基于CRISPRi调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种进行乙醛酸生物合成的基于crispri调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法。

背景技术：

乙醛酸(glyoxylicacid)是醛酸家族中分子量最小的物质，是生物体tca循环(三羧酸循环)和乙醛酸循环中重要的有机酸，影响着生物体的代谢平衡，其衍生品多达数十种，其中典型的有香兰素、乙基香兰素、尿囊素、对羟基苯丙氨酸、对羟基苯乙酰胺等。乙醛酸衍生物被广泛应用于食品添加剂、糕点、糖果、烘烤食品、烟酒、香料、化妆品以及医药等行业，随着乙醛酸需求量的增加，化学法生产乙醛酸带来的污染日益严重，为减少污染，利用生物法合成乙醛酸逐渐成为一种重要途径。

目前，生物法合成乙醛酸主要是通过酵母的静息细胞进行生物催化反应，并利用乙醇酸氧化酶将乙醇酸氧化为乙醛酸，反应中需要以石油的衍生物乙醇酸作为底物，同时加入过氧化氢酶和fmn。此方法相较于化学法减少了污染，但该方法也存在操作复杂、生产成本高的不足，从而限制了其产业化应用。

基于此人们又开始了更有利于可持续发展的基因工程菌发酵法的研究，且其中由rna引导的dna核酸内切酶的ⅱ型crispr/cas9系统的crispri技术，也即利用调节基因转录和蛋白表达水平提高合成效率，逐渐成为人们关注的一个研究方向。

crispri体系由失去核酸内切酶活性的dcas9蛋白和sgrna两个组件构成，其中sgrna由3部分组成，也即20nt目标基因特定核苷酸区域的识别序列，42ntdcas9蛋白结合序列，以及40nt转录终止子序列。crispri的工作机制为sgrna引导dcas9蛋白结合在dna的特定位置时，三者形成的复合物能够形成空间位阻，从而实现调节基因表达水平的目的。

对研究人员而言，采用crispri技术以调控乙醛酸合成，从而有助于利用生物法以实现乙醛酸的工业化生产便显得很有意义，但现有技术中关于基因工程菌发酵法生产乙醛酸的报道却很少。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种基于crispri调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法，以能够利用crispri技术构建谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸工艺，利于乙醛酸的生物合成。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法，该方法包括通过dcas9表达盒基因置换谷氨酸棒状杆菌的乙醛脱氢酶编码基因，通过异柠檬酸脱氢酶编码基因与苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元置换谷氨酸棒状杆菌的乳酸脱氢酶编码基因，并过表达谷氨酸棒状杆菌的异柠檬酸裂合酶编码基因，得到谷氨酸棒状杆菌工程菌株，且培养所述工程菌株发酵合成乙醛酸。

进一步的，所述dcas9表达盒基因置换乙醛脱氢酶编码基因包括构建dcas9表达盒基因打靶质粒，将所述dcas9表达盒基因打靶质粒通过电转化转入野生型谷氨酸棒状杆菌菌株，通过两次同源重组，使dcas9表达盒基因置换乙醛脱氢酶编码基因。

进一步的，所述dcas9表达盒基因打靶质粒的构建包括：

a1.以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，扩增出乙醛脱氢酶编码基因的上、下同源臂片段，启动子posd基因片段；

a2.以dcas9-peasy质粒为模板，扩增出dcas9基因片段；

a3.通过融合pcr技术将a1和a2步骤扩增的基因片段搭接；

a4.将a3步骤获得的搭接片段与空质粒pk18mobsacb用nhei和xhoi进行双酶切，得到的酶切产物纯化，经t4连接酶于16℃过夜连接，转化至e.colitranst1感受态细胞中，经验证筛选获得打靶质粒dcas9-pk18mobsacb。

进一步的，所述异柠檬酸脱氢酶编码基因与苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元置换乳酸脱氢酶编码基因包括构建异柠檬酸脱氢酶编码基因与苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元打靶质粒，将该sgrna转录单元打靶质粒通过电转化转入已由dcas9表达盒基因置换乙醛脱氢酶编码基因的谷氨酸棒状杆菌菌株，通过两次同源重组，使异柠檬酸脱氢酶编码基因与苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元置换乳酸脱氢酶编码基因。

进一步的，所述异柠檬酸脱氢酶编码基因与苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元打靶质粒的构建包括：

b1.以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，扩增出乳酸脱氢酶编码基因的上、下同源臂片段；

b2.利用融合pcr扩增出异柠檬酸脱氢酶编码基因的sgrna转录单元组件，以及苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元组件，其中，异柠檬酸脱氢酶编码基因的sgrna转录单元组件包括启动子psod基因序列、20bp的sgrna基因序列、cas9蛋白结合区域基因序列以及终止子rrnb基因序列，苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元组件包括启动子ptuf基因序列、20bp的sgrna基因序列、cas9蛋白结合区域基因序列以及终止子rrnb基因序列；

b3.利用b1步骤的上、下同源臂片段与b2步骤的异柠檬酸脱氢酶编码基因和苹果酸合成酶编码基因的sgrna组件，通过goldengate克隆法构建出异柠檬酸脱氢酶编码基因与苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元打靶质粒。

进一步的，所述过表达谷氨酸棒状杆菌的异柠檬酸裂合酶编码基因包括构建异柠檬酸裂合酶编码基因过表达质粒，将异柠檬酸裂合酶编码基因过表达质粒通过电转化转入已由dcas9表达盒基因置换乙醛脱氢酶编码基因、以及由异柠檬酸脱氢酶编码基因与苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元置换乳酸脱氢酶编码基因的谷氨酸棒状杆菌菌株，并过表达异柠檬酸裂合酶合成基因，得到谷氨酸棒状杆菌工程菌株。

进一步的，所述异柠檬酸裂合酶编码基因过表达质粒的构建包括：

c1.以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板扩增出启动子psod基因片段、异柠檬酸裂合酶编码基因片段，以及终止子rrnb基因片段并搭接；

c2.将c1搭接片段与pxmj19gz质粒利用hindiii和bamhi进行双酶切，得到的酶切产物纯化，经t4连接酶于16℃过夜连接，转化至e.colitranst1感受态细胞中，经验证筛选得到异柠檬酸裂合酶编码基因过表达质粒。

进一步的，所述dcas91表达盒基因打靶质粒、或sgrna转录单元打靶质粒、或异柠檬酸裂合酶编码基因过表达质粒电转化转入谷氨酸棒状杆菌菌株包括：

d1.将过夜培养的谷氨酸棒状杆菌菌株按照10％的接种量接种于种子培养基中摇瓶振荡培养，当od600达到0.5-0.7时，于4℃、4000r/min离心收集菌体，弃掉上清后加入10％甘油轻轻洗涤两次获得谷氨酸棒状杆菌感受态细胞；

d2.吸取质粒和谷氨酸棒状杆菌感受态细胞于离心管中轻弹混合，转入电击杯，静置5min后开始电击，电击条件为2.5kv/m电压、250ω电阻、25μf电容；

d3.电击完成后立即向电击杯中加入预热的孵育培养基，重悬混合后转移至离心管中，在恒温加热器中于48℃加热6min，之后30℃、180r/min培养4h；

d4.离心弃上清后将菌液涂布在含有卡那霉素的lb固体培养基平板上，30℃恒温培养48-72h。

进一步的，所述dcas9表达盒基因置换乙醛脱氢酶编码基因、所述异柠檬酸脱氢酶编码基因与苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元置换乳酸脱氢酶编码基因，其中的两次同源重组包括：

e1.将质粒电转化入谷氨酸棒状杆菌菌株48-72h后，对在含卡那霉素的固体培养基上生长的单菌落进行分子验证，确定质粒发生第一次同源重组并已整合到谷氨酸棒状杆菌染色体上；

e2.选取确定发生第一次同源重组的阳性单菌落转接到孵育培养基中，30℃、180r/min培养12h，使之在无抗生素条件下自由生长，并使之发生第二次同源重组；

e3.将菌液稀释涂布在含10％蔗糖的lb固体培养基上，30℃过夜培养。将长出的转化子一一对应扩培到含10％蔗糖和卡那霉素的lb固体培养基上；

e4.基于在含蔗糖培养基上生长而在含卡那霉素培养基上不生长的单菌落为发生第二次同源重组的菌株确定阳性转化子，并通过菌液pcr验证获得的阳性转化子。

进一步的，培养所述工程菌株发酵合成乙醛酸包括将工程菌株接种到种子培养基中，30℃、180r/min摇瓶振荡过夜培养，再接种到含5％葡萄糖的cd培养基中振荡培养，培养中定时取样测定菌体生长浓度。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法，以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，敲除了其支流代谢关键酶乳酸脱氢酶编码基因，建立了crispri调控体系，并利用该体系使支流代谢中的异柠檬酸脱氢酶编码基因和苹果酸合成酶编码基因调低表达水平，同时过表达异柠檬酸裂合酶编码基因，与现有敲除异柠檬酸脱氢酶编码基因和苹果酸合成酶编码基因策略相比较，谷氨酸棒状杆菌生长几乎不受影响，并且通过强化乙醛酸合成通路，阻断支流代谢途径，也能够减少副产物的生成，使得乙醛酸得到积累，而为谷氨酸棒状杆菌工业化生产乙醛酸奠定了基础。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1谷氨酸棒杆菌合成乙醛酸代谢工程策略示意图；

图2为本发明实施例同源重组原理示意图；

图3为本发明实施例质粒dcas9-pk18mobsacbpcr验证结果(图中，d：dcas9表达盒基因验证结果；+：阳性对照；0：阴性对照；m：dl15000dnamarker)；

图4为本发明实施例工程菌c.glutamicum/dcas9δaldh菌液pcr验证结果(图中，q：aldh基因验证结果；d：dcas9基因验证结果；+：阳性对照；0：阴性对照；m：dl2000/5000dnamarker)；

图5为本发明实施例质粒icd-ms-pk18mobsacb酶切验证(图中，z：icd-ms-pk18mobsacb质粒酶切验证结果；m：dl15000dnamarker)；

图6为本发明实施例工程菌c.glutamicum/icd-msδlldh菌液pcr验证结果(图中，q：lldh基因验证结果；c：icd-sgrna基因验证结果；m：ms-sgrna基因验证结果；+：阳性对照；0：阴性对照；m：dl2000dnamarker)；

图7为本发明实施例质粒icl-pxmj19gz酶切验证结果(图中，z：icl-pxmj19gz质粒酶切验证结果；m：dl15000dnamarker)；

图8为本发明实施例工程菌株c.glutamicum/icl菌液pcr验证结果(图中，s：icl基因验证结果；+：阳性对照；0：阴性对照；m：dl2000dnamarker)；

图9为本发明实施例野生菌与工程菌的生长情况对比；

图10为本发明实施例野生菌株发酵48h后发酵液中乙醛酸的含量；

图11为本发明实施例工程菌c.glutamicum/icl发酵48h后发酵液中乙醛酸的含量。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本实施例涉及一种基于crispri调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法。

谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicumatcc13032，简称c.glutamicumatcc13032)作为食品安全级的微生物，具有易培养、不产孢子、产率高、生物安全等优点。随着谷氨酸棒状杆菌全基因组测序的完成和各个组学数据的积累，对其进行定向改造和构建工程菌株得以实现，在c.glutamicum糖酵解途径和tca循环过程中，丙酮酸、乳酸、柠檬酸、异柠檬酸、乙醛酸和苹果酸之间存在着复杂的网络系统，它们错综复杂并且相互关联，通过对其进行定向改造，可在作为工程菌时使之具有更高的生产效率。

本实施例的乙醛酸合成方法，整体设计上包括通过dcas9表达盒基因置换谷氨酸棒状杆菌的乙醛脱氢酶编码基因(aldh基因)，通过异柠檬酸脱氢酶编码基因(icd基因)与苹果酸合成酶编码基因(ms基因)的sgrna转录单元置换谷氨酸棒状杆菌的乳酸脱氢酶编码基因(lldh基因)，并过表达谷氨酸棒状杆菌的异柠檬酸裂合酶编码基因(icl基因)，得到谷氨酸棒状杆菌工程菌株，并且培养所述工程菌株而发酵合成乙醛酸。

其中，利用谷氨酸棒杆菌合成乙醛酸代谢的工程策略整体如图1中所示，而具体来说，本实施例以采用dcas9表达盒基因为例，上述的dcas9表达盒基因置换aldh基因包括构建dcas9表达盒基因打靶质粒(dcas9-pk18mobsacb)，将该打靶质粒dcas9-pk18mobsacb通过电转化转入野生型谷氨酸棒状杆菌菌株，通过两次同源重组，使得dcas9表达盒基因置换aldh基因。

上述的icd基因与ms基因的sgrna转录单元置换lldh基因包括构建icd基因与ms基因的sgrna转录单元打靶质粒(icd-ms-pk18mobsacb)，将该sgrna转录单元打靶质粒icd-ms-pk18mobsacb通过电转化转入已由dcas9表达盒基因置换aldh基因的谷氨酸棒状杆菌菌株，并通过两次同源重组，使得icd基因与ms基因的sgrna转录单元置换lldh基因。

上述过表达icl基因包括构建icl基因过表达质粒，将icl基因过表达质粒通过电转化转入已由dcas9表达盒基因置换aldh基因、以及由icd基因与ms基因的sgrna转录单元置换lldh基因的谷氨酸棒状杆菌菌株，并过表达icl基因，而得到谷氨酸棒状杆菌工程菌株。

在以上打靶质粒dcas9-pk18mobsacb的构建中，为了将dcas9基因整合到c.glutamicum基因组上，选择c.glutamicum支流代谢中乙醛脱氢酶编码基因alldh做为其替代基因，以将dcas9替换到aldh基因的相应位置，同时该替换具体包括有如下的步骤：

a1.以c.glutamicum基因组为模板，扩增出aldh基因的上、下同源臂片段，和启动子posd基因片段；

a2.以dcas9-peasy质粒为模板，扩增出dcas9基因片段；

a3.通过融合pcr技术(fusionpcr)将a1和a2步骤扩增的基因片段搭接；

a4.将a3步骤获得的搭接片段与空质粒pk18mobsacb用nhei和xhoi进行双酶切，得到的酶切产物纯化，经t4连接酶于16℃过夜连接，转化至e.colitranst1感受态细胞中，经验证筛选获得打靶质粒dcas9-pk18mobsacb。

上述步骤中，dcas9-peasy质粒一般在实验室中会有保存，当然dcas9-peasy质粒也可由其它具有相同功用、可满足本实施例使用要求的质粒代替。而对于其中的酶切产物纯化处理，所用纯化方法按照公知的常规方法进行便可，并且上述的进行验证筛选以得到打靶质粒dcas9-pk18mobsacb。验证筛选采用公知的pcr验证方法，以dcas9基因序列设计引物，能扩增出条带的为阳性转化子，本文其它验证筛选与此类同。

本实施例在以上icd基因与ms基因的sgrna转录单元打靶质粒的构建中，为了敲除c.glutamicum支流代谢关键酶乳酸脱氢酶编码基因lldh，同时也为了将icd和ms基因的sgrna转录单元整合到c.glutamicum染色体上，因此选取lldh基因的相应位置作为目的位置，将sgrna转录单元替换掉lldh基因，此时该替换具体包括以下的步骤：

b1.以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，扩增出乳酸脱氢酶编码基因的上、下同源臂片段；

b2.利用公知的融合pcr方法，分别扩增出异柠檬酸脱氢酶编码基因，以及苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元组件。其中，异柠檬酸脱氢酶编码基因的sgrna转录单元组件包括启动子psod基因序列、20bp的sgrna基因序列cgcgagcagcggtgcttcgt(非编码链序列)、cas9蛋白结合区域基因序列以及终止子rrnb基因序列，苹果酸合成酶编码基因的sgrna转录单元组件包括启动子ptuf基因序列、20bp的sgrna基因序列ggaaatcctcgtacgcctct(非编码链序列)、cas9蛋白结合区域基因序列以及终止子rrnb基因序列；

b3.将b1步骤的上、下同源臂片段与b2步骤的异柠檬酸脱氢酶编码基因和苹果酸合成酶编码基因的sgrna组件，通过goldengate克隆法构建出打靶质粒icd-ms-pk18mobsacb。

需要说明的是，上述步骤b3中的goldengate克隆法具体又包括有如下的步骤：

首先构建一个工具质粒px-ackt-lacz，其包括：lldh基因的上同源jiyin序列、lacz基因和lldh基因的下同源基因序列。lacz基因两端带有bsaι酶切位点，一端的4个bp长度的overhang与sgicl转录单元组件一端的overhang互补，另一端与sgms转录单元组件的一端overhang互补，sgicl转录单元组件与sgms转录单元组件之间的overhang互补。

分别扩增sgms转录单元组件和sgicl转录单元组件，酶切工具质粒px-ackt-lacz，分别纯化后进行酶切连接，其中sgicl和sgms的浓度至45ng，px-ackt-lacz80ng，bsaι内切酶、t4连接酶0.751μl，dtt1μl，atp0.41μl，总反应体系10μl。将连接产物转化至大肠杆菌，筛选验证，最终构建得到带有lldh上下同源臂及sgms转录单元组件和sgicl转录单元组件的打靶质粒px-ackt-sgicl-sgms。

同时，还需要指出的是，本实施例以上sgrna组件中所采用的启动子psod、ptuf和终止子rrnb是天然启动子及终止子，一般来说由于其转录范围较大，不能精确转录cas9蛋白所结合的靶向rna特定的靶向识别序列，因而在crispr/cas9系统中可能影响到cas9蛋白的对目标位置的精准切割，而对于crispri体系，其只影响到crispri体系对目标基因的调控范围和强度。

在本实施例中，通过下文将提及的对所得工程菌株发酵液的检测，可以发现与野生型菌株相比所得的工程菌发酵的乙醛酸得到了积累，由此可知本实施例上述的天然启动子及终止子可应用于crispri调控体系，并起到调控靶向基因的作用。

本实施例中，在以上icl基因过表达质粒的构建中，其具体包括如下的步骤：

c1.以c.glutamicum基因组为模板扩增出启动子psod基因片段、异柠檬酸裂合酶编码基因片段，以及终止子rrnb基因片段并搭接；

c2.将c1搭接片段与pxmj19gz质粒利用hindiii和bamhi进行双酶切，得到的酶切产物纯化，经t4连接酶于16℃过夜连接，转化至e.colitranst1感受态细胞中，经验证筛选得到异柠檬酸裂合酶编码基因过表达质粒icl-pxmj19gz。

基于以上的各打靶质粒的构建，本实施例中将dcas9表达盒基因打靶质粒dcas9-pk18mobsacb、sgrna转录单元打靶质粒icd-ms-pk18mobsacb、或异柠檬酸裂合酶编码基因过表达质粒icl-pxmj19gz电转化转入谷氨酸棒状杆菌菌株时，其具体上又包括有如下的步骤：

d1.将过夜培养的谷氨酸棒状杆菌菌株按照10％的接种量接种于种子培养基中摇瓶振荡培养，当od600达到0.5-0.7时，于4℃、4000r/min离心收集菌体，弃掉上清后加入10％甘油轻轻洗涤两次，获得谷氨酸棒状杆菌感受态细胞。

d2.吸取质粒和谷氨酸棒状杆菌感受态细胞于离心管中轻弹混合，转入电击杯，静置5min后开始电击，电击条件为2.5kv/m电压、250ω电阻、25μf电容；

d3.电击完成后立即向电击杯中加入预热的孵育培养基，重悬混合后转移至离心管中，在恒温加热器中于48℃加热6min，之后30℃、180r/min培养4h；

d4.离心弃上清后将菌液涂布在含有卡那霉素的lb固体培养基平板上，30℃恒温培养48-72h。

在上述电转化步骤中，c.glutamicum感受态细胞的制备，其具体例如可参考现有文献(jangk,britzm.improvedelectrotransformationfrequenciesofcorynebacteriumglutamicumusingcell-surfacemutants[j].biotechnologyletters,2000,22(7):539-545.doi:10.1023/a:1005629224109)

此外，本实施例上述的dcas9表达盒基因置换aldh基因中，c.glutamicum菌株利用蔗糖致死基因sacb反向筛选技术，并通过两次同源重组方法来进行基因敲除，其原理可如图2中所示，且其中的两次同源重组具体上则包括有如下的步骤：

e1.将打靶质粒dcas9-pk18mobsacb电转化入野生型c.glutamicumatcc13032菌株48-72h后，挑取在含卡那霉素的固体培养基上生长的单菌落进行分子验证，以dcas9基因序列设计引物，能扩增出条带的为阳性转化子，以确定质粒发生第一次同源重组并已整合到谷氨酸棒状杆菌染色体上；

e2.选取确定发生第一次同源重组的阳性单菌落转接到孵育培养基中，30℃、180r/min培养12h，使之在无抗生素条件下自由生长，并使之发生第二次同源重组；

e3.将菌液稀释涂布在含10％蔗糖的lb固体培养基上，30℃过夜培养。将长出的转化子一一对应扩培到含10％蔗糖和卡那霉素的lb固体培养基上；

e4.基于在含蔗糖培养基上生长而在含卡那霉素培养基上不生长的单菌落为发生第二次同源重组的菌株确定阳性转化子，并进一步通过菌液pcr验证，以sac基因序列设计引物扩增不出条带、并且以dcas9基因序列设计引物，能扩增出条带的为阳性转化子，也即阳性工程菌株c.glutamicum/dcas9δaldh。

在上述步骤中，对单菌落进行菌液pcr验证的方法具体为在200μl离心管中加入20μl的无菌水，用枪尖蘸取少量单菌放入离心管中，充分吹吸混匀。再将菌液恒温加热器100℃裂解20min，然后迅速放入-40℃冰箱中速冻5min，以使细胞壁充分裂解。以裂解液为模板进行pcr验证，能批出插入基因条带并且批不出被敲除基因条带的即为阳性转化子。

按照与上述阳性工程菌株c.glutamicumdcas9/δaldh相同的方法，将质粒icd-ms-pk18mobsacb转入到c.glutamicumdcas9/δaldh中，两次同源重组，替换lldh基因，获得阳性工程菌株c.glutamicumicd-ms/δlldh。

将icl基因过表达质粒icl-pxmj19gz转入到c.glutamicum/icd-msδlldh中，便可获得阳性工程菌株c.glutamicum/icl。

此时，本实施例培养所得工程菌株c.glutamicum/icl发酵合成乙醛酸具体则包括将工程菌株接种到种子培养基中，30℃、180r/min摇瓶振荡过夜培养，再接种到含5％葡萄糖的cd培养基中振荡培养，培养中定时取样测定菌体生长浓度，并调节ph值维持在6.5-7.5，即可进行乙醛酸的生物合成生产。

下面将根据以上所述的对本实施例合成方法的整体介绍，结合于具体的实例进一步说明本发明的乙醛酸生物合成方法。

在本实施例的实例中，除特别声明外，其中所涉及的诸如融合pcr技术、基因验证引物设计、菌液pcr验证等各种技术均采用现有基因工程中常规操作规程便可，当然不仅仅是本实例，在本实施例中涉及的所有技术均亦如此。

另外，各t克隆质粒、打靶工具质粒和e.colitrant1等均可通过市购获得。

所使用的试剂中，其也可通过市购获得，例如high-fidelitydna聚合酶可购自北京全式金生物制品公司，t4dna连接酶、限制性内切酶、t4dna连接酶均可购自neb(北京)有限公司，基因组提取试剂盒、质粒小提中量试剂盒、超薄dna产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒均可购自天根生化科技(北京)有限公司，聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)引物可由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

所使用的设备中，pcr扩增仪可采用eppendorfmastercyclergradient，全自动凝胶成像系统可采用bioradmolecularimagergeldocxr，台式高速离心机可采用eppendorfminispin，高速冷冻离心机可采用thermosorvallevolutionrc，酶标仪可采用biotekepowerwave，高效液相色谱仪可采用agilent1260infinity。

本实例采用的质粒及菌株列表：

而所涉及的培养基或培养条件中，具体来说可设置为如下：

1.e.coli的培养条件为：lb培养基、37℃培养，氨苄青霉素工作浓度为100μg/l，卡那霉素工作浓度为50μg/l；

2.c.glutamicumatcc13032的培养条件为：37℃培养，卡那霉素工作浓度为30μg/l。

其培养基配方如下：

3.lb培养基：10g/l胰蛋白胨(tryptone)，10g/lnacl，5g/l酵母提取物(extract)，调ph值7左右；固体培养基则添加琼脂粉20g/l。

4.soc培养基(g/l)：20g/l胰蛋白胨(tryptone)，5g/l酵母提取物(extract)，0.5g/lnacl，250mmkcl10ml，1m葡萄糖2ml，2mmgcl2.5ml，调ph值7左右。

5.cd培养基：1g/lkh2po4，1g/lnh4no3，3g/l(nh4)2so4，0.5g/lmgso4，0.01g/lfe2(so4)3，0.2g/lcacl2，0.001g/lznso4，0.01g/lmnso4，0.002g/lcuso4，0.002g/l生物素，调ph值7左右。

6.孵育培养基：10g/l胰蛋白胨(tryptone)，10g/lnacl，5g/l酵母提取物(extract)，1g/l乙酸钠，调ph值7左右。

7.种子培养基：10g/l玉米浆，25g/l葡萄糖，20g/l琼脂，调ph值7左右。

8.发酵培养基：50g/l葡萄糖，5g/l乙酸钠，0.1g/lnhno3，1.5g/lkh2po4，0.3g/lcacl2，0.25g/lmgso4，5g/l(nh4)2so4，调ph值7左右。

在具体实例中，基于前述的整体方法设计，为了将dcas9表达盒基因置换掉aldh基因，以c.glutamicum基因组为模板，分别扩增出aldh基因上、下同源臂片段、启动子psod基因片段，以dcas9-peasy质粒为模板，扩增出dcas9基因片段，再通过融合pcr技术将其搭接，并与质粒pk18mobsacb相连，获得重组质粒dcas9-pk18mobsacb。

构建完成后可对其进行pcr验证，具体为挑取单菌落液体培养，取菌液20μl，通过高温热裂解的方式在恒温加热器中100℃加热20min，得到的裂解液可以作为pcr模板，以验证引物为引物进行pcr验证，得到的条带如图3所示。此时由图3所示，dcas9表达盒基因与阳性对照条带大小一致，即说明打靶质粒dcas9-pk18mobsacb构建成功。

然后，将打靶质粒dcas9-pk18mobsacb利用电转化转入到野生型c.glutamicumatcc13032菌株，通过两次同源重组，使dcas9表达盒基因置换aldh基因。接着，采用aldh基因序列为模板设计敲除基因验证引物，以dcas9基因序列为模板设计敲入基因验证引物如下表。

引物pcas1f和pcas2r验证dcas9基因是否敲入，dcas9-peasy质粒为阳性；引物qaldhf和qaldhr验证转化子中aldh基因是否敲除，c.glutamicum为阳性对照；引物sacyzf和sacyzr验证转化子中反向筛选标记sacb基因是否敲除，pk18mobsacb为阳性对照；引物qyzf和qyzr验证c.glutamicum自身已知基因是否存在，c.glutamicum为阳性对照。

通过进行菌液pcr验证，菌液pcr验证结果如图4所示，aldh基因未能扩增出，而dcas9基因与阳性对照条带大小一致，即说明dcas9表达盒基因置换了aldh基因的工程菌c.glutamicum/dcas9δaldh构建成功。

接着，为了将icd基因和ms基因的sgrna转录单元置换掉lldh基因，以c.glutamicum基因组为模板扩增出lldh基因的上、下同源臂片段，并通过延长引物，利用两次pcr扩增出icd基因和ms基因的sgrna组件，利用goldengate克隆法构建出打靶质粒icd-ms-pk18mobsacb。然后，可对该质粒进行酶切验证，如图5所示，经酶切后分别获得5400bp和3000bp两条片段，其与pk18mobsacb质粒和icd与ms基因sgrna转录单元片段大小一致，由此可说明打靶质粒icd-ms-pk18mobsacb构建成功。

然后，将打靶质粒icd-ms-pk18mobsacb利用电转化转入到已验证正确的工程菌c.glutamicum/dcas9δaldh中，通过两次同源重组，使icd与ms基因sgrna转录单元基因置换lldh基因。再分别以lldh基因序列为模板设计敲除基因验证引物，并以icd基因sgrna转录单元基因序列和ms基因sgrna转录单元基因为模板设计敲入基因验证引物，进行菌液pcr验证，此时如图6所示，lldh基因未扩增出条带，而icd-sgrna基因大小、ms-sgrna基因大小均与阳性对照条带大小一致，即说明icd与ms基因sgrna转录单元基因置换lldh基因的工程菌c.glutamicum/icd-msδlldh构建成功。

接着，以c.glutamicum基因组为模板扩增出icl基因片段及启动子psod基因片段并搭接，并与pxmj19gz质粒连接，以获得过表达质粒icl-pxmj19gz。对该过表达质粒进行酶切验证，如图7所示，经酶切后获得6500bp和1600bp两条片段，其与pxmj19gz质粒和icl基因及启动子psod基因搭接片段大小一致，也说明重组过表达质粒构建成功。

然后，将过表达质粒icl-pxmj19gz利用电转化转入到已验证正确的工程菌c.glutamicum/icd-msδlldh，再挑取在含氯霉素的固体培养基上生长的单菌落，进行菌液pcr验证，如图8所示，扩增出的icl基因大小与阳性对照条带大小一致，可说明工程菌株c.glutamicum/icl构建成功。

最后，为验证经本实施例方法所获得的工程菌株c.glutamicum/icl的乙醛酸合成能力，首先将获得的工程菌株c.glutamicum/icl与野生菌株c.glutamicumatcc13032分别接种到种子培养基中，30℃，180r/min，摇瓶振荡过夜培养，分别以等od值接种到含5％葡萄糖的cd培养基中，在相同的条件下摇瓶振荡培养48h，定时取样，并测定菌体生长浓度。两者的生长状况如图9所示，由图9可知野生菌株和c.glutamicum/icl生长趋势几近相同，其说明敲除了aldh和lldh基因，同时降低了icd和ms基因的表达水平，并未影响c.glutamicum菌株的糖酵解途径和tca循环，菌株能正常生长。

再检测工程菌株发酵液中乙醛酸的产量，此时将工程菌株c.glutamicum/icl与野生菌株c.glutamicumatcc13032以等od值接种到含5％葡萄糖的cd培养基中，同时以5％葡萄糖作为碳源的cd培养基进行发酵，连续培养48h后收集发酵液。培养中定时取样，并测定菌体生长浓度。

培养完成后，将留存待测的样品经8000r/min离心10min后，吸取上清液用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤并稀释，利用高效液相色谱法来检测发酵液中乙醛酸的含量。检测条件设置为：agilent1200高效液相色谱仪，紫外检测器，bdshypersilc18柱，4.6×200mm，流动相为20mmol/lkh2po4(ph2.8)和乙腈混合液，检测波长210nm，柱温29℃，流速0.5ml/min，进样量20μl。

经检测，结果如图10和图11所示，且经计算工程菌c.glutamicum/icl发酵液中乙醛酸的含量为5mg/ml，而野生菌c.glutamicum发酵液中乙醛酸几乎不积累。由此可知在工程菌c.glutamicum/icl的乙醛酸代谢途径中，通过敲除乳酸脱氢酶编码基因，降低苹果酸合酶基因和异柠檬酸脱氢酶编码基因表达，切断了乙醛酸代谢途径支路，并遏制了副产物的行成，由此积累了乙醛酸，实现了从无到有的过程，而有利于乙醛酸的生物合成。

本实施例借助crispri技术，可在转录层面对目标基因，也即异柠檬酸脱氢酶和苹果酸合酶的表达进行调控，能够规避传统基因敲除方法的缺点，能够在不影响细胞生长的前提下，对c.glutamicum的代谢途径进行优化和调整。同时其能够强化异柠檬酸裂合酶表达，阻断支流代谢产物乳酸形成，使得工程菌与野生型相比较生长速度基本相同，可在不影响生长的情况下，达到了生物合成乙醛酸得目的，由此可为乙醛酸的生物合成生产奠定基础，并且其也能够对其他代谢工程产品的研究提供借鉴。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>河北科技大学

<120>基于crispri调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法

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