一种提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法与流程

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种提高粗毛栓菌(trameteshirsuta)木质素过氧化物酶产量的方法。

背景技术：

木质素过氧化物酶(ligninperoxidase，lip)是由白腐菌分泌的主要胞外酶之一，它是一种含亚铁红血素的过氧化物酶，最早是在金孢展齿革菌(phanerochaetechrysosporium)中发现的，木质素过氧化物酶的活性中间体具有比其它过氧化物酶更高的氧化潜能，能够氧化苯酚、芳香胺、芳香醚、甲氧基芳香环和多环芳香化合物等物质，进而能够有效降解木质素，去除多种有毒物质，且由于其氧化生成的产物不污染环境，因此在食品、造纸、环境保护及其它领域具有很大的研究价值和应用潜力。

粗毛栓菌作为白腐菌的一员，相比于香菇(lentinula)、侧耳菌(pleurotus)、平革菌(phanerochaete)等真菌，具有较强的产木质素过氧化物酶能力，可作为生物制浆、纸浆漂白、环境保护等方面的理想菌株。但是其木质素过氧化物酶产量低导致其生产和应用成本较高，难以满足工业化生产的需要。因此，低成本高产量成为木质素过氧化物酶生产研究的主要目的。目前提高木质素过氧化物酶酶产量常用的方法是筛选高产菌株及木质素过氧化物酶基因的克隆和异源表达。高产菌株的获得周期长、效率低，木质素过氧化物酶基因的克隆和异源表达涉及基因工程改造，工作难度大，但通过对木质素过氧化物酶发酵培养基的温度、ph、转速和接种量等条件进行优化，不仅操作简单、成本低、周期短，还能够提高木质素过氧化物酶产量，这在一定程度上为工业化生产奠定了基础。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法。该方法能够大幅提高粗毛栓菌的木质素过氧化物酶产量，且操作简单，易于扩大生产，适于大规模木质素过氧化物酶发酵，从而降低木质素过氧化物酶生产成本，满足规模化应用的要求。

为实现本发明的目的，本发明提供了一种提高粗毛栓菌产木质素过氧化物酶的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将粗毛栓菌活化和预培养，

2)将预培养的粗毛栓菌接种到基础产酶培养基中，并在温度30℃-40℃、ph5-7、转速140-180rpm的条件下进行发酵培养，接种量按体积计为所述培养基体积的6-9％(v/v)，和

3)培养至发酵液中木质素过氧化物酶酶活达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。

在本发明的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法中，活化包括：将粗毛栓菌接种到pda固体培养基上，于25℃-30℃培养3-5天。

在本发明的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法中，预培养包括将活化的粗毛栓菌菌丝接种到pda液体培养基中，于25℃-30℃、120rpm条件下培养3-5天，混匀后按5％(v/v)的接种量接入新的pda液体培养基中，培养3天，即得预培养的菌丝体。

在本发明的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法中，基础产酶培养基包含：木质素2-4g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o1g/l，蛋白胨1g/l，mnso4·h2o0.0016g/l，znso40.0014g/l，cocl20.002g/l。。在本发明方法优选的实施方案中，基础产酶培养基包含3g/l木质素。

在本发明的提高粗毛栓菌木质素过氧化物酶产量的方法中，在步骤2)中，按基础产酶培养基的体积计，接种量为7.58％(v/v)，且发酵培养在ph5.72、温度34.6℃、转速160rpm的条件下进行。

与现有技术相比，本发明具有突出的有益技术效果。借由上述技术方案可知，本发明的有益技术效果至少包括：

本发明通过优化木质素的浓度、发酵温度、发酵初始ph、发酵转速和接种量等条件可有效提高粗毛栓菌的木质素过氧化物酶酶活和酶产量，利用本发明的方法可将木质素过氧化物酶酶活提高322.89％，酶产量提高321.43％。本方法操作简单、能耗小、污染低，易于扩大生产，适于大规模木质素过氧化物酶发酵，从而降低木质素过氧化物酶生产成本，满足规模化应用的要求。

附图说明

图1显示了未优化前粗毛栓菌木质素过氧化物酶酶活。

图2显示了木质素浓度对产木质素过氧化物酶的影响。

图3显示了ph对产木质素过氧化物酶的影响。

图4显示了温度对产木质素过氧化物酶的影响。

图5显示了转速对产木质素过氧化物酶的影响。

图6显示了接种量对产木质素过氧化物酶的影响。

图7显示了ph与温度对木质素过氧化物酶酶活交互影响的等高线图和曲面图。

图8显示了ph与接种量对木质素过氧化物酶酶活交互影响的等高线图和曲面图。

图9显示了温度与接种量对木质素过氧化物酶酶活交互影响的等高线图和曲面图。

具体实施方式

下面将结合具体实施方案对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。

以下实施例涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作，其中粗毛栓菌(trameteshirsuta)为保藏于湖北省武汉市武昌区中国典型培养物保藏中心(cctcc)的粗毛栓菌，保藏编号cctccm20191095。

在粗毛栓菌发酵培养过程中用到如下培养基：

pda固体培养基：配制方法为，称量去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g。将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1l，煮沸30min，用纱布滤去马铃薯残渣，加入葡萄糖、琼脂，再加入适量的水补充至1l。

pda液体培养基：与上述pda固体培养基不同之处在于，pda液体培养基中未添加琼脂。

基础产酶培养基：木质素2g，kh2po41g，mgso4·7h2o1g，蛋白胨1g，mnso4·h2o0.0016g，znso40.0014g，cocl20.002g，蒸馏水1l，ph约为7。

上述基础产酶培养基为在张年磊等(张年磊，付广义，许友泽，陈跃辉.aspergillussp.f-1降解水溶性木质素的研究[j].环境科学与技术，2019，42(02)：44-50.)报道的培养基的基础上进行改良而获得的培养基。

实施例1

1.粗毛栓菌的活化与预培养

(1)活化

将粗毛栓菌(cctccm20191095)接种到pda固体培养基上，于25℃-30℃培养3-5天。

(2)预培养

挑取步骤(1)中的粗毛栓菌菌丝体接种到装有100mlpda液体培养基的250ml锥形瓶中，于25℃-30℃、120rpm条件下培养3-5天。混匀后按5％(v/v)的接种量接入新的装有100mlpda液体培养基的250ml锥形瓶中，培养3天，即得预培养的菌丝体，用于接种到基础产酶培养基中进行木质素过氧化物酶发酵。

以后实施例中均用250ml锥形瓶，装液量均为100ml，x％(v/v)接种量指的是从原培养体系中取xml菌液接入指定培养基。

2.木质素过氧化物酶酶活及蛋白质浓度的测定

(1)木质素过氧化物酶活性测定

木质素过氧化物酶酶活的测定方法参照燕红等(燕红，张晓甜，刘明.木质素降解菌株产木质素降解酶的研究[j].黑龙江大学自然科学学报，2011，28(6)：845-847.)的报道进行改良。改良后的木质素过氧化物酶酶活的测定方法如下：

藜芦醇法：125mmol/l酒石酸钠1.6ml(ph＝3.0)，10mmol/l白黎芦醇0.05ml，基础产酶培养基发酵液0.3ml，10mmol/lh2o20.05ml。测定最初3min内310nm处吸光度变化，每组三个重复。摩尔消光系数ε＝9300l/(mol·cm)。酶活的定义：1分钟氧化1微摩尔白黎芦醇所需木质素过氧化物酶的量定义为一个酶活单位(u)。

(2)蛋白质浓度的测定(bradford法)

bradford法采用以下文献的报道：marionm.bradford.arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding[j].analyticalbiochemistry，1976，72(1-2)：248-254及赵亚华，高向阳，罗素萍，等.生物化学与分子生物学实验技术教程[m].北京：高等教育出版社，2005.

根据bradford法原理，配置1mg/ml的牛血清白蛋白溶液，将其稀释为1-10μg/ml的蛋白质溶液。在4ml标准蛋白溶液中加入1ml考马斯亮蓝g250蛋白试剂，充分振荡混合，在4ml蒸馏水中加1ml考马斯亮蓝g250蛋白试剂为空白，5min后于595nm下测定吸光度值，每组三个重复，并制作吸光度-蛋白质浓度标准曲线。

取粗毛栓菌木质素过氧化物酶发酵液，5000r/min离心取上清，测定时用4ml稀释后的样品代替标准蛋白溶液，其他步骤同上，595nm处测定吸光值，每组三个重复，然后根据标准曲线即可求得相应的蛋白含量，蛋白含量即为酶产量。

3.粗毛栓菌发酵产酶

据金剑等(金剑，康文丽，生吉萍，等.云芝(coriolusversicolor)木质素过氧化物酶酶学性质分析[j].食品科学，2010，31(17)：224-227.)的报道，产木质素过氧化物酶的适宜发酵条件为：250ml锥形瓶，装液量100ml，温度30℃、初始ph7、转速120rpm。根据现有文献报道发现，在上述基本条件下，测定木质素过氧化物酶酶活最低为6.7u/l(于德涵，黎莉.重筛野生黑木耳废渣中木质素过氧化物酶的研究[j].湖北农业科学，2016(17)：4510-4513.)，最高为145.2u/l(王茂成.木质素降解真菌的筛选鉴定及相关酶活性研究[d].西南大学，2013.)。

本发明将预培养的粗毛栓菌菌液按3％(v/v)的接种量接入基础产酶培养基，在温度30℃、初始ph7、转速120rpm条件下培养，每隔12h采集发酵液，12000r/min离心10min，取上清液即为粗酶液，测定木质素过氧化物酶酶活。

由图1可知，上述发酵条件下木质素过氧化物酶酶活在72h最高为86.22u/l，因此后续实验中，在发酵进行72h后即测定木质素过氧化物酶酶活。

下面结合附图描述粗毛栓菌液体培养条件优化的具体实施例。

实施例2发酵培养基及发酵条件的优化

1.发酵条件优化一单因素试验

(1)木质素浓度对产木质素过氧化物酶的影响

以下实施例中初始ph用naoh或稀hcl调节。

将预培养的粗毛栓菌菌液按3％(v/v)的接种量接入木质素浓度不同的基础产酶培养基，其中木质素浓度分别为1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/il、6g/l，调节初始ph为7，在温度30℃、转速120rpm条件下培养72h。之后，采集发酵液，12000r/min离心10min，取上清液即为粗酶液，用于测定木质素过氧化物酶酶活。

由图2可知，随着木质素浓度的增加，木质素过氧化物酶酶活呈现先增加后降低的趋势，当木质素浓度为3g/l时，木质素过氧化物酶酶活最高为86.22u/l，木质素浓度为2-4g/l时，木质素过氧化物酶酶活差异不显著。因此选择木质素浓度2g/l-4g/l进行plackett-burman试验。

(2)ph对产木质素过氧化物酶的影响

将预培养的粗毛栓菌菌液按3％(v/v)的接种量接入基础产酶培养基中，调节初始ph为4、5、6、7、8、9，在30℃，120rpm条件下培养72h。采集发酵液，12000r/min离心10min，取上清液即为粗酶液，测定木质素过氧化物酶酶活。

由图3可知，随着ph的增加，木质素过氧化物酶酶活呈现先增加后减少的趋势。在ph5-6之间，木质素过氧化物酶酶活上升速率较快，在ph为6时，木质素过氧化物酶酶活达到最大值为93.66u/l，之后呈下降趋势，在ph为7时是86.22u/l，因此选择初始ph5-7进行plackett-burman试验。

(3)温度对产木质素过氧化物酶的影响

将预培养的粗毛栓菌菌液按3％(v/v)的接种量接入基础产酶培养基中，调节初始ph为7，分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，120rpm条件下培养72h。采集发酵液，12000r/min离心，10min，取上清液即为粗酶液，测定木质素过氧化物酶酶活。

由图4可知，当温度为30℃-40℃时，木质素过氧化物酶酶活两者没有明显差别，且显著高于其它温度对应的酶活，因此选择30℃-40℃进行plackett-burman试验。

(4)转速对产木质素过氧化物酶的影响

将预培养的粗毛栓菌菌液按3％(v/v)的接种量接入基础产酶培养基中，调节初始ph为7，分别在转速100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm，30℃条件下培养72h。采集发酵液，12000r/min离心10min，取上清液即为粗酶液，测定木质素过氧化物酶酶活。

由图5可知，转速为160rpm时，木质素过氧化物酶酶活最高，转速在140rpm-180rpm时，木质素过氧化物酶酶活相对较高，随着转速的增加，木质素过氧化物酶酶活逐渐下降，因此选择转速140rpm-180rpm进行plackett-burman试验。

(5)接种量对产木质素过氧化物酶的影响

将预培养的粗毛栓菌菌液按3％(v/v)、6％(v/v)、9％(v/v)、12％(v/v)、15％(v/v)、18％(v/v)的接种量接入基础产酶培养基中，调节初始ph为7，在30℃、120rpm条件下培养72h。采集发酵液，12000r/min离心10min，取上清液即为粗酶液，测定木质素过氧化物酶酶活。

由图6可知，当接种量为6％(v/v)-9％(v/v)时，木质素过氧化物酶酶活两者没有明显差别且显著高于其它接种量对应的酶活，因此选择接种量6％(v/v)-9％(v/v)进行plackett-burman试验。

2.plackett-burman设计

plackett-burman法参照已报道文献(niladevikn，sukumaranrk，jacobn，etal.optimizationoflaccaseproductionfromanovelstrain-streptomycespsammoticususingresponsesurfacemethodology[j].microbiologicalresearch，1986，164(1)：105-113.)

plackett-burman试验可以快速地从众多的因素中有效地确定几个主要因素，供进一步研究。分别从初始ph、温度、转速、接种量、木质素浓度5个因素中筛选出对产木质素过氧化物酶酶活影响重要的几个因素，试验设计见表1，试验设计结果见表2。

表1plackett-burman试验因素及水平设计

表2plackett-burman试验设计结果

运用minitab软件对表2中的木质素过氧化物酶酶活进行回归模型建立与方差分析得出初始ph、温度、接种量3个最主要影响因素。

由表2可知，当初始ph为5-7、温度为30℃-40℃、转速为140rpm-180rpm、接种量为6％-9％、木质素浓度为2g/l-4g/l时，木质素过氧化物酶酶活都显著高于未优化前，此时优化后的酶活比优化前的86.22u/l提高173.49％-233.57％，用bradford法测定此时优化后的酶产量为0.039-0.047g/l，比优化前的0.014g/l提高171.43％-235.71％。

为获得最佳产酶条件，后续实验中基础产酶培养基中木质素含量均为3g/l，转速均为160rpm。

3.响应面优化试验

响应面设计方法参照已报道文献(yulinx，juanf，hel.optimizingfermentationconditionsfortheexpressionoflaccasegenelac1338byresponsesurfacemethodology[j].chinesejournalofappliedandenvironmentalbiology，2016，22(02)：219-223.)

(1)box-behnken试验设计

运用designexpert8.0软件进行box-behnken试验设计，采用响应面分析法对产酶条件参数进行优化分析，最后对预测值进行验证。每个试验重复3次，取平均值。

以plackett-burman试验筛选得到的对产木质素过氧化物酶影响显著的因素(初始ph、温度、接种量)为自变量，设计了17个试验组，以木质素过氧化物酶酶活为响应值，试验设计见表3，各因素水平选择及结果见表4。

表3box-behnken设计水平表

表4box-behnken试验设计和结果

(2)模型的建立与显著性检验

运用designexpert8.0软件进行回归拟合，得到的木质素过氧化物酶酶活回归方程如下：木质素过氧化物酶酶活(u/l)＝354.26-30.61×a-17.34×b+7.33×c-12.20×a×b+6.89×a×c-8.12×b×c-51.36×a²-80.71×b²-60.08×c²

模型回归方程方差分析见表5，该模型p＜0.001，表明该回归方程达到极显著，模型的失拟项f值为6.45(＞0.05)，表明该方程失拟不显著，模型拟合程度好。确定系数r²为0.9872和调整确定系数r²adj为0.9706基本接近，表明模型的回归方程和相关性都很好。因此，box-behnken设计是可靠的，该模型可较好地应用于粗毛栓菌木质素过氧化物酶酶活的理论值预测。模型一次项a、b对响应值木质素过氧化物酶酶活影响达到极显著水平(p＜0.01)，一次项c对响应值木质素过氧化物酶酶活影响不显著(p＞0.05)；交互项ab、ac、bc对木质素过氧化物酶酶活影响不显著(p＞0.05)；平方项a²、b²、c²对响应值木质素过氧化物酶酶活影响达到极显著水平(p＜0.01)。

表5模型回归方程方差分析

应用design-expert软件绘制响应面曲线图，结果见图7-9。由图可知，响应值存在最大值，对所建立的数学模型进行分析，得出ph5.72，温度34.56℃，接种量7.58％为最佳条件，此时模型预测的木质素过氧化物酶酶活为359.56u/l。在最优条件下进行验证试验，因考虑试验中现实操作情况，将优化条件修正为：ph5.72，温度34.6℃，接种量7.58％，得到木质素过氧化物酶酶活为364.62u/l，相对误差不大，说明响应面法优化的产木质素过氧化物酶条件具有真实性，在一定程度上存在实际应用价值。

在木质素3g/l、ph5.72、温度34.6℃、接种量7.58％、转速160rpm的条件下，优化后的酶活比优化前的86.22u/l提高322.89％，用bradford法测定优化后的酶产量为0.059g/l，比优化前的0.014g/l提高了321.43％。