一种花生原生质体提取方法及其应用与流程

本发明涉及植物技术领域，具体涉及一种花生原生质体提取方法及在外源基因导入花生原生质体中的应用。

背景技术：

植物原生质体是去除细胞壁后由细胞质膜包裹着的裸露的细胞，其保持着植物细胞全部的细胞器和与原细胞相似的生理功能，所以可以作为一种有效快捷的多功能实验材料，其广泛用于植物分子生物学和植物细胞工程实验中。植物原生质体没有细胞壁的阻碍，易于实现外源基因的高效导入和快速表达，可作为建立基因瞬时表达体系比较理想的转化受体，而peg法是最为常用导入外源基因于植物原生质体的方法之一。目前已在烟草(nicotianatabacuml.)、玉米(zeamaysl.)、拟南芥(arabidopsisthalianal.)、水稻(oryzasatival.)大豆(glycinemax(l.)merr.)等模式植物和重要作物中建立了比较成熟的原生质体瞬时表达体系^[1-4]，其中以拟南芥叶肉原生质体瞬时表达体系的应用最为广泛^[5]，而利用peg诱导转化的方法将外源基因转入花生叶肉细胞原生植体中尚未有成熟的技术。刘旭等虽曾报道将外源基因ahnac3基因导入花生原生质体，但使用其方法提取的花生原生质体易破裂且导入外源基因的转化率很低^[6]。

参考文献

[1]koophu,klaussteinmüller,wagnerh,etal.integrationofforeignsequencesintothetobaccoplastomeviapolyethyleneglycol-mediatedprotoplasttransformation[j].planta,1996,199(2):193-201.

[2]zhangy,suj,duans,etal.ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransientgeneexpressionandstudyinglight/chloroplast-relatedprocesses[j].plantmethods,2011,7(1):30.

[3]linw,wittenbachva.subcellularlocalizationofproteasesinwheatandcornmesophyllprotoplasts[j].plantphysiology,1981,67(5):969-972.

[4]rasmussenjo,rasmussenos.pegmediateddnauptakeandtransientgusexpressionincarrot,rapeseedandsoybeanprotoplasts[j].plantscience,1993,89(2):199-207.

[5]史勇,金维环,刘姣姣,王林会,陈彦惠.一种改良的拟南芥原生质体的制备和转化方法[j].生物技术,2019,29(02):147-152,170.

[6]liux,zhangby,hongl,etal.molecularcharacterizationofarachishypogaeanac2(ahnac2)revealsitasanac-likeproteininpeanut[j].biotechnology&biotechnologicalequipment,2010,24(4):2066-2070.

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种花生原生质体提取方法及其应用，从花生幼苗的幼叶提取花生原生质体，使花生原生质体完整度比例提高，外源基因在花生的原生质体中转化效率达到20％。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种花生原生质体的提取方法，包括如下步骤：

s1、选取2叶期花生的顶端稍微展开的嫩绿色幼叶，用镊子撕下表皮后放入装有酶解液的烧杯中，避光，置摇床中在50rpm的速度、温度26℃下酶解4h到5h；

所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、甘露醇、mes、cacl2、bsa；纤维素酶的质量浓度为1.5％，离析酶的质量浓度为0.75％，甘露醇的浓度为0.6mol/l，mes的浓度为10mmol/l，cacl2的浓度为15mmol/l，bsa的质量浓度为1％；

s2、酶解完成后，用60-100目细胞筛过滤，用w5溶液冲洗烧杯，再用细胞筛过滤，将两次的滤液合并转入离心管中，4℃，60×g离心3min；

所述w5溶液包括cacl2125mmol/l、nacl154mmol/l、glucose5mmol/l、mes5mmol/l、kcl5mmol/l，ph为5.8～6.0；

s3、弃上清，再加入2至3mlw5溶液洗涤混匀，离心，重复3次；然后加入新的w5溶液并混匀，于冰上静置30min；倒掉上清，加入mmg溶液至花生原生质体数2×10³/ml；所述mmg溶液包括甘露醇0.5mol/l、mgcl215mmol/l、mes4mmol/l，ph为5.8～6.0。

本发明还提供一种将上述花生原生质体的提取方法在外源基因导入花生原生质体中的应用，具体为：

(1)按照上述方法提取花生原生质体；

(2)取100μl步骤(1)提取得到的花生原生质体，加入10μl携有外源基因egfp的质粒中，轻轻吸打混匀；然后加入110μlpeg-cacl2溶液，轻轻吸打混匀，室温放置10min；

所述peg-cacl2溶液包括甘露醇0.2mmol/l、peg4000、cacl2150mmol/l；所述peg4000的质量浓度为40％；

(3)放置在冰上，然后加入1.4mlw5溶液混匀，冰上放置1min；

所述w5溶液包括cacl2125mmol/l、nacl154mmol/l、glucose5mmol/l、mes5mmol/l、kcl5mmol/l，ph为5.8～6.0；

(4)在4℃下，60×g离心3min，去上清，再用200μlw5溶液混匀，离心，重复清洗3次；

(5)放置于26℃、黑暗条件下培养24h。

进一步地，外源基因egfp的质粒的浓度为1000ng/μl。

本发明的有益效果在于：目前一些花生的基因只能在模式植物拟南芥的原生质体基因表达系统，难以准确地表示其亚细胞定位。本发明方法可以使提取到的花生原生质体的完整度比例有效提高，且外源基因在所提取的原生质体中转化效率达到20％。利用本发明方法可以观察外源基因在花生原生质体中的亚细胞定位，弥补研究缺陷；同时也可以利用得到的含外源基因的花生原生质体去进行组织培养，为得到非嵌合体的转基因提供方法。另外利用本发明可以开展免疫共沉淀实验观察，用于筛选和确定花生的互作蛋白。

附图说明

图1为本发明实施例1中提取得到的花生原生质体的观察结构示意图；

图2为本发明对比例1中提取得到的花生原生质体的观察结构示意图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

实施例1

本实施例提供一种花生原生质体的提取方法，包括如下步骤：

s1、选取2叶期花生的顶端稍微展开的嫩绿色幼叶，用镊子小心撕下表皮后，幼叶放入装有酶解液的烧杯中，避光，置摇床中在50rpm的速度、温度26℃下酶解4h到5h；

需要说明的是，所述酶解液包括纤维素酶(质量浓度1.5％)、离析酶(质量浓度0.75％)、甘露醇(0.6mol/l)和mes(一水吗啉乙磺酸，10mmol/l)。将上述试剂根据相应浓度加超纯水配制后，于水浴55℃水浴10min，恢复室温。再加入cacl215mmol/l和bsa(牛血清白蛋白)1％。

s2、酶解完成后，用60-100目细胞筛过滤，用w5溶液冲洗烧杯，再用细胞筛过滤，将两次的滤液合并转入离心管中，4℃，60×g离心3min，加速5档，减速4档。

需要说明的是，所述w5溶液包括cacl2(125mmol/l)、nacl(154mmol/l)、glucose(5mmol/l)、mes(5mmol/l)、kcl(5mmol/l)；混合上述试剂加超纯水配制至上述浓度后，调节溶液ph至5.8～6.0。

s3、弃上清，再加入2至3mlw5溶液洗涤混匀，离心，重复3次；然后加入新的w5溶液并混匀，于冰上静置30min。

冰上静置完成后，常温下，吸取上清，加入适量的mmg溶液，取少量液体在显微镜中观看花生原生质体密度和状态，浓度大概为20万个/100ml。如图1所示。

需要说明的是，所述mmg溶液包括甘露醇(0.5mol/l)、mgcl2(15mmol/l)、mes(4mmol/l)；混合上述试剂加超纯水配制至上述浓度后，调节溶液ph至5.8～6.0。

实施例2

本实施例提供一种将实施例1所述花生原生质体的提取方法在外源基因导入花生原生质体中的应用，具体为：

(1)按照实施例1所述方法提取花生原生质体；

(2)取100μl步骤(1)得到的花生原生质体，加入10μl携有外源基因egfp的质粒(浓度1000ng/μl)中，轻轻吸打混匀。然后加入110μlpeg-cacl2溶液，轻轻吸打混匀，室温放置10min。

需要说明的是，所述peg-cacl2溶液包括甘露醇(0.2mmol/l)、peg4000(40％)、cacl2(150mmol/l)；混合上述试剂加超纯水配制至上述浓度。

(3)放置在冰上，然后加入1.4mlw5溶液混匀，冰上放置1min。

(4)在4℃下，60×g离心3min，去上清，再用200μlw5溶液混匀，离心，重复清洗3次。

(5)放置于26℃、黑暗条件下培养24h。

用lsm800共聚焦显微镜于激发波长395-495nm中观察外源荧光绿色基因egfp是否导入原生质体并表达。结果显示，花生原生质体中egfp荧光蛋白表达比达20％，即外源荧光egfp基因能在实施例1方法所提取的花生原生质体中表达。

对比例1

一种将外源基因导入花生原生质体的方法，包括如下步骤：

选取花生第2至4叶已展开绿色叶片，用镊子小心撕下表皮后，幼叶放入装有酶解液的烧杯中，避光，置摇床中在50rpm的速度、温度26℃下酶解2到3h；所述酶解液包括纤维素酶(质量浓度1.5％)、离析酶(质量浓度0.75％)、甘露醇(0.5mol/l)和mes(一水吗啉乙磺酸，10mmol/l)。将上述试剂根据相应浓度加超纯水配制后，于水浴55℃水浴10min，恢复室温。再加入cacl215mmol/l和bsa(牛血清白蛋白)1％。

酶解完成后，用60-100目细胞筛过滤，用w5溶液冲洗烧杯，再过细胞筛，转入离心管中，4℃，60×g离心3min，加速5档，减速4档。所述w5溶液包括cacl2(125mmol/l)、nacl(154mmol/l)、glucose(5mmol/l)、mes(5mmol/l)、kcl(5mmol/l)；混合上述试剂加超纯水配制至上述浓度后，调节溶液ph至5.8～6.0。

弃上清，再加入2至3mlw5溶液洗涤混匀，离心，重复3次，清洗滤渣3次；然后加入新的w5溶液并混匀，于冰上静置30min。

冰上静置完成后，常温下，吸取上清，加入适量的mmg溶液，取少量液体在显微镜中观看原生质体密度和状态，浓度大概为20万个/100ml。

所述mmg溶液包括甘露醇(0.4mol/l)、mgcl2(15mmol/l)、mes(4mmol/l)；混合上述试剂加超纯水配制至上述浓度后，调节溶液ph至5.8～6.0。

本对比例提取得到的花生原生质体如图2所示。

从图2可见，本对比例提取的原生质体易破碎及易凝聚成团，而从图1可见，实施例1的方法提取的花生原生质体完整程度可达75％。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。