创伤弧菌的快速恒温检测方法、引物组及应用与流程

本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610780421.x、发明名称为：“快速恒温检测创伤弧菌的方法、引物及应用”的中国发明专利申请的分案申请；该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、发明名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国发明专利申请的优先权。

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速恒温检测创伤弧菌的方法、引物及试剂盒。

背景技术：

创伤弧菌(vibriovulnificus)，又称海洋弧菌，是在海水和一些海洋食品中发现的一种嗜盐性革兰氏阴性致病菌。人类通常是因为生食受污染的海产品，或者伤口接触受污染的海水或海洋动物而感染该细菌，可引起原发性败血症、创伤感染和急性胃肠炎等症状，其中引起的败血症性休克的死亡率高达50％以上。在我国，创伤弧菌感染多发生于沿海地区，被列为食品污染源中八大高危微生物之一。此外，由创伤弧菌引起的最初症状并无明显特异性，因此对该菌的预防和检测尤为重要。

目前，针对创伤弧菌的检测主要通过病原分离与生化鉴定完成，但存在检测周期长，操作繁琐，不易鉴别相近物种等缺点。近年来随着核酸分子检测技术的发展，以特异性基因为靶标建立的常规pcr或real-timepcr技术已成功应用于创伤弧菌的实验室诊断，具有灵敏度高，检测时间短等优点，但该方法必须配备昂贵的仪器设备，需专门的操作人员。因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的创伤弧菌。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物f3和b3以及上下游内引物fip和bip，其中fip由f1c和f2组成，bip由b1c和b2组成)，利用一种具有链置换活性的dna聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献notomit,okayamah,masubuchih,yonekawat,watanabek,aminon,haset.loop-mediatedisothermalamplificationofdna,nucleicacidsresearch,2000jun15；28(12):e63)。该技术具有不需要pcr仪或荧光定量pcr仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。

引物设计是lamp技术中最为关键的一步，常规做法是将某待检测生物的公认的特异性基因导入lamp引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e)，设定相关参数生成引物组。也就是说，用户首先必须确保该靶基因为待测物种的特异序列。以发明专利cn103160604a和zl201310556940.4为例，它们分别针对文献报道的创伤弧菌的特异基因——vvha基因和tolc基因序列，采用lamp技术进行创伤弧菌检测。然而，所谓“公认的特异性基因”往往基于滞后的知识，并未基于不断增长的微生物基因组数据进行必要的更新，导致基于该靶基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其特异性和/或通用性。本发明用表1展示了现有技术中存在的引物通用性不够的问题。也就是说，现有技术方法中所使用的创伤弧菌检测序列实际上并非所有创伤弧菌菌株共有，即，有可能漏检创伤弧菌的部分菌株。类似的问题也存在于特异性的确认，即，有可能将非创伤弧菌错误地认定为创伤弧菌。因此，行业内亟需一种能够确保特异性和通用性的创伤弧菌检测方法，同时满足基层检测部门对快速、便捷的需求，能够方便地在企业生产线内部开展实时实地检测。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于克服现有lamp技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别创伤弧菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本发明基于genbank数据库中的微生物基因组数据资源(截至2013年8月5日数据)进行创伤弧菌lamp引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测创伤弧菌的方法、引物组及试剂盒。采用本发明的检测方法检测创伤弧菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。

本发明提出一种快速检测创伤弧菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从待测样品中提取基因组dna；

(2)以所述基因组dna为模板，以能扩增创伤弧菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物，在酶反应体系下，进行恒温扩增反应；

(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在创伤弧菌。

本发明恒温检测创伤弧菌菌株的方法，从待测样品中提取基因组dna，以其为模板，以创伤弧菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应，然后，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在创伤弧菌。其中，所述酶反应体系包括但不限于dna聚合酶反应体系。

本发明中，所述创伤弧菌基因组特异性碱基序列为gi号为320154846的创伤弧菌的62063～62415bp位序列。

本发明中，所述能扩增创伤弧菌基因组特异性碱基序列的引物组为所述基因组(gi号为320154846)的62063～62415bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。其中，所述创伤弧菌基因组特异性碱基序列是指仅为创伤弧菌基因组所特有的，而其它微生物基因组所不包含的碱基序列。

其中，所述能扩增创伤弧菌基因组特异碱基序列的引物组包括但不限于引物组a，或选自与该引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为60％及以上的引物组之任意一组。

引物组a：

上游外引物f3_a：5’-gtctccaaacttagaccaaa-3’(seqidno：1)；

下游外引物b3_a：5’-tctactttgagcaaccgtat-3’(seqidno：2)；

上游内引物fip_a：5’-gttgctttaatgttcgatatgggccaaaatttcgttatccagcg-3’(seqidno：3)；

下游内引物bip_a：5’-acattttcttttctagctcgcgtcagtacgaatcactacctt-3’(seqidno：4)。

本发明中，所述能扩增创伤弧菌基因组特异碱基序列的引物组还可以包括与前述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为60％及以上的引物组，该引物组包括但不限于以下引物组b：

引物组b：

上游外引物f3_b：5’-gtactgaatacggttgctc-3’(seqidno：5)(与引物b3_a的互补链5’-atacggttgctcaaagtaga-3’同源性为60％)；

下游外引物b3_b：5’-ctggatgaactcaggcta-3’(seqidno：6)；

上游内引物fip_b：5’-caacaatatcgcaccatgtggaagtagacaagtttgaagcc-3’(seqidno：7)；

下游内引物bip_b：5’-tttcaaaggcatatcacgggtgtattactcaacgagttgcc-3’(seqidno：8)。

本发明方法中，在一具体实施方案中，所述恒温扩增的酶反应体系为：1×bstdna聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/lmg²⁺(mgso4或mgcl2)，1.0-1.6mmol/ldntp，0.8-2.0μmol/l的fip和bip引物，0.15-0.3μmol/l的f3和b3引物，0.16-0.64u/μlbstdna聚合酶和0-1.5mol/l甜菜碱。例如，1×bstdna聚合酶反应缓冲液可以选用1×thermopol反应缓冲液，包含20mmol/ltris-hcl(ph8.8)，10mmol/lkcl，10mmol/l(nh4)2so4，0.1％tritonx-100，2mmmgso4。1×bstdna聚合酶反应缓冲液中的mgso4和酶反应体系中的镁离子mg²⁺做合并处理。

本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90min，优选地为10～60min；②80℃终止反应2～20min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。

本发明方法中，检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测等。所述电泳检测，优选为凝胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶，也可以是聚丙烯酰胺凝胶。电泳检测结果中，如电泳图呈现特征性阶梯状条带，则待测样品呈创伤弧菌阳性，含有创伤弧菌；如电泳图不呈现特征性阶梯状条带，则待测样品呈创伤弧菌阴性。所述浊度检测，是用肉眼观察或浊度仪检测浊度，检测管出现明显混浊，则待测样品呈创伤弧菌阳性，含有创伤弧菌；如未见混浊，则待测样品为创伤弧菌阴性。也可以经离心后肉眼观察反应管底是否有沉淀，若反应管底有沉淀，则待测样品呈创伤弧菌阳性，含有创伤弧菌；如反应管底没有沉淀，则待测样品呈创伤弧菌阴性。

所述显色检测，是在反应管中加入显色剂，包括但不限于钙黄绿素(50μm)或sybrgreeni(30-50×)，或羟基萘酚蓝(即hnb，120-150μm)。当采用钙黄绿素或sybrgreeni作为显色剂时，如反应后颜色为橙色，则待测样品为创伤弧菌阴性；如反应后颜色为绿色，则待测样品为创伤弧菌阳性，含有创伤弧菌。当采用羟基萘酚蓝作为显色剂时，如反应后颜色为紫罗兰色，则待测样品为创伤弧菌阴性；如反应后颜色为天蓝色，则待测样品为创伤弧菌阳性。所述显色检测，除了上述通过肉眼观察反应结果外，也可以通过检测仪器进行实时或终点检测反应结果，通过合理的设定阴性反应的阈值，当待测样品反应的结果低于或等于该阈值时，则待测样品为创伤弧菌阴性；当待测样品反应的结果大于该阈值时，则待测样品为创伤弧菌阳性。所述检测仪器包括但不限于荧光分光光度计、荧光定量pcr仪、恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和genieii等温扩增荧光检测系统等。

所述显色检测中，若采用钙黄绿素或羟基萘酚蓝作为显色剂，可以在恒温扩增反应之前加入，也可以在恒温扩增反应完成之后加入，优选地为恒温扩增反应之前加入，可以有效的减少反应污染的可能性。若采用sybrgreeni作为显色剂，则在恒温扩增反应完成之后加入。若采用钙黄绿素作为显色剂，则在酶反应体系中加入50μm钙黄绿素的同时，加入0.6-1mm[mn²⁺]，例如，0.6-1mm的mncl2。

本发明还提供了用于恒温检测创伤弧菌菌株的方法中的引物。所述引物包括能扩增创伤弧菌基因组特异碱基序列的引物组，其包括但不限于，所述引物的序列为gi号为320154846的创伤弧菌基因组的62063～62415bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。

其中，所述能扩增创伤弧菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下各引物组之任意一组，或选自与所述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为60％及以上的任一引物组。其中，所述引物组包括但不限于以下引物组a。所述与前述引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为60％及以上的引物组包括但不限于以下引物组b。

引物组a：

上游外引物f3_a：5’-gtctccaaacttagaccaaa-3’

下游外引物b3_a：5’-tctactttgagcaaccgtat-3’

上游内引物fip_a：

5’-gttgctttaatgttcgatatgggccaaaatttcgttatccagcg-3’；

下游内引物bip_a：5’-acattttcttttctagctcgcgtcagtacgaatcactacctt-3’；

引物组b：

上游外引物f3_b：5’-gtactgaatacggttgctc-3’；

下游外引物b3_b：5’-ctggatgaactcaggcta-3’；

上游内引物fip_b：5’-caacaatatcgcaccatgtggaagtagacaagtttgaagcc-3’；下游内引物bip_b：5’-tttcaaaggcatatcacgggtgtattactcaacgagttgcc-3’；

本发明还提供一种用于上述恒温检测创伤弧菌菌株方法中的试剂盒，其包括所述能扩增创伤弧菌基因组特异碱基序列的引物组。本发明试剂盒中，所述能扩增创伤弧菌基因组特异性碱基序列的引物组，包括但不限于以基因组(gi号:320154846)的62063～62415bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分作为所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物组a。还包括但不限于以与前述引物序列或其互补链序列中单条序列同源性为60％及以上的引物组作为引物；包括但不限于引物组b。

本发明试剂盒中，还包括bstdna聚合酶缓冲液、bstdna聚合酶、dntp溶液、mg²⁺(mgso4或mgcl2)和甜菜碱中的一种或多种。在一具体实施方案中，本发明试剂盒酶反应体系包含1×bstdna聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/lmg²⁺(mgso4或mgcl2)，1.0-1.6mmol/ldntp，0.8-2.0μmol/l的fip和bip引物，0.15-0.3μmol/l的f3和b3引物，0.16-0.64u/μlbstdna聚合酶和0-1.5mol/l的甜菜碱。例如，1×bstdna聚合酶反应缓冲液可以选用1×thermopol反应缓冲液，包含20mmol/ltris-hcl(ph8.8)，10mmol/lkcl，10mmol/l(nh4)2so4，0.1％tritonx-100，2mmmgso4。1×bstdna聚合酶反应缓冲液中的mgso4和酶反应体系中的镁离子mg²⁺做合并处理。

本发明试剂盒中，还包含阳性对照模板。在一具体实施方案中，所述阳性对照模板包括但不限于创伤弧菌的全基因组dna、部分基因组dna，或包含创伤弧菌全基因组dna或部分基因组dna的载体。

本发明试剂盒中，还包含阴性对照模板，所述阴性对照模板包括但不限于双蒸水。

本发明试剂盒中，还包含显色剂，显色剂包括但不限于钙黄绿素，sybrgreeni或羟基萘酚蓝。当显色剂为钙黄绿素时，试剂盒中还包含[mn²⁺]，例如，mncl2。

本发明试剂盒中，还包含双蒸水。

本发明试剂盒中，还包含核酸抽提试剂。

本发明还提出了一种载体，所述载体包含选自引物组a、b之任意一组引物。该载体由于包含了具有创伤弧菌特异性的dna序列，因此可应用于微生物分类学、比较基因组学、进化等研究领域，以及微生物检测等应用领域。该载体可以是但不限于质粒载体(如pbr322、puc18、puc19、pbluescriptm13、ti质粒等)、病毒载体(如λ噬菌体等)和人造染色体载体(如细菌人造染色体bac、酵母人造染色体yac等)。例如，包含引物组a之任意一条引物的载体pbr322-a、包含引物组b之任意一条引物的载体pbr322-b等。包含引物组a之任意一条引物的载体λ噬菌体-a、包含引物组b之任意一条引物的载体λ噬菌体-b等。

本发明还提出了选自引物组a、b之任意一组的引物在恒温检测创伤弧菌中的应用。

本发明还提出了所述试剂盒在恒温检测创伤弧菌中的应用。

本发明还提出了所述载体在恒温检测创伤弧菌中的应用。

本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测创伤弧菌的方法、引物/引物组、检测试剂/试剂盒，对我国的食品安全具有较大意义。本发明有益效果包括：采用本发明创伤弧菌检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、结果判定简单、操作便捷、成本低等优点。与目前常用检测方法相比，本发明采用的恒温扩增法，可以在恒温条件下进行，只需采用简单的恒温装置，不需要pcr实验中的昂贵仪器，不需要对扩增产物进行电泳检测等步骤，因而，非常适于广泛应用于社会各界包括基层食品安全检测部门推广使用，即使在分子生物学专业知识和技能基础相对不足的环境下也可充分应用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。

附图说明

图1表明本发明实施例7创伤弧菌恒温检测方法的特异性。

图2表明本发明实施例8创伤弧菌检测方法的灵敏度。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1-6创伤弧菌恒温反应体系和检测方法

按照以下(1)～(3)步骤进行检测：

(1)基因组dna的提取

用于检测的创伤弧菌菌种来源中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号cicc10383(＝atcc27562)。取1ml细菌培养物使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组dna，dnaod260/od280为1.8，浓度为210.8ng/μl。

(2)以待测创伤弧菌基因组dna为模板，分别采用自配的试剂盒(见表2，表3)，并按照表3中所述条件，配制反应体系，以创伤弧菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应。实施例1～6中的引物分别为引物组a，a，a，b，b，b。

(3)按照表3中所述条件，通过电泳检测、浊度检测或显色检测，进行扩增结果确认。

由表3可以看出，本发明检测方法及其所采用的引物组及反应体系能够很好地对创伤弧菌特异性片段进行扩增并得到检测结果。因此，本发明可以应用于检测样本中是否含有创伤弧菌。

实施例7创伤弧菌特异性检测

收集非创伤弧菌28株(表4和图1中的1～25，27～29)，将这些菌株与创伤弧菌菌株(表4和图1中的26)分别进行培养，取1ml菌液，采用试剂盒ia，提取细菌dna，并参照实施例1的反应体系和条件，分别进行lamp扩增(引物组为a)和加入显色剂观察。

其检测结果如表4和图1所示，图1中，1～25分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、表皮葡萄球菌、马红球菌、蜡样芽孢杆菌、蕈样芽孢杆菌、单核增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、肠沙门氏菌肠亚种、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌(含肉毒梭菌a型基因)、致病性大肠埃希氏菌、致泻大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、阪崎克罗诺杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌，27～29分别为副溶血弧菌、弗氏弧菌和霍乱弧菌，ntc：阴性对照，26：创伤弧菌。图1中，仅有创伤弧菌菌株扩增反应后的产物呈现为亮绿色，为阳性结果，如第26号管所示。而其他非创伤弧菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物均呈现为橙色，为阴性结果，如第1～25、27～29号管以及ntc阴性对照管所示。

由图1和表4结果可以看出，本发明检测试剂盒及检测方法具有良好的创伤弧菌菌株特异性，即，只有创伤弧菌菌株扩增阳性，其他非创伤弧菌菌株为阴性。

配制检测试剂盒，试剂盒中采用的引物为引物组b，按上述特异性检测方法，得到同样的检测结果，即，非创伤弧菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物为阴性结果，创伤弧菌菌株扩增反应后的产物为阳性结果。

此外，按照表1中所述方法，分别对引物组a，引物组b的特异性进行理论分析，结果发现，在各条引物最多允许三个错配的情况下，各引物组最多有一条引物比对到非创伤弧菌上，表明各引物组的特异性均较好。

实施例8灵敏度检测

按实施例1的方法提取细菌cicc10383的dna，采用试剂盒ib，并按照1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg梯度加入反应体系，其他反应条件参照表3实施例1的方法分别进行lamp扩增(引物组为a)和加入显色剂观察。如图2所示，1-6分别为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg和10fg，ntc：阴性对照。图2中1ng、100pg和10pg处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，1pg、100fg和10fg处理以及阴性对照的反应产物呈现为橙色，为阴性结果。检测结果表明，每个反应管中最低含10pg(约相当于2×10³个细菌)的dna时仍可被检出。

按上述检测方法，其他步骤及条件同上，用引物组b，每个反应管中低至100fg的dna仍可被检出，检测灵敏度较高。

实施例9通用性检测

按照表1中所述方法，分别对引物组a，引物组b的通用性进行理论分析，结果发现，各引物组的引物区域与三株创伤弧菌1号染色体(gi号分别为320154846，326423644和37678184)的完全匹配，理论上可以用于上述三株创伤弧菌菌株的检测，表明各引物组的通用性均较好。

表1创伤弧菌的现有检测方法中引物的通用性和特异性分析

注：a)每个创伤弧菌菌株有两条染色体，将专利中引物f3和b3间的序列与创伤弧菌的3个菌株的6个染色体基因组序列进行bowtie比对，确定检测区域在gi号320154846#1/320157827#2基因组中的位置，#1代表该菌株的第一条染色体的基因组序列，#2代表该菌株的第二条染色体的基因组序列。b)将检测区域序列在公共数据库资源中进行blast比对，引物区域完全匹配为通用性好。c)将检测区域序列在公共数据库资源中进行blast比对，引物区域匹配程度越高，特异性越差；若引物不能同时比对到非创伤弧菌株上，表明特异性好。

表2恒温检测创伤弧菌的试剂盒种类及主要组成成分

表3实施例1-6本发明恒温检测创伤弧菌的方法中的反应条件及检测结果

表4试验所用菌株及检测结果

注：a)cgmcc：中国普通微生物菌种保藏中心，cicc：中国工业微生物菌种保藏管理中心，cmcc：中国医学细菌菌种保藏管理中心。b)+：阳性结果，-：阴性结果。

<110>上海产业技术研究院、上海旺旺食品集团有限公司

<120>创伤弧菌的快速恒温检测方法、引物组及应用

<160>8

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtctccaaacttagaccaaa20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tctactttgagcaaccgtat20

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gttgctttaatgttcgatatgggccaaaatttcgttatccagcg44

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

<400>4

acattttcttttctagctcgcgtcagtacgaatcactacctt42

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtactgaatacggttgctc19

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctggatgaactcaggcta18

<210>7

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

caacaatatcgcaccatgtggaagtagacaagtttgaagcc41

<210>8

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tttcaaaggcatatcacgggtgtattactcaacgagttgcc41