一种产乙醇酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产乙醇酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。


背景技术：

2.乙醇酸(英文名为glycolic acid)又名羟基乙酸，是最简单的α-羟基酸,被广泛用于工业加工、化妆品行业和聚合物(pga、plga)的合成。高纯度的乙醇酸价格在30000-40000元/吨。
3.目前，乙醇酸的合成主要有化学合成法和生物合成法。化学合成主要有氯乙酸法、甲醛羰基化法、氰化法、酯交换法等等，但是化学反应存在反应条件严苛、催化剂难以回收利用以及污染环境等缺点。生物合成法又可以细分为生物酶法合成和全生物合成，生物酶法主要利用的酶有产腈水解酶和产甘油氧化酶，分别水解乙醇腈和氧化乙二醇获得乙醇酸。由于生物酶法所需要的前体物质比较昂贵并且该前体物质本身或其降解产物有毒害作用，所以目前该方法并没有得到广泛的应用。为了解决上述问题，研究者试图以微生物为细胞工厂，以葡萄糖、木糖、乙醇、乙烯乙二醇等化合物作为碳源来生产乙醇酸。目前以葡萄糖为碳源，在大肠杆菌中利用乙醛酸途径最高能得到56.44g/l乙醇酸；以d-木糖和乙醇为碳源，在酵母工程菌中能得到15g/l乙醇酸；以乙烯乙二醇为碳源，利用毕赤酵母和红酵母能分别得到105g/l和110g/l的乙醇酸。除此之外，谷氨酸棒状杆菌、化能自养型铁硫细菌以及伯克霍尔德菌也被报道能用于乙醇酸的生产。
4.生物法合成乙醇酸的主要技术限制仍然是所采用途径的理论转化率低，因此一条新的高转化率路线亟待开发。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题为提供高产的乙醇酸菌株，以实现乙醇酸的高效合成。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组大肠杆菌。
7.本发明重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中蛋白质a的基因的表达量增加和/或所述蛋白质a的含量增加和/或所述蛋白质a的活性增加，和/或所述重组大肠杆菌中蛋白质b的基因的表达量降低和/或所述蛋白质b的含量降低和/或所述蛋白质b的活性降低；
8.所述蛋白质a选自如下至少一种：
9.a1)苹果酸硫激酶；
10.a2)苹果酰辅酶a裂解酶；
11.a3)乙醛酸还原酶；
12.a4)异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶；
13.a5)异柠檬酸裂解酶；
14.所述蛋白质b选自如下至少一种：
15.b1)nad依赖型-苹果酸酶；
16.b2)nadp依赖型-苹果酸酶；
17.b3)苹果酸合酶a；
18.b4)乙醛酸途径转录抑制因子；
19.b5)乙醇酸氧化酶。
20.上述重组大肠杆菌中，所述受体大肠杆菌可为大肠杆菌k12，更具体的为大肠杆菌bw25113。
21.上述重组大肠杆菌中，所述苹果酸硫激酶的基因来源于荚膜甲基球菌(methylococcus capsulatus)，所述苹果酰辅酶a裂解酶的基因来源于类球红细菌(rhodobacter sphaeroides)。
22.上述重组大肠杆菌中，所述乙醛酸还原酶可为c1)或c2)所示：
23.c1)seq id no.2所示的dna分子编码的蛋白质；
24.c2)将c1)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
25.所述异柠檬酸裂解酶可为c3)或c4)所示：
26.c3)seq id no.3第1-1305位所示的dna分子编码的蛋白质；
27.c4)将c3)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c3)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
28.所述异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶可为c5)或c6)所示：
29.c5)seq id no.3第1488-3224位所示的dna分子编码的蛋白质；
30.c6)将c5)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c5)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
31.所述苹果酸硫激酶可为c7)或c8)所示：
32.c7)seq id no.4第1-2088位所示的dna分子编码的蛋白质；
33.c8)将c7)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c7)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
34.所述苹果酰辅酶a裂解酶可为c9)或c10)所示：
35.c9)seq id no.4第2105-3061位所示的dna分子编码的蛋白质；
36.c10)将c9)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c9)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
37.所述nad依赖型-苹果酸酶可为c11)或c12)所示：
38.c11)seq id no.5所示的dna分子编码的蛋白质；
39.c12)将c11)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c11)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
40.所述nadp依赖型-苹果酸酶可为c13)或c14)所示：
41.c13)seq id no.6所示的dna分子编码的蛋白质；
42.c14)将c13)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c13)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
43.所述苹果酸合酶a可为c15)或c16)所示：
44.c15)seq id no.7所示的dna分子编码的蛋白质；
45.c16)将c15)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c15)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
46.所述乙醛酸途径转录抑制因子可为c17)或c18)所示：
47.c17)seq id no.8所示的dna分子编码的蛋白质；
48.c18)将c17)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c17)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
49.所述乙醇酸氧化酶可为c19)或c20)所示：
50.c19)seq id no.9所示的dna分子编码的蛋白质；
51.c20)将c19)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c19)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
52.其中，seq id no.2由939个核苷酸组成，第1-939位为编码序列，编码乙醛酸还原酶。
53.seq id no.3第1-1305位由1305个核苷酸组成，第1-1305位为编码序列，编码异柠檬酸裂解酶。
54.seq id no.3第1488-3224位由1737个核苷酸组成，第1488-3224位为编码序列，编码异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶。
55.seq id no.4第1-2088位由2088个核苷酸组成，第1-2088位为编码序列，编码苹果酸硫激酶。
56.seq id no.4第2105-3061位由957个核苷酸组成，第2105-3061位为编码序列，编码苹果酰辅酶a裂解酶。
57.seq id no.5由1695个核苷酸组成，第1-1695位为编码序列，编码nad依赖型-苹果酸酶。
58.seq id no.6由2217个核苷酸组成，第1-2217位为编码序列，编码nadp依赖型-苹果酸酶。
59.seq id no.7由1599个核苷酸组成，第1-1599位为编码序列，编码苹果酸合酶a。
60.seq id no.8由822个核苷酸组成，第1-822位为编码序列，编码乙醛酸途径转录抑制因子。
61.seq id no.9由1497个核苷酸组成，第1-1497位为编码序列，编码乙醇酸氧化酶。
62.上述重组大肠杆菌中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
63.上述重组大肠杆菌中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
64.上述重组大肠杆菌中，所述乙醛酸还原酶的基因(ghra)可为如下d1)或d2)所示：
65.d1)编码序列为seq id no.2所示的dna分子；
66.d2)将seq id no.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.2具有相同功能的dna分子；
67.所述异柠檬酸裂解酶的基因(acea)可为如下d3)或d4)所示：
68.d3)编码序列为seq id no3第1-1305位所示的dna分子；
69.d4)将seq id no.3第1-1305位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.3第1-1305位具有相同功能的dna分子；
70.所述异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的基因(acek)可为如下d5)或d6)所示：
71.d5)编码序列为seq id no.3第1488-3224位所示的dna分子；
72.d6)将seq id no.3第1488-3224位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.3第1488-3224位具有相同功能的dna分子；
73.所述苹果酸硫激酶的基因(mtk)可为如下d7)或d8)所示：
74.d7)编码序列为seq id no.4第1-2088位所示的dna分子；
75.d8)将seq id no.4第1-2088位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.4第1-2088位具有相同功能的dna分子；
76.所述苹果酰辅酶a裂解酶的基因(mcl)可为如下d9)或d10)所示：
77.d9)编码序列为seq id no.4第2105-3061位所示的dna分子；
78.d10)将seq id no.4第2105-3061位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.4第2105-3061位具有相同功能的dna分子；
79.所述nad依赖型-苹果酸酶的基因(maea)可为d11)或d12)所示：
80.d11)编码序列为seq id no.5所示的dna分子；
81.d12)将seq id no.5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.5具有相同功能的dna分子；
82.所述nadp依赖型-苹果酸酶的基因(maeb)可为d13)或d14)所示：
83.d13)编码序列为seq id no.6所示的dna分子；
84.d14)将seq id no.6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.3具有相同功能的dna分子；
85.所述苹果酸合酶a的基因(aceb)可为d15)或d16)所示：
86.d15)编码序列为seq id no.7所示的dna分子；
87.d16)将seq id no.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.7具有相同功能的dna分子；
88.所述乙醛酸途径转录抑制因子的基因(iclr)可为d17)或d18)所示：
89.d17)编码序列为seq id no.8所示的dna分子；
90.d18)将seq id no.8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.8具有相同功能的dna分子；
91.所述乙醇酸氧化酶的基因(glcd)可为d19)或d20)所示：
92.d19)编码序列为seq id no.9所示的dna分子；
93.d20)将seq id no.9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.9具有相同功能的dna分子。
94.本发明进一步提供了重组大肠杆菌的构建方法。
95.本发明重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：提高受体大肠杆菌中蛋白质a的基因的表达量和/或所述蛋白质a的含量和/或所述蛋白质a的活性，和/或降低所述受体大肠杆菌中蛋白质b基因的表达量和/或所述蛋白质b的含量和/或所述蛋白质b的活性：
96.所述蛋白质a选自如下至少一种：
97.a1)乙醛酸还原酶；
98.a2)异柠檬酸裂解酶；
99.a3)异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶；
100.a4)苹果酸硫激酶；
101.a5)苹果酰辅酶a裂解酶；
102.所述蛋白质b选自如下至少一种：
103.b1)nad依赖型-苹果酸酶；
104.b2)nadp依赖型-苹果酸酶；
105.b3)苹果酸合酶a；
106.b4)乙醛酸途径转录抑制因子；
107.b5)乙醇酸氧化酶。
108.在本发明具体的实施方式中，所述重组大肠杆菌的构建方法可以为如下p1)-p3)中任一种：
109.p1)提高受体大肠杆菌中乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶a裂解酶的基因的表达量和/或乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶a裂解酶的含量和/或乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶a裂解酶的活性，且降低所述受体大肠杆菌中nad依赖型-苹果酸酶、nadp依赖型-苹果酸酶、苹果酸合酶a、乙醛酸途径转录抑制因子和乙醇酸氧化酶的基因的表达量和/或nad依赖型-苹果酸酶、nadp依赖型-苹果酸酶、苹果酸合酶a、乙醛酸途径转录抑制因子和乙醇酸氧化酶的含量和/或nad依赖型-苹果酸酶、nadp依赖型-苹果酸酶、苹果酸合酶a、乙醛酸途径转录抑制因子和乙醇酸氧化酶的活性；
110.p2)提高受体大肠杆菌中乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶a裂解酶的基因的表达量和/或乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶a裂解酶的含量和/或乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶a裂解酶的活性，且降低所述受体大肠杆菌中nad依赖型-苹果酸酶、nadp依赖型-苹果酸酶和苹果酸合酶a的基因的表达量和/或nad依赖型-苹果酸酶、nadp依赖型-苹果酸酶、苹果酸合酶a、乙醛酸途径转录抑制因子和乙醇酸氧化酶的含量和/或nad依赖型-苹果酸酶、nadp依赖型-苹果酸酶、苹果酸合酶a、乙醛酸途径转录抑制因子和乙醇酸氧化酶的活性；
111.p3)提高受体大肠杆菌中乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶a裂解酶的基因的表达量和/或乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅酶a裂解酶的含量和/或乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶、苹果酸硫激酶和苹果酰辅
酶a裂解酶的活性。
112.上述方法中，所述构建方法是通过将所述蛋白质a的基因导入受体大肠杆菌中实现；所述受体大肠杆菌为大肠杆菌突变体或野生型大肠杆菌；
113.所述蛋白质a选自如下至少一种：
114.a1)乙醛酸还原酶；
115.a2)异柠檬酸裂解酶；
116.a3)异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶；
117.a4)苹果酸硫激酶；
118.a5)苹果酰辅酶a裂解酶。
119.上述方法中，所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌基因组进行下述m1)-m5)全部、任四种、任三种、任两种或任一种的改造得到的：
120.m1)将nad依赖型-苹果酸酶的基因(maea)敲除；
121.m2)将nadp依赖型-苹果酸酶的基因(maeb)敲除；
122.m3)将苹果酸合酶a的基因(aceb)敲除；
123.m4)将乙醛酸途径转录抑制因子的基因(iclr)敲除；
124.m5)将乙醇酸氧化酶的基因(glcd)敲除。
125.在本发明具体的实施方式中，所述大肠杆菌突变体为如下任一种：
126.m1)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)-m5)的改造得到的大肠杆菌突变体；
127.m2)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)-m4)的改造得到的大肠杆菌突变体；
128.m3)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)-m3)的改造得到的大肠杆菌突变体；
129.m4)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)和m2)的改造得到的大肠杆菌突变体；
130.m5)所述大肠杆菌突变体为对所述野生型大肠杆菌进行上述m1)的改造得到的大肠杆菌突变体。
131.上述方法中，所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌k12，更具体的为大肠杆菌bw25113。
132.上述方法中，所述敲除是利用p1噬菌体转导敲除基因技术进行基因敲除。
133.在本发明具体的实施方式中，所述乙醛酸还原酶的基因(ghra)、异柠檬酸裂解酶的基因(acea)、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的基因(acek)通过重组载体甲导入到受体大肠杆菌，所述重组载体甲为将yb1s载体的ncoi和ecori位点间的片段替换为ghra基因后，且保持yb1s载体其他序列不变得到的重组表达载体pyb1s-ghra，然后将pyb1s-ghra重组表达载体的ecori和psti位点间的片段替换为包含acea和acek基因的片段后，且保持pyb1s-ghra载体其他序列不变得到的重组表达载体pyb1s-ghra-aceak。
134.所述苹果酸硫激酶的基因(mtk)和苹果酰辅酶a裂解酶的基因(mcl)通过重组载体乙导入到受体大肠杆菌，所述重组载体乙为将psb1a载体的ncoi和ecori位点间的片段替换为包含mtk和mcl基因的片段后，且保持psb1a载体其他序列不变得到的重组表达载体psb1a-mtk-mcl。
135.上述方法中，苹果酸硫激酶的基因(mtk)来源于methylococcus capsulatus，所述苹果酰辅酶a裂解酶的基因(mcl)来源于rhodobacter sphaeroides。
136.上述方法中，所述乙醛酸还原酶可为c1)或c2)所示：
137.c1)seq id no.2所示的dna分子编码的蛋白质；
138.c2)将c1)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
139.所述异柠檬酸裂解酶可为c3)或c4)所示：
140.c3)seq id no.3第1-1305位所示的dna分子编码的蛋白质；
141.c4)将c3)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c3)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
142.所述异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶可为c5)或c6)所示：
143.c5)seq id no.3第1488-3224位所示的dna分子编码的蛋白质；
144.c6)将c5)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c5)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
145.所述苹果酸硫激酶可为c7)或c8)所示：
146.c7)seq id no.4第1-2088位所示的dna分子编码的蛋白质；
147.c8)将c7)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c7)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
148.所述苹果酰辅酶a裂解酶可为c9)或c10)所示：
149.c9)seq id no.4第2105-3061位所示的dna分子编码的蛋白质；
150.c10)将c9)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c9)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
151.所述nad依赖型-苹果酸酶可为c11)或c12)所示：
152.c11)seq id no.5所示的dna分子编码的蛋白质；
153.c12)将c11)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c11)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
154.所述nadp依赖型-苹果酸酶可为c13)或c14)所示：
155.c13)seq id no.6所示的dna分子编码的蛋白质；
156.c14)将c13)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c13)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
157.所述苹果酸合酶a可为c15)或c16)所示：
158.c15)seq id no.7所示的dna分子编码的蛋白质；
159.c16)将c15)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c15)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
160.所述乙醛酸途径转录抑制因子可为c17)或c18)所示：
161.c17)seq id no.8所示的dna分子编码的蛋白质；
162.c18)将c17)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c17)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
163.所述乙醇酸氧化酶可为c19)或c20)所示：
164.c19)seq id no.9所示的dna分子编码的蛋白质；
165.c20)将c19)中的蛋白质的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c19)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
166.其中，seq id no.2由939个核苷酸组成，第1-939位为编码序列，编码乙醛酸还原酶。
167.seq id no.3第1-1305位由1305个核苷酸组成，第1-1305位为编码序列，编码异柠檬酸裂解酶。
168.seq id no.3第1488-3224位由1737个核苷酸组成，第1488-3224位为编码序列，编码异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶。
169.seq id no.4第1-2088位由2088个核苷酸组成，第1-2088位为编码序列，编码苹果酸硫激酶。
170.seq id no.4第2105-3061位由957个核苷酸组成，第2105-3061位为编码序列，编码苹果酰辅酶a裂解酶。
171.seq id no.5由1695个核苷酸组成，第1-1695位为编码序列，编码nad依赖型-苹果酸酶。
172.seq id no.6由2217个核苷酸组成，第1-2217位为编码序列，编码nadp依赖型-苹果酸酶。
173.seq id no.7由1599个核苷酸组成，第1-1599位为编码序列，编码苹果酸合酶a。
174.seq id no.8由822个核苷酸组成，第1-822位为编码序列，编码乙醛酸途径转录抑制因子。
175.seq id no.9由1497个核苷酸组成，第1-1497位为编码序列，编码苹果酰辅酶a裂解酶。
176.上述方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
177.上述方法中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
178.上述方法中，所述乙醛酸还原酶的基因(ghra)可为如下d1)或d2)所示：
179.d1)编码序列为seq id no.2所示的dna分子；
180.d2)将seq id no.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.2具有相同功能的dna分子；
181.所述异柠檬酸裂解酶的基因(acea)可为如下d3)或d4)所示：
182.d3)编码序列为seq id no.3第1-1305位所示的dna分子；
183.d4)将seq id no.3第1-1305位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.3第1-1305位具有相同功能的dna分子；
184.所述异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的基因(acek)可为如下d5)或d6)所示：
185.d5)编码序列为seq id no.3第1488-3224位所示的dna分子；
186.d6)将seq id no.3第1488-3224位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.3第1488-3224位具有相同功能的dna分子；
187.所述苹果酸硫激酶的基因(mtk)可为如下d7)或d8)所示：
188.d7)编码序列为seq id no.4第1-2088位所示的dna分子；
189.d8)将seq id no.4第1-2088位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.4第1-2088位具有相同功能的dna分子；
190.所述苹果酰辅酶a裂解酶的基因(mcl)可为如下d9)或d10)所示：
191.d9)编码序列为seq id no.4第2105-3061位所示的dna分子；
192.d10)将seq id no.4第2105-3061位经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.4第2105-3061位具有相同功能的dna分子；
193.所述nad依赖型-苹果酸酶的基因(maea)可为d11)或d12)所示：
194.d11)编码序列为seq id no.5所示的dna分子；
195.d12)将seq id no.5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.5具有相同功能的dna分子；
196.所述nadp依赖型-苹果酸酶的基因(maeb)可为d13)或d14)所示：
197.d13)编码序列为seq id no.6所示的dna分子；
198.d14)将seq id no.6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.6具有相同功能的dna分子；
199.所述苹果酸合酶a的基因(aceb)可为d15)或d16)所示：
200.d15)编码序列为seq id no.7所示的dna分子；
201.d16)将seq id no.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.7具有相同功能的dna分子；
202.所述乙醛酸途径转录抑制因子的基因(iclr)可为d17)或d18)所示：
203.d17)编码序列为seq id no.8所示的dna分子；
204.d18)将seq id no.8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.8具有相同功能的dna分子；
205.所述乙醇酸氧化酶的基因(glcd)可为d19)或d20)所示：
206.d19)编码序列为seq id no.9所示的dna分子；
207.d20)将seq id no.9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与seq id no.9具有相同功能的dna分子。
208.上述构建方法得到的重组大肠杆菌及其在制备乙醇酸中的应用也在本发明的保护范围之内。
209.本发明进一步公开了一种制备乙醇酸的方法。
210.本发明制备乙醇酸的方法，包括：利用上述重组大肠杆菌催化葡萄糖反应得到乙醇酸。
211.具体的，所述重组大肠杆菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组大肠杆菌，用所述诱导后重组大肠杆菌催化葡萄糖反应得到乙醇酸。
212.上述方法中，所述阿拉伯糖诱导培养是在含有阿拉伯糖的培养基中进行的，所述
诱导培养的温度为30℃，时间为16h。
213.上述方法中，所述阿拉伯糖为l-阿拉伯糖。
214.本发明构建了重组大肠杆菌，通过改变葡萄糖摄入途径及糖酵解途径使磷酸烯醇式丙酮酸大量积累，进而增强固碳途径以获得大量的前体物质草酰乙酸；通过削弱三羧酸循环氧化链以及加强乙醛酸途径第一步反应，从而加强中间产物乙醛酸的合成，减少碳硫的流失。并且引入了逆向乙醛酸途径，从而使进入三羧酸循环的乙酰辅酶a与逆向乙醛酸途径释放的乙酰辅酶a形成循环，在大量草酰乙酸的推进下，进一步提高乙醛酸的合成效率；最后增强乙醇酸合成途径所需的乙醛酸还原酶基因的表达，从而获得高效合成乙醇酸的能力。
215.本发明以葡萄糖为原料进行发酵、转化，同时引入固碳途径和反向乙醛酸途径构建的重组大肠杆菌使葡萄糖具有更高的转化率，大大提高了乙醇酸的产量，使得以葡萄糖为原料合成乙醇酸具有巨大的潜力。
附图说明
216.图1为利用葡萄糖为原料的重组大肠杆菌工程菌株乙醇酸产量。
具体实施方式
217.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
218.下述实施例中，大肠杆菌bw25113(datsenko ka,wanner bl.one-step inactivation of chromosomal genes in escherichia coli k-12using pcr products.proc.natl.acad.sci.u.s.a.2000；97(12):6640-6645.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌bw25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
219.实施例1重组大肠杆菌工程菌株ga00-ga07的构建
220.1、构建表达大肠来源的乙醛酸还原酶的重组质粒(pyb1s-ghra)。
221.(1)大肠杆菌基因组dna的提取和ghra基因的pcr扩增。
222.采用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，产品目录为dp302)提取大肠杆菌bw25113的基因组dna。以提取大肠杆菌基因组总dna作为模板，以ghra-f和ghra-r为引物(表1)，用高保真transstart fastpfu dna聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为ap221)pcr扩增，获得pcr产物，对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，得到包含基因ghra(核苷酸序列如seq id no.2所示)的基因片段ghra-nx。
223.(2)构建含有ghra基因的重组表达载体。
224.用ncoi和xhoi酶切载体pyb1s(载体pyb1s核苷酸序列如seq id no.1，其中，第86-964位为arac基因编码序列，第1238-1266位为p
bad
启动子序列，第1295-1299位为rbs序列，第1307-1312位为ncoi位点，第1366-1371位为xhoi位点，第1393-1398位为ecori位点，第1414-1419位为psti位点，第1501-1658位为t
rrnb
终止子序列，第1667-2457位为p15a复制起始位点ori基因编码序列，第2561-3349位为链霉素抗性基因编码序列)，回收载体大片段
pyb1s-nx。用gibson组装方法(gibson dg,young l,et al.enzymatic assembly of dna molecules up to several hundred kilobases.nat.methods.2009；6(5):343-345)将基因片段ghra-nx与载体大片段pyb1s-nx进行连接反应，获得连接产物。用cacl2法将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录为cd201)，并将其均匀涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜，挑选克隆，用引物105-f和ghra-r(表1)鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，获得阳性质粒命名为pyb1s-ghra。
225.2、构建协同表达大肠来源的乙醛酸还原酶、异柠檬酸裂解酶和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的重组质粒(pyb1s-ghra-aceak)。
226.提取大肠杆菌的基因组dna，用引物acea-f和acek-r扩增获得包含基因aceak(核苷酸序列如seq id no.3所示)的基因片段aceak-nx，同时将rbs序列引入在引物中。用ecori和psti酶切载体pyb1s-ghra获得载体大片段yb1s-ghra-ep。将基因片段aceak-nx与载体大片段yb1s-ghra-ep片段进行连接反应，得到的连接产物用cacl2法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，并将其均匀涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物acea-f和124-r(表1)鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，筛选阳性克隆，并获得阳性质粒命名为pyb1s-ghra-aceak。
227.3、构建协同表达methylococcus capsulatus来源的苹果酸硫激酶和rhodobacter sphaeroides来源的苹果酰辅酶a裂解酶的重组质粒psb1a-mtk(mca)-mcl(rsp)。
228.人工合成经过大肠杆菌密码子优化过的methylococcus capsulatus来源的苹果酸硫激酶基因mtk和rhodobacter sphaeroides来源的苹果酰辅酶a裂解酶基因mcl，基因mcl前加了rbs序列，按照上述扩增ghra的方法，用引物mtk(mca)-f和mcl(rsp)-r(表1)扩增出mtk(mca)-mcl(rsp)-nx片段(含有rbs的mtk(mca)-mcl(rsp)的核苷酸序列如seq id no.3)。用ncoi和xhoi酶切载体psb1a(载体yb1s核苷酸序列如seq id no.10，其中，第86-964位为arac基因编码序列，第1238-1266位为p
bad
启动子序列，第1295-1299位为rbs序列，第1307-1312位为ncoi位点，第1366-1371位为xhoi位点，第1501-1658位为t
rrnb
终止子序列，第2260-3210位为p15a复制起始位点repa基因编码序列，第3832-4692位为氨苄青霉素抗性基因编码序列)，回收载体大片段sb1a-nx。将mtk(mca)-mcl(rsp)-nx片段与载体片段sb1a-nx进行gibson组装，得到的连接产物转化大肠杆菌dh5感受态细胞，并将其均匀涂布含氨苄青霉素的lb平板上37℃培养过夜，挑选克隆，用引物105-f和124-r(表1)鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，筛选阳性克隆，获得阳性质粒命名为psb1a-mtk(mca)-mcl(rsp)。
229.4、构建宿主菌
230.(1)nad依赖型-苹果酸酶基因maea的敲除
231.nad依赖型-苹果酸酶基因maea的编码序列如seq id no.5第1-1695位所示。
232.(1-a)制备含有maea敲除性状的大肠杆菌基因片段的p1噬菌体，即噬菌体p1virδmaea
233.含有maea敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw5238，该菌株为含有maea敲除性状的w3110系列菌株，购自日本国立遗传学研究所(nig，japan)，其中的编码nad依赖型-苹果酸酶基因maea替换为两端带有frt位点的卡那霉素抗性基因(约1300bp)从而
将maea基因敲除(baba t,ara t, et al. construction of escherichia coli k-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the keio collection.mol.syst.biol.2006；2:2006.0008.)。
234.具体所述p1噬菌体制备过程如下：将jw5238菌株在37℃过夜培养后，转接于含5mmol/lcacl2和0.1％葡萄糖的lb培养基中，37℃培养1h，然后，加入野生型p1噬菌体继续培养1-3h，加几滴氯仿再培养几分钟，离心取上清即得到含有maea敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体p1virδmaea。
235.(1-b)利用p1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株ga01-kan，具体步骤如下：过夜培养的xy24(受体菌)(记载有该菌的非专利文献为“metabolic engineering of escherichia coli for production of l-aspartate and its derivativeβ-alanine with high stoichiometric yield.metabolic engineering.54:244-254.”)，1.5ml菌液8000rpm离心3分钟后，用0.75ml的p1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mm cacl2和5mm mgso4)重悬xy24菌体细胞，获得xy24菌体细胞悬浮液；将100μl噬菌体p1virδmaea与100μl xy24菌体细胞悬浮液混和，37℃孵育30min。然后，加入1ml的lb培养基和200μl的1mol/l柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用200μl的lb培养基重悬后，涂布含卡那霉素的lb平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上，37℃培养过夜后，挑选克隆，用引物maea-f/maea-r(表1)pcr扩增鉴定(扩增出1900bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为ga01-kan。
236.(1-c)抗性的消除：将pcp20质粒(购自clontech公司)通过氯化钙转化法转化至ga01-kan，在含有氨苄青霉素的lb平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pcp20的重组大肠杆菌ga01-kan/pcp20。在含有氨苄青霉素抗性的lb培养基30℃培养后，涂布于无抗性lb平板上42℃培养过夜，挑选克隆，用引物maea-f/maea-r(表1)pcr扩增鉴定(扩增出600bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为大肠杆菌突变体ga01。
237.(2)nadp依赖型-苹果酸酶基因maeb的敲除。
238.nadp依赖型-苹果酸酶基因maeb的编码序列如seq id no.6第1-2217位所示。
239.从大肠杆菌突变体ga01出发，使用步骤(1)的相同方法，将nadp依赖型-苹果酸酶基因maeb敲除，获得大肠杆菌突变体ga02。其中与步骤(1)的区别在于：使用菌株、引物名称不同，即将“含有maea敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw5238”替换为“含有maeb敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw2447(购自日本国立遗传学研究所(nig，japan))”；对应引物的名称中由maea变为maeb，具体见表1。
240.(3)苹果酸合酶a基因aceb的敲除。
241.苹果酸合酶a基因aceb的编码序列如seq id no.7第1-1599位所示。
242.从大肠杆菌突变体ga02出发，使用步骤(1)的相同方法，将苹果酸合酶基因aceb敲除，获得大肠杆菌ga03。其中与步骤(1)的区别在于：使用菌株、引物名称不同，即将“含有maea敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw5238”替换为“含有aceb敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw3974(购自日本国立遗传学研究所(nig，japan))”；对应引物的名称中由maea变为aceb，具体见表1。
243.(4)乙醛酸途径转录抑制因子基因iclr的敲除。
244.乙醛酸途径转录抑制因子基因iclr的编码序列如seq id no.8第1-822位所示。
245.从大肠杆菌突变体ga03出发，使用步骤(1)的相同方法，将乙醛酸途径转录抑制因
子基因iclr敲除。获得重组大肠杆菌ga04。其中与步骤(1)的区别在于：使用菌株、引物名称不同，即将“含有maea敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw5238”替换为“含有iclr敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw3978(购自日本国立遗传学研究所(nig，japan))”；对应引物的名称中由maea变为icl，具体见表1。
246.(5)乙醇酸氧化酶基因glcd的敲除。
247.乙醇酸氧化酶基因glcd的编码序列如seq id no.9第1-1497位所示。
248.从大肠杆菌突变体ga04出发，使用步骤(1)的相同方法，将乙醇酸氧化酶基因glcd敲除，获得大肠杆菌ga05。其中与步骤(1)的区别在于：使用菌株、引物名称不同，即将“含有maea敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw5238”替换为“含有glcd敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw2946(购自日本国立遗传学研究所(nig，japan))”；对应引物的名称中由maea变为glcd，具体见表1。
249.5、重组大肠杆菌的构建
250.(1)重组大肠杆菌ga06的构建
251.将大肠杆菌突变体ga05制备感受态细胞，将质粒pyb1s-ghra-aceak用cacl2法转化ga05，涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜，挑选克隆，采用步骤1-4中所述的引物鉴定所对应的目的片段，鉴定正确的克隆命名为重组大肠杆菌ga06。
252.(2)重组大肠杆菌ga07的构建
253.将大肠杆菌突变体ga06制备感受态细胞，将质粒psb1a-mtk-mcl用cacl2法转化ga06，涂布于含链霉素和氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养过夜，挑选克隆，采用步骤1-4中所述的引物鉴定所对应的目的片段，鉴定正确的克隆命名为重组大肠杆菌ga07。
254.(3)重组大肠杆菌ga00的构建。
255.将大肠杆菌突变体ga05制备感受态细胞，将质粒pyb1s和psb1a用cacl2法转化ga05，涂布于含链霉素和氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养过夜，挑选克隆，采用步骤1-4中所述的引物鉴定所对应的目的片段，鉴定正确的克隆命名为重组大肠杆菌ga00。
256.表1引物序列列表
257.[0258][0259]
实施例2利用重组大肠杆菌菌株ga00、ga06、ga07以葡萄糖为原料生产乙醇酸
[0260]
1、培养基的配方
[0261]
(11)lb培养基成分如下：
[0262]
酵母粉：5g/l
[0263]
蛋白胨：10g/l
[0264]
nacl：10g/l
[0265]
(12)自诱导培养基zym配方如下：
[0266]
100ml a+2ml b+2ml c+200μl d+100μl e(以下均为质量百分比浓度)；
[0267]
a.zy：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；
[0268]
b.50
×
m：1.25m na2hpo4，1.25m kh2po4，2.5m nh4cl和0.25m na2so4；
[0269]
c.50
×
5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％l-阿拉伯糖；
[0270]
d.500
×
mgso4：1m mgso4[0271]
e.1000
×
微量元素：50mm fecl3，20mm cacl2，10mm mncl2，10mm znso4，cocl2、nicl2、na2mo4、na2seo3和h3bo3各2mm。
[0272]
(13)转化液成分如下：
[0273]
葡萄糖10g/l、nahco
3 100mm/l、100mm kh2po4/k2hpo
4 buffer。
[0274]
2、菌体的培养和酶的诱导
[0275]
将甘油管保存的相关工程菌株ga00、ga06、ga07在含有相应抗生素(实施例1(5)中所述)的lb平板上，37℃长出单克隆。挑取单克隆接种于含有相应抗生素的液体lb培养基中，37℃震荡培养(转数200rpm)16h，按1％接种量，转接于含50ml zym自诱导培养基的摇瓶中，加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖和终浓度为千分之一的链霉素和氨苄青霉素，30℃诱导培养16h后，收集菌体。
[0276]
3、全细胞催化进行转化
[0277]
将上述收集的150od菌体，4℃、5000rpm离心10min，使用0.85％生理盐水洗涤两次，弃上清后，将菌体用5ml转化液重悬，转移到试管，使其最终od值为30，37℃、200rpm进行转化，转化4h、6h、8h后分别取样，将样品在4℃、13000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm滤膜过滤后，用高效液相色谱(hplc)检测有机酸和葡萄糖的量，实验设置三次重复，结果取平
均值。
[0278]
高效液相色谱检测仪器及检测条件如下：
[0279]
检测仪器：岛津lc-20at 220v
[0280]
检测条件：流动相是5mm h2so4，流速0.6ml/min，检测的色谱柱型号是aminex hpx-87h(300mm
×
7.8mm)，柱温55℃，示差检测检测波长210nm，进样量10μl，每个样品检测分析时间30min。
[0281]
参照标品(购自sigma-aldrich公司，货号420581)出峰时间和峰面积，制定标准曲线，再根据样品的峰面积，计算样品中乙醇酸的含量。
[0282]
结果如图1所示，从图中可以看出：ga07的乙醇酸产量为4.13g/l，ga06的产量为1.94g/l，而ga00的产量为0，说明所构建菌株的性状对乙醇酸产量至关重要。
[0283]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。