一种能够调控MSCs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能够调控mscs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品。

背景技术：

间充质干细胞(mscs)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有以下特性：一、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。二、具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制t细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。三、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。四、面目模糊，表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在血液病治疗方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)来源于不同组织，是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，体内和体外培养均可使其向成脂肪、成骨和成软骨分化。但其具体的分化机制研究甚少。

磷酸酶wip1(野生型p53诱导的磷酸酶1)是由ppm1d基因编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，是一种p53依赖的基因，属于pp2c(蛋白磷酸酶2c)家族，该家族成员主要参与细胞代谢过程，包括增殖、凋亡、分化等等。wip1在原核生物和真核生物中均有表达，主要存在细胞核中。在细胞稳态调控、dna损伤修复、抗衰老、肿瘤发生及免疫调控等方面具有重要作用，并作为原癌基因受到越来越多的关注。

pp2a是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2，在人类其由ppp2ca基因编码，由a和b两个亚单位组成。对磷酸酶的调节起到重要作用，对细胞内多种信号通路产生影响。研究已经发现pp2a影响成骨细胞和脂肪细胞的分化，通过调节相关转录因子的表达来确定成骨细胞或脂肪细胞的表型。

过氧化物酶体增殖体激活受体-γ(peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ，ppar-γ)，是重要的细胞分化转录因子，在哺乳动物的脂肪组织、血管平滑肌组织、心肌组织中均有表达。ppar-γ是由配体激活的核转录因子，活化后可以调控多种核内靶基因的表达。研究发现，ppar-γ具有调节脂肪代谢、炎症、免疫以及细胞分化等作用，参与诸多慢性免疫性疾病的发生及发展。ppar-γ是mscs成脂早期过程中的转录因子，ppar-γ高表达，说明细胞成脂分化能力强。

技术实现要素：

我们通过研究发现，wip1基因敲除后mscs成脂分化能力显著下降，进一步研究发现，具体机制是wip1基因通过调控pp2a-ppar-γ信号通路促进mscs的成脂分化。

本发明目的之一是wip1基因调控mscs成脂肪分化能力的分子机制研究提供新的线索，为临床研究应用mscs治疗疾病提供新靶标。

具体方案：本发明人利用成熟的小鼠骨组织来源的mscs分离培养和体外诱导培养体系，经实验研究发现wip1基因通过调节pp2a-ppar-γ信号通路调控mscs的成脂分化；具体实施过程，体外分离培养wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs，进一步诱导，成脂分化后检测成脂相关转录因子ppar-γ，c/ebpα变化。结果表明，wip1^-/-mscs成脂诱导后，脂滴数量显著减少，成脂相关转录因子表达显著降低。采用基因芯片结合生物信息学分析，发现wip1^-/-mscs中pp2a表达降低。收集mscs成脂诱导第0天，第2天，第4天和第5天的样本，q-pcr检测发现成脂相关转录因子ppar-γ与pp2a变化一致。利用pp2asirna敲低mscs中pp2a，q-pcr和westernblot检测结果显示，敲低pp2a基因后，成脂分化关键转录因子ppar-γ表达显著下调，说明成脂分化能力降低，从而证实wip1具有促进mscs成脂分化能力。

首先，本发明提供了一种能够调控mscs成脂肪分化能力的基因，所述基因为wip1基因。

优选的，所述wip1基因正向调控mscs成脂肪分化能力。

优选的，所述wip1基因通过调节pp2a-ppar-γ信号通路调控mscs的成脂分化。

优选的，所述间充质干细胞包括牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。

在本发明上述应用的一些实施方案中，所述间充质干细胞(mscs)为小鼠骨组织来源的间充质干细胞。

进一步地，本发明提供了一种基因修饰间充质干细胞的生物制剂，所述基因为wip1基因，所述制剂中含有促进wip1基因表达的试剂和促进wip1基因表达产物的试剂。如mscs成脂分化的促进剂。

优选的，所述促进wip1基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂，促进基因翻译的试剂，促进wip1蛋白含量提高的试剂；所述促进wip1基因表达产物的试剂包括促进wip1基因表达稳定性的试剂，促进wip1基因表达产物活性的试剂，促进wip1基因表达产物功能的试剂。

进一步地，本发明提供了一种基因修饰间充质干细胞的生物制剂，所述基因为wip1基因，所述制剂中含有降低wip1基因表达的试剂和降低wip1基因表达产物的试剂。

优选的，所述降低wip1基因表达的试剂是通过sirna敲低pp2a基因使得成脂关键转录因子ppar-γ表达显著下调，从而抑制msc成脂分化能力。

优选的，pp2asirna具有seqidno:9-seqidno:14所示的核苷酸序列。

更进一步地，本发明提供了一种细胞治疗药物，所述药物通过wip1基因修饰间充质干细胞起作用。

优选地，所述细胞治疗药物包括外用细胞治疗药物或注射细胞治疗药物。

再进一步地，本发明还提供了一种基因改造mscs的方法，所述方法是通过调控wip1基因的表达进而调节pp2a-ppar-γ信号通路来改造mscs。

具体为：

1)从1周龄c57bl/6小鼠骨组织中分离获取间充质干细胞，然后进行原代培养和传代培养；

2)利用sirna瞬时转染技术将pp2asirna导入p3代间充质干细胞，然后培养。

sirna瞬时转染的转染体系为：jetprimereagentbuffer200ul/2ml、sirna3ul/2ml、jetprimereagent4ul/2ml，转染时间为48h。

最后，本发明还提供了一种基因改造mscs的方法在制备利用mscs治疗疾病药物中的应用，所述利用mscs治疗疾病药物包括肿瘤药物等。

有益效果

本发明人通过实验发现，wip1基因通过pp2a-ppar-γ信号通路调节mscs成脂分化的能力，为mscs生物学特性的研究及临床应用提供了理论与实验依据，也为临床研究应用mscs治疗疾病提供新靶标。因此，可将wip1用于制备调控mscs成脂分化的产品，如mscs成脂分化的促进剂。本发明采用成熟的小鼠骨组织来源的mscs分离培养技术，结合特定的成脂诱导分化体系及特定的接种细胞数，稳定的基因转染敲低技术，可操作性强，方便实用。

附图说明

图1所示为鼠尾基因型鉴定结果；

图2为wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs成脂诱导后油红o染色结果；

图3为wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs成脂诱导后油红o染色，显微镜下脂滴计数结果和成脂相关转录因子ppar-γ和c/ebpα变化；

图4为293t细胞过表达wip1后pp2a表达升高；

图5为mscs成脂诱导后相关因子变化；

图6为敲低mscs中pp2a，ppar-γ表达降低。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所用常规基础方法示例如下：

wip1：geneid:53892

ppar-γ：geneid:19016

pp2a：geneid:19052

c/ebpα：geneid:12606

基因型鉴定方法如下：

首先提取鼠尾dna，然后pcr扩增，最后水平电泳检测基因型。

鼠尾dna提取如下：收集需要检测的小鼠尾尖0.5～1cm，至于1.5mlep管中，并做好标记(或-20℃冰箱暂存)；加入200μl裂解液，用眼科剪把组织剪成小块；55℃孵育2h，间断混匀裂解液使组织消化充分；在通风橱内，加入200μl酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)至裂解液中，剧烈震荡，充分混匀变性蛋白质，至于离心机中最高转速离心10min；取出离心管，小心的收取上层水相的上清约180μl(<200μl，切勿吸入中间层沉淀)，加入10％体积的醋酸钠和60％体积的异丙醇，混合均匀，至于离心机中最高转速离心10min；去除上清，加入70％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，离心机中最高转速离心后去除上清；晾干，加入50μlte溶液或ddh2o溶解dna，得到的基因组即可用于pcr。

原代mscs培养方法：

1)断颈处死1周龄小鼠，75％酒精浸泡5分钟；

2)无菌条件下剪取胫骨、股骨骨干，置于含10％血清的完全培养基的青瓶中；

3)眼科剪剪碎，1％ⅱ型胶原酶消化45min；

4)将骨片移至装有10％血清的完全培养基的25cm²培养瓶中，用电动移液枪吹散，放置孵箱培养；

5)72h后换液，弃去悬浮细胞，每2～3d换一次液；

6)待细胞长至80～90％融合后，胰蛋白酶消化，传代，重复上述步骤，直至细胞培养至p3待用。

继代培养方法：

胰酶消化细胞，血清终止，拍打培养瓶瓶壁，使所有细胞脱落，移入离心管，1000rpm/min，离心10min，弃去上清，完全培养基重悬细胞，接种于培养瓶。

293t细胞过表达方法：

首先复苏实验室保存的293t细胞，接种于t75培养瓶培养，传代后接种于六孔板，1×10⁵/孔，长到80％融合换液，加入转染试剂(jetprimereagentbuffer200ul/孔、质粒1ug/孔、jetprimereagent4ul/孔)，转染时间为48h，收取细胞用于继续实验。

芯片方法：

委托康普森公司，按照程序化流程操作。

实施例1：小鼠基因组总dna提取及基因型鉴定

通过wip1^+/-小鼠的交配，获得1周龄小鼠，剪取鼠尾进行基因型鉴定。图1为基因型鉴定结果，2号和5号是wip1^+/+小鼠，1号，6号和4号是杂合小鼠，3号为wip1^-/-小鼠。

实施例2：wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs体外分离培养和成脂诱导分化

将上述例一中鉴定出的wip1^+/+小鼠和wip1^-/-小鼠消毒后超净工作台内提取骨片，行原代mscs培养。将体外分离培养的p2代wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs，接种于六孔板进行成脂诱导。用油红o染色，检测wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs成脂分化结果计数形成的脂滴数。如图2为油红o染色结果，可以发现两种mscs均可向成脂细胞分化，a、b：wip1^+/+mscs；c、d：wip1^-/-mscs；a、c：自分化组；b、d:诱导组。如图3a为高倍视野下脂滴计数结果，发现wip1^+/+mscs脂滴更多。图3b和图3c为q-pcr检测成脂相关转录因子结果。显示与wip1^-/-mscs成脂关键转录因子ppar-γ和c/ebpα表达显著降低。q-pcr检测所用引物如表1所示。

以上结果表明wip1缺失可使mscs成脂分化能力显著降低。

表1：引物与基因序列

实施例3：wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs中pp2a表达差异

wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs芯片显示pp2a在两种细胞中的表达存在明显差异，为此，提取p3代wip1^+/+mscs和wip1^-/-mscs蛋白，westernblot进行验证。结果如图4a所示wip1^-/-mscs中pp2a表达下降，差异显著。

为探讨wip1与pp2a是否存在相互作用，我们将293t细胞过表达wip1-gfp。如图4b所示，流式细胞术检测结果显示转染效率为57.5％，说明wip1基因成功转入293t细胞。如图4c所示，荧光显微镜下可见大量荧光细胞。图4d所示结果为westernblot检测发现wip1过表达，同时pp2a表达亦显著升高。

实施例4：成脂诱导过程中pp2a与成脂相关转录因子变化一致

mscs成脂诱导分化后，收集第0天，第2天，第4天和第5天的样本，q-pcr检测成脂诱导分化过程中成脂相关关键转录因子ppar-γ、c/ebpα和pp2a表达。如图5所示，成脂过程中ppar-γ和c/ebpα均先升高后降低，pp2a与其变化趋势一致。

实施例5：干扰pp2a表达后ppar-γ表达亦降低

体外分离培养mscs，传至p3代接种于6孔板，转染pp2asirna。合成3对sirnapp2a，(序列为seqidno:9-seqidno:14)，转染48h后，收集细胞，q-pcr验证，挑选一组敲低效果最好的用于后续实验。如图6a所示，sirna-615敲低效果最好。选择sirna-615，再次转染mscs，如图6b所示pp2a敲低。进一步检测，pp2a敲低后成脂肪相关转录因子变化。如图6c所示，q-pcr检测发现ppar-γ表达亦显著降低。图6d所示，westernblot检测发现pp2a表达降低同时ppar-γ表达也降低。

上述实验结果表明，wip1基因敲低的mscs成脂分化能力亦显著降低，wip1通过调节pp2a-ppar-γ信号通路影响mscs的成脂分化。

以上结果表明，wip1基因具有促进mscs成脂分化作用。可用于制备mscs促分化产品，或者在治疗肥胖时，敲除wip1基因可更好的治疗肥胖，为成脂分化机制提供了新的信号通路机制。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一种能够调控mscs成脂肪分化能力的基因及其衍生产品

<130>p200123

<141>2020-01-16

<160>16

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