一种神经干细胞的体外培养方法与流程

本发明涉及一种细胞培养方法，具体为一种神经干细胞的体外培养方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术：

神经干细胞是中枢神经系统中具有自我更新能力并且能够分化产生成熟脑细胞的多潜能细胞。1992年rynolds等从成年鼠脑纹状体中首次分离出了神经干细胞，可以在体外持续扩増且具有向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化潜能的能力.其后在脊髓、小脑、嗅球、侧脑室、海马和纹状体实质内也分离出多潜能性质的干细胞，1998年erikson等证实成人脑同样存在神经干细胞。

干细胞体外分离扩增和分化技术的建立及干细胞在不同的胚层之间横向分化的实现，为中枢神经系统损伤、神经系统变性病或遗传性代谢疾病、神经退行性疾病、脑肿瘤及脑血管疾病等的治疗提供了新的策略。目前干细胞治疗作为一种全新的生物学治疗方法，其开发研究主要集中在以下几个方面:一是直接细胞移植进行细胞替代治疗和基因治疗的双重作用；二是通过对生长因子和细胞因子的研究，诱导内源性干细胞増殖分化，进行神经自我修复。

干细胞的临床应用还不成熟，目前迫切需要加深了解干细胞的生物学特性及解决体外培养干细胞保持其强大的增殖能力、诱导干细胞定向分化等问题，以及了解控制和影响神经干细胞向神经元细胞多样化转化途径的因素。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种神经干细胞的体外培养方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种神经干细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一、分离神经干细胞，从新生大鼠海马中分离神经干细胞；

步骤二、神经干细胞体外培养扩增，将所分离出的神经干细胞放置在培养基中进行培养扩增；

步骤三、观察神经干细胞表达，使用倒置相差显微镜观察细胞形态，并釆用免疫细胞化学法检测nsc标志物nestin的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶的表达；

步骤四、分离星形胶质细胞，釆用化学法、差速贴壁法和振荡法分离纯化星型胶质细胞，并用免疫细胞化学染色法，gfap标记星型胶质细胞，并进行细胞纯度的鉴定；

步骤五、干细胞接种培养，将星型胶质细胞接种在6孔培养板中，待细胞均匀长满后，换神经干细胞基础培养液，置于培养箱孵育24h；

步骤六、观察细胞表达，将涂有pll的盖玻片放入6孔板中，将神经干细胞球种到盖玻片上，在互不接触的情况共培养，每2d更换一次培养基，免疫细胞化学染色法观察星型胶质细胞源性因子对神经干细胞分化后nse、gfap和酪氨酸羟化酵表达的影响。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一中，从新生大鼠海马中分离的神经干细胞为具有能自我更新、具有増殖能力和多分化潜能表达nestin蛋白的干细胞。

作为本发明进一步的方案：所述步骤二中，对神经干细胞体外培养时采用nsc克隆悬浮法，选用dmen/f12培养液，添加无血清培养添加剂b27，使碱性成纤维细胞生长因子及表皮细胞生长因子进行体外扩增培养，并机械和胰酵消化的方法分离连续传代培养。

作为本发明进一步的方案：所述步骤三中，观察20ng/ml浓度下的bfgf、egf对神经干细胞增殖的影响，并用免疫荧光染色和流式细胞仪分选细胞法观察bfgf,egf对神经干细胞分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的影响。

作为本发明进一步的方案：所述步骤五中，釆用化学法、差速贴壁法和振荡法，分离纯化星型胶质细胞，并与神经干细胞在互不接触的条件下进行共培养。

本发明的有益效果是：该神经干细胞的体外培养方法设计合理：

1、从新生大鼠海马中分离的神经干细胞为具有能自我更新、具有増殖能力和多分化潜能表达nestin蛋白的干细胞，该类细胞属于中枢神经系统的干细胞，简便易行,是进行诱导分化的良好细胞模型；

2、釆用化学法、差速贴壁法和振荡法，分离纯化星型胶质细胞，并与神经干细胞在互不接触的条件下进行共培养，使星型胶质细胞能促神经干细胞更快、更多地向神经元分化，且分化为多巴胺神经元的含量也明显增多，能够为进一步研究神经干细胞增殖、定向分化机制及细胞移植治疗帕金森病奠定基础。

附图说明

图1为本发明流程结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种神经干细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一、分离神经干细胞，从新生大鼠海马中分离神经干细胞；

步骤二、神经干细胞体外培养扩增，将所分离出的神经干细胞放置在培养基中进行培养扩增；

步骤三、观察神经干细胞表达，使用倒置相差显微镜观察细胞形态，并釆用免疫细胞化学法检测nsc标志物nestin的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶的表达；

步骤四、分离星形胶质细胞，釆用化学法、差速贴壁法和振荡法分离纯化星型胶质细胞，并用免疫细胞化学染色法，gfap标记星型胶质细胞，并进行细胞纯度的鉴定；

步骤五、干细胞接种培养，将星型胶质细胞接种在6孔培养板中，待细胞均匀长满后，换神经干细胞基础培养液，置于培养箱孵育24h；

步骤六、观察细胞表达，将涂有pll的盖玻片放入6孔板中，将神经干细胞球种到盖玻片上，在互不接触的情况共培养，每2d更换一次培养基，免疫细胞化学染色法观察星型胶质细胞源性因子对神经干细胞分化后nse、gfap和酪氨酸羟化酵表达的影响。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，从新生大鼠海马中分离的神经干细胞为具有能自我更新、具有増殖能力和多分化潜能表达nestin蛋白的干细胞，该类细胞属于中枢神经系统的干细胞，简便易行,是进行诱导分化的良好细胞模型。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，对神经干细胞体外培养时采用nsc克隆悬浮法，选用dmen/f12培养液，添加无血清培养添加剂b27，使碱性成纤维细胞生长因子及表皮细胞生长因子进行体外扩增培养，并机械和胰酵消化的方法分离连续传代培养。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，观察20ng/ml浓度下的bfgf、egf对神经干细胞增殖的影响，并用免疫荧光染色和流式细胞仪分选细胞法观察bfgf,egf对神经干细胞分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的影响。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，釆用化学法、差速贴壁法和振荡法，分离纯化星型胶质细胞，并与神经干细胞在互不接触的条件下进行共培养，使星型胶质细胞能促神经干细胞更快、更多地向神经元分化，且分化为多巴胺神经元的含量也明显增多，能够为进一步研究神经干细胞增殖、定向分化机制及细胞移植治疗帕金森病奠定基础。

工作原理：在使用该神经干细胞的体外培养方法时，从新生大鼠海马中分离神经干细胞；将所分离出的神经干细胞放置在培养基中进行培养扩增；使用倒置相差显微镜观察细胞形态，并釆用免疫细胞化学法检测nsc标志物nestin的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶的表达；釆用化学法、差速贴壁法和振荡法分离纯化星型胶质细胞，并用免疫细胞化学染色法，gfap标记星型胶质细胞，并进行细胞纯度的鉴定；将星型胶质细胞接种在6孔培养板中，待细胞均匀长满后，换神经干细胞基础培养液，置于培养箱孵育24h；将涂有pll的盖玻片放入6孔板中，将神经干细胞球种到盖玻片上，在互不接触的情况共培养，每2d更换一次培养基，免疫细胞化学染色法观察星型胶质细胞源性因子对神经干细胞分化后nse、gfap和酪氨酸羟化酵表达的影响。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。