与猪肌内脂肪含量性状相关的分子标记及其应用的制作方法

【
技术领域：
】本发明涉及猪分子标记筛选
技术领域：
，具体涉及与猪肌内脂肪含量性状相关的分子标记及其应用。
背景技术：
：猪肉质性状是一项重要的经济性状，一直是育种工作者关注的重点。肌内脂肪含量作为重要的肉质性状，在很大程度上决定了猪肉的口感、风味与品质，具有重要的经济价值(zhangetal.2019)。在长期追求瘦肉型猪的育种过程中，通过背膘厚性状的选择使得猪瘦肉率得到极大的提高，然而在商业猪品种中猪肉的口感、风味与品质均出现不同程度的降低。如何提高猪肉品质，生产肌内脂肪含量高、优质美味的猪肉是当前市场的需求，也是育种工作的重要目标。然而，肉质性状需要屠宰后测定，属于难于度量的性状范畴，在遗传改良中具有较大的难度(maetal.2018)。现阶段主要的思路是：通过标记辅助选择或基因组选择方法对肌内脂肪含量等肉质性状进行遗传改良，但目前与猪肌内脂肪含量性状相关的分子标记依然十分有限。本发明利用fst(weiretal.1984)和xpehh(sabtebietal.2007)两个群体间选择信号的检测方法，针对大白猪肌内脂肪含量性状，通过构建3个表型梯度变化群体对，准确定位出肌内脂肪含量性状特异的选择信号关联位点，确定潜在的性状特异选择信号候选区域，结合数据库挖掘等生物信息分析手段准确定位了位于4号染色体上两个重要的snp标记与两个基因片段与肌内脂肪含量性状密切相关。目前上述成果尚未见报道，因此该标记的发现对于猪肉质性状的遗传改良具有潜在的重要价值。技术实现要素：鉴于上述内容，有必要提供与猪肌内脂肪含量性状相关的分子标记及其应用，该分子标记能应用于筛选肌内脂肪含量高/低的猪，为猪的肌内脂肪含量选择和提高提供了新的分子标记基础。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：与猪肌内脂肪含量相关的分子遗传标记，，所述的分子遗传标记至少包括以下标记之一：标记一：位于猪第4号染色体第89398587位核苷酸，该位点的碱基为g或a，对应核苷酸序列表seqidno.1的第51位碱基；(rs55617884)标记二：位于猪第4号染色体第90378144位核苷酸，该位点的碱基为t或c，对应核苷酸序列表seqidno.2的第51位碱基。(rs80782100)进一步的，所述猪第4号染色体的第89398587位碱基为g的纯合体时，为gg型；所述猪第4号染色体的第89398587位碱基为a的纯合体时，为aa型；所述猪第4号染色体的第89398587位碱基为g和a的杂合体时，为ga型；所述猪第4号染色体的第90378144位碱基为c的纯合体时，为cc型；所述猪第4号染色体的第90378144位碱基为t的纯合体时，为tt型；所述猪第4号染色体的第90378144位碱基为c和t的杂合体时，为tc型。进一步的，所述aa型基因的猪其肌内脂肪含量高于ga型和gg型；所述tc型基因的猪其肌内脂肪含量高于tt型和cc型。用于扩增所述分子遗传标记的引物或鉴定所述分子遗传标记的探针。含有所述引物或探针的试剂盒。本发明还包括所述分子遗传标记在高或低猪肌内脂肪含量品种或品系选育中的用途。本发明还包括利用所述分子标记在选育或辅助选猪肌内脂肪含量高/低猪的方法，所述方法为：提取目标猪的总dna，检测猪的第4号染色体的第89398587位核苷酸，判断猪的基因型为gg型、ga型或aa型；检测猪的第90378144位核苷酸，判断猪的基因型为cc型、tc型或tt型；针对需求选择不同基因型的猪。本发明获取与猪肌内脂肪含量相关的分子遗传标记的方法，其特征在于，所述方法为：屠宰实验测定猪肌内脂肪含量，并构建3个表型梯度变化群体对；采用群体间选择信号检测方法fst和xpehh分别检测三对极端表型梯度变化的群体对的选择信号特征；计算上述显著选择信号位点在3组梯度对中的snp位点选择信号梯度变化指数；表示为第1指数、第2指数；第1指数为最高差异梯度对计算统计量和中等差异梯度对计算统计量之差，第2指数为普通差异梯度对计算统计量和中等差异梯度对计算统计量之差，呈现统计量大小梯度递增，即计算选择位点梯度变化指数第1指数为正值、第2指数为负值的位点被定义为目标性状关联位点，具备选择潜力。基于fst方法共检测到位于ssc4上的4个符合上述条件的snp分子标记位点；在3组极端表型差异梯度对中分别计算xpehh统计量，分别对3组极端表型差异对中计算获得的正负统计量进行秩排序，统计量位于前1％的值定义为选择信号显著位点，基于xpehh方法共检测到位于ssc4上的14个符合上述条件的snp分子标记位点，将上述目标性状关联的snp分子位点左右100kb的区域定义为目标性状选择信号候选区域，并将有重合的区域进行合并之后得到肌内脂肪含量性状关联的特异选择信号区域。本发明具有如下有益效果：本发明筛选的分子标记通过新的建模方法，判断出于猪肌内脂肪含量相关基因的位置，然后通过进一步的精细定位找出与猪肌内脂肪含量性状相关的基因位点，该位点可应用于对猪肌内脂肪相关基因的基因型或猪肌内脂肪相关的关联分析中，为猪肌内脂肪的分子标记辅助选择提供了新的分子标记资源。本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的对猪肌内脂肪进行分子标记辅助选择，与目前的pcr-rflp等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点，本发明筛选的与猪肌内脂肪含量性状相关的潜在候选基因可以丰富猪的基因库，为猪的育种做出贡献。【附图说明】图1：肌内脂肪含量梯度变化群体对各亚群全基因组连锁不平衡水平程度及其衰减趋势图。其中，左图为高肌内脂肪含量各亚群全基因组连锁不平衡水平程度及其衰减趋势图；右图为低肌内脂肪含量各亚群全基因组连锁不平衡水平程度及其衰减趋势图；图标中high_1(high_2,high_3)和low_1(low_2,low_3)表示第1(2,3)个群体对的两个子群体。图2：猪肌内脂肪含量性状特异的选择信号位点的分布示意图。其中，上图为利用fst方法揭示的肌内脂肪含量性状特异的选择信号位点的分布；下图为利用xpehh方法揭示的肌内脂肪含量性状特异的选择信号位点的分布；附图标记说明：肌内脂肪含量性状特异选择信号的可视化。黑色点表示性状特异选择信号。方块(圆点，三角形)点表示在第1(2,3)个群体对中识别的选择信号，其中xpehh方法具有选择指示作用，l代表肌内脂肪含量低的亚群，h代表肌内脂肪含量高的亚群。【具体实施方式】为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。实施例1：基因分型及检测相同生产条件下，使用相同的饲料配方饲养233头猪至屠宰体重，开展屠宰实验并获得肌内脂肪含量表型数据，根据表型数据构建3个表型梯度变化群体对。(1)使用标准苯酚-氯仿法，提取233头大白猪个体耳组织的基因组dna，使用illumina猪snp60k芯片(illumina,sandiego,ca,usa)对全体猪群进行基因分型，获得snp分型数据。(2)对基因型数据进行质量控制，删去最小等位基因频率<0.05的11624个snps,hw检验删去42个标记(p<＝10-6)，最终的数据集由18条染色体上的37061个snps组成。(3)计算按肌内脂肪含量划分群体对各亚群肉质的最小等位基因频率，并对所有亚群全基因组连锁不平衡水平及其衰减规律进行分析。实施例2：大白猪肌内脂肪含量性状特异选择信号检测：为检测性状特异选择信号，在本研究中，我们首先组建了三对表型呈梯度变化的群体对，相邻梯度对的样本数目差值是40。针对肌内脂肪含量，以下是具体步骤：(1)对统计的233头大白猪的肌内脂肪含量表型值进行秩排序；(2)根据排序结果，选择肌内脂肪含量最高的105个个体和肌内脂肪含量最低的105个个体形成普通差梯度对，记录为第一群体对；(3)在普通差梯度对的基础上，从105个肌内脂肪含量高的个体中选择更高肌内脂肪含量的75个个体，从105个肌内脂肪含量低的个体中选择更低肌内脂肪含量的75个个体，创建出中等差异梯度对，记录为第二群体对；(4)在中等差异梯度对的基础上，从75个更高肌内脂肪含量的个体中选择35个更高肌内脂肪含量个体，从75个更低肌内脂肪含量的个体中选择35个更低肌内脂肪含量个体，创建出一个最大差异梯度对，记录为第三个群体对；(5)对各亚群进行连锁不平衡分析，其结果表明人为制造表型梯度差异群体对各群体基因组结构特征并无显著影响(图1：如图所示，ld曲线衰减趋势在所有亚群体中衰减速度相似，说明群体划分的影响不会对性状特异性选择信号的检测造成负面影响)。(6)采用群体间选择信号检测方法fst和xpehh分别检测三对极端表型梯度变化的群体对的选择信号特征。首先，将计算获得的fst统计量进行秩排序，其中统计量位于每个梯度对前1％的值定义为选择信号显著位点。计算上述显著选择信号位点在3组梯度对中的snp位点选择信号梯度变化指数，表示为第1指数、第2指数。第1指数＝最高差异梯度对计算统计量–中等差异梯度对计算统计量，第2指数＝普通差异梯度对计算统计量–中等差异梯度对计算统计量，呈现统计量大小梯度递增，即计算选择位点梯度变化指数第1指数为正值、第2指数为负值的位点被定义为目标性状关联位点，具备选择潜力。基于fst方法共检测到位于ssc4上的4个符合上述条件的snp分子标记位点(表1)。其次，在3组极端表型差异梯度对中分别计算xpehh统计量。鉴于xpehh统计量正负值能够反映选择发生的方向，分别对3组极端表型差异对中计算获得的正负统计量进行秩排序，统计量位于前1％的值定义为选择信号显著位点。在上述显著选择信号位点的基础上，在3组梯度对中呈现统计量正值大小梯度递增(或负值递减)的位点被定义为目标性状关联位点，具备选择潜力。基于xpehh方法共检测到位于ssc4上的14个符合上述条件的snp分子标记位点(表2)。表1：猪4号染色体目标区域肌内脂肪含量fst统计量染色体位置(bp)普通差异梯度对中等差异梯度对最大差异梯度对4893394744.479927e-025.703801e-021.500577e-014893815483.306270e-026.583257e-021.042938e-014894495903.330626e-027.143678e-021.775239e-014896696673.321305e-026.301678e-021.269859e-01表2：猪4号染色体目标区域肌内脂肪含量xpehh统计量(7)将上述目标性状关联的snp分子位点左右100kb的区域定义为目标性状选择信号候选区域，并将有重合的区域进行合并之后得到了位于ssc4上的89239474bp-89769667bp和89982606bp-90446408bp这两个区域为肌内脂肪含量性状关联的特异选择信号区域。基于步骤(7)中的两个性状特异的选择信号候选区域，根据“数据库基因95”和“猪基因(sscrofa11.1)”数据库，使用biomart程序检测位于上述候选区域内的基因。通过基因直系同源比对的思想，利用mgi数据库，在小鼠表型数据库中进一步筛选影响肌肉性状的功能候选基因，部分具有功能报道的基因如表3所示。这些性状特异选择信号区域内发现的具有明确功能报道的基因，在很大程度上证明了本研究中鉴定出来的ssc4上89239474bp-89769667bp和89982606bp-90446408bp的区域为肌内脂肪含量性状特异选择信号候选区域的可靠性。表3:猪4号染色体目标区域肌内脂肪含量性状相关的5个功能候选基因例如，在4号染色体89239474bp-89769667bp区域内富集了ndufs2和usf1两个与能量代谢以及脂质稳态相关的重要功能候选基因；在4号染色体89982606bp-90446408bp区域内富集了casq1和igsf8两个与肌肉发育有关的重要功能候选基因。分别对这两个区域内的snp进行分析发现，有两个变异(rs55617884(第89398587位碱基)和rs80782100(第90378144位碱基))分别位于usf1基因和igsf8基因中，上述两个snps也是肌内脂肪含量性状特异的选择信号位点，因此可以推断上述位点可能对该基因的功能产生影响，从而影响其脂质稳态和肌肉发育的功能，进而影响猪的肉质性状。上述实施例主要是通过利用受选择snp位点的梯度变化指数评估猪肉质性状特异选择区域的方法，筛选出了ssc4上89239474bp-89769667bp和89982606bp-90446408bp的区域为猪肉质性状特异选择区域。并通过生物信息学分析，富集到了具有调节肌肉发育的候选基因，证明了本研究结果的可靠性；同时揭示了两个与猪肌内脂肪含量性状密切相关的功能候选位点。对组肌内脂肪含量进行统计分析当猪第4号染色体的第89398587位碱基为a的纯合体时，为aa型；所述猪第4号染色体的第89398587位碱基为g和a的杂合体时，为ga型；所述猪第4号染色体的第90378144位碱基为c的纯合体时，为cc型；当猪第4号染色体的第90378144位碱基为t的纯合体时，为tt型；所述猪第4号染色体的第90378144位碱基为c和t的杂合体时，为tc型。对样本肌内脂肪含量进行分析得到结果如表4和表5：表4：猪4号染色体第89398587位核苷酸基因型与肌内脂肪含量分析结果基因型猪数(头)基因型频率肌内脂肪含量(％)aa型640.272.26±0.55ga型1300.562.21±0.52gg型390.172.19±0.54可见aa型猪的肌内脂肪含量高于ga型高于gg型。表5：猪4号染色体第90378144位核苷酸基因型与肌内脂肪含量分析结果基因型猪数(头)基因型频率肌内脂肪含量(％)tt型210.092.14±0.54tc型1180.512.28±0.52cc型940.402.17±0.54可见tc型猪的肌内脂肪含量高于cc型高于tt型。实施例3：根据上述筛选得到的基因结果，显示，本申请与猪肌内脂肪相关的分子遗传标记，所述的分子遗传标记位于猪的第4号染色体的第89398587核酸位点，该位置为一个a>g突变，对应位于核酸序列表seqidno.1的第51位核酸位点(rs55617884基因)；或第4号染色体的第90378144核酸位点，该位置为一个t>c突变，对应位于核酸序列表seqidno.1的第51位核酸位点(rs55617884基因)。实施例4：本领域技术人员很容易根据本发明的分子遗传标记设计出用于扩增该分子标记的引物或鉴定所述分子标记的探针，从而用于该遗传标记的检测，例如通过pcr扩增得到所述分子遗传标记，再通过克隆测序得到相应的序列，或者通过bsm-rflp多态性进行检测。因此，本发明还包括用于扩增所述分子遗传标记的引物或鉴定所述分子遗传标记的探针，以及含有所述引物或探针的试剂盒。实施例5：可应用本申请的分子遗传标记辅助进行猪的育种或辅助育种工作，具体方法为：提取目标猪的总dna，检测猪的第4号染色体的第89398587位核苷酸，判断猪的基因型为gg型、ga型或aa型；检测猪的第90378144位核苷酸，判断猪的基因型为cc型、tc型或tt型；针对需求选择不同基因型的猪。综上所述，使用本申请的方法能简单、高效、准确的获取与猪肌内脂肪相关的分子遗传标记，根据该突变可设计出用于扩增该分子标记的引物和鉴定分子标记的探针；快速筛选出肌内脂肪含量符合要求的猪，能有效提高筛选分子标记的准确率和效率。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>广西扬翔股份有限公司华中农业大学<120>与猪肌内脂肪含量性状相关的分子标记及其应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>101<212>dna<213>猪属猪(susscrofa)<220><221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>nisgora<220><221>misc_feature<222>(51)..(51)<223>nisa,c,g,toru<400>1agaagggaaccaataggatgggggtgtggcacgggatggtgaggcagctanagctgcctt60gacccaaagctctaggctctccctttctggatgtttctact101<210>2<211>101<212>dna<213>猪属猪(susscrofa)<220><221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>nistorc<220><221>misc_feature<222>(51)..(51)<223>nisa,c,g,toru<400>2tttaaaaactcccagatgattcagggtgcagacagggtgggaaccaactgngtctaagat60cgctagctcatcagagctatcaggtaatggggggccaggct101当前第1页12