一种天然低分子量独活多糖及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种天然低分子量独活多糖及其制备方法和应用。

背景技术：

生物体在新陈代谢过程中会不断产生自由基，自由基过多会不同程度损伤生物体的重要分子如核酸、蛋白质等，引起健康问题。现有研究表明，众多慢性疾病如糖尿病、高血脂症、癌症、衰老等的发生发展都与自由基密切相关。因此，生物体从食品或药物中摄取天然抗氧化剂是延缓或降低人体氧化损伤、抗衰老的重要途径之一。

研究表明，天然来源的活性多糖具有抗氧化、降血脂、免疫调节及抗肿瘤等活性且毒副作用小，安全可靠。本申请人前期研究发现，某些中草药来源的活性多糖如桑叶多糖、海参多糖等具有良好的抗氧化活性(carbohydrpolym,2015,128,52–62；molecules,2018,23,590)。但不同来源多糖结构具有非常大的差异，如分子量大小、单糖组成、理化性质、糖苷键种类、分支情况等等都有较大差异，导致各类多糖的抗氧化活性也存在较大差异。不同来源中药多糖的抗氧化性仍待探讨，仍是学术界研究热点。

独活为伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan的干燥根，主要用于祛风除湿，痛痹止痛。目前所见已报道的独活提取物如中国发明专利公开号为cn1718578a和cn104274505b等制备的提取物一般是挥发油等脂溶性成分，具有止痛、消肿、抗炎等功效，用于止痛及治疗风湿性关节炎等，但不含有多糖成分而且不具有抗氧化活性。到目前为止国内外鲜见独活主要活性成分之一的多糖组成及理化性质的相关研究报道，更未见独活多糖确切结构的研究报道，尤其未见具有确切结构的独活多糖具备抗氧化活性的相关研究报道。

研究显示，中草药活性多糖抗氧化性与其黏度、单糖组成、分子量、糖醛酸含量、糖苷键类型等结构密切相关。尤其分子量大小是影响抗氧化活性强弱的一个重要结构特征因素。一般来说，一定范围内，分子量越小抗氧化性越强。而大多数天然中草药多糖存在一些药学上难以接受的物理特性如分子量大、黏度大、溶解性差等。正如本申请人近些年研究所示，桑黄多糖分子量大(812kda)、黏度大(225ml/g)、溶解性较差，其抗氧化活性较低(intjbiolmacromol,2018,120,1855–1864)。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供了一种天然低分子量独活多糖。本发明首次从独活中提取制备了一种低分子量独活多糖，进一步研究发现天然低分子量独活多糖具有较高的抗氧化活性，其在实验剂量范围内能显著地清除dpph自由基、羟基自由基以及具有较强的金属离子螯合能力。该低分子量独活多糖较本申请人前期提取得到的高分子量桑黄多糖黏度小、溶解性更好，抗氧化活性更强。因此，本发明之低分子量独活多糖作为天然抗氧化剂具有重要的应用价值。

本发明所述的天然低分子量独活多糖是一种高抗氧化活性的天然低分子量低黏度独活多糖(low-molecular-weightangelicapubescenspolysaccharide,lapp)，所述独活多糖lapp为具有以下结构式的同系多糖的混合物，结构式如下：

上述结构式中，

a、b、d、f、g为α–d–葡萄糖–1–基；

c为α–d–甘露糖–1–基；

e为α–l–阿拉伯糖–1–基；

h为β–d–半乳糖–1–基；

i为β–d–半乳糖醛酸–1–基；

进一步的，所述结构式中，以摩尔比计，所述独活多糖所含甘露糖(d-manp)、半乳糖醛酸(d-galap)、葡萄糖(d-glcp)、半乳糖(d-galp)、阿拉伯糖(l-araf)的摩尔比范围为2.0：(1.2±0.3)：(68.2±0.3)：(7.6±0.3)：(1.0±0.3)；

其中的m与n之和为5～12的整数，例如m＝2，n＝5，之和为7。

进一步的，

本发明之独活多糖lapp的重均分子量(mw)为3000～5000da；所述分子量可采用高效凝胶色谱法(hpgpc)检测。从抗氧化活性强度考虑，以重均分子量计，本发明选择的lapp的分子量范围为约3000～5000da(即结构式所示同系物的m+n约为5～12的整数)，优选分子量范围为约3000～4000da(结构式所示同系物的m+n约等于5～9的整数)。

本发明之独活多糖的多分散指数介于1.0至2.0之间；多分散指数(pdi,重均/数均分子量之比，mw/mn)优选介于1.0至1.5之间。

本发明之独活多糖的纯度>90％(hpgpc，面积归一化法)。

本发明之独活多糖的黏度为5～30ml/g，易溶于水或生理盐水。

本发明所述独活多糖lapp是伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan的干燥根中提取分离的低分子量多糖。

本发明研究发现，所述独活多糖lapp具有强效抗氧化活性，能够清除dpph自由基、羟基自由基以及具有较强的金属离子螯合能力。

本发明的第二目的是提供所述天然低分子量独活多糖lapp的制备方法。所述lapp的制备方法是从伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan的干燥根(即独活)中提取及分离制备；采用热水浸提得到独活总多糖，经分级醇沉或超滤得到低分子量独活粗多糖，进一步采用凝胶排阻获得所述分子量范围的均一性多糖。具体包括如下步骤：

(1)独活粗多糖的提取制备：将独活洗净、切片、烘干、粉碎、过筛，得独活粉末，取独活粉末用有机溶剂浸泡或回流除去色素及脂溶性小分子杂质，得到除杂残渣，将除杂残渣挥干溶剂后，置于反应釜中加水提取，料液比为1：10～1：30，55～95℃提取1～2次，每次1～4h，离心并合并所得提取液，用大孔树脂脱色，得到独活粗多糖提取液；

所述有机溶剂可选但不局限于无水乙醇、丙酮或乙酸乙酯等，优选毒性小对环境友好的无水乙醇。

(2)低分子量独活粗多糖制备：分级醇沉或超滤步骤(1)所得的独活粗多糖提取液以获得低分子量范围的独活多糖组分。

脱色后的独活粗多糖提取液任选以下两种方法之一进行分级处理：

方法一(超滤方法)：独活粗多糖提取液采用超滤膜超滤，收集超滤透过溶液，取透过液进行浓缩、冻干，得到低分子量独活粗多糖；

方法二(分级醇沉方法)：独活粗多糖提取液边搅拌边缓慢加入95％食用乙醇或无水乙醇至乙醇终浓度为50～60％，4℃静置4h～12h，离心取上清，再往上清液边搅拌边加入95％食用乙醇或无水乙醇至乙醇终浓度为80％～90％，4℃静置4h～12h，离心得多糖沉淀，真空冷冻干燥，得到低分子量独活粗多糖；

(3)低分子量独活多糖的制备：取步骤(2)所得低分子量范围的独活粗多糖进一步分离纯化，以得到低分子量独活多糖为目标分子量的均一性多糖。

将步骤(2)得到的低分子量独活粗多糖配成质量分数为5％～10％的水溶液，过处理好的凝胶柱(直径2～5cm×长100～200cm)，流动相为0.01～0.2mnacl，上样体积为柱总体积的1％～6％，流速为20～40ml/h，3～8ml/管，收集洗脱流份，检测，合并目标分子量(3000～5000da)的低分子量独活多糖组分，除盐，真空冷冻干燥，得到天然低分子量独活多糖。

进一步的，所述步骤(1)中，除杂残渣的制备步骤具体为：取独活粉末，反复用无水乙醇或其他有机溶剂室温浸泡3次，或于60～80℃水浴回流提取0.5～1h，弃上清液，下层残渣重复上次操作2～4次。

进一步的，所述步骤(1)中，55～95℃热水提取时可加入蛋白酶如木瓜蛋白酶等酶解辅助提取，或用超声或微波的物理手段进行辅助提取。

进一步的，所述步骤(2)中，方法一的超滤膜超滤，超滤膜为截留分子量8～20kda。

进一步的，所述步骤(2)中，方法二将独活粗多糖提取液先加乙醇至乙醇终浓度为50～60％醇沉，离心弃沉淀除掉大部分(80％以上)分子量大于20kda的物质，再向上清液中加乙醇至乙醇终浓度为80％～90％。

进一步的，步骤(3)中，凝胶柱层析法所用的凝胶填料可选但不局限于葡聚糖凝胶如sephadexg-100凝胶或sephadexg-75凝胶、琼脂糖凝胶如sepharosecl-4b或sepharosecl-6b、聚丙烯酰胺凝胶如bio-gelp30等。洗脱流份检测可选但不局限于苯酚硫酸法、硫酸咔唑法、硫酸蒽酮法等，也可采用多糖的末端吸收210nm检测。除盐方法包括但不限于透析、超滤或凝胶柱层析脱盐。

本发明的第三目的是提供所述的天然低分子量独活多糖在制备天然抗氧化剂中的应用，所述天然抗氧化剂可用于医药、食品和化妆品等领域。

有益效果：

本发明的天然低分子量独活多糖，黏度小，易溶于水，其重均分子量为3000～5000da，单糖组成为甘露糖(d-manp)、半乳糖醛酸(d-galap)、葡萄糖(d-glcp)、半乳糖(d-galp)和阿拉伯糖(l-ara)，d-man:d-gala:d-glc:d-gal:l-araf的摩尔比范围为2.0:(1.2±0.3):(68.2±0.3):(7.6±0.3):(1.0±0.3)，主链由(1→3)-α-d-glcp、(1→4)-α-d-glcp、(1→4)-β-d-galp、(1→6)-α-d-manp、(1→3)-α-l-araf组成，侧链为α-d-glcp-(1→3)-β-d-gala，连接于主链(1→4)-α-d-glcp糖残基的o-6位。经验证，本发明的天然低分子量独活多糖能显著地清除dpph自由基、羟基自由基以及具有较强的金属离子螯合能力；该低分子量独活多糖较本申请人前期提取得到的高分子量桑黄多糖黏度小、溶解性更好，抗氧化活性更强。本发明的独活多糖结构清晰、分子量低、纯度高、黏度小、水溶性强，并具有显著抗氧化活性，可作为天然无毒抗氧化剂，应用于医药、食品和化妆品等领域。

附图说明

图1为lapp-1的洗脱曲线及hpgpc色谱图；

图2为lapp-1的¹hnmr检测图谱；

图3为lapp-1的¹³cnmr检测图谱；

图4为lapp-1的¹h-¹hcosy、tocsy和roesy异头氢信号区域叠加图谱；

图5为lapp-1的¹h-¹hhsqc检测图谱；

图6为lapp-1的¹h-¹³chmbc检测图谱；

图7为lapp-2的紫外图谱；

图8为lapp-2的红外图谱；

图9为lapp-1对dpph自由基清除作用检测结果；

图10为lapp-1对羟基自由基清除作用检测结果；

图11为lapp-1对金属离子螯合能力检测结果。

具体实施方式

下面结合附图及具体的实施例对本发明作进一步说明。

【实施例1】

天然低分子量独活多糖(lapp-1)的制备

1.1材料：

伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan的根采自湖北省五峰土家族自治县；sephadexg-100和sephadexg-10(美国gehealthcre公司)，nacl、乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。

1.2方法：

(1)独活粗多糖的提取制备：伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan(独活)的根用自来水洗净、切片、60℃鼓风干燥箱中烘干、组织捣碎机粉碎、过60目筛，称取独活粉末1kg用无水乙醇浸泡3次除去色素及脂溶性小分子杂质，除色素的残渣挥干乙醇，置反应釜中加水20l(料液比为1:20)，92℃提取2次，每次3h，每次提取后离心取上清液，合并所有提取液，用ads-7型大孔树脂脱色。

(2)低分子量独活粗多糖制备：将步骤(1)所得脱色的独活粗多糖提取液边搅拌边缓慢加入95％食用酒精至乙醇终浓度为60％，4℃静置4h，离心取上清，再往上清液边搅拌边加入95％食用乙醇至乙醇终浓度为80％，4℃静置4h，离心得多糖沉淀，真空冷冻干燥。最终制备得到低分子量独活粗多糖冻干粉为10.1g，得率约为1.0％。

(3)低分子量独活多糖(lapp-1)制备：取所述步骤(2)制备的低分子量独活粗多糖10g，加水200ml溶解，过处理好的sephadexg-100凝胶柱(φ5×200cm)，流动相为0.1mnacl，每次上样体积为50ml，流速为30ml/h，约5ml/管，收集洗脱流份，苯酚硫酸法检测，合并目标分子量(3000～5000da)的lapp-1组分，sephadexg-10凝胶柱除盐，真空冷冻干燥。最终得到纯化的lapp-1冻干粉2.2g，纯度>98％(hpgpc，面积归一化法)，重均分子量(mw)为3600da。

(4)lapp-1理化性质及结构检测：采用乌式粘度计按照中国药典(2015版)四部通则0633黏度测定法测定特性黏度；高效凝胶色谱法(hpgpc)检测分子量及分布；单糖组成采用柱前衍生化hplc检测。

avanceav600核磁共振谱仪(600mhz)检测nmr谱图解析多糖结构(瑞士bruker公司，溶剂为d2o含trimethylsilyl-propionicacid(tsp-d4)内标，温度25℃)。

1.3结果：

lapp-1的洗脱曲线及hpgpc检测谱图见附图1，单糖组成、理化参数测定结果见表1；1d和2dnmr检测谱图见附图2～6，¹h/¹³cnmr谱图数据的信号归属见表2。表1检测结果显示，lapp-1分子量和特性粘度均较低。

表1.低分子量独活多糖lapp-1的理化参数、单糖组成检测结果

以lapp-1的¹h/¹³cnmr谱图见附图2-3，其信号归属数据见表2。表2中加粗的化学位移为糖残基取代位点，由于其化学位移较单糖标准品化学位移有明显向低场移动。

¹h-¹hcosy、tocsy、roesy谱图(附图4)显示制备的lapp-1含有十组自旋耦合系统。结合¹h-¹³chsqc(附图5)等nmr谱图，各糖残基及其连接方式最终归属为(1→4)-α-d-glcp(a)、(1→3)-α-d-glcp(b)、(1→6)-α-d-manp(c)、(1→4,6)-α-d-glcp(d)、(1→3)-α-l-araf(e)、(4→)-α-d-glcp(fα)、(1→)-α-d-glcp(g)、(1→4)-β-d-galp(h)、(4→)-β-d-glcp(fβ)、(1→3)-β-d-galap(i)等糖残基及连接方式。¹h-¹³chmbc谱图(附图6)进一步确认了lapp-1组成单糖之间的连接关系。¹hnmr谱图异头氢信号峰的峰面积可以计算各糖残基的摩尔比，由核磁计算得到的各糖残基的摩尔比与单糖组成分析计算得到的结果一致。从¹h-¹³chmbc谱图也可以看出各残基的异头氢构型，耦合常数大于170ppm为α型，小于165为β型。由1d和2d核磁归属结果提示，lapp-1还原末端为d-glcp-(4→，所占比重较大，能够清晰辨别其异头氢的化学信号，其在重水溶液中为α型和β型相互转变。因此，糖残基f存在两组自旋耦合系统。由核磁归属得到的lapp-1结构可以知道，葡萄糖醛酸与葡萄糖相连形成二糖作为侧链连接于主链→4)-α-d-glcp-(1→的o-6位。

表2.低分子量独活多糖lapp-1的1h/13cnmr检测数据(δ[ppm])

【实施例2】天然低分子量独活多糖(lapp-2)的制备

2.1材料：

伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan的根采自湖北省五峰土家族自治县；木瓜蛋白酶(40万u/g，北京鼎国生物技术有限责任公司)，sepharosecl-4b(sigma-aldrich公司)，bio-gelp-2(美国伯乐公司)nacl、乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。

2.2方法：

(1)独活粗多糖的提取制备：伞形科植物重齿毛当归angelicapubescensmaxim.f.biserratashanetyuan的根用自来水洗净、切片、60℃鼓风干燥箱中烘干、组织捣碎机粉碎、过60目筛，称取独活粉末1kg用无水乙醇回流提取3次，每次1h，除去色素及脂溶性小分子杂质，除色素的残渣挥干乙醇，置反应釜中加入0.5％(w/w)的木瓜蛋白酶水溶液15l，55℃搅拌反应4h，酶解溶液煮沸10min灭酶活，离心取上清液，用ads-7型大孔树脂脱色，洗脱液中加乙醇至终浓度80％(v/v)，4℃静置12h过夜，8000rpm离心，弃上清，所得沉淀即为独活粗多糖。

(2)低分子量独活粗多糖制备：将步骤(1)所得脱色的独活粗多糖加水2l，用10kda的超滤膜在切向流超滤系统(美国pall)超滤。收集透过液，浓缩、80％乙醇醇沉，最终制备得到低分子量独活粗多糖冻干粉为15.8g，得率约为1.6％。

(3)低分子量独活多糖(lapp-2)制备：取所述步骤2制备的低分子量独活粗多糖15g，加水300ml溶解，过预处理好的sepharosecl-4b凝胶柱(φ2.5×150cm)，流动相为0.1mnacl，每次上样体积为25ml，流速为25ml/h，约4ml/管，收集洗脱流份，210nm紫外分光光度计检测，合并目标分子量的lapp-2组分，bio-gelp-2凝胶柱除盐，真空冷冻干燥。最终得到纯化的lapp-2冻干粉3.5g，纯度>98％(hpgpc,面积归一化法)，重均分子量(mw)为3600da。

(4)lapp-2理化性质及结构检测：采用乌式粘度计按照中国药典(2015版)四部通则0633黏度测定法测定特性黏度；高效凝胶色谱法(hpgpc)检测分子量及分布；单糖组成采用柱前衍生化hplc检测。

扫描lapp-2的紫外和红外光谱；avanceav600核磁共振谱仪(600mhz)检测nmr谱图解析多糖结构(瑞士bruker公司，溶剂为d2o含trimethylsilyl-propionicacid(tsp-d4)内标，温度25℃)。

2.3结果：

lapp-2的单糖组成、理化参数测定结果见表3；紫外与红外光谱见附图7-8。lapp-2分子量、特性粘度及单糖组成与实施例1制得的lapp-1无明显差异，表明lapp-1和lapp-2为同一种独活多糖化合物。

表3.低分子量独活多糖lapp-2的理化参数、单糖组成检测结果

【实施例3】天然低分子量独活多糖(lapp)抗氧化活性测定

3.1材料与试剂

检测样品：实施例1制备的lapp-1(分子量为3553da)；l,1-二苯基苦基苯肼(dpph)、菲咯嗪、邻二氮菲、抗坏血酸(vc)等为美国sigma公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化亚铁(fec12)、乙二胺四乙酸二钠盐(edta-2na)、过氧化氢(h2o2)等均为国产分析纯试剂。

3.2方法

(1)lapp-1清除dpph自由基活性检测(carbohydrpolym,2015,128,52–62)：吸取不同浓度的lapp多糖样品溶液50μl于96孔板中，加入25μl0.4mmol/ldpph无水乙醇溶液及100μl超纯水，振荡96孔板混匀，30℃暗处反应30min，酶标仪于517nm处测定吸光值。vc为阳性对照。清除活性依公式：清除率(％)＝[1-(abs1-abs2)]/abs0×l00％计算，其中：abs0为对照实验(水代替样品)吸光值；abs1为样品实验吸光值；abs2为样品干扰实验(无水乙醇代替dpph溶液)吸光值。

(2)lapp-1清除羟基自由基活性检测(carbohydrpolym,2015,128,52–62)：反应体系包含不同浓度的样品溶液50μl，邻二氮菲(0.75mm)50μl，磷酸盐缓冲液(0.15m，ph7.4)75μl，feso4(0.75mm)50μl及h2o2(0.01％，w/v)50μl，混匀后，37℃水浴中反应30min，在536nm下测定吸光值。按下式：羟基自由基清除率(％)＝[(abs2-abs0)/(abs1-abs0)]×l00计算羟基自由基清除率，其中：abs0是对照组实验(水代替样品溶液)吸光值；abs1是水代替h2o2及样品吸光值；abs2是样品组吸光值。

(3)lapp-1金属离子螯合能力测定：取不同浓度的样品溶液50μl于96孔板中，再加入2.0mmol/l氯化亚铁溶液2.5μl、5.0mmol/l菲洛嗪溶液10μl、去离子水137μl。混匀反应10min后于562nm处测吸光值。edta-2na为阳性对照。螯合能力依公式螯合率(％)＝[1-(abs1-abs2)]/abs0×l00％计算，其中：abs0为对照实验(样品溶液以水代替)的吸光值；abs1为样品实验的吸光值；abs2为样品干扰实验(氯化亚铁溶液以水代替)的吸光值。

3.3结果

(1)lapp-1清除dpph自由基活性：附图9中vc为阳性对照，结果显示，lapp-1在实验剂量范围能够有效地清除dpph自由基，其清除dpph自由基活性随着多糖浓度的增加呈现出稳定的增加趋势，最大清除率可达58.6％。

(2)lapp-1清除羟基自由基活性：附图10中vc为阳性对照，结果显示，lapp-1在实验剂量范围清除羟基自由基效果较好，随着多糖浓度的增加，对羟基自由基清除能力呈现增加趋势，最大清除率可达65.1％。

(3)lapp-1金属离子螯合能力测定：附图11中edta-2na为阳性对照，结果显示，lapp-1在实验剂量范围具有较强的金属离子螯合能力，最大螯合率可达48.7％，表明lapp-1抗氧化活性可能与螯合金属离子有关。

通过以上研究结果表明低分子量独活多糖具有较强的抗氧化活性，可能与较高分子量的多糖含更多的还原末端有关。本发明制备的低分子量独活多糖抗氧化活性较其他中草药来源多糖如本申请人近些年报道的桑黄多糖的抗氧化活性强(intjbiolmacromol,2018,120,1855–1864)。在相同检测条件下，本申请人已报道的桑黄多糖的dpph自由基及羟基自由基最大清除率分别为42.8％和58.0％，金属离子最大螯合率仅为23.59％，各项抗氧化活性指标均低于本发明制备的lapp-1。本发明制备的lapp-1抗氧化活性也明显高于已报道的当归多糖(当归多糖dpph及羟基自由基最大清除率分别为43.8％和33.4％)(intjbiolmacromol,2017,97,46–54)。因此，本发明的低分子量独活多糖lapp在医药、食品、化妆品等领域具有重要的应用价值。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。