一种降低氮源用量的甾体药物前体生产方法与流程

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，更具体地涉及一种降低氮源用量的甾体药物前体高效生产方法。

背景技术：
：

甾体化合物对生物体的正常运转必不可少，当机体自身出现生产缺陷时，需主动摄入这类甾体化合物以补充机体的正常需要，甾体药物市场应运而生，且目前市场需求位列第二。

甾体药物的高需求促进了另一重要产业的发展——甾体药物前体(甾体药物中间体)的提取与制备。目前，主流生产甾体药物前体多以微生物转化法实现，利用廉价、易取的植物甾醇生产多功能的甾体药物前体。以甾醇为源头的微生物前体物质可主要分为c19-甾体(ad、add、9-ohad)与c22-甾体(20-羧基-孕甾-4-烯-3-酮、4-bnc、20-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮、4-bna)，其中，雄甾-4-烯-3，17-二酮(androstenedione，ad)主要用来生产雄性激素、蛋白同化激素、螺内酯等药物；雄甾-1，4-二稀-3，17-二酮(androsta-diene-dione，add)是合成19-去甲甾体系列雌激素，如雌酮(estrone)，炔诺酮(norethisterone)和黄体酮(progestin)的重要前体物。ad和add除了可以合成性激素外，还可以通过在其17位的酮基上引入皮质激素侧链使之能够应用于皮质激素的生产。由此可见，ad和add几乎可以合成所有的甾体药物，因此两者在市场上极为畅销。

氮是微生物合成蛋白质，核酸和生长所需物质的必不可少的元素。氮源的供应影响菌株的生长和代谢，这对于发酵过程中的产物生产非常重要。发酵工业中的可吸收氮通常由昂贵的酵母提取物，蛋白胨等提供，并占培养基成本的很大一部分。因此，寻找廉价的替代氮源是降低培养基成本的主要方法。但是大部分廉价碳源的使用需要进行过滤、水解等复杂的前处理，有时处理成本的存在会抵消部分使用优势，而且有些复杂的处理工艺不能很好的应用在大规模工业生产中。与使用廉价替换氮源相比，提高菌株对低氮源的适应性是降低氮源成本最直接，最有效的方法。

技术实现要素：
：

本发明的目的是提供一种基因工程菌，从而解决现有技术的甾体药物工业生物转化生产过程中氮源消耗巨大，效率低，成本高，继而导致甾体药物价格高昂的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供一种降低甾体药物前体生产氮源需求量的方法，是通过敲除甾体药物前体生产菌株中的氮源转录调节因子glnr基因实现的；

所述的甾体药物前体，包括但并不限于雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，ad)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，9α-oh-ad)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androst-1,4-diene-3,17-dione，add)、a环降解物等。

所述的甾体药物前体生产菌株可以是分枝杆菌属微生物或红球菌属微生物；

进一步地，所述分枝杆菌属微生物选自分枝杆菌(mycobacteriumsp.)nrrlb-3683、分枝杆菌(mycobacteriumsp.)nrrlb-3805、耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatism)、偶发分枝杆菌(mycobacteriumfortuitum)、微黄分枝杆菌(mycobacteriumgilvum)、新金分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)、草分枝杆菌(mycobacteriumphlei)、鸟分枝杆菌(mycobacteriumavium)等；

优选地，所述分枝杆菌属微生物为分枝杆菌(mycobacteriumsp.)mnrm3，该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ciccno.21097；

所述氮源转录调节因子的基因glnr编码如下蛋白质i或ii：

i：具有seqidno:2所示的氨基酸序列，大小为265个氨基酸；

ii：在i限定的氨基酸序列中经过取代，缺失或增加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质且与i的蛋白质具有相同的功能。

优选地，所述氮源转录调节因子基因编码的蛋白质与seqidno:2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性；更优的是具有80％以上的一致性，又更优的是具有90％以上的一致性。

优选地，所述氮源转录调节因子的基因glnr具有seqidno:1所示的核苷酸序列。

本发明提供的技术方案之二，是一种甾体药物生产基因工程菌，是在宿主菌分枝杆菌(mycobacteriumsp.)mnrm3的基础上，缺失seqidno:1所示的氮源转录调节因子的基因glnr所得。

本发明提供的技术方案之三，是技术方案二所述基因工程菌在生产甾体药物前体中的应用；

进一步地，采用所述菌株在低氮水平下发酵生产ad的方法如下：

将上述基因工程菌株的种子液按1％-10％的接种量转接于发酵培养基中，培养基含0.1％-5％植物甾醇，在25-37℃，100-200rpm条件下培养24-168h，可获得60％-99％的植物甾醇摩尔转化率；

进一步地，所述发酵培养基除氮源以外其他组成为：k2hpo40.1-3g/l，mgso40.1-3g/l，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/l，柠檬酸1-5g/l，还原糖5-50g/l，植物甾醇1-50g/l，其余为水，ph6.0-7.5；

进一步地，发酵培养基中氮源含量为：磷酸氢二铵0.1-10g/l；

优选地，发酵培养基中氮源含量为：磷酸氢二铵0.35-3.5g/l；

更优选地，发酵培养基中氮源含量为：磷酸氢二铵2.45-3.5g/l。

有益效果：

glnr是分枝杆菌中重要的转录调节因子，它的功能是调控大量基因的表达以应对培养环境的变化，但是本发明意外的发现，glnr的敲除可以反向调控菌株对氮源的需求量，并兼具提高菌株的活力的效果。从而构建了一株在低氮水平下高效转化生产甾体药物前体的基因工程菌。与原始菌mycobacteriumsp.mnrm3(以下简称mnr)相比，glnr敲除菌mycobacteriumsp.mnrm3△glnr(以下简称mnr△glnr)在低氮水平下生物量始终高于原始菌mnr，说明glnr基因的缺失可以反向调控菌株对氮源的需求量，有利于菌株在低氮源水平下的生长。在ad生产过程中mnr△glnr的菌体活力始终高于mnr，说明glnr基因的缺失可以提高菌株活力。又比较了多个氮源水平下mnr△glnr和mnr的转化能力，mnr△glnr在低氮源水平下的ad转化率始终高于原始菌mnr。在n^0.7条件下mnr△glnr的ad转化率(88.73％)已经比n¹条件下mnr的ad转化率(75.67％)高，比相同水平下mnr的ad转化率(59.41％)高29.32％。此外，在n¹条件下mnr△glnr的ad最高转化率可达93.14％比相同条件下mnr的ad转化率提高了17％。使用本方法描述的基因工程菌进行工业生产可在降低氮源需求的情况下提高转化率，从而大大提高生产效率降低生产成本。

附图说明：

图1glnr敲除菌基因型的验证图

其中泳道m是dna标准marker，泳道1-3是原始菌株mnr中glnr基因的扩增条带，泳道4-6是敲除菌mnr△glnr中glnr基因缺失459bp后的扩增条带；

图2mnr和mnr△glnr在不同氮源水平下菌体活力；

图3mnr和mnr△glnr在不同氮源水平下ad摩尔转化得率。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明中，氮源含量标示如下：

正常氮源水平设置为1(n¹＝3.5g/l(nh4)2hpo4)，低氮源水平培养基中氮含量分别为十分之一(n^0.1＝0.35g/l(nh4)2hpo4)，十分之三(n^0.3＝1.05g/l(nh4)2hpo4)，一半(n^0.5＝1.75g/l(nh4)2hpo4)，五分之三(n^0.6＝2.1g/l(nh4)2hpo4)，十分之七(n^0.7＝2.45g/l(nh4)2hpo4)，五分之四(n^0.8＝2.8g/l(nh4)2hpo4)和十分之九(n^0.9＝3.15g/l(nh4)2hpo4)。

本发明涉及的glnr基因序列如下(798个核苷酸，seqidno:1)：

gtggaactcttactactgaccgtggatccgcatcccgataccgtgttgccgtcactgtcgctgttggcccacaacgtgcgcaccgctcccaccgaggtgtcctcgctgctggaggcaggaaccgccgatatcgcgatcgtcgatgcgcgcagcgatctggcggccgcccgtgggttgtgccggctgctcggcaccaccggcacctccatcccggtcgtggccgtggtcaacgagggcgggctggtcgcggtcaatgtcgaatgggggctggacgagatcctgctgcccggtaccggccccgccgagatcgatgcccggttgcggctgctgatcggccgccgcggcggtgtcgccgaccaggagagcgtgggcaaggtcaccctcggggagttggtcatcgatgagggcacctacaccgcgcggttgcgcggacggccgctggacctcacctacaaggaattcgagctgctgaagtatctggcccaacacgccggtcgggtcttcacccgcgcgcagttgctccaggaggtgtgggggtacgacttcttcggtggcacccgcaccgtcgacgtccacgtccgtcgactgcgcgccaagctcggtcccgagtacgaggcgctgatcggtaccgtgcgcaacgtcgggtacaaggcggtccggccggcccgcggccgcgccgcggctcccgcggccgaggatgatctggacgaggagttcggcggcgaactcgacgccgacctcggtgagtccgaattcggttccgcggcagggtcgttcggacccctgcgtggccagtga

glnr基因编码的转录调节因子glnr的氨基酸序列如下(265个氨基酸，seqidno:2)：

melllltvdphpdtvlpslsllahnvrtaptevsslleagtadiaivdarsdlaaarglcrllgttgtsipvvavvnegglvavnvewgldeillpgtgpaeidarlrlligrrggvadqesvgkvtlgelvidegtytarlrgrpldltykefellkylaqhagrvftraqllqevwgydffggtrtvdvhvrrlraklgpeyealigtvrnvgykavrpargraaapaaeddldeefggeldadlgesefgsaagsfgplrgq

以下将通过具体实施方式对本发明做进一步地解释说明。

实施例1glnr基因敲除菌株mnr△glnr的构建

构建新金分枝杆菌基因敲除质粒，将其电转化入mnr感受态中，利用潮霉素和卡那霉素进行双抗筛选并同时进行蓝白斑筛选。对筛选正确的菌株进行蔗糖平板筛选并同时进行卡那霉素抗性复筛以获得基因敲除克隆子。利用pcr方法对基因敲除克隆子进行验证。

具体步骤如下：

1.敲除质粒构建：根据seqidno:1所述glnr基因序列信息设计glnr基因上下臂引物。上臂引物glnr-u-f和glnr-u-r：

glnr-u-f：ataaactaccgcattaaagctttctgaacccgtccaggtcga；

glnr-u-r：ctcgggaccgacgatcgcgatatcggcg；

下臂引物glnr-d-f和glnr-d-r：

glnr-d-f：atcgtcggtcccgagtacgaggcgctg；

glnr-d-r：tgacactatagaatacataggatccggtccgcggacggaaagtga。

分别将目标基因glnr的1131bp上臂基因和1107bp下臂基因克隆到质粒p2nil上。再用paci酶切上述质粒和pgoal19质粒后进行非定向连接，构建基因敲除质粒pko-glnr。

2.mnr感受态制备：用接种环取一环mnr甘油菌在无抗lb平板上三区划线，30℃培养3d，挑取单菌落至无抗lb试管中，30℃200r/min培养2d，按10％接种量转接到种子培养基(不含碳酸钙)中进行二级种子培养；36h后加入10％甘氨酸(20％)继续培养24h。冰浴预冷，4℃离心收集菌体，分别用1倍、3/4倍、1/2倍和1/4倍发酵液体积的10％预冷甘油(含cacl2)冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1/25倍的10％甘油悬浮菌体，并分装保存；

3.电转化：取10μl构建好的glnr基因敲除质粒pko-glnr，加入到100μl感受态菌体中放置30min后转入电转杯进行电击。电击条件2kv/cm，25μf,720ω条件下电转4-6ms后冰上放置5min。向电转杯中加入700μl新鲜灭菌lb培养基，混匀，转移至1.5ml灭菌ep管，30℃200rpm进行复苏。

4.筛选与验证：将复苏后的菌液涂布在含有hyg50μg/ml、kn20μg/ml、x-gal50μg/ml和iptgμg/ml的lb固体培养基上培养5-7d，挑取带蓝斑菌落，pcr验证正确的即为单交换菌株。将验证好的单交换菌涂布含2％蔗糖平板上，培养3-7d挑取白色菌落提取基因组进行pcr验证，验证结果见图1，其中泳道m是dna标准marker，泳道1-3是原始菌株mnr中glnr基因的扩增条带，泳道4-6是敲除菌mnr△glnr中glnr基因的扩增条带，结果表明在敲除菌mnr△glnr中glnr基因缺失459bp，glnr敲除成功。将glnr基因敲除菌株命名为mnr△glnr。

实施例2原始菌mnr与敲除菌mnr△glnr在不同氮源水平下菌株生物量比较

将原始菌mnr与敲除菌mnr△glnr分别接种于八种氮源水平(n^0.1、n^0.3、n^0.5、n^0.6、n^0.7、n^0.8、n^0.9、n¹)的发酵培养基中，除氮源(nh4)2hpo4外，培养基组成为：k2hpo41g/l，mgso41g/l，柠檬酸铁铵0.1g/l，柠檬酸2g/l，还原糖20g/l，植物甾醇3g/l，其余为水，ph6.0-7.5。30℃，200rpm，培养96h后检测发酵液的od600值。

结果如下表所示，随着培养基氮源水平的提高，两株菌的生物量均有所上升，说明氮源对菌株生长的影响较大。敲除菌mnr△glnr的生物量始终高于原始菌mnr，说明glnr基因的缺失有利于菌株在低氮源水平下的生长。

表1不同氮源水平下菌株生物量比较

实施例3原始菌mnr与敲除菌mnr△glnr在不同氮源水平下菌株活力比较

按照实施例2的方法在n^0.1、n^0.5、n^0.7和n¹四种氮源水平下，培养原始菌mnr与敲除菌mnr△glnr，分别在24h、72h、120h取样。将样品用磷酸盐缓冲液洗涤三次后用pbs缓冲液调整od值为1，取190μl加入到96孔板中，再分别加入10μl含有2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐的细胞活力检测液，30℃下振荡孵育1小时后使用酶标仪检测450nm的吸收值。

原始菌mnr与敲除菌mnr△glnr在不同氮源水平下菌株活力比较结果如图2所示，在相同取样点时，mnr△glnr在所有氮源水平下的菌体活力均比mnr高，特别是在120h，mnr△glnr在n^0.1、n^0.5、n^0.7和n¹四种氮源水平下的菌体活力分别是mnr的1.42、1.55、1.55、1.49倍。由此可说明glnr的敲除能够提高菌体的活力有利于ad的生产。

实施例4不同氮源水平下原始菌mnr与敲除菌mnr△glnr的ad转化能力比较

1.菌株活化及种子制备

将原始菌mnr及敲除菌mnr△glnr分别转接于新鲜lb培养基上，30℃培养2d，用20ml0.5％的tween80无菌水溶液洗菌，吸取lml洗脱液加入到50ml种子培养基中，在30℃，200rpm条件下摇床培养36h得种子液；

2.ad生产过程

将步骤1中获得的种子液按10％的接种量分别转接于含有不同氮源梯度水平的发酵培养基(含10％过筛植物甾醇)中，在30℃，140rpm条件下生物转化168h。氮源梯度水平按如下设置：正常氮源水平设置为1(n¹＝3.5g/l(nh4)2hpo4)，低氮源水平培养基中氮含量分别为十分之一(n^0.1＝0.35g/l(nh4)2hpo4)，一半(n^0.5＝1.75g/l(nh4)2hpo4)，五分之三(n^0.6＝2.1g/l(nh4)2hpo4)，十分之七(n^0.7＝2.45g/l(nh4)2hpo4)，五分之四(n^0.8＝2.8g/l(nh4)2hpo4)和十分之九(n^0.9＝3.15g/l(nh4)2hpo4)。

所述发酵培养基组成为(除氮源(nh4)2hpo4外)：k2hpo40.8g/l，mgso40.4g/l，柠檬酸铁铵0.05g/l，柠檬酸1.8g/l，磷酸氢二铵3.5g/l，还原糖20g/l，植物甾醇5g/l，其余为水，ph6.0-7.5。

3.样品检测

每24h取样一次，取发酵液1ml，加入等体积乙酸乙酯，超声30min。12,000g离心10min，吸取100μl上清液，室温干燥后，用80％甲醇重悬样品，超声30min，12,000g离心20min，吸取上清，进行hplc分析。agilentl200型色谱仪各项参数设定为：c18(4.6×250mm)色谱柱，柱温30℃；流动相甲醇/水(8:2,v/v)，流速1ml/min，检测波长254nm，进样量10μl，每个样品运行10min。按标准曲线计算ad产量及转化率。

4.结果分析

根据图3结果分析，随着氮源水平的提高(n^0.5到n¹)，mnr和mnr△glnr的ad摩尔转化率不断升高。在不同的氮源水平下glnr敲除菌株mnr△glnr的ad摩尔转化率始终高于原始菌株mnr。在n^0.7条件下mnr△glnr的ad转化率(88.73％)已经比n¹条件下mnr的ad转化率(75.67％)高，比相同水平下mnr的ad转化率(59.41％)高29.32％。此外，在n¹条件下mnr△glnr的ad最高转化率可达93.14％比相同条件下mnr的ad转化率提高了17％。进一步证明敲除glnr基因是一种降低氮源用量高效生产甾体药物前体的方法。因此，使用所述基因敲除菌株用于甾体药物前体工业生产具有提高转化率和节省氮源消耗的双重益处，大大降低生产成本。

综上所述，采用本发明构建的氮源转录调控因子缺失分枝杆菌基因工程菌，可以明显缩短工业生产的转化周期，降低氮源的消耗，大大提高甾体药物前体的生产效率，降低生产成本。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>天津科技大学

<120>一种降低氮源用量的甾体药物前体生产方法

<130>1

<141>2020-01-16

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>798

<212>dna

<213>分枝杆菌(mycobacteriumsp.mnrm3)

<400>1

gtggaactcttactactgaccgtggatccgcatcccgataccgtgttgccgtcactgtcg60

ctgttggcccacaacgtgcgcaccgctcccaccgaggtgtcctcgctgctggaggcagga120

accgccgatatcgcgatcgtcgatgcgcgcagcgatctggcggccgcccgtgggttgtgc180

cggctgctcggcaccaccggcacctccatcccggtcgtggccgtggtcaacgagggcggg240

ctggtcgcggtcaatgtcgaatgggggctggacgagatcctgctgcccggtaccggcccc300

gccgagatcgatgcccggttgcggctgctgatcggccgccgcggcggtgtcgccgaccag360

gagagcgtgggcaaggtcaccctcggggagttggtcatcgatgagggcacctacaccgcg420

cggttgcgcggacggccgctggacctcacctacaaggaattcgagctgctgaagtatctg480

gcccaacacgccggtcgggtcttcacccgcgcgcagttgctccaggaggtgtgggggtac540

gacttcttcggtggcacccgcaccgtcgacgtccacgtccgtcgactgcgcgccaagctc600

ggtcccgagtacgaggcgctgatcggtaccgtgcgcaacgtcgggtacaaggcggtccgg660

ccggcccgcggccgcgccgcggctcccgcggccgaggatgatctggacgaggagttcggc720

ggcgaactcgacgccgacctcggtgagtccgaattcggttccgcggcagggtcgttcgga780

cccctgcgtggccagtga798

<210>2

<211>265

<212>prt

<213>分枝杆菌(mycobacteriumsp.mnrm3)

<400>2

metgluleuleuleuleuthrvalaspprohisproaspthrvalleu

151015

proserleuserleuleualahisasnvalargthralaprothrglu

202530

valserserleuleuglualaglythralaaspilealailevalasp

354045

alaargseraspleualaalaalaargglyleucysargleuleugly

505560

thrthrglythrserileprovalvalalavalvalasngluglygly

65707580

leuvalalavalasnvalglutrpglyleuaspgluileleuleupro

859095

glythrglyproalagluileaspalaargleuargleuleuilegly

100105110

argargglyglyvalalaaspglngluservalglylysvalthrleu

115120125

glygluleuvalileaspgluglythrtyrthralaargleuarggly

130135140

argproleuaspleuthrtyrlysgluphegluleuleulystyrleu

145150155160

alaglnhisalaglyargvalphethrargalaglnleuleuglnglu

165170175

valtrpglytyraspphepheglyglythrargthrvalaspvalhis

180185190

valargargleuargalalysleuglyproglutyrglualaleuile

195200205

glythrvalargasnvalglytyrlysalavalargproalaarggly

210215220

argalaalaalaproalaalagluaspaspleuaspglugluphegly

225230235240

glygluleuaspalaaspleuglygluserglupheglyseralaala

245250255

glyserpheglyproleuargglygln

260265