靶向人CD19的嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种靶向人cd19的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术：

cd19又名b4或leu-12，特异的表达在正常和恶性b淋巴细胞膜表面，以及滤泡树突状细胞膜表面，属于免疫球蛋白(ig)超家族成员，其分子量为95kda，位于16号染色体的短臂上，含有15个外显子，编码556个氨基酸的i型跨膜糖蛋白。cd19是b细胞最可靠的表面标记物之一，其最早在晚期祖b细胞和早期前b细胞中表达，发生在免疫球蛋白基因重组时。cd19在整个b细胞的发育和成熟过程中均高表达，直至b细胞分化为浆细胞时，表达量下调，其在成熟b细胞中的表达是未成熟细胞的3倍。

cd19通过同时调节b细胞受体(bcellrecertor,bcr)依赖和非依赖信号建立b细胞信号阈值，对b细胞的发育，增殖和分化起着重要的调控作用。cd19作为成熟b细胞的表面多分子复合物的主要组成部分，与受体cd21(cd2)，cd81(tapa-1)以及cd225共同形成复合体，通过调节内源性和受体诱导信号减少触发b细胞分裂及分化所需抗原浓度的阈值。cd81作为伴侣蛋白，提供信号传导途径的分子对接位点，并且调节cd19的表达。cd19通过招募和放大src家族蛋白酪氨酸激酶的活化，使蛋白酪氨酸激酶(ptk)激活，激活bcr信号。同时当bcr信号激活时，cd19也可通过活化pi3k和下游的akt激酶，增强bcr信号，促进b细胞的增殖。

cd19对b细胞的增殖和分化具有重要的调控作用。cd19在几乎所有的b细胞恶性肿瘤中广泛表达，包括慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)和非霍奇金淋巴瘤等，因此cd19成为b细胞恶性肿瘤治疗的特异性分子靶点。近年来靶向cd19的免疫治疗策略在临床前以及临床研究中广泛发展，包括单克隆抗体、双特异性抗体和嵌合抗原受体修饰t细胞(car-t)，并取得了显著优于常规小分子化疗方案的临床效果，推动了免疫治疗的进展。

嵌合抗原受体主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如t细胞受体的zeta链)，起传递信号激活t细胞的作用。将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(singlechainantibodyfragmentofvariableregions，scfv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)，转染至t细胞内而形成嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptor，car-t)。cd19-car嵌合抗原受体免疫疗法改变了恶性血液病治疗的传统方法，并在临床i期的研究中取得了令人瞩目的成果。

目前，绝大多数cd19cart临床试验都采用的是鼠源cd19抗体作为胞外区。鼠源抗体具有较高的免疫原性，容易被机体的免疫系统清除，影响car-t细胞在体内存活的时间。

技术实现要素：

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种良好特异性、较高杀伤力、较低免疫原性的人源化cd19嵌合抗原受体及其应用。

技术方案：本发明所述的一种靶向人cd19的嵌合抗原受体，包含基于cd19抗原的人源化cd19抗体结合结构域、跨膜区及胞内信号结构域；其中，所述cd19抗体结合结构域重链序列如seqidno：1所示，轻链序列如seqidno：2所示。

进一步的，所述cd19抗体结合结构域的氨基酸序列如seqidno：3所示，或与其具有85％～99％同一性的改造的氨基酸序列。优选的与seqidno：3所示氨基酸序列具有90％～99％，甚至95％～99％的同一性。

进一步的，所述跨膜区选自cd4、cd8α、cd28或4-1bb跨膜区。优选的，所述跨膜区结构包含seqidno：6所示的cd8α跨膜区氨基酸序列。

所述胞内信号结构域包括信号传导结构域和/或共刺激信号结构域，选自cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、cd3中的一种或多种。优选cd3zeta、4-1bb和/或cd28信号结构域。

优选的，胞内信号传导结构域包含seqidno：8所示的cd3zeta氨基酸序列。胞内共刺激信号结构域包含seqidno：7所示的4-1bb氨基酸序列。

上述靶向人cd19的嵌合抗原受体还包含胞外信号肽结构，选自cd8α信号肽、gm-csfrα信号肽、cd4信号肽或il-2信号肽。优选cd8α信号肽，氨基酸序列如seqidno：4所示。

上述靶向人cd19的嵌合抗原受体还包括用于连接胞外区肽段与跨膜区肽段的铰链区结构，铰链区为cd8α、cd28分子。优选cd8α分子，其氨基酸序列如seqidno：5所示。

本发明所述靶向人cd19的嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno：9或seqidno：10所示。

本发明还公开了一种编码所述靶向人cd19的嵌合抗原受体的核酸分子。

进一步的，所述核酸分子的核苷酸编码序列如seqidno：11所示。

本发明还公开了一种包含所述核酸分子的重组表达载体。所述重组表达载体包括嵌合抗原受体表达框和复制系统，所述嵌合抗原受体表达框由可在t细胞中表达的启动子和位于所述启动子下游的编码所述嵌合抗原受体的核酸组成。所述启动子为巨细胞病毒启动子、sv40启动子、ef1alpha启动子或rsv启动子。

本发明还公开了一种包含所述核酸分子或重组表达载体的基因工程改造免疫细胞。其中，所述免疫细胞可选自t淋巴细胞、nk细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。进一步优选t淋巴细胞。

进一步的，所述基因工程改造的免疫细胞表达的靶向人cd19的嵌合抗原受体包括胞外信号肽、抗cd19的人源化抗体结合结构域、铰链区、跨膜区及胞内信号结构域。

所述基因工程改造的免疫细胞表达的靶向人cd19的嵌合受体配体具有seqidno：9或seqidno：10所示氨基酸序列。

本发明还公开了所述靶向人cd19的嵌合抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用；优选在制备抗血液恶性肿瘤药物，特别是制备治疗急性髓细胞白血病的药物中的应用。

有益效果：本发明提供了一种靶向人cd19的嵌合抗原受体，通过将该嵌合抗原受体表达于t细胞中可使得到cart细胞能够有效并且特异性地靶向表达cd19表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达cd19表面抗原的肿瘤，例如b淋巴细胞白血病等提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。

附图说明

图1是本发明中嵌合抗原受体的示意图；

图2是cd19car-t细胞对靶细胞nalm6裂解杀伤能力结果图；

图3是cd19car-t细胞分泌ifn-γ结果图；

图4是cd19car-t细胞分泌il-2结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。

实施例一嵌合抗原受体(car)慢病毒表达载体构建

以cd137的胞内结构域和cd3zeta的itam区作为激活信号，与cd19单链抗体进行融合，构建嵌合抗原受体表达载体，并亚克隆至plvx-ef1a(购自clontech)载体中。构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中各个元件的组合顺序如图1所示：

所构建的嵌合抗原受体中各元件氨基酸序列分别为：

信号肽：seqno.4

malpvtalllplalllhaarp

人源化单链抗体序列：seqno.3

diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqdisnylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsissgdyywswirqppgkglewigyiyysgstyynpslksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycarhyyyggsyamdywgqgtsvtvss

cd8铰链区：seqno.5

tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd

cd8跨膜区：seqno.6

iyiwaplagtcgvlllslvitlyc

cd137胞内域：seqno.7

krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeggcel

cd3zeta：seqno.8

rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

实施例二慢病毒制备

具体实验步骤如下：

s1、准备15cm皿，接种5*10⁶个293t细胞(购自atcc)，加入完全培养基(dmem高糖、10％fbs、双抗)，置于37℃、5％co2培养箱，过夜培养。

s2、从冰箱中取出100μmpei及慢病毒包装质粒(plvx-ef1a-car、pgp、pvsvg)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出pbs或hbss缓冲液，温热至室温。取2mlpbs至6孔板的一个孔，分别加入10μglenti-ef1a-car、4μgpgp、2μgpvsvg，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μl100μmpei，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

s3、将上述dna/pei复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％co2培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。

连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，转至离心管中，加入20％体积peg6000，4度静置2和，配平后，3000xg4℃离心0.5小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μlpbs缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。

实施例三原代t细胞的分离

具体实验步骤如下：

s1、将淋巴细胞分离液上下颠倒数次，充分混匀lymphoprep试剂。

s2、在生物安全柜中，向50ml离心管(或15ml离心管，视分离血样的体积而定)中加入15mllymphoprep试剂，备用。

s3、将血样使用等体积的pbs+2％fbs进行稀释。

s4、使用移液枪小心的将稀释后的血样沿管壁缓慢添加至分离试剂的上层，避免分离试剂与血样的混合。

s5、将离心机设置为800xg，转速下降速度设为最慢，室温离心20分钟。

s6、离心结束后，收集上层浅黄色血清至另一个无菌离心管中，贮存于-80℃。

s7、轻轻的将处于血清与分离试剂界面的单核细胞层吸至一个新的离心管中，使用培养基洗涤细胞一次。

s8、将细胞密度调整至1*10⁸细胞/ml(总体积不超过2.5ml)，重悬于5ml的圆底管中。

s9、加入100μl/ml的抗体cocktail，充分混匀后，室温孵育15分钟。

s10、取出磁珠，用移液枪上下吹打至少5次，充分混匀。

s11、吸取50μl磁珠/ml至上述样品中，充分混匀后，室温孵育10分钟。

s12、添加完全培养基至管内总体积为2.5ml，将管子(开盖)插入磁极中，室温静置5分钟。

s13、孵育完毕后，管子继续留在磁极中，轻轻倒置，将管内的细胞倒出。

s14、将细胞重悬于x-vivo15培养基中，并添加10％fbs，300u/mlil-2,5ng/mlil-15和10ng/mlil-7。

实施例四原代t细胞的激活与慢病毒感染

具体实验步骤如下：

s1、调整细胞密度至1*10⁶细胞/ml，加入细胞因子及抗体复合物(终浓度为300u/ml的il-2、10ng/mlil-7、5ng/mlil-15、500ng/mlanti-cd3(okt3)、2ug/mlanti-cd28)，连续培养48小时。

s2、按照moi＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(ml)＝(moi*细胞数量)/病毒滴度

s3、从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为6μg/ml的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800xg离心1小时。

s4、离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃5％co2的培养箱中，继续培养24小时。

s5、250xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3-6天备用。

实施例五car-t细胞对靶细胞裂解

具体实验步骤如下：

s1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；

s2、将靶细胞重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*10⁵个/ml，取一块新的96孔板，按照100μl/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μl无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％co237℃培养箱中，过夜培养。

s3、离心收集上述制备的car-t细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌pbs轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述e/t比例，加入car-t细胞，并将最终体积补至100μl/孔；maxilysis和minilysis为接种同样数量的靶细胞，但是不加car-t细胞。将孔板置于5％co237℃培养箱中，培养6小时。

s4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，向maxilysis孔加入ldh检测试剂盒中的裂解液，将其中的靶细胞完全裂解后，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μl至另一个新的96孔板中，加入ldh检测试剂后，使用酶标仪读取od值。

靶细胞裂解百分数计算公式：

s5、将上述处理后的数据使用graphpad6.0进行作图。

实验结果：

以car-t细胞为效应细胞，以天然表达cd19的淋巴瘤细胞株nalm6细胞为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为50000个，分别加入不同数量的car-t细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30微升上清，检测培养基上清中ldh的释放量，以此反映car-t细胞对靶细胞的裂解能力，结果如图2所示，在效靶比为4：1时即可高效的介导t细胞对肿瘤细胞或重组细胞的杀伤；随着效靶比的升高，cd19car-t细胞对靶细胞nalm6的杀伤作用也随之升高，在效靶比为8:1时达到最高。

实施例六car-t细胞因子分泌水平检测

具体实验步骤如下：

s1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；

s2、将靶细胞重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*10⁵个/ml，取一块新的96孔板，按照100μl/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μl无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％co237℃培养箱中，过夜培养。

s3、离心收集上述制备的car-t细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌pbs轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述e/t比例，加入car-t细胞，并将最终体积补至100μl/孔；将孔板置于5％co237℃培养箱中，培养6小时。同时设置对照t细胞组。

s4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μl培养基上清，使用elisakit检测ifn-γ和il-2的表达，使用酶标仪读取od值。

s5、将上述获取的数据使用graphpad6.0进行作图。

实验结果：

以car-t细胞为效应细胞，以天然表达cd19的淋巴瘤细胞株nalm6细胞为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为50000个，分别加入不同数量的car-t细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30微升上清，用elisa的方法检测培养基上清中由car-t细胞被肿瘤细胞激活后分泌的ifn-γ和il-2的表达量；结果如图3和图4所示，cd19-cart细胞与靶向肿瘤细胞结合后，可以有效的激活原代t细胞，并引起细胞因子分泌表达量的升高；在效靶比为2:1时，car-t细胞被肿瘤细胞激活后，即可分泌大量的ifn-γ,显著高于对照t细胞；在效靶比为8:1时分泌量达到最高值。

序列表

<110>南京蓝盾生物科技有限公司

<120>靶向人cd19的嵌合抗原受体及其应用

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