一种荧光检测装置及其检测方法与流程

本发明涉及荧光检测技术领域，尤其是涉及一种荧光检测装置及其检测方法。

背景技术：

聚合酶链式反应（pcr）是一种分子生物技术，通过变性、复性和延伸，可在短时间内将靶dna扩增数百万倍。实时荧光定量pcr是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，通过标准曲线实现对未知模板浓度进行定量分析。现在农业、医疗等行业被诸多领域广泛应用。当前荧光检测装置对携带有待检测产物试管的检测方式可以分为两种，分别是顶部检测和底部扫描。1）顶部检测，该荧光检测装置的主要结构包括设置有试管插接槽的金属模块，而金属模块底部是封闭的，激发和检测部件位于金属模块上方。这种方式优点是可以使用通用的制冷片或其他类型的加热片和散热器对试管进行温度控制；缺点是试管顶部不平，会有蒸发和结露，造成荧光重复性差。2）底部扫描，例如一种在中国专利文献上公开的“基于底部扫描检测的荧光定量pcr检测系统”，其公告号“cn101328503”，包括自上而下依次装置成一整体的可插放若干试管的变温金属模块，半导体制冷器和散热器件，其特征是变温金属模块的试管插孔为贯通变温金属模块、半导体制冷器和散热器件的通孔，散热器件为热管散热器，热管延伸至整体结构外侧，延伸端连接散热翅片，光电检测器位于整体结构散热器件的底部，由电机驱动扫描，从试管的底部检测试剂荧光。这种方式优点是检测模块位置靠近试管储存试剂位置，荧光信号强，检测灵敏度高；缺点是模块上下会形成空气对流，影响金属模块稳定均匀性，制冷片或其他类型加热片和散热器需要打孔，造成通用尺寸制冷片或其他类型的加热片和散热器将不能采用，而且加工和安装难度加大，从而造成成本增加，还有试管底部一般都不平滑，也会造成信号采集的不稳定性。因此，上述问题需要一种新型荧光检测装置来解决。

技术实现要素：

针对现有技术中以下几个问题：1、顶部检测型荧光检测装置距离待检测样本物质较远，容易受到管内蒸发、结露等现象干扰检测结果；2、底部扫描时荧光检测装置无法配合温控装置使用进而无法得到较为准确的检测结果；本发明提供了一种荧光检测装置及其检测方法，通过基体安置携带待检测样本物质的试管，配合温控装置以及设置在试管下方的往复式光纤扫描机构对试管内的待检测样本物质进行侧边扫描，以此得到一致性较好且干扰较少的荧光强度信号。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种荧光检测装置，包括内部放置有样本试管的基体和设置有光电检测系统的基座，所述光电检测系统包括激发光模块和荧光检测模块，所述光电检测系统还包括设置在基座上的往复式光纤扫描机构，所述往复式光纤扫描机构设置在基体一侧，所述基体上对应光纤扫描机构一侧设置有检测孔，所述往复式光纤扫描机构通过光纤与激发光模块和荧光检测模块连接。所述激发光模块用于发射激发光，使得待检测样本物质内的荧光成分吸收光能并进入激发态，而所述荧光检测模块用于接收荧光信号，并转化为电信号，用于pcr定量数据分析。所述试管竖直安置在基体内部，当往复式光纤扫描机构对试管进行扫描时，试管内的样本因重力作用均匀贴附于试管侧壁，而平行于试管运动的往复式光纤扫描机构可对样本进行充分扫描，且依靠平滑的试管侧壁能够避免因试管本体形状而可能出现的检测误差和重复性，有效提高荧光检测的准确度。

作为优选，所述基体与基座之间设置有控温装置，所述控温装置与基体和基座之间均设置有导热介质。所述控温装置用于对基体进行加热和制冷，通过调整样本物质的温度，加快样本的变性-复性过程，从而充分与荧光成分进行配对，以此达到pcr定量实验通过检测荧光信号强度而得到样本成分数据的实验目的；所述导热介质可在控温装置对样本试管进行加热时进行温度缓冲，而在冷却过程中亦可起到加快散热的效果。

作为优选，所述控温装置底部设置有散热模块，所述散热模块上设置有若干散热片，所述散热模块与基座连接。所述散热模块用于辅助散失冗余热量。

作为优选，所述往复式光纤扫描机构包括平行于基体设置的扫描轨道、电机和与电机连接的同步机构，所述同步机构上设置有信号交互头，所述信号交互头在扫描轨道上往复运动。所述往复式光纤扫描机构用于沿样本试管侧壁对其内部样本物质进行激发和检测，并将荧光信号通过光纤输出，所述信号交互头在电机驱动下通过皮带带动匀速运动在扫描轨道上，提高实验结果准确度。

作为优选，所述基体内设置有安置槽，所述样本试管放置在安置槽内，所述安置槽平行于基座设置，所述检测孔设置在安置槽中部，所述检测孔的孔口朝向往复式光纤扫描机构可将光纤与检测孔的距离调节到最小，有利于提高激发光效率，获得更高的荧光灵敏度和荧光信号强度，提高稳定性。

作为优选，所述安置槽纵剖面为锥形结构，所述样本试管与安置槽插合连接。所述倒锥形结构的安置槽用于配合倒锥形试管，使得实验过程中试管与基体充分贴合，既能确保反应步骤的进行更加迅速高效，也能确保检测过程下光电检测系统能够对试管内样本进行充分扫描。

作为优选，所述光纤为包括有分叉端和集束端的y字型结构，所述集束端包括有激发部和接收部，所述分叉端包括与激发部连通的输入端和与接收部连通的输出端，所述激发光模块通过输入端与激发部连接，所述荧光检测模块通过输出端接收部与连接，所述光纤集束端设置在信号交互头上。所述y型光纤的分叉端分别与激发光模块和荧光检测模块连接，而其集束端则与信号交互头连接，避免分离式光纤在限号交互头运动时互相缠绕造成隐患。所述激发部用于将激发光模块产生的激发光均匀照射于样本试管，相应的，所述接收部则可将激发后的荧光强度信号输入荧光检测模块并转换为电信号，进而完成实验数据的收集。

本发明还公开了一种荧光检测方法，包括以下步骤：

将设置有待检测物质及荧光成分的样本试管插入安置槽中；

启动控温装置对样本物质进行高温变性，变性温度为80℃-95℃，接着对处理后的样本物质进行复性，调控温装置的温度至40℃-60℃，复性时间根据样本种类设置在30s-60s之间，最后对处理后的样本物质进行升温延伸反应，调整控温装置的温度至70℃-80℃，延伸反应时间根据样本中扩增片段长度设置为1-15min；

根据实验目标扩增程度以及样本浓度循环进行b步骤；

循进入采样阶段，启动光电检测系统（2），激发光模块（21）产生激发光，并通过往复式光纤扫描机构（4）自检测孔（12）逐个照射样本试管，同时样本试剂发射的荧光由检测孔（12）通过光纤传输到荧光检测模块（22），并转为为电信号。

根据样本试管中待检测物质的dna模板种类，可对检测方法中的实验参数进行调整，确保a）、b）和c）三个步骤结束后得到的重组物质与荧光成分充分结合，依靠光电检测系统对各样本试管内的荧光成分进行激发，通过平行设置在样本试管一侧的往复式光纤扫描机构对样本试管内的荧光成分进行充分照射激发，使其跃迁至激发态，接着通过荧光检测机构依靠往复运动的往复式光纤扫描机构对激发态荧光成分进行检测，并将光信号转化为电信号输出检测装置，获得实验数据。

作为优选，所述激发光模块包括内部设置有激发光滤光片的第一透镜组件和led灯，所述第一透镜组件设置在led灯与光纤之间；所述荧光检测模块包括内部设置有接收滤光片的第二透镜组件和光电检测器，所述第二透镜组件设置在光纤与光电检测器之间。所述led灯用于输出光信号，配合第一透镜组件和光纤完成对荧光成分的激发，而所述第二透镜组件则用于将激发态荧光成分的荧光信号转变为光电检测器可识别光线，所述光电检测器将接收到的光信号转变为电信号，并输出本发明公开的荧光检测装置，以完成荧光检测。

因此，本发明具有如下有益效果：（1）通过基体安置携带待检测样本物质的试管，电机带动往复式光纤扫描机构往复运动，扫描检测试剂荧光，有利于提高激发光效率，获得更高的荧光灵敏度和荧光强度，提高荧光信噪比，提高模块温度均匀性，降低成本；（2）试管内的样本因重力作用均匀贴附于试管侧壁，而平行于试管运动的往复式光纤扫描机构可对样本进行充分扫描，且依靠平滑的试管侧壁能够避免因试管本体形状而可能出现的检测误差和重复性，有效提高荧光检测的准确度；（3）所述控温装置用于对基体进行加热和制冷，通过调整样本物质的温度，加快样本的变性-复性过程，从而充分与荧光成分进行配对，以此达到pcr定量实验通过检测荧光信号强度而得到样本成分数据的实验目的；（4）结构简单，通过电机驱动信号交互头运动使得装置操作便捷，且侧边式检测方式的检测结果较为准确。

附图说明

图1为本发明的结构示意图（俯视图）。

图2为图1中基体的竖剖图。

图3为图1中光纤的结构示意图。

图中：1、基体，11、安置槽，12、检测孔，2、光电检测系统，21、激发光模块，22、荧光检测模块，3、基座，4、往复式光纤扫描机构，41、扫描轨道，42、电机，5、光纤，51、输入端，52、输出端，6、控温装置，61、导热介质，7、散热模块，71、散热片，8、信号交互头。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。

实施例1

如图1所示，一种荧光检测装置，包括内部放置有样本试管的基体1和设置有光电检测系统2的基座3，所述光电检测系统2包括激发光模块21和荧光检测模块22，所述光电检测系统2还包括设置在基座3上的往复式光纤扫描机构4，所述往复式光纤扫描机构4设置在基体1一侧，所述基体上对应光纤扫描机构一侧设置有检测孔12，所述往复式光纤扫描机构4通过光纤5与激发光模块21和荧光检测模块22连接。所述激发光模块用于发射激发光，使得待检测样本物质内的荧光成分吸收光能并进入激发态，而所述荧光检测模块用于接收荧光信号，并转化为电信号，用于pcr定量数据分析。所述试管竖直安置在基体内部，当往复式光纤扫描机构对试管进行扫描时，试管内的样本因重力作用均匀贴附于试管侧壁，而平行于试管运动的往复式光纤扫描机构可对样本进行充分扫描，且依靠平滑的试管侧壁能够避免因试管本体形状而可能出现的检测误差和重复性，有效提高荧光检测的准确度。

所述基体与基座之间设置有控温装置6，所述控温装置与基体和基座之间均设置有导热介质61。所述控温装置用于对基体进行加热和制冷，通过调整样本物质的温度，加快样本的变性-复性过程，即荧光成分的快速扩增过程，从而使得dna与荧光成分充分配对，以此达到pcr定量实验通过检测荧光信号强度而得到样本成分数据的实验目的；所述导热介质可在控温装置对样本试管进行加热时进行温度缓冲，而在冷却过程中亦可起到加快散热的效果。本实施例中导热介质采用空气层，亦可采用导热率较高的铝制层或银质层。所述控温装置底部设置有散热模块7，所述散热模块上设置有若干散热片71，所述散热模块与基座连接。所述散热模块进一步提高样本试管的复性过程，有效加快实验进度。本实施例中，控温装置采用微加热器，所述微加热器使得样本高温变性；采用散热模块采用金属片式散热器，通过前后式通风结构对样本试管进行有效散热。

所述往复式光纤扫描机构包括扫描轨道41、电机42和与电机连接的信号交互头8，所述信号交互头套接于扫描轨道并在扫描轨道上往复运动。所述往复式光纤扫描机构用于沿样本试管侧壁对其内部样本物质进行激发和检测，并将荧光信号通过光纤输出，所述信号交互头滑动连接于扫描轨道并在电机驱动下通过皮带带动匀速运动，可对样本试管进行无死角式充分扫描，提高实验结果准确度。所述信号交互头顶部设置有激发部和接收部，所述激发部与接收部集成一体，所述激发光模块通过光纤与激发部连接，所述接收部通过光纤与荧光检测模块连接。所述激发部用于将激发光模块产生的激发光均匀照射于样本试管，相应的，所述接收部则可将激发后的荧光强度信号输入荧光检测模块，进而完成实验数据的收集。

如图2所示，所述基体内竖直设置有安置槽，所述样本试管放置在安置槽内，所述基座平行于安置槽设置，所以安置槽底部设置有直径小于安置槽的检测孔，所述检测孔槽口朝向往复式光纤扫描机构设置，本实施例中，检测孔的中心高于安置槽底部2-5mm。可将光纤与检测孔的距离调节到最小，有利于提高激发光效率，获得更高的荧光灵敏度和荧光信号强度，提高稳定性。所述基体1内设置有安置槽11，所述样本试管设置在安置槽11内，所述安置槽11平行于基座3设置，所述检测孔12设置在安置槽11中部偏下位置，所述检测孔12的孔口朝向往复式光纤扫描机构4设置。如图3所示，所述光纤5为包括有分叉端和集束端的y字型结构，所述集束端包括有激发部和接收部，所述分叉端包括连通激发部的输入端51和连通接收部的输出端52，所述激发光模块21通过输入端51与激发部连接，所述荧光检测模块22通过输出端52接收部与连接，所述光纤5集束端设置在信号交互头8上。所述y型光纤的分叉端分别与激发光模块和荧光检测模块连接，而其集束端则与信号交互头连接，避免分离式光纤在限号交互头运动时互相缠绕造成隐患。所述安置槽纵剖面为锥形结构，所述样本试管与安置槽插合连接。所述倒锥形结构的安置槽用于配合倒锥形试管，使得实验过程中试管与基体充分贴合，既能确保反应步骤的进行更加迅速高效，也能确保检测过程下光电检测系统能够对试管内样本进行充分扫描。

本发明还公开了一种荧光检测方法，包括以下步骤：

将设置有待检测物质及荧光成分的样本试管插入安置槽中；

启动控温装置对样本物质进行高温变性，变性温度为80℃-95℃，接着对处理后的样本物质进行复性，调控温装置的温度至40℃-60℃，复性时间根据样本种类设置在30s-60s之间，最后对处理后的样本物质进行升温延伸反应，调整控温装置的温度至70℃-80℃，延伸反应时间根据样本中扩增片段长度设置为1-15min；

根据实验目标扩增程度以及样本浓度循环进行b步骤；

进入采样阶段，启动光电检测系统2，激发光模块21产生激发光，并通过往复式光纤扫描机构4自检测孔12逐个照射样本试管，同时样本试剂发射的荧光由检测孔12通过光纤传输到荧光检测模块22，并转为为电信号。

根据样本试管中待检测物质的dna模板种类，可对检测方法中的实验参数进行调整，确保a）、b）和c）三个步骤结束后得到的重组物质与荧光成分充分结合，依靠光电检测系统对各样本试管内的荧光成分进行激发，通过平行设置在样本试管一侧的往复式光纤扫描机构对样本试管内的荧光成分进行充分照射激发，使其跃迁至激发态，接着通过荧光检测机构依靠往复运动的往复式光纤扫描机构对激发态荧光成分进行检测，并将光信号转化为电信号输出检测装置，获得实验数据。

作为优选，所述激发光模块包括内部设置有激发光滤光片的第一透镜组件和led灯，所述第一透镜组件设置在led灯与光纤之间；所述荧光检测模块包括内部设置有接收滤光片的第二透镜组件和光电检测器，所述第二透镜组件设置在光纤与光电检测器之间。所述led灯用于输出光信号，配合第一透镜组件和光纤完成对荧光成分的激发，而所述第二透镜组件则用于将激发态荧光成分的荧光信号转变为光电检测器可识别光线，所述光电检测器将接收到的光信号转变为电信号，并输出本发明公开的荧光检测装置，以完成荧光检测。

具体的，本装置在使用前首先确定试管中的样本物质已经添加荧光成分、随机引物、taq酶等pcr实验辅助成分，即形成pcr反应体系。荧光定量pcr所使用的荧光成分可分为两种：荧光探针和荧光染料，本实施例中主要采用sybr荧光染料，在pcr反应体系中，加入过量sybr荧光染料，sybr荧光染料特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入dna链中的sybr染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步。接着将样本试管插入基体的安置槽中，因基体通过螺钉固定在基座外侧，因此可确保安置槽内的样本试管处于平行于光电检系统的位置；开始正式实验：a）变性：启动控温装置对样本试管进行高温加热，温度控制在90℃-95℃，样本物质中的双链dna模板在热作用下，氢键断裂，形成单链dna；b）复性：通过散热模块配合控温装置使得样本试管温度降低至45℃-60℃，该过程目的在于使得荧光成分与dna模板结合，形成局部双链；c）延伸：控制温度至72℃，在taq酶的作用下，以dntp为原料，从随机引物的x′端→y′端延伸，合成与模板互补的dna链，此时sybr荧光染料特异性地掺入dna双链，对样本物质的处理结束。其中三个步骤为一次循环，每次循环使得dna含量增加一倍。物质处理结束后开始进行检测；电机驱动信号交互头在扫描轨道上匀速运动，首先利用激发光模块产生激发射线，通过激发部对样本试管中的荧光成分进行激发，使得荧光成分吸收光能转变为激发态，接着关闭激发光模块，通过接收部将激发形成的荧光信号进行扫描采集，并通过光纤传输至荧光检测模块，实验完毕。本实施例中，激发光模块的第一透镜组件包括第一透镜和第二透镜，所述激发滤光片设置在第一透镜与第二透镜之间，所述led灯为单色led灯，确保光源单一稳定；所述荧光检测模块包含第三透镜和第四透镜，所述检测滤光片设置在第三透镜与第四透镜之间。激发部内的激发光源经过第一透镜，激发滤光片和第二透镜射入光纤，通过光纤传导，逐孔激发样本试管内的荧光成分，反射荧光则逐孔射入光纤，通过接收光纤传导给接收部，荧光依次经过光学检测单元的第三透镜、接收滤光片和第四透镜，照射到光电检测器上，所述光电检测器将其转化为电信号，用于分析处理。

除上述实施例外，在本发明的权利要求书及说明书所公开的范围内，本发明的技术特征可以进行重新选择及组合，从而构成新的实施例，这些都是本领域技术人员无需进行创造性劳动即可实现的，因此这些本发明没有详细描述的实施例也应视为本发明的具体实施例而在本发明的保护范围之内。