本发明属于医用动物模型技术领域,具体涉及一种干眼动物模型的建立方法。
背景技术:
干眼是指由于泪液质和量及动力学的异常而导致泪膜不稳定和/或眼表面的异常,并伴有眼部不适症状的一类疾病。是眼科最常见的疾病之一,可引起眼表损伤和视力模糊等,而影响到患者的生活质量。
干眼可以分为蒸发过强型干眼、水液缺乏型干眼、粘蛋白异常型干眼、泪液动力学异常型干眼及混合型干眼。临床调查显示,干眼是目前常见的眼表疾病,并可继发引起角膜炎、角膜新生血管以及角膜溃疡等,严重影响人们的生活质量和工作效率。干眼发病的共同病理生理特征有眼表上皮屏障破坏、泪液减少、结膜杯状细胞减少、眼表上皮鳞状上皮化生等。由于干眼发病机制复杂且具有多样性,目前关于干眼的发病机制、诊断和治疗的一系列基础以及临床问题尚有待进一步深入研究。
动物模型的建立是研究干眼的发病机制,探索治疗方法的有效且实用的手段。目前已经报道的干眼动物模型的建立方法包括:通过营养因素、环境因素、毒性物质、药物作用、改变动物性激素分泌水平、去除泪腺或眼表的神经支配、诱导泪腺产生自身免疫反应、手术摘除泪腺以及转基因动物等。这些干眼动物模型的建立往往需要较高的技术条件或较长的时间,并且变异性较大。
技术实现要素:
本发明的目的在于克服现有模型种类的不足,提供一种稳定的干眼动物模型,从而弥补现有技术的不足。
申请人采用crispr/cas9技术,设计sgrna,应用高通量电转受精卵方式,获得aqp5基因敲除小鼠(aqp5-/-)。并且首次证明aqp5-/-小鼠,出生后即表现为干眼,模型的表型稳定,并且无性别差异,从而促成了本发明。
本发明首先提供一种干眼动物模型的构建方法,是通过敲除动物中aqp5基因来构建干眼动物模型;
所述的敲除动物中aqp5基因,是通过crispr/cas9系统来进行的;
本发明还提供一种干眼小鼠模型,是通过上述的方法敲除aqp5基因来构建的;
所述的敲除aqp5基因,是敲除小鼠第15条染色体上的99589876-99594444区域,长度为4569bp的核苷酸片段;
本发明还提供一种用于检测aqp5-/-小鼠的制品,所述的制品中包含有用于检测上述缺失片段的引物对;
其中用于检测上述缺失片段的引物对,其一种序列信息如下:aqp5-f1:caaagtgctcaaacactaaccgtac(seqidno:1)aqp5-r1:gattggtggtttattgggaaacg(seqidno:2)。aqp5-r3:tgcaggtctttgtttctgccg(seqidno:3)。
本发明所提供的干眼小鼠模型应用于筛选或评价干眼治疗药物的效果。
本发明的aqp5-/-模型小鼠,可重复性高,模型稳定,有利于干眼病理机制的研究和药物干预,可避免其他影响因素对实验结果产生影响。而且本发明的aqp5-/-小鼠模型,在出生后即出现泪液分泌减少的特征性改变,在出生后,眶外泪腺就出现空泡变性的病理学特征;且泪液分泌量随年龄增长无明显变化,并且无性别差异。
附图说明
图1:a、b为本发明实施例1的aqp5-/-小鼠信息及ko区域,c为aqp5-/-小鼠的测序鉴定结果图;
图2:本发明实施例1中aqp5-/-小鼠基因鉴定结果电泳图;
图3:本发明实施例1中不同年龄aqp5+/+和aqp5-/-小鼠眼表的荧光素钠染色图;
图4:本发明实施例1中aqp5+/+和aqp5-/-小鼠的泪液分泌分析结果图;
图5:本发明实施例1中aqp5+/+和aqp5-/-小鼠的眶外泪腺he染色照片;
图6:本发明实施例1中aqp5+/+和aqp5-/-小鼠的眶外泪腺的透射电镜扫描图。
具体实施方式
申请人发现敲除水通道蛋白5基因(aquaporin5,aqp5)的aqp5-/-小鼠出生后即表现为干眼,并且其泪液分泌功能随年龄增加无明显变化,并且无性别差异。
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1:构建aqp5-/-小鼠干眼动物模型
1、aqp5-/-小鼠的构建及鉴定
aqp5(ncbiid:11830)位于小鼠的15号染色体,aqp5-/-小鼠的信息及敲除的区域见图1a、b,采用crispr/cas9技术,设计sgrna,通过应用高通量电转受精卵方式,敲除chr15:99589876-99594444区域,长度为4569bp的基因片段,获得aqp5-/-小鼠。图1c为aqp5-/-小鼠的测序鉴定结果,与野生型序列比较可见,共缺失了4569bp的序列,表明模型小鼠成功建立。该小鼠在我单位已经成功进行了繁殖,目前已经获得了稳定的纯合子小鼠的种群。
后续的常规饲养中,应用pcr扩增法检测aqp5-/-小鼠的敲除效果。
pcr扩增目的片段:反应条件与反应体系:
(1)pcr反应条件:94℃3min;94℃30sec,60℃30se,65℃50sec,33cycles;72℃10min。
(2)反应体系:(takaralataqpolymerase)
其中应用引物对分别为
aqp5-f1:caaagtgctcaaacactaaccgtac、
aqp5-r1:gattggtggtttattgggaaacg、
aqp5-f1:caaagtgctcaaacactaaccgtac、
aqp5-r3:tgcaggtctttgtttctgccg。
繁殖小鼠的鉴定结果见图2,鼠尾基因组dna行pcr扩增的结果显示,1、2、6、7列仅有640bp的片段,为纯合子小鼠;3、4、5列有640bp和348bp的两条片段,为杂合子。
2、aqp5-/-小鼠的干眼症状
选用aqp5+/+和aqp5-/-小鼠,常规饲养,aqp5-/-小鼠在出生后即出现泪液分泌减少的特征性改变:包括角膜上皮细胞减少,荧光素钠着色实验结果见图3。泪液分泌明显减少,通过酚红棉线法测量结果见图4。
3、aqp5-/-小鼠的眶外泪腺的病理改变
本发明的aqp5-/-小鼠,在出生后,摘取其眶外泪腺,常规制作石蜡切片,并进行he染色,发现眶外泪腺就出现空泡变性的病理学特征改变,如图5所示,表现为单位面积内腺泡数量减少、腺泡上皮细胞的数量下降,单个腺泡面积增大;单位面积内腺泡上皮内空泡数量明显增加,空泡所占面积比例明显增加。
4、aqp5-/-小鼠的眶外泪腺的透射电镜扫描结构改变
取aqp5+/+小鼠和本发明的aqp5-/-小鼠的泪腺的研究,常规制作透射电镜切片,透射电子显微镜下观察,采集图像分析,结果如图6所示,aqp5+/+组泪腺图片所示上皮细胞形态轻微水肿,线粒体轻微肿胀,分泌颗粒大小、形态均一,细胞间隙尚可。aqp5-/-组图片所示上皮细胞损伤相对较严重,线粒体嵴消失,膜破损,基质外溢,分泌颗粒大小不等,部分颗粒融合,细胞间隙明显增宽。
本发明所构建的动物模型,能用于研究泪液生成不足型干眼的发病机制,并用于筛选或评价各种干眼治疗药物的作用机制及效果评价;还可用于干眼对眼表微环境的损害及机制的研究,及用于筛选或评价各种干眼治疗药物对眼表微环境的保护作用及效果。
序列表
<110>青岛大学
<120>一种小鼠干眼动物模型及其应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
caaagtgctcaaacactaaccgtac25
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gattggtggtttattgggaaacg23
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tgcaggtctttgtttctgccg21