一种用于检测比格犬封闭群的微卫星标记及其组合的制作方法

本发明涉及一种用于检测比格犬封闭群的微卫星标记，特别是用于检测比格犬封闭群的微卫星标记的组合。
背景技术：
：比格犬(beagle)又称米格鲁猎犬或小猎兔犬，原产英国，是猎犬中较小的一种，1880年传入美国，是国际通用的品种犬之一。它具有体型小、性格温顺、反应均一、重复性好、大脑发达和适应性强等优点，非常适合用于生命科学和医学研究，是理想的实验动物，也是国际公认的实验用犬。比格犬在急性毒性试验等药物非临床研究中的应用十分广泛，在使用比格犬复制口腔、泌尿系统疾病的动物模型也有报道。此外，比格犬还可用于遗传学、微生物学和生物学等多个领域的研究。2015年，全国比格犬年用量为1.96万只，占全国实验犬用量的80％。据专家估计，2018年我国比格犬的用量已达到10万余只。虽然比格犬具有对实验反应均一性、重复性和可比性良好等特点，但由于我国早在1983年就正式引进比格犬，经过近30年的繁殖已基本形成适应于国内饲养环境的封闭群，受种群、饲养环境等对方面因素的影响，其遗传信息和生物学特性相比于国外种群也发生了一定程度的变化。面对多地域，多学科，大数量的比格犬市场需求，为了保证比格犬的质量，建立比格犬遗传质量检测方法，进而建立其遗传质量标准已成为比格犬生产质量保障体系的当务之急。微卫星(microsatellite)，又称短串联重复(shorttandemrepeats，str)，是指以少数几个核苷酸(一般为2至6个)为重复单位组成的简单多次串联重复序列。在真核生物中，微卫星广泛存在于染色体几乎所有区域。微卫星标记按其核心单位的碱基数可分为1、2、3、4、5、6核苷酸微卫星。按微卫星自身结构，weber将微卫星分为完全、不完全和复合微卫星：完全型微卫星是由不中断的重复单位串联而成；不完全微卫星是指重复单位间有3个以下的非重复碱基间隔，且两间隔间重复单位连续重复数不低于3；复合微卫星是指由几类串联重复单位构成，中间有3个以下碱基间隔，且重复单位连续重复数不低于5。微卫星标记由核心序列和两侧保守的侧翼序列构成，保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。利用微卫星dna侧翼序列设计引物进行pcr扩增，由于重复次数的不同形成片段长度不同，经电泳分离，成像表现出不同的电泳带型。微卫星dna具有丰富的多态性、遗传连锁不平衡现象、数量多分布均匀、易检测、重复性好、省时，适于自动化分析和在相关物种之间具有保守性等特点而广泛应用于生命科学的研究中。主要表现在以下几个方面：(1)构建基因图谱微卫星是一种共显性标记，其遗传分析过程相对简化，不仅利于作图群体间标记转换，而且也便于从遗传图谱向物理图谱过渡。(2)制作dna指纹图，微卫星最早应用之一就是制作dna指纹图来进行个体、品种(系)鉴定。(3)定位功能基因和数量性状基因座(qtl)利用微卫星与某些功能基因或qtl间的连锁关系，可将一些功能基因或qtl定位在染色体上或连锁群中，这方面的研究在家畜(禽)中己有一些利用。(4)进行血缘鉴定和血缘控制，在育种中，系谱记录是十分重要的，最早用于血型和血液蛋白多态性分析，但因多态性不够丰富而让位于dna指纹技术。(5)用于群体遗传多样性、遗传结构及起源的研究，nei等(1994)认为，用微卫星估计亲缘关系较近的群体间的遗传距离、绘制系统发育树时，比其它的遗传标记技术更精确和高效。国际动物遗传学会(isag，internationalsocietyofanimalgenetics)在2001-2002年首次验证不同微卫星dna标记在犬亲权鉴定中的有效性及可靠性，并推荐22个位点供作参考使用。然而这些微卫星位点完全不适用于封闭群比格犬遗传质量的检测与监测。技术实现要素：本发明之一提供了一种微卫星标记，其包括fh2776、pez1、fh3972、c08.618、c14.866、ren06c11、ren85n14、cph17、pez3、fh2626、ren87o21、ren239k24、fh3082、af85862和pez2中的至少一种；其中，所述fh2776通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.1和seqidno.2为引物对进行pcr扩增得到；所述pez1通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.3和seqidno.4为引物对进行pcr扩增得到；所述fh3972通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.5和seqidno.6为引物对进行pcr扩增得到；所述c08.618通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.7和seqidno.8为引物对进行pcr扩增得到；所述c14.866通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.9和seqidno.10为引物对进行pcr扩增得到；所述ren06c11通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.11和seqidno.12为引物对进行pcr扩增得到；所述ren85n14通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.12和seqidno.14为引物对进行pcr扩增得到；所述cph17通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.15和seqidno.16为引物对进行pcr扩增得到；所述pez3通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.17和seqidno.18为引物对进行pcr扩增得到；所述fh2626通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.19和seqidno.20为引物对进行pcr扩增得到；所述ren87o21通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.21和seqidno.22为引物对进行pcr扩增得到；所述ren239k24通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.23和seqidno.24为引物对进行pcr扩增得到；所述fh3082通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.25和seqidno.26为引物对进行pcr扩增得到；所述af85862通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.27和seqidno.28为引物对进行pcr扩增得到；所述pez2通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.29和seqidno.30为引物对进行pcr扩增得到。本发明之二提供了一种微卫星标记组合，所述组合包括fh2776、pez1、fh3972、c08.618、c14.866、ren06c11、ren85n14、cph17、pez3、fh2626、ren87o21、ren239k24、fh3082、af85862和pez2。在一个具体实施方式中，所述组合还包括fh2313、fh2263、fh2054、ren286p03和pez8中的至少一种；其中，所述fh2313通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.31和seqidno.32为引物对进行pcr扩增得到；所述fh2263通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.33和seqidno.34为引物对进行pcr扩增得到；所述fh2054通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.35和seqidno.36为引物对进行pcr扩增得到；所述ren286p03通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.37和seqidno.38为引物对进行pcr扩增得到；所述pez8通过以比格犬的基因组为模板，以seqidno.39和seqidno.40为引物对进行pcr扩增得到。在一个具体实施方式中，所述组合包括所述fh2313、所述fh2263、所述fh2054、所述ren286p03和所述pez8。本发明之三提供了一种引物对，所述引物对包括seqidno.1和seqidno.2组成的引物对、seqidno.3和seqidno.4组成的引物对、seqidno.5和seqidno.6组成的引物对、seqidno.7和seqidno.8组成的引物对、seqidno.9和seqidno.10组成的引物对、seqidno.11和seqidno.12组成的引物对、seqidno.12和seqidno.14组成的引物对、seqidno.15和seqidno.16组成的引物对、seqidno.17和seqidno.18组成的引物对、seqidno.19和seqidno.20组成的引物对、seqidno.21和seqidno.22组成的引物对、seqidno.23和seqidno.24组成的引物对、seqidno.25和seqidno.26组成的引物对、seqidno.27和seqidno.28组成的引物对、seqidno.29和seqidno.30组成的引物对中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述引物对还包括seqidno.31和seqidno.32组成的引物对、seqidno.33和seqidno.34组成的引物对、seqidno.35和seqidno.36组成的引物对、seqidno.37和seqidno.38组成的引物对、seqidno.39和seqidno.40组成的引物对中的至少一种。本发明之四提供了一种引物对组合，所述组合包括seqidno.1和seqidno.2组成的引物对、seqidno.3和seqidno.4组成的引物对、seqidno.5和seqidno.6组成的引物对、seqidno.7和seqidno.8组成的引物对、seqidno.9和seqidno.10组成的引物对、seqidno.11和seqidno.12组成的引物对、seqidno.12和seqidno.14组成的引物对、seqidno.15和seqidno.16组成的引物对、seqidno.17和seqidno.18组成的引物对、seqidno.19和seqidno.20组成的引物对、seqidno.21和seqidno.22组成的引物对、seqidno.23和seqidno.24组成的引物对、seqidno.25和seqidno.26组成的引物对、seqidno.27和seqidno.28组成的引物对、seqidno.29和seqidno.30组成的引物对。在一个具体实施方式中，所述组合还包括seqidno.31和seqidno.32组成的引物对、seqidno.33和seqidno.34组成的引物对、seqidno.35和seqidno.36组成的引物对、seqidno.37和seqidno.38组成的引物对、seqidno.39和seqidno.40组成的引物对。本发明之五提供了本发明之一所述的微卫星标记、本发明之二中任意一项所述的微卫星标记的组合、本发明之三所述的引物对、本发明之四所述的引物对组合在用于检测、鉴定和区分比格犬封闭群中的至少一种中的应用。在一个具体实施方式中，所述比格犬为小型比格犬、中型比格犬和大型比格犬中的至少一种。本发明的有益效果本发明首次确立了能够用于比格犬封闭群检测的多个微卫星位点。基于这些微卫星位点的组合可以对封闭群比格犬进行群体遗传质量检测，从而建立一种可以有效检测封闭群比格犬遗传质量的方法，进而有助于封闭群比格犬遗传质量标准的建立，从而规范比格犬的生产和应用，对封闭群比格犬的遗传状况进行全面、客观、公正的评价，为实现我国封闭群比格犬的应用和资源有效保存以及提出封闭群比格犬遗传质量控制标准及相应技术规范奠定基础。附图说明图1显示了部分比格犬基因组dna的0.8％琼脂糖电泳结果。m泳道为50bpmarker，1至3泳道为小型比格犬的基因组dna，4至6泳道为中型比格犬的基因组dna，7至10泳道为大型比格犬的基因组dna。图2显示了部分比格犬的潜在微卫星位点的0.8％琼脂糖电泳结果。m泳道为50bpmarker，1至10泳道为不同的潜在微卫星位点。图3显示了基于遗传距离的4个厂家的小型比格犬群体聚类图。具体实施方式实施例11.1.1实验动物随机选取购自青岛博隆实验动物有限公司的非同窝不限性别的小型比格犬共30只。每只单独静脉采取血液5ml于各抗凝采血管中，保存于4℃冰箱备用。同样随机选取购自青岛博隆实验动物有限公司的非同窝不限性别的中型比格犬6只以及非同窝不限性别的大型比格犬6只，每只单独静脉抽取血液5ml于各抗凝采血管中，保存于4℃冰箱备用。1.1.2比格犬血液样本基因组dna的提取与检测使用血液基因组dna提取试剂盒(qiaampdnabloodmidikit，德国qiagen公司)，按照说明书对上述各比格犬的血液样本分别进行基因组dna的提取。经微量紫外分光光度计测得所提取的基因组dna的浓度，所有样品的a260/a280值均在1.8-2.0之间。将dna原液稀释成80ng/μl。稀释的dna经0.8％琼脂糖电泳检测，其中，部分比格犬基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。结果表明，各基因组dna比较完整，可用于下一步pcr分析。1.1.3通过普通pcr反应扩增初筛潜在的微卫星位点制备6个dna池，每个dna池中包含上述其中1只小型、1只中型和1只大型比格犬的dna样本，不同dna池间的各比格犬的dna样本不重复。设计并合成用于筛选潜在微卫星位点的120对pcr引物。采用20μl反应体系：80ng/μl基因组dna池样品2μl，上、下游引物(分别10μmol/μl)各1μl，10×pcr缓冲液2μl，dntpmg2+plus(100μmol/l)4μl，taq酶(5u/μl)0.2μl，补充9.8μl的双蒸水(ddh2o)。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火1min(每个位点的退火温度经53-60℃之间的优化确定)，72℃延伸1min；循环35次；72℃继续延伸10min；扩增产物于4℃保存。琼脂糖凝胶电泳初步检测pcr产物，凝胶成像系统进行图像采集和分析。结果在120个潜在微卫星位点中有101个能够显示出扩增条带，说明被成功扩增，将其确定为阳性条带。其中部分微卫星位点电泳图如2所示。然后选择在小型、中型和大型3个群体中多态性高(即电泳检测条带较粗，或者有明显多条主要条带)、产物条带较为集中、无非特异性的杂带，并且在犬全部39对染色体上较均匀覆盖的位点(保证每对染色体上含有两个位点)，最终获得73个潜在微卫星位点，见表1。根据同一对引物所扩增的目的条带间大小差异越大越优和不同引物对间的退火温度越接近越优两个原则将该73个位点进行后续荧光引物标记分组。1.1.4str扫描利用荧光引物扩增的潜在微卫星位点将通过上述普通引物筛选到共计73个潜在微卫星位点重新合成荧光标记的引物(上海生工有限公司合成)，当同一组别包括三个位点时，用fam、hex、tamra分别标记于三个位点上游引物的5’端；当同一组别包括两个位点时，用fam和tamra分别标记于两个位点上游引物的5’端；用fam标记于其他位点上游引物的5’端。73个微卫星位点的位点名称、染色体位置、荧光标记及退火温度见表1。表1.73个比格犬微卫星位点名称、染色体位置、荧光标记及退火温度用荧光引物对30只小型比格犬的dna样品分别进行pcr扩增同1.1.3小节的普通引物实验过程，其中，退火温度见表1。然后进行str扫描以统计潜在微卫星位点的等位基因个数和片段大小范围并基于扫描结果进行基因分型。结果表明，有64个微卫星位点可以成功分型，其检出率较高，结果详见表2。说明这些位点可以用于比格犬群体遗传结构分析，但是位点数目偏多，而且有些位点的扫描图不够明晰，例如ren107h05，因此更优地是对这些位点进一步优化。表264个小型比格犬微卫星位点名称以及在青岛博隆封闭群中检测到的等位基因个数和等位基因范围1.1.5统计学方法扫描结果由genemarkerv2.2.0软件分析30个样本在73个比格犬微卫星位点的扩增片断大小。每个位点的等位基因根据扩增片断大小从大到小顺序排列记录为a、b、c、d、e……每个样本的基因型即可记录为aa、ab、ac、ad……1.1.6小型比格犬群体遗传变异分析进一步选取等位基因个数大于等于4、并且扫描结果好的比格犬微卫星位点(49个)，用popgene3.1软件对小型比格犬群体遗传结构特征分析(表3)。结果表明，使用该49个微卫星位点在小型比格犬中共检测到413个等位基因，平均每个微卫星位点有8.4个。其中等位基因数最多的是fh3083位点，有25个等位基因；最少的是fh2062、fh2890、fh2326、ren106i06、fh2885、ren164b05、fh2060和fh2708，分别只有4个等位基因。群体的杂合度也通过popgene3.1软件由不同微卫星位点的等位基因频率计算所得，如表3所示，不同微卫星位点的群体杂合度各不相同。在fh3083该微卫星位点上检测的平均杂合度显示为最高(0.9367)，而在fh2062位点检测到的平均杂合度显示为最低(0.3361)。最终所选的49个微卫星位点的整体平均杂合度达到0.7375。表3小型比格犬青岛博隆封闭群49个微卫星位点上的等位基因个数、平均杂合度和多态性信息含量以多态性信息含量(polymorphisminformationcontent，pic)来判断位点的多态性，据此，在小型比格犬群体中在所选的49个微卫星位点中，多态性信息含量在0.3055-0.9333范围内，使得群体的平均多态信息含量达到0.7038(可通过popgene软件计算得到)，呈现群体高度多态性。其中，高度多态性位点(pic＞0.5)有46个，中度多态性位点(0.25＜pic＜0.5)有3个，低度多态性位点(pic＜0.25)有0个(详见表3)。同时平均香隆指数也较高，达到1.6625，说明该小型比格犬群体比较均衡。利用popgen1.32计算小型比格犬49个微卫星位点的hardy-weinberg遗传平衡检验的p值，见表3。结果有12个微卫星位点非常显著偏离hardy-weinberg遗传平衡(p<0.01)，其中3个微卫星位点显著偏离hardy-weinberg遗传平衡(0.01<p<0.05)，剩余34个微卫星位点在群体遗传中处于hardy-weinberg遗传平衡(p>0.05)。进一步地，综合考虑等位基因个数、染色体位置、香农指数和杂合度这几个重要指标后，从中选出20个微卫星位点并组合起来足以用于比格犬封闭群的遗传检测分析(表4)。表4优化的20个微卫星位点名称、染色体位置以及比格犬在青岛博隆封闭群中的等位基因个数。其中，f为上游引物，r为下游引物。实施例2购买西安迪乐普、北京玛斯和江苏兆生源3个国内不同厂家来源的小型比格犬封闭群各30只，用优化的适合封闭群比格犬遗传质量检测的20个微卫星位点组合对其进行遗传质量验证评价。分别采集各群体每只犬的血液5ml。dna提取、检测、pcr、等位基因个数以及等位基因范围的分析同实施例1。其中，使用的引物具体序列详见表4，荧光标记详见表1。检测结果见表5。表520个微卫星位点对3个群体检测的等位基因个数和范围从表5可以看出，在西安迪乐普、北京玛斯和江苏兆生源封闭群中，等位基因个数最多分别达到29、14和14个，最少等位基因个数均为2个。在西安迪乐普、北京玛斯和江苏兆生源3个封闭群用20个位点进行了上述等位基因分型后，将这3个封闭群以及实施例1中青岛博隆封闭群的各等位基因型输入popgene3.1程序进行群体遗传结构分析，结果见表6。从表6中可以看出，这些封闭群的有效等位基因个数最少为5.45，最大为9.95。有效等位基因个数最少为3.3774，最大为5.8897。平均杂合度均高于0.5，香隆指数均高于1.1，多态信息含量也都比较好，达到了高度多态的水平(pic>0.5)。将这些数据与以49个位点分析青岛博隆封闭群的数据(表3)进行比较后可知，用20个位点进行群体遗传结构参数的检测和计算的数值，无论是等位基因个数、有效等位基因个数、观察杂合度、期望杂合度、平均杂合度、香隆指数和多态信息含量，都与49个位点计算的结果相当。可见，优化的20个位点的检测效果等同于49个位点，但是位点数的降低显著提高了检测工作的效率，降低了工作量和费用，是比较理想的组合。表64个厂家的比格犬群体遗传结构参数将西安迪乐普、北京玛斯和江苏兆生源以及青岛博隆的封闭群进行nei遗传相似系数和遗传距离的比较分析，结果见表7。结果发现江苏兆生源和北京玛斯的群体nei遗传相似系数最高(0.6276)，遗传距离最近(0.4659)。而青岛博隆群体和其他三个群体的相似系数均比较小，遗传距离较远。用popgene3.1对西安迪乐普、北京玛斯、江苏兆生源和青岛博隆4个封闭群进行聚类分析，结果见图3。从图3可以看出，青岛博隆封闭群与其他三个的亲缘关系较远，江苏兆生源和北京玛斯两个封闭群的亲缘关系更近。表74个厂家比格犬群体的nei遗传相似系数和遗传距离比较群体id西安迪乐普北京玛斯江苏兆生源青岛博隆西安迪乐普****0.46480.56540.4764北京玛斯0.7662****0.62760.3746江苏兆生源0.57010.4659****0.4576青岛博隆0.74150.98180.7817****注：对角线上为遗传相似系数，对角线下遗传距离以上结果分析与4个封闭群之间动物的实际来源等情况相符合。可见，20个微卫星位点组合可以对比格犬封闭群的遗传特征进行很好的评价。以上结果都说明，通过逐层反复优化所确定的20个微卫星位点组合能有效评价比格犬封闭群的遗传检测。序列表<110>首都医科大学<120>一种用于检测比格犬封闭群的微卫星标记及其组合<130>lha2060045<160>40<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggaacagatgagaagcatgg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ctgggtggttcagtagttgg20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccaccccaccacaatctctc20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4acagccagccatccaaaag19<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ataaagctggatacagtttggc22<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aggcttttctaatgaaagggac22<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7caacccagggtggaagc17<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tagcaagaaaatgtgccca19<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tgtcataatagttggaatgac21<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ttagagcttactcatgatatctg23<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tgcagggcagaggctggagg20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gggggtgtcggtggagttct20<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13aaggcaggaggaggagcac19<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tatggagatggagggcacac20<210>15<211>21<212>dna<213>人工序列(artifi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