一株枯草芽孢杆菌菌株及其在植物生长中应用的制作方法

本申请属于土壤改良技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌菌株及其在植物生长中应用。

背景技术：

土壤是物质循环和能量交换的主要场所，是农业生产中最重要的自然资源。对土壤的深入了解，对于维持生物多样性和人类生产生活的稳定性具有十分重要的生态安全意义。但近年来，随着人类对土壤的过度开发和使用，以及大量废渣、废水、废气等污染物的不合理排放，导致了大面积土壤处于严重污染和退化状态，同时对于人体健康和农产品质量安全也构成了严重威胁。因此，土壤修复、土壤改良技术得到了快速发展。

现有技术中，土壤改良方式和改良物质有多种，其中腐殖酸和生物炭因其材料易得、效果显著，因此是最为常用的土壤改良物料。

生物炭是在缺氧环境下，通过高温裂解将木材、草、玉米秆或其它农作物废料中的有机物质炭化之后的产物。生物炭的孔洞结构丰富，可以聚集营养物质和有益微生物，从而改良土壤结构。腐植酸是由木材、秸秆等植物残体和生物废料经过分解形成的，含有丰富的碳、氢、氧、氮等元素。这些土壤改良材料，一方面可以改良土壤的物理结构，另一方面，可以持续性增加土壤肥力，使贫瘠的土地变得肥沃，从而有利于植物生长繁茂，增加粮食产量。

但总体上，土壤改良是一个复杂的系统性工程，单独的生物炭或腐殖酸的应用并不能解决所有土壤问题，仍然需要结合不同土壤情况有针对性对土壤进行改良，从而满足不同作物生长需要。

技术实现要素：

本申请目的在于提供一株土壤改良用枯草芽孢杆菌菌株，配合相关腐殖酸和生物炭载体应用，可较好改良土壤物理结构和水肥特性，从而适用于相关农作物生长需要。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一株土壤改良用枯草芽孢杆菌菌株，该菌株为：枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）zwca02，已于2019年6月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：cgmccno.17889，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

利用所述土壤改良用枯草芽孢杆菌菌株所制备土壤菌剂，以枯草芽孢杆菌zwca02菌株作为发酵用菌株，利用生物发酵工艺发酵制备获得，其中发酵培养基组成为，

每吨培养基中含有：玉米粉13kg,葡萄糖5kg,豆粉20kg,炭酸钙caco37kg,硫酸铵(nh4)2so41kg,磷酸钾k2hpo40.3kg,氯化钾kcl0.4kg，硫酸镁mgso4·7h2o0.2kg,硫酸锰mnso4·h2o0.2kg；培养基ph=7.0~7.2，发酵条件为：28℃、通风比1:1有氧条件下、搅动转速为180转/分钟培养。

利用所述土壤改良用枯草芽孢杆菌菌株所制备的土壤改良剂，以重量份数计，包括：腐殖炭基粉60-80份，枯草芽孢杆菌zwca02菌剂10-30份（每g菌剂中含10~100亿活性孢子）。

所述腐殖炭基粉为吸附有腐植酸的生物炭或活性炭，具体制备方法为：分别取2份生物炭（或活性炭）、1份腐植酸，将腐植酸与适量水溶解混匀后，将水溶液倒入生物炭（或活性炭）中充分吸收，然后将吸附有腐植酸的生物炭（或活性炭）充分干燥即可。

所述土壤改良剂，其形态优选为颗粒状（也可为粉末状），从而便于改良土壤团粒的物理结构，具体可通过如下步骤制备而成：

（1）菌株发酵

将枯草芽孢杆菌zwca02在26-37℃条件下进行培养和发酵，制备成发酵液；

（2）制备发酵基液

在步骤（1）的发酵液中加入腐殖炭基粉；混合均匀干燥后即为土壤改良剂，或者通过挤压或滚筒机械制粒，即可得到颗粒状土壤改良剂。

所述土壤改良剂在植物栽培中应用，用于促进植物生长，所述植物具体例如为小白菜。

本申请通过对于相关优势微生物菌株的筛选和验证，为相关土壤改良和作物增产奠定了一定基础。初步应用效果表明，利用本申请所提供的菌株所制备的微生物菌剂、以及配合该菌剂所制备的土壤改良剂，一方面能够明显改善土壤团粒结构，改善土壤板结情况，另一方面，能够显著提高土壤中微生物含量和有机质养分，提高土壤肥力，促进植物生长，有利于保持土壤结构和功能的持续稳定性。由于相关制备工艺较为成熟，生产成本较低，且使用较为方便，加上本申请对于土壤改善效果较为持久，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1枯草芽孢杆菌zwca02在固体培养基中的菌落形状和颜色，其中a为28℃培养箱生长24h结果；b为28℃培养箱生长72h结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请做进一步的解释说明。

实施例1

在申请人所使用的试验基地（申请人河南中威化工有限公司在河南新乡平原新区所设基地）内，发明人发现同一地块内的部分土壤板结情况相交其他地块板结情况较轻，且作物产量相对较高，发明人为此猜测其土壤中相关优势微生物菌株对于土壤改良、作物生长具有一定有益效果，为此，发明人对此地块土壤进行了采样，并就优势微生物菌株进行筛选、培养，具体过程简要介绍如下。

采用稀释平板法，对从试验基地土壤中所采集土样在室内用无菌水溶解后，将上清液依次稀释涂布平板，挑取单个菌进行平板划线纯化，逐渐进行初筛和复筛，以挑选优势菌株，并进行鉴定。需要说明的是，菌株筛选和培养过程中，采用yepd酵母膏胨葡萄糖培养基（yepd平板培养基的制备方式为：溶解10g酵母膏，20g蛋白胨，加入20g琼脂粉，121℃下灭菌20min，加入100ml20%灭菌葡萄糖溶液，在每个培养皿倒入10-15ml培养基冷却凝固后，接种菌株）28℃条件进行培养。培养24h和72h的生长情况分别如图1的a图和b图所示。

进一步理化特性鉴定结果汇总如下表所示：

。

综合相关菌落形态及理化特性等结果，发明人鉴定其为：枯草芽孢杆菌，因此将该菌株命名为：枯草芽孢杆zwca02。而鉴于该菌株可能的土壤改良应用及作物增产应用，发明人进一步将其进行了微生物保藏，即，发明人于2019年6月3日将枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）zwca02菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：cgmccno.17889，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2

由于微生物菌株实际应用时，一般均以菌剂或菌粉形式应用，结合本申请土壤改良及作物增产目的，发明人将实施例1所筛选的菌株进一步制备成发酵液，以便进一步加以应用。本实施例就具体发酵液制备过程简要介绍如下。

制备种子液：将保存的枯草芽孢杆菌zwca02菌株接种到已灭菌的0.5l摇瓶中，摇瓶培养（每瓶装有0.2l的yepd酵母膏胨葡萄糖液体培养基），200转/分钟条件下，摇瓶培养18hr，作为液体种子液。

中级发酵：将液体种子液无菌转入已灭菌的含有0.3t液体发酵培养基的发酵罐中（发酵罐中培养基组分为，每吨液体发酵培养基中含有：玉米粉13kg，葡萄糖5kg，豆粉20kg，炭酸钙caco37kg，硫酸铵(nh4)2so41kg，磷酸钾k2hpo40.3kg，氯化钾kcl0.4kg，硫酸镁mgso4·7h2o0.2kg，硫酸锰mnso4·h2o0.2kg；培养基ph=7.0~7.2）；液体种子液与发酵培养基按照体积比1:500的量进行接种，发酵条件为：28℃、通风比1:1有氧条件下、180转/分钟，进行发酵培养18h，作为中级发酵液。

.规模发酵：将中级发酵液接种到已灭菌的10t发酵罐中（发酵罐装有3.5t液体发酵培养基，发酵培养基与中级发酵中的液体发酵培养基组分相同），发酵条件为：28℃、通风比1:1有氧条件下、180转/分钟培养36h。

发酵结束后，对规模发酵的发酵液测定结果表明，发酵液中有效成分（菌株发酵所产生的菌丝干重和孢子粉）含量为：40-45kg／吨（每公斤的孢子数量约为10^12-13个左右）。

实施例3

以实施例2所制备菌剂为基础，以小白菜（普通白菜曾氏变种，brassicacampestrisl.ssp.chinensismakino，var.communistsenetlee)为种植对象，发明人进行了实际栽种实验，具体实验过程简要介绍说明如下。

实验情况：

实验地块，申请人河南中威化工有限公司在河南中牟所设试验基地，实验地块连年使用有尿素、复合肥等化工肥料，土壤具有明显板结现象，并且前茬种植作物为油菜；

实验设计为3个重复，每个重复小区面积为：3m×4m；

小白菜种植时间为：2019年9月~11月期间，种植过程中分别测量小白菜株高和每个种植小区内小白菜的产量。

实验结果：

种植结束后，对小白菜植株高度(厘米)情况统计如下表所示：

注：表中1~10为每个处理组中随机选取样品的测量数据。

表中ck1、ck2和ck3为空白对照，不施用肥料，设置三个重复；

基质1、基质2和基质3为采用腐殖炭基粉改良土壤板结情况（现有研究表明，生物炭或者腐植酸均可以一定程度改良土壤结构，本申请中所采用的腐殖炭基粉，为申请人自制的200-400目粉末状的腐殖炭基粉产品，该腐殖炭基粉的制备方法为：分别取2份生物炭（采用现有技术制备即可，或者具体参考如下制备步骤：以修剪后苹果茎干废料为生物质原料，剪切成5cm长度左右的小段，110℃烘箱中干燥24h后，粉碎成木屑；随后采用碳化炉装置，在惰性气体氛围条件下，500℃保温120min，以使生物质原料在厌氧条件下进行高温裂解和炭化；保温结束后，自然冷却，并最终粉碎成300目左右即为本实施例所采用的生物炭成品，其密度0.55g/cm³左右，灰分含量在5%左右）、1份腐植酸，将腐植酸与适量水溶解混匀后，将水溶液倒入生物炭中充分吸收，然后将吸附有腐植酸的生物炭充分干燥即可）；该基质处理种植组不含任何菌剂，每平方米土壤中腐殖炭基粉施用量为75g，设置三个重复；

菌剂1、菌剂2和菌剂3为“枯草芽孢杆菌菌株zwca02菌剂处理组”，每平方米土壤中，施用：10g（孢子数200亿/g左右）枯草芽孢杆菌zwca02菌剂；

处理1、处理2和处理3为“枯草芽孢杆菌菌株zwca02菌剂+腐殖炭基粉处理组”，每平方米土壤中，施用：10g（孢子数20亿/g左右）枯草芽孢杆菌zwca02菌剂和75g腐殖炭基粉。

对上述株高结果进行进一步统计计算，可以看出，单一枯草芽孢杆菌菌剂处理组、和枯草芽孢杆菌菌剂+腐殖炭基粉处理组的小白菜植株高度显著高于其他处理组结果。

而具体小白菜产量（克/m²）结果统计如下表所示：

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结合前述小白菜株高统计结果，分析可以看出，相较于现有的利用生物炭的单一的改良土壤结构，本申请所采用的菌剂确实具有明显促进作物长高和提高产量的作用效果。但就单一菌剂与菌剂+生物炭联用效果对比而言，配合生物炭应用时，进一步作物增高、增产改进效果较为有限，但就实际土壤板结、土壤结构的初步观察效果而言，相较于单一生物炭对于土壤板结、土壤结构的改进效果，单一菌剂、尤其是菌剂+生物炭联合应用时的土壤结构改善效果更优，这也是本申请中作物株高、作物产量明显提升的主要影响因素之一。