一种识别N6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及一种可分泌n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，同时涉及该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体及其应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术：

禽流感(ai)是由正粘病毒科a型流感病毒引起的禽类急性传染病，被世界动物卫生组织列为a类烈性传染病。禽流感病毒(aiv)是一种单股负链分节段的rna病毒，亚型众多，可根据其表面糖蛋白血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的抗原差异分为16种不同的ha亚型和9种不同的na亚型，此外，还在蝙蝠体内分离到h17n10和h18n11亚型流感病毒。

na是由片段6编码的一种ii型糖蛋白，na蛋白在结构上形成一个异源四聚体，每个na蛋白单体都是由一段氨基端短的胞质区，疏水的跨膜区，茎部区和球状的头部区组成。na蛋白具有神经氨酸酶活性，在病毒感染的后期，可以切割宿主细胞表面以及新生病毒粒子表面的唾液酸，进而促进新形成病毒粒子的释放和扩散，阻止新生病毒粒子在细胞表面的聚积。

n6是当前国内流行禽流感病毒的主要na亚型之一，其中以h5n6和h6n6亚型组合最为常见。h5n6亚型禽流感病毒不仅对家禽养殖业危害严重，同时还可以跨越种间屏障感染人类，截止2019年8月8日，已有22例人感染h5n6亚型禽流感病毒。此外，也有h6n6亚型禽流感病毒跨越种间屏障感染猪的报道。因此，加强对n6亚型禽流感病毒的监测具有重要的公共卫生学意义。目前，who推荐使用的na亚型检测方法为神经氨酸酶抑制实验，但是该方法实验周期长，并且实验试剂亚砷酸钠为剧毒试剂，所以该方法很难在临床上推广使用。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种能够稳定分泌具有广谱性抗n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的具有广谱性抗n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体。

本发明的目的之三是将上述单克隆抗体应用于n6亚型禽流感的诊断和治疗。

本发明达到上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明首先选取3株位于不同进化分支的n6亚型禽流感病毒，将灭活后病毒依次间隔14天免疫6周龄balb/c雌性小鼠，取免疫后小鼠脾脏与sp2/0细胞融合。利用间接免疫荧光方法筛选到1株能够稳定分泌具有广谱性抗n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为3h7，分类命名为杂交瘤细胞，该细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.18900，保藏时间为2019年12月4日。

进一步的，本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的具有广谱性抗n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体3h7。经鉴定该抗体重链亚类为igg2b，轻链亚类为κ链。取单克隆抗体3h7与n6亚型禽流感病毒进行westernblot检测，结果3h7能够与变性后n6亚型禽流感病毒的神经氨酸酶蛋白发生特异性结合，表明3h7识别的是n6蛋白的线性表位。杂交瘤细胞3h7上清elisa效价为1:6400，小鼠腹水elisa效价为1:409600。选择15株不同进化分支的n6亚型aiv感染df-1细胞并进行ifa检测，结果3h7能够与这15株病毒结合，表明3h7具有良好的广谱性。将n1-n9亚型aiv及新城疫病毒作为包被抗原进行间接elisa试验，结果表明3h7只能与n6亚型aiv结合，表明3h7具有良好的特异性。

更进一步的，本发明还提出了所述的单克隆抗体在制备检测n6亚型禽流感病毒试剂中的用途。以及所述的单克隆抗体在制备治疗n6亚型禽流感药物中的应用。

一种药物组合，其包含本发明所述的单克隆抗体。

更进一步的，本发明利用3h7较好的广谱性及特异性建立了一种用于检测n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体的阻断elisa检测试剂盒及其检测方法。

所述的一种用于检测n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体的阻断elisa检测试剂盒，其中含有本发明所述的单克隆抗体。

其中，优选的，所述的试剂盒中还含有灭活抗原a/chicken/hunan/s3003/2009(h6n6)、酶标板、包被液、pbst溶液、hrp标记的羊抗鼠二抗、tmb显色液以及终止液。

所述的试剂盒用于检测n6亚型禽流感病毒抗体时，按照以下步骤进行：

(1)将ha效价为2⁸的灭活抗原a/chicken/hunan/s3003/2009(h6n6)用包被液以1:80倍稀释后包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜；

(2)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入5％的脱脂乳溶液进行封闭，每孔200μl，37℃孵育1h；

(3)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入待测血清、阴性血清和阳性血清，每孔100μl，37℃孵育1h；

(4)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入1:12800倍稀释的单抗腹水3h7，每孔100μl，37℃孵育1h；

(5)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入1:3000倍稀释的hrp标记的羊抗鼠二抗，每孔100μl，37℃孵育1h；

(6)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后避光加入tmb显色液，每孔100μl，显色15min，加入50μl的2m硫酸进行终止显色，并在酶标仪上读取od450nm值。

实验证明，该方法敏感性高，重复性好，可以用于临床血清样品中n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体水平的检测，具有良好的开发前景。

附图说明

图1为n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体3h7的间接免疫荧光检测；

a：3h7；b：阴性对照

图2为n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体3h7的westernblot检测；

1:3h7：2：阴性对照

图3为n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体3h7的广谱性检测；

a:dk/hub/sp143/2014(h5n6)；b:dk/hun/se226/2017(h5n6)；

c:ck/hun/s3003/2009(h6n6)；d:dk/hun/s4270/2010(h6n6)；

e:dk/gx/s4111/2010(h6n6)；f:dk/hun/s1351/2009(h6n6)；

g:dk/zj/s4354/2016(h11n6)；h:dk/gd/s4180/2017(h6n6)；

i:ck/gd/s1031/2018(h6n6)；j:dk/jx/s40199/2017(h6n6)；

k:dk/jx/s1129/2018(h6n6)；l:dk/jx/s1200/2018(h6n6)；

m:dk/gx/s40437/2017(h6n6)；n:dk/gx/s31293/2017(h6n6)；

o:ck/hub/s1246/2018(h4n6)；p:阴性对照。

具体实施方式

为了能够更清楚的解释本发明，下面会结合具体的实施例对本发明进行详细说明，但本发明不仅局限于以下实施例。

实施例1n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

1.1免疫原的制备及动物免疫

选择3株处于不同进化分支的n6亚型禽流感病毒(ck/hun/s3003/2009(h6n6)，简称hun3003；dk/hub/sp143/2014(h5n6)，简称hub143；dk/hun/se226/2017(h5n6)，简称hun226)作为免疫原，其中hun226与hun3003之间氨基酸同源性为95％，hun3003与hub143之间的氨基酸同源性为94.1％，hun226与hub143之间的氨基酸同源性为91.7％。首先将病毒hun226、hun3003和hub143进行10倍倍比稀释，并接种9-11日龄spf鸡胚，置于37℃孵化箱内培养48h，收取尿囊液，按照1:2000的比例加入β-丙内酯灭活病毒，鸡胚接种后检测病毒灭活是否充分，并经无菌检验后置于-70℃保存备用。

选取8只6周龄雌性balb/c小鼠，依次用灭活的hun226、hun3003和hub143进行免疫，在融合前3天，利用hun3003进行加强免疫，具体免疫程序如下(表1)：

表1制备n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的免疫程序

1.2杂交瘤细胞株的制备

无菌采集小鼠脾脏，用2.5ml注射器的活塞研磨脾脏，使脾细胞均匀散开，然后移至无菌的50ml离心管中。用无血清的dmem将sp2/0细胞吹下放置于含有脾细胞的离心管中，轻轻混合，800rpm离心10min，弃去上清。然后将离心管置于37℃水浴中，在45s内缓慢滴加1ml预热的peg，同时晃动离心管，使其均匀混合。静置1min后，缓慢滴加无血清的dmem至40ml，800rpm离心10min，弃掉上清。用含有37℃预热的含有1％hat及20％fbs的dmem将融合后的细胞重悬分装至96孔板中，每孔100μl，随后放置于含有5％co2的37℃细胞培养箱中培养。

1.3阳性杂交瘤细胞的筛选

待细胞孔内的杂交瘤细胞生长到一半左右时，吸取细胞上清进行ifa检测，确定阳性孔。筛选前一天用真核表达质粒pcaggs-n6(hun3003)转染293t细胞，培养24h后弃去细胞上清，并用pbst溶液清洗3次，然后加入福尔马林固定液，每孔100μl，室温固定30min。固定后用pbst溶液清洗3次，然后加入5％脱脂乳溶液进行封闭，每孔200μl，37℃封闭2h或者4℃过夜，封闭后同上洗涤3次。吸取融合后的杂交瘤细胞上清100μl至293t细胞板中，1:400稀释的小鼠阴阳性血清作为阴阳性对照，37℃孵育1h，同上洗涤3次。然后每孔加入100μl的1:1000倍稀释的fitc标记的羊抗鼠荧光二抗，37℃孵育1h，同上洗涤3次，该过程在避光环境下进行。然后利用荧光显微镜观察结果，最终筛选到1株可识别n6蛋白的杂交瘤细胞，命名为3h7。该细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.18900，保藏时间为2019年12月4日。

1.4阳性杂交瘤细胞3h7的亚克隆

首先将阳性杂交瘤细胞3h7孔内细胞轻轻吹打混匀后进行细胞计数，并将细胞用含20％fbs的dmem稀释至10ml中含有大约100个细胞，混合均匀后加至96孔板中，每孔100μl，然后每孔再补加100μl含20％fbs的dmem培养液，置于含5％co2的37℃细胞培养箱内培养。每日观察细胞情况直至出现细胞集落，并标记好单细胞孔，待细胞长至一半左右时进行阳性杂交瘤细胞筛选。如此重复亚克隆3次。

1.5单克隆抗体3h7的制备

小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只注射0.5ml。注射3d后，将细胞状态良好的杂交瘤细胞3h7吹下，800rpm离心10min，弃去上清，用无菌pbs重悬细胞，再次进行离心，弃上清。加入无菌pbs重悬细胞，并进行细胞计数，将细胞稀释至每500μl中含有5×10⁵个细胞。均匀混合细胞稀释液，然后注射到小鼠腹腔，每只注射500μl。细胞注射后7-10d内，每日观察小鼠状态，待小鼠腹部肿胀时，用注射器吸取小鼠腹水，4℃过夜后，4500rpm离心10min，收集腹水上清，并置于-70℃冰箱备用。

1.6单克隆抗体3h7的亚类鉴定

用无血清培养基培养3h7杂交瘤细胞，并收集细胞上清，根据抗体亚类鉴定试剂盒说明书对3h7的亚类进行鉴定。确定其重链亚类为igg2b，轻链亚类为κ链。

1.7单克隆抗体3h7的效价测定

将n6亚型aiv配制成8单位抗原并包被酶标板，4℃过夜。用pbst洗涤3次后加入200μl的5％脱脂乳溶液进行封闭，37℃孵育1h。将3h7杂交瘤细胞上清或者腹水进行梯度稀释作为一抗，37℃孵育1h。洗涤后加入1:3000倍稀释的hrp标记的羊抗鼠二抗，每孔100μl，37℃孵育1h。洗涤后加入tmb显色液进行避光显色，每孔100μl，显色15min后每孔加入50μl的2mh2so4终止显色，并在酶标仪上读取od450nm值。最终确定杂交瘤细胞上清elisa效价为1:6400，腹水elisa效价为1:409600。

1.8单克隆抗体3h7的ifa检测

利用1.3中的方法对3h7细胞上清进行ifa检测，其中转染用质粒为构建好的pcaggs-na(hun226)真核表达重组质粒。一抗为细胞上清，二抗为1:1000倍稀释的fitc标记的羊抗鼠荧光二抗，并在荧光显微镜下记录结果。结果发现3h7能够与hun226的n6蛋白反应发出绿色荧光(图1)。

1.9单克隆抗体3h7的westernblot检测

将全病毒hun3003与5×sds-page上样buffer混合加热变性后进行电泳，转膜。转膜结束后，用5％脱脂乳溶液进行封闭，37℃孵育2h。用pbst溶液洗涤，每次5min。将3h7细胞上清作为一抗，置于37℃摇床1h，同上方法洗膜后加入1:1000倍稀释的红外标记抗鼠二抗，37℃的避光孵育1h。同上方法洗膜后置于红外扫膜仪上扫描结果。结果发现3h7能够与hun3003的n6蛋白发生特异性反应(图2)。

1.10单克隆抗体3h7的特异性检测

选择n1-n9亚型aiv及新城疫病毒作为抗原，并将这些病毒配制成8单位抗原包被酶标板，4℃过夜。用pbst洗涤3次后加入200μl的5％脱脂乳溶液进行封闭，37℃孵育1h。以3h7细胞上清作为一抗，37℃孵育1h。洗涤后加入1:3000倍稀释的hrp标记的羊抗鼠二抗，每孔100μl，37℃孵育1h。洗涤后加入tmb显色液进行避光显色，每孔100μl，显色15min后每孔加入50μl的2mh2so4终止显色，并在酶标仪上读取od450nm值。结果显示3h7只能与n6亚型aiv结合(表2)，表明3h7具有良好的特异性。

表2n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体3h7的特异性检测

1.11单克隆抗体3h7的广谱性检测

首先在96孔板中培养df-1细胞，待细胞长至80％左右时，将15株处于不同进化分支的n6亚型禽流感病毒感染df-1细胞，37℃细胞培养箱内培养48h后取出弃去上清，用pbst洗涤3次。每孔加入100μl的福尔马林固定液，室温固定30min后弃上清，用pbst洗涤3次。一抗为杂交瘤细胞3h7培养上清，每孔100μl，37℃孵育1h后，用pbst洗涤3次。二抗为1:1000倍稀释的fitc标记的羊抗鼠荧光二抗，每孔100μl，该过程避光进行，37℃孵育1h后，用pbst洗涤3次，并在荧光显微镜下记录结果。在荧光显微镜下观察到被这15株病毒感染过的细胞均能发出绿色荧光(图3)，表明3h7具有良好的广谱性。

实施例2n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断elisa检测方法的建立

2.1n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断elisa操作方法

(1)将ha效价为2⁸的灭活抗原a/chicken/hunan/s3003/2009(h6n6)用包被液(50mmol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6))以1:80倍稀释后包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜。

(2)弃去上清，用pbst溶液(含0.05％tween-20的50mmol/lph7.2的磷酸盐缓冲液)清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入含5％w/w脱脂乳的pbst溶液进行封闭，每孔200μl，37℃孵育1h。

(3)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入待测血清、阴性血清和阳性血清，每孔100μl，37℃孵育1h。

(4)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入1:12800倍稀释的单抗腹水3h7，每孔100μl，37℃孵育1h。

(5)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入1:3000倍稀释的hrp标记的羊抗鼠二抗，每孔100μl，37℃孵育1h。

(6)弃去上清，用pbst溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后避光加入tmb显色液，每孔100μl，显色15min，加入50μl的2m硫酸进行终止显色，并在酶标仪上读取od450nm值。

2.2临界值的确定

选择60份阴性血清做1:160倍稀释，并将spf鸡血清作为阴性对照，利用建立好的阻断elisa方法测定这60份血清抑制率(表3)，并求得平均抑制率为9.04％，标准偏差为4.36％。根据临界值判定标准计算出阳性临界值为22.12％，阴性临界值为17.76％。处于两者中间的判定为疑似，重新测定后若依然小于阳性临界值，则判定为阴性。

表3n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断elisa检测方法临界值的测定

2.3阻断elisa方法的特异性检测

选择n1-n9亚型aiv血清以及新城疫病毒血清进行阻断elisa方法检测，将spf鸡血清作为阴性对照，抑制率结果显示除n6亚型血清以外其余血清的抑制率均小于阴性临界值(表4)，表明此方法具有较好的特异性。

表4n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断elisa检测方法的特异性检测

2.4阻断elisa方法的重复性检测

选择5份血清样本分别在一块酶标板上重复4次以及4块酶标板上进行重复，求得平均抑制率x及标准偏差sd，变异系数cv(％)＝sd×100％/x。计算出板内变异系数在1.14％-6.57％之间；板间变异系数在2.22％-4.98％之间(表5)，均小于10％，表明此方法具有良好的重复性。

表5n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断elisa检测方法的重复性检测

2.5阻断elisa方法的敏感性检测

选择30份背景清楚的阳性血清进行阻断elisa方法检测，并计算出抑制率在27.83％-75.31％之间(表6)，符合率100％，表明此方法具有良好的敏感性。

表6n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断elisa检测方法的敏感性检测

以上结果表明本发明建立的阻断elisa方法具有良好的特异性、重复性及敏感性，能够用来检测临床血清样品中n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体水平。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。