用于降解土壤中PAHs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物降解有机污染物领域，尤其涉及以丝瓜络为载体，采用吸附法固定混合菌制备的用于降解土壤中致癌物多环芳烃的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒。

本发明中所称高大毛霉(mucormucedo)s1，已于2019年11月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.19025。

背景技术：

多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，简称pahs)，是指由两个及两个以上苯环稠合而成的一类化合物，其所有的碳原子和氢原子都处于同一平面内，是世界上最早发现的一类化学致癌物。由于致癌、致畸、致突变的作用，pahs被列入对生态系统和人类健康危害最大的化合物列表，美国环保总局(epa)等也把pahs列为优先监测污染物中的一类。pahs通过废水排放、废物沥滤、意外排放、大气沉降等最终进入土壤环境，并且在土壤中残留时间长、累积量大，可通过食物链进入人体，危害人体健康及生态环境。

微生物修复是土壤pahs去除的主要且有效途径，但游离微生物难以适应复杂环境而不能有效发挥作用，导致应用结果与实验结果有较大出入，而微生物固定化技术是解决上述问题的一种有效方法。固定化载体的选择和耐低温高效pahs降解菌的筛选是微生物固定化技术修复北方寒冷地区受pahs污染的冻融土壤的关键。

生物质材料不仅对持久性有机污染物吸附能力强，并易通过改性成为良好的吸附材料，且可以作为良好的微生物固定化载体，引起了广泛关注。

丝瓜属于葫芦科丝瓜属一年生攀援性植物，丝瓜络由丝瓜果实成熟、发黄、干枯时采摘，经去皮、除子、晒干获得。丝瓜络一般呈黄白色或白色，是由维管束纵横交错而成的立体多孔网状物，多数为长圆形，两头细中间略粗。目前丝瓜络可用于洗碗，清洁汽车和玻璃器皿，绝缘材料以及枕头，床垫，马鞍和垫肩的填充物等。除这些用途外，丝瓜络材料在帽子制造、鞋底、汽车挡风玻璃刮水器、船用发动机过滤器、罐保持器和手套以及水过滤器中具有商业用途。丝瓜络是一种天然，低成本，无毒，可生物降解的材料，在地球上有着惊人的储存量，近年来除了将其应用于生活领域外，大部分被丢弃，造成资源的浪费。丝瓜络具有较大的比表面积和孔隙度，使其成为高效的吸附材料及微生物固定化载体。因此，研究丝瓜络固定化混合菌降解土壤中痕量pahs，对于净化pahs污染土壤具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以丝瓜络为载体，通过对其进行改性制备并以吸附法固定化微生物，用于降解土壤中pahs。

本发明采用的技术方案是：一种用于降解土壤中pahs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒，是以经高温高压改性制得的丝瓜络为生物质固定化载体，采用吸附法固定混合菌剂，制得的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒；所述混合菌剂由保藏编号为cgmccno.14048的假单胞菌(pseudomonassp.)sdr4和保藏编号为cgmccno.19025的高大毛霉(mucormucedo)s1组成。

优选的，上述的一种用于降解土壤中pahs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒，所述混合菌剂由假单胞菌(pseudomonassp.)sdr4和高大毛霉(mucormucedo)s1，按体积比1:1混合而成。

一种用于降解土壤中pahs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1)生物质固定化载体的制备：将丝瓜络清洗后于烘箱中烘干，然后用粉粹机碾磨并过40目筛，取筛下物于高温高压下处理5-6小时，用蒸馏水清洗，烘干，得丝瓜络生物质固定化载体；

2)混合菌剂的制备：将保藏编号为cgmccno.14048的假单胞菌(pseudomonassp.)sdr4和保藏编号为cgmccno.19025的高大毛霉(mucormucedo)s1，按体积比1:1接种于营养培养基中，15℃，110r·min^-1摇床混合培养3d，得混合菌剂；

3)生物质固定化真菌-细菌混合颗粒的制备：将步骤1)获得的丝瓜络生物质固定化载体灭菌处理后，放入增殖培养基中浸润12-14h，按10％接种量接种步骤2)获得的混合菌剂，放置于低温光照培养箱中，15℃避光培养7d，期间适量补充增殖培养基，得用于降解土壤中pahs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒。

优选的，上述的制备方法，步骤1)中，所述高温为130℃，所述高压为0.125mpa。

优选的，上述的制备方法，所述营养培养基组成为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，nacl5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph为7.1～7.2，121℃灭菌20min。

优选的，上述的制备方法，所述增殖培养基组成为：蔗糖4g，酵母膏3g，kh2po40.5g，(nh4)2hpo42g，mgso4·h2o0.25g，ph6.0～6.5，121℃灭菌20min。

生物质固定化真菌-细菌混合颗粒在降解土壤中多环芳烃中的应用。方法如下：于多环芳烃污染的土壤中，施加上述的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒，进行降解60天。

优选的，所述多环芳烃是菲或芘。

优选的，生物质固定化真菌-细菌混合颗粒的施加量为1％。

(一)本发明提供的高大毛霉(mucormucedo)s1的筛选方法如下：

从沈抚灌渠采集3点受pahs污染冻融土壤土样，采样深度约为50cm，经碾碎，过2mm筛，将土样混合后装入试剂袋密封，放入冰箱4℃保存备用，并测定其pahs浓度。模拟该地区冬季低温的冻结土样，将其置于-20℃冰箱内冷冻20d，并于15℃培养箱内融化10d后备用。称取适量混合后的土样，编号为s(未冻结土样)、d(冻结土样)，置于营养培养基中自然富集培养4d，然后取上述富集培养液10ml接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，采用定时定量转接逐步提高碳源浓度法进行驯化，于15℃，120r·min^－1摇床富集培养7d。选择培养基中phe、pyr与bap初始浓度为10、10与5mg·l^－1，第2次转接浓度增加至20、20与10mg·l^－1，第3次转接浓度增加至30、30与15mg·l^－1。将菌泥悬液用无菌水稀释制成10^－2、10^－3、10^－4、10^－5和10^－6稀释度的菌泥悬液。吸取0.2ml分别涂布于加pahs膜的固体营养培养基平板上，15℃倒置培养至有肉眼可见的明显菌落长出，平板连续划线转板3次，挑取菌落大，生长较快的单菌株接入喷涂pahs的营养培养基斜面，分别于28、15、4℃下倒置培养10d左右，观察生长状况，对低温pahs降解菌进行初筛。初筛得到菌株s1。

菌株s1基因的提取、pcr扩增、测序由上海生工生物技术有限公司完成。将测序结果在ncbi网站上的genbank中用blast对基因序列进行同源性比较，以确定该菌种属。应用mega5.0软件(moleculaevolutionarygeneticsanalysis)计算遗传距离，采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，用bootstrap分析评估数的稳定性。由图1可见，菌株s1与高大毛霉菌属的16srdna序列自然聚类，与其相似度在99％，因此菌株s1归属于高大毛霉(mucormucedo)。

无机盐液体培养基包括：k2hpo41.0g，(nh4)2so45g，mgso4﹒7h2o0.5g，ph7.0～7.2，蒸馏水1l定容，121℃灭菌25min，营养培养基(cm培养基)：蛋白胨10.0g，葡萄糖10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，ph7.0～7.2，以蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌25min，固体培养基另加琼脂粉20g/l。

本发明的有益效果是：本发明所采用的生物质固定化载体原料丝瓜络具有成本低、去除效率高、易于操作等优点，且是一种可以多次重复利用、机械强度大、无毒、可生物降解的材料，对微生物的吸附容量大。本发明生物质固定化混合菌颗粒，对土壤中多环芳烃的降解效率高。本发明按10％的接菌量，制备生物质固定化混合菌颗粒，按1％的生物质固定化混合菌的投加量，投加入初始浓度为30mg·kg^-1的菲和芘污染土壤中，能够降解其中64.23％的菲和42.43％的芘。

附图说明

高大毛霉(mucormucedo)s1，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：cgmcc，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2019年11月25日，保藏编号为cgmccno.19025。

图1是基于16srdna序列和neighbor-joining法构建s1的系统进化树。

图2是本发明实施例1制备的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒的sem图；

其中，a:2000倍下原始丝瓜络截面sem图；b:2000倍下丝瓜络固定化混合菌载体表面sem图；c:2000倍下生物质固定化真菌-细菌混合颗粒表面sem图。

图3是本发明实施例2中生物质固定化真菌-细菌混合颗粒对菲与芘的降解率图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不限制本发明的使用范围。

实施例1

用于降解土壤中pahs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒，制备方法如下：

(一)丝瓜络生物质固定化载体的制备

将条状丝瓜络用蒸馏水冲洗以除去灰尘，然后于65℃烘箱中烘干。将烘干后的丝瓜络用粉粹机碾磨并过筛(40目)，取筛下物，得丝瓜络粉末。将丝瓜络粉末经高温高压(130℃；0.125mpa)处理5小时，产物用蒸馏水冲洗，120℃烘箱中烘干，得丝瓜络生物质固定化载体。

(二)混合菌剂的制备

1、假单胞菌(pseudomonassp.)sdr4的培养

完全培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，nacl5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph为7.1～7.2，121℃灭菌20min。

取保存于斜面培养基上的、保藏编号为cgmccno.14048的假单胞菌(pseudomonassp.)sdr4，按5％的接种量接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床培养30～40h，至细菌密度为6×10⁸cfu·ml^－1，得假单胞菌(pseudomonassp.)sdr4细菌菌悬液。

2、高大毛霉(mucormucedo)s1的培养

完全培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，nacl5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph为7.1～7.2，121℃灭菌20min。

取保存于斜面培养基上的、保藏编号为cgmccno.19025的高大毛霉(mucormucedo)s1，按5％的接种量接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床培养30～40h，至细菌密度为6×10⁸cfu·ml^－1，得高大毛霉(mucormucedo)s1细菌菌悬液。

3、混合菌剂的制备

营养培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，nacl5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph为7.1～7.2，121℃灭菌20min。

按体积比1:1，取假单胞菌(pseudomonassp.)sdr4细菌菌悬液和高大毛霉(mucormucedo)s1真菌菌悬液，分别按10％的接种量接种于营养培养基中，15℃，110r/min摇床混合培养3d，得混合菌剂。

(三)生物质固定化真菌-细菌混合颗粒的制备

增殖培养基组成：蔗糖4g，酵母膏3g，kh2po40.5g，(nh4)2hpo42g，mgso4·h2o0.25g，ph6.0～6.5，121℃灭菌20min。

将步骤1)获得的丝瓜络生物质固定化载体于130℃下高温灭菌处理5h，按2ml/g的固液比，将丝瓜络生物质固定化载体放入增殖培养基中浸润12h。然后，按10％接种量接种步骤(二)获得的混合菌剂，放置于低温光照培养箱中，15℃避光培养7d，期间适量补充增殖培养基，得用于降解土壤中pahs的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒。

所得生物质固定化真菌-细菌混合颗粒经电子扫描显微镜检测，结果如图1所示。由图1可见，本发明丝瓜络生物质固定化载体表面粗糙，有脊，且截面处有大量空隙，壁褶皱不平，假单胞菌(pseudomonassp.)sdr4附着于丝瓜络表面及空隙之中的同时，还附着于丝状真菌高大毛霉(mucormucedo)s1菌丝表面，随真菌菌丝移动，可以更大程度的接触污染物。本发明丝瓜络生物质固定化载体具有极高的空隙率，低密度，较大的比表面积，从而具有较强的吸附微生物能力，从而发挥细菌-真菌对污染物协同降解作用。

实施例2

用于模拟土壤pahs生物降解试验方法

(一)模拟污染土壤的配制

精确称取30mg固体phe放入烧杯中，加入丙酮直至phe完全溶解，将溶液转置于250ml容量瓶中，丙酮定容，配置初始浓度为0.12mg·ml^-1phe丙酮溶液。

精确称取30mg固体pyr放入烧杯中，加入丙酮直至pyr完全溶解，将溶液转置于250ml容量瓶中，丙酮定容，配置初始浓度为0.12mg·ml^-1pyr丙酮溶液。

将土壤分装于培养瓶中，每瓶4g，置于高压蒸汽灭菌器灭菌30min。分别取1ml配置好的初始浓度均为0.12mg·ml^-1的phe、pyr的丙酮溶液拌入土壤中，配置phe、pyr初始含量均为30mg·kg^-1的污染土壤，充分搅拌均匀，放置过夜待丙酮完全挥发。

(二)方法

在上述配制好的污染土壤中投加土壤质量1％的实施例1制备的生物质固定化真菌-细菌混合颗粒，进行为期60天的降解试验。期间每天加灭菌水，保证50％的含水量。结果如图3所示。

由图3可见，试验60d，生物质固定化真菌-细菌混合颗粒对phe的降解率为64.23％，对pyr的降解率为42.43％。