香典型香气以及糠硫醇产生来源并不清晰，对于生产芝麻香型白酒，以及提高芝麻香型白酒中芝麻香典型香气都具有阻碍作用。本团队研究发现半胱氨酸是糠硫醇的重要前体物质，因此，获得芝麻香型白酒中典型芝麻香香气糠硫醇产生相关微生物，尤其是高产半胱氨酸的微生物，对其进行白酒生产应用，有助于生产优质芝麻香型白酒，促进芝麻香型白酒产业的快速发展。

白酒生产过程存在高酸、高温、高醇等环境特征，微生物要在此环境中发挥功能必须具有耐受这些恶劣环境的特点；同时，白酒生产是一个多菌种共同发酵的过程，微生物之间的互作也会影响到微生物功能的发挥。例如，前期研究发现芽孢杆菌与酵母共存时会被酿酒酵母抑制，生长会受到抑制，发酵72h后，生物量降至10²cfu/ml以下(jindmicrobiolbiotechnol(2015)42:1601–1608)。从而影响其功能发挥。因此，筛选具有合成硫化物以及产芝麻香香气特征，并具有耐受白酒酿造恶劣环境、耐受酿酒酵母抑制的微生物，对于提高白酒品质乃至其他发酵食品品质具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明要解决的一个技术问题是提供高效产生芝麻香特征物质的芽孢杆菌，来源于中国白酒高温大曲。

在本发明的一种实施方式中，所述芽孢杆菌为死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002，其分类命名为死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)，已于2018年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，其保藏编号为cgmccno.16704。

上述菌株具有如下特征：

(1)能耐受60℃高温环境；

(2)耐受ph4、浓度为12％的乙醇环境；

(3)能够利用麸皮、大麦、小麦、高粱中一种或其组合制成的液体或固态培养基，

产生明显的芝麻香香气；

(4)能够利用可发酵麸皮、大麦、小麦、高粱一种或其组合制成的液体和固态培养基，产生硫化物，包括半胱氨酸、糠硫醇、同时产生甲硫醇、二甲基三硫、二甲基二硫、3-甲硫基丙醇、3-甲硫基丙醛。

本发明的第二个目的是提供含有所述芽孢杆菌的组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001和食品学上可接受的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物含有死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002和食品学上可接受的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是芽孢杆菌制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述制剂含有所述的芽孢杆菌活细胞和细胞保护剂。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物含有菌浓≥1×10⁵cfu/g或菌浓≥1×10⁵cfu/ml的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物含有菌浓≥1×10⁵cfu/g或菌浓≥1×10⁵cfu/ml的死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是含有菌浓≥1×10⁵cfu/g枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001或死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002的酒曲。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001和死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002的酒曲。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是含有菌浓≥1×10⁵cfu/g枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001或死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002的酒醅。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是含有枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001和死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002的酒醅。

本发明的第三个目的是提供一种培养所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001或死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002的方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在液体培养基中，于30～60℃，0～200rpm，发酵2～10天。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在固体培养基中，于30～60℃，发酵5～15天。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是与酿酒酵母共培养，在共培养体系中，菌株不受酿酒酵母的抑制，生长良好，培养24h生物量最高可达到1.51×10⁷cfu/ml。

在本发明的一种实施方式中，所述共培养是在以粮食为原料的培养体系中共培养。

在本发明的一种实施方式中，所述共培养是在堆积后的酒醅中进行。

本发明的第四个目的是提供所述菌株在中国白酒酿造中的应用工艺。

在本发明的一种实施方式中，所述工艺是将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001和死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002以液体培养物的形式接种于白酒大曲、堆积醅或窖池发酵酒醅中。

在本发明的一种实施方式中，所述工艺是将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001和死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002以固体培养物的形式接种于白酒大曲、堆积醅或窖池发酵酒醅中。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是将菌株单独接种，接种量为1～200ml/kg或1～200g/kg。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是将菌株与其他微生物混合接种；所述液体培养物总接种量为1～200ml/kg，菌株固体培养物总接种量为1～200g/kg。

本发明还要求保护所述芽孢杆菌在其它食品发酵中提升食品或酒精饮品风味品质方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是提高白酒中硫化物含量。

在本发明的一种实施方式中，所述硫化物包括但不限于糠硫醇，二甲基二硫、二甲基三硫、甲硫醇、3-甲硫基丙醇或3-甲硫基丙醛。

有益效果：本发明提供了芝麻香高效产生芽孢杆菌，该菌能耐受60℃的高温；该菌应用于中国白酒酿造中，生产的白酒品质提高，芝麻香香气典型性增强，生产的白酒中的硫化物含量提高，包括糠硫醇，二甲基二硫、二甲基三硫、甲硫醇、3-甲硫基丙醇、3-甲硫基丙醛。本发明针对中国白酒酿造中存在的主要问题，获得了高温大曲产芝麻香的功能芽孢杆菌，并提供了功能菌株在中国白酒中的应用工艺，对于提升白酒品质，以及实现白酒行业技术水平与行业竞争力的提升具有重要的意义。

生物材料保藏

一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001，其分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，已于2018年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为cgmccno.16703。

一株死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002，其分类命名为死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)，已于2018年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为cgmccno.16704。

附图说明

图1为芽孢杆菌产半胱氨酸含量；0为地衣芽孢杆菌14580模式株，1-20为筛选菌株；其中19为枯草芽孢杆菌cgmccno.16703；20为死谷芽孢杆菌cgmccno.16704。

具体实施方式

实施例1：产芝麻香芽孢杆菌菌株的分离筛选

本发明涉及的菌株来源于芝麻香型白酒生产高温大曲。

步骤1：称取5g粉碎均匀的大曲样品于20ml无菌生理盐水中，150r/min振荡30min。取菌悬液经适当稀释后，在营养琼脂培养基平板上涂布，37℃培养1d。挑取生长较好、性状不同菌落接种于肉汤琼脂斜面，作为筛选用菌株。

步骤2：将步骤1筛选得到的菌株分别接种于装有100ml液体种子培养基(按g/l计，牛肉膏10，葡萄糖10，nacl5，ph7.0)的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，再分别以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的100ml大麦和小麦混合浸出液体培养基的250ml摇瓶中，37℃静置培养6d。

大麦和小麦混合浸出液体培养基：大麦和小麦分别100g，加水800ml，于100℃蒸煮10min。过滤取上清液，ph6.2，1×10⁵pa灭菌20min。

步骤3：对发酵液中的芝麻香代表性风味糠硫醇的前体物半胱氨酸含量进行检测，结果如图1所示，共筛选获得20株产半胱氨酸能力较强的菌株。对上述菌株的发酵液风味物质进行感官评价，每个样品由四名品评人员分三次进行品评。品评人员由国家评酒委员和从事白酒研究工作并经过半年闻香训练的人员组成。在20℃的品评环境下，评价发酵液的芝麻香。芝麻香典型性按浓度强弱分为4-5分(芝麻香较强)，2-3分(芝麻香一般)，1份(芝麻香较弱)，0分(无芝麻香)。最终筛选得到2株半胱氨酸含量较高且具有较强芝麻香的菌株。

将2株菌株分别进行菌种鉴定，提取菌株基因组，对其16srdna序列pcr并测序，经过blast比对鉴定其种属，结果显示，菌株分别为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)，分别命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)jnqt001和死谷芽孢杆菌(bacillusvallismortis)jnqt002，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏。

实施例2：菌株耐高温特性的测定

将实施例1筛选得到的2株菌分别接种于lb培养基，分别在40℃、50℃、60℃、70℃下培养24h，结果显示，菌株在60℃下生长良好，培养24h后菌浓(od600)达1.8以上。采用地衣芽孢杆菌14580模式株作为对照，在60℃培养相同的时间，结果显示，od600仅为0.2。

实施例3：菌株耐乙醇特性的测定

将实施例1筛选得到的2株菌株分别接种于含2％、4％、6％、8％、12％、14％、16％乙醇的lb培养基，分别在37℃下培养24h，结果显示，菌株在乙醇浓度不高于12％的环境下生长良好，培养24h后菌浓(od600)达3.6以上。采用地衣芽孢杆菌14580模式株作为对照，在含乙醇浓度为12％的环境下培养相同时间，结果显示，培养24h后菌浓(od600)仅为0.3。

实施例4：菌株耐酸性环境的性能测定

将实施例1筛选得到的2株菌株分别接种于ph为3、4、5、6的lb培养基(采用hcl调节ph)，分别在37℃下培养24h，结果显示，菌株在ph为4的环境下生长良好，培养24h后菌浓(od600)达3.2以上。采用地衣芽孢杆菌14580模式株作为对照，在ph为4的环境下培养相同时间，结果显示，od600仅为0.3。

实施例5：产芝麻香枯草芽孢杆菌利用大麦和小麦混合浸出液体培养基发酵

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环枯草芽孢杆菌jnqt001于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得液体种子培养物。

种子液培养基(g/l)：牛肉膏10，葡萄糖10，nacl5，ph7.0，1×10⁵pa灭菌20min。

步骤2：一级液体种子培养物分别以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的100ml大麦和小麦混合浸出液体培养基的250ml摇瓶中，37℃静置培养6d。

大麦和小麦混合浸出液体培养基：大麦和小麦分别100g，加水800ml，于100℃蒸煮10min。过滤取上清液，ph6.2。1×105pa灭菌20min。

步骤3：对菌株的发酵产物进行分析，分析方法为：取上述发酵液以8000rpm离心8min。取8ml上清液进行hs-spmegc-pfpd分析，采用标准品及其标准曲线进行成分定性与定量，结果显示，发酵液中的风味成分包括：半胱氨酸35.7mg/l，糠硫醇2.1μg/l，二甲基二硫140.3μg/l、二甲基三硫20.8μg/l、甲硫醇17.3μg/l、3-甲硫基丙醇4.8μg/l、3-甲硫基丙醛5.8μg/l。

实施例6：产芝麻香死谷芽孢杆菌利用大麦和小麦混合浸出液体培养基发酵

具体实施方式同实施例5，区别在于，将枯草芽孢杆菌替换为死谷芽孢杆菌。采用相同方法对死谷芽孢杆菌jnqt002的发过酵产物进行分析，结果显示：发酵液中的风味成分包括：半胱氨酸33.6mg/l，糠硫醇2.7μg/l，二甲基二硫87.3μg/l、二甲基三硫27.8μg/l、甲硫醇15.4μg/l、3-甲硫基丙醇2.4ug/l、3-甲硫基丙醛3.2μg/l。

实施例7：产芝麻香枯草芽孢杆菌利用麸皮固态培养基发酵

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环枯草芽孢杆菌jnqt001于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得液体种子培养物。

种子液培养基(g/l)：牛肉膏10，葡萄糖10，nacl5，ph7.0，1×10⁵pa灭菌20min。

步骤2：将一级液体种子培养物分别以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的100g麸皮固态培养基的三角瓶中，37℃培养10d。

麸皮固体培养基：采用粉碎后的麸皮，添加40％的水，100℃蒸煮30min。

步骤3：对枯草芽孢杆菌jnqt001发酵后的产物中香气成分进行分析，发酵产物分析方法为：准确称取10g酒醅放入100ml离心管，加入20ml超纯水浸泡30min，4℃，10000rpm离心10min，取上清液。进行hs-spme和gc-ms分析，采用标准品及其标准曲线进行成分定性与定量，结果显示，发酵后的酒醅中风味成分包括：半胱氨酸32.6mg/kg，糠硫醇3.2μg/kg，二甲基二硫81.6μg/kg、二甲基三硫12.4μg/kg、甲硫醇20.1μg/kg，3-甲硫基丙醇5.7μg/kg、3-甲硫基丙醛4.6μg/kg。

实施例8：产芝麻香死谷芽孢杆菌利用麸皮固态培养基发酵

具体实施方式同实施例7，区别在于，将枯草芽孢杆菌替换为死谷芽孢杆菌。采用相同方法对死谷芽孢杆菌jnqt002的发酵产物进行分析，结果显示：半胱氨酸28.7mg/kg，糠硫醇1.2μg/kg，二甲基二硫57.4μg/kg、二甲基三硫14.8μg/kg、甲硫醇13.7μg/kg，3-甲硫基丙醇8.1μg/kg、3-甲硫基丙醛2.1μg/kg。

实施例9：产芝麻香芽孢杆菌单独在芝麻香型白酒生产中的应用

步骤1：液体种子培养物的制备：在无菌条件下挑1环枯草芽孢杆菌jnqt001于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

二级种子培养物的制备：按10％接种量(按体积计)将一级液体种子培养物转接于装有2l液体种子培养基的5l摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得二级液体种子培养物。

上述种子液培养基(g/l)：牛肉膏10，葡萄糖10，nacl5，ph7.0，1×10⁵pa灭菌20min。

步骤2：将二级液体种子培养物以体积百分比为1％的接种量接种到装有已灭菌的麸皮固体培养基中，37℃培养10d，制成固态麸曲。

步骤3：将上述固态麸曲混在经过蒸酒后的酒醅和新粮、高温大曲粉中进行堆积发酵。用曲量为投料量的20％(按质量计)，堆积时间2d。

步骤4：芝麻香堆积酒醅入窖发酵35d。

实施例10：两株产芝麻香芽孢杆菌混合菌株在芝麻香型白酒生产工艺中的应用。

步骤1：液体种子培养物的制备：分别在无菌条件下用接种环挑1-2环枯草芽孢杆菌jnqt001和死谷芽孢杆菌jnqt002于装有100ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，分别置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得一级液体种子培养物。

二级种子培养物的制备：分别将步骤1制备的两种种子液按10％接种量(按体积计)接种于装有2l液体种子培养基的5l摇瓶中，置摇床上以旋转转速为100rpm、37℃培养24h，即制得二级液体种子培养物。

上述种子液培养基(g/l)：牛肉膏10，葡萄糖10，nacl5，ph7.0，1×10⁵pa灭菌20min。

步骤2：将枯草芽孢杆菌jnqt001和死谷芽孢杆菌jnqt002的二级液体种子培养物以相同比例(1:1)，总接种量1％(v/w，即1ml种子液/100g培养基)共同接种到装有已灭菌的麸皮固体培养基中，37℃培养10d，制成固态麸曲。

步骤3：将上述固态麸曲与酒糟、新粮、高温大曲粉混合进行堆积发酵。用曲量为投料量的20％，堆积时间2d。

步骤4：芝麻香堆积酒醅入窖发酵35d。

实施例11：芝麻香型白酒的传统制备工艺

将未接种强化菌株的固态麸曲与酒糟、新粮、高温大曲粉混合进行堆积发酵。具体操作步骤同实施例10的步骤3～4，即用曲量为投料量的20％，堆积时间2d，再将芝麻香堆积酒醅入窖发酵35d。

实施例12：芝麻香型白酒感官评价

步骤1：发酵蒸馏所得酒样由三名品评人员分三次进行品评。品评人员由国家级评酒委员和省级评酒委员组成。芝麻香型酒样稀释酒度至55°，在20℃的品评环境下进行品评。

表1感官评价标准表

步骤2：感官评价结果如表2所示，添加菌株产生芝麻香典型性显著提高。

表2不同实施例制备的酒样感官评价结果

实施例13：芝麻香型白酒硫化物成分分析

对实施例10、实施例11制备的芝麻香型白酒进行分析，具体步骤为：向20ml顶空瓶中加入8ml稀释至酒精度10％vol的酒样，进行hs-spme和gc-ms分析。采用标准品及其标准曲线进行成分定性与定量，硫化物成分见表3。产芝麻香芽孢杆菌能够明显提高芝麻香白酒中的糠硫醇，二甲基二硫、二甲基三硫、甲硫醇，3-甲硫基丙醇、3-甲硫基丙醛的浓度。

表3原酒中部分硫化物含量(ug/l)

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。