膜蛋白CcmB的表达载体及其表达纯化方法

文档序号:25949831发布日期:2021-07-20 17:05阅读:来源:国知局

技术特征:

1.膜蛋白ccmb的表达载体,其特征在于,为表达质粒ply077-ccmb,核苷酸序列如seqidno.2所示,包含:噬菌体t7启动子;大肠杆菌核糖体结合位点,其中包含ncoi序列ccatgg、seqidno.1所示的大肠杆菌膜蛋白ccmb序列以及bamhi位点ggatcc;烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点gagaacctgtacttccaatcc;ndei酶切位点catatg;超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列;xhoi酶切位点ctcgag;6个组氨酸位点以及终止密码子tag。

2.根据权利要求1所述的膜蛋白ccmb的表达载体的表达纯化方法,其特征在于,具体步骤如下:

步骤1,大肠杆菌膜蛋白ccmb表达载体突变株的制备:将膜蛋白ccmb的表达载体即表达质粒ply077-ccmb转化到宿主大肠杆菌中,并涂布于含抗生素以及0.1mmiptg琼脂平板,挑选黄绿色的阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达;

步骤2,将挑选的突变菌株转化株接种至培养基中进行扩大培养,并用1mmiptg大规模诱导表达膜蛋白ccmb。

3.根据权利要求1所述的表达纯化方法,其特征在于,步骤1中,所述的大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)或大肠杆菌c43(de3)。

4.根据权利要求1所述的表达纯化方法,其特征在于,步骤2中,所述的培养基为lb培养基或tb培养基。


技术总结
本发明公开了一种膜蛋白CcmB的表达载体及其表达纯化方法。所述的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,包含:噬菌体T7启动子;大肠杆菌核糖体结合位点,其中包含了NcoI序列CCATGG、SEQ ID NO.1所示的大肠杆菌膜蛋白CcmB序列以及BamHI位点GGATCC;烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC;NdeI酶切位点CATATG;超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列;XhoI酶切位点CTCGAG;6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。本发明利用分子刚性的荧光蛋白作为筛选标记以及表达进程指示剂,该荧光蛋白由于具有分子水平刚性结构可以迅速折叠,能够帮助氮端膜蛋白CcmB稳定其构象。本发明构建的表达载体能够实现膜蛋白CcmB的大量表达,可用于后续新型抗生素的高通量筛选。

技术研发人员:周敏;张苑桢;华铮翼;卢颖洪
受保护的技术使用者:南京理工大学
技术研发日:2020.01.16
技术公布日:2021.07.20
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