用于鉴别芸薹属作物Cam和Pol胞质类型的KASP标记引物及其应用的制作方法

本发明属于芸薹属作物分子育种技术领域，具体涉及到基于多类型甘蓝型油菜细胞质基因组设计的用于检测芸薹属作物cam和pol胞质类型的kasp标记引物及其应用。

背景技术：

芸薹属栽培种涉及到蔬菜、油料作物、肥用作物、观赏植物等多个方面，主要包含三个二倍体和由之作为亲本进化产生的三个异源四倍体。二倍体包含白菜(brassica.rapa，2n＝20，aa)、黑芥(b.nigra，2n＝16，bb)和甘蓝(b.oleracea，2n＝18，cc)，异源四倍体包含甘蓝型油菜(b.napus，2n＝38，aacc)、芥菜型油菜(b.juncea，2n＝36，aabb)和埃塞俄比亚芥菜(b.carinata，2n＝34，bbcc)。其中三个异源四倍体是由三个二倍体两两杂交并自然加倍形成，这种关系被称为“禹氏三角”(un，1935)。芸薹属植物的多样性，为研究系统发育进化、基因组学、植物品种\种质资源鉴定、亲缘关系评价等提供了丰富的遗传资源。植物细胞中的细胞质dna基因组较小，并且绝大多数以稳定的单亲模式遗传，重组变异少。因此，它被广泛用于系统进化、种质鉴定、细胞质遗传特性等研究和应用中。

杂种优势利用是目前国内外油菜增产的主要途径。其中利用雄性不育配制油菜杂交种，可以节省大量劳动力，降低制种成本，提高杂交种纯度。作为杂种优势利用的主要途径之一，它在油菜生产上得到了广泛应用。雄性不育大体可分为细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility,cms)和细胞核雄性不育(geneticmalesterility,gms)两类，细胞质雄性不育(cms)在三系杂交制种中应用很广。波利马(polima)胞质不育系统是油菜育种中最为成功利用的一个胞质不育系统(liuetal,2016)，现有的大部分油菜品种是通过polcms系统育成，包括华杂4号、华杂9号、青杂2号等。cam胞质是白菜型油菜的主要胞质类型，在甘蓝型油菜中小比例存在，在对新创制(尤其是借助白菜)的甘蓝型油菜的鉴定中很重要。育种材料的雄性不育胞质类型鉴定、雄性不育材料纯度鉴定和利用不育系配制杂交种的鉴定是cms制种的必要工作，因此获得一套适于鉴定育种材料的不同胞质特异的dna分子标记具有十分重要的意义。

目前，芸薹属作物细胞质类型主要通过普通的遗传学方法研究、线粒体基因组dna的限制性酶切片段长度多态性(mtdna-rflp)标记、标记位点pcr扩增等方法。普通遗传学方法鉴定周期长，鉴定材料范围受限；mtdna-rflp方法操作程序繁琐、技术难度大且成本高；标记位点pcr扩增方法效率较低，不能自动化鉴定。因此，利用高质量的重测序数据开发一套适于芸薹属作物胞质类型的高效率分子标记位点非常必要。利用snp位点进行基因分型只需要检测样本序列中的部分snp位点，而sanger测序或者基因芯片技术经济成本及时间成本都比较高。竞争性等位基因特异性pcr(kasp)使用通用的荧光探针和简单的pcr反应就可以实现高通量、准确可靠的snp分型，是目前国际上主流的snp检测方法之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供用于鉴别芸薹属作物cam和pol胞质类型的kasp标记引物，包括6组cam胞质类型的引物cc1、cc2、cc3、cc4、cm1、cm2，以及7组pol胞质类型的引物pc1、pc2、pm1、pm2、pm3、pm4、pm5，13组kasp分子标记引物具体信息如下：

第1组引物cc1的序列为：

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第2组引物cc2的序列为：

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第3组引物cc3的序列为：

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第4组引物cc4的序列为：

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第5组引物cm1的序列为：

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第6组引物cm2的序列为：

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第7组引物pc1的序列为：

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第8组引物pc2的序列为：

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第9组引物pm1的序列为：

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第10组引物pm2的序列为：

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第11组引物pm3的序列为：

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第12组引物pm4的序列为：

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第13组引物pm5的序列为：

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上述引物扩增的13组kasp分子标记的具体位点变异信息如表1。

基于上述kasp标记引物用于鉴定芸薹属作物cam和pol胞质类型的方法，包括以下步骤：

(1)选取任意一组cam胞质类型的引物和任意一组pol胞质类型的引物分别对待鉴定材料的基因组dna进行pcr扩增；

(2)检测pcr扩增产物中多态位点的基因型；

(3)根据表1所列的多态位点的基因型判断胞质类型。

进一步地，pcr扩增的反应程序：94℃15min；采取降落pcr方式，94℃20s，60℃1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃20s，55℃1min，循环30次；37℃1min，最后1s采集荧光信号。

上述引物不仅可用于鉴定芸薹属作物(包括芸薹属各二倍体和四倍体基因组属性作物，如白菜型油菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜、大白菜、包菜、西兰花、芥蓝、花椰菜、羽衣甘蓝等)的cam和pol胞质类型，还可用于在芸薹属作物细胞质雄性不育系、保持系和恢复系选育。

与现有技术相比，本发明的积极效果：

1、本发明基于高质量的重测序数据开发一组适用于芸薹属作物细胞质基因组snp分子标记，可快速实现芸薹属作物种质资源或育种材料cam和pol的细胞质基因组分型，用于鉴定芸薹属作物cam和pol胞质类型的种质材料，检测杂交种后代胞质来源，鉴定cam和pol胞质材料的纯度，检测结果准确可靠，操作简单，通量高，成本低。

2、本发明开发的分子标记基于snp位点信息和新型快捷的kasp分型技术，相比传统的分子标记在基因组水平上拓展了可用标记位点的范围，为芸薹属作物种质资源基础性工作、种质创新及育种材料选育等方面都提供了新的知识信息和方法工具。

本发明是在国家自然科学基金--芸薹属油菜类作物细胞质基因组单倍型的精细解析及其协同进化分析(项目编号：31600179)，湖北省自然科学基金--多类型人工合成油菜新种质的设计性高效创制(项目编号：2017cfb230)，以及农业部农业行业标准制定--指定《杂交油菜细胞质雄性不育系分子鉴定方法》标准项目的共同资助下完成。

附图说明

图1为实施例2中用于鉴定甘蓝型油菜cam胞质类型的6个kasp引物扩增后的荧光信号图。

图2为实施例2中用于鉴定甘蓝型油菜pol胞质类型的7个kasp引物的扩增后的荧光信号图。

图3为实施例3中引物cc3、cm1、pc1和pm2鉴别482份甘蓝型油菜中部分材料是否为cam或pol胞质的荧光信号图。

具体实施方式

实施例1

用于鉴定芸薹属作物cam和pol胞质类型的kasp标记引物的开发：

(1)样品选取：选取54份代表性的芸薹属实验材料(具体信息见表1)，包含nap、cam和pol胞质类型；

(2)样品制备：每份样品选取10株并取其新鲜幼嫩的植物叶片组织，避免选取病虫害及老化叶片，用清水冲洗3次，并用滤纸吸干；用液氮充分研磨后迅速放入匀浆仪中，加入前处理缓冲液(0.5msucrose+1mmedta+70mmkh2po4+0.6％pvp(v/v)+0.8％bsa(v/v)+0.1％β巯基乙醇(v/v)；ph＝7.5)，混匀后在低温环境下匀浆处理；在低温环境下梯度离心，提取细胞质，然后采用ctab法提取dna，并去除rna；

(3)细胞质dna高通量测序：将上述步骤(1)获得的样本细胞质dna采用超声打断，切胶回收300-400bp的dna片段，构建文库，利用illuminahiseq2500测序平台上进行测序，获得原始reads；

(4)细胞质基因组多态位点确定：以已知的甘蓝型油菜nap类型的51218(liuetal,2019)材料的叶绿体基因组序列(kp161617.1)和线粒体基因组序列(kp161618.1)为参考基因组，分别提取各测序材料叶绿体和线粒体基因组范围内的基本变异(snp和shortindel)；

(5)kasp引物组设计：依据上述步骤(4)获得snp/indel位点设计kasp引物组，并在两条末端碱基不同的等位基因引物的5’端分别加上对应的荧光检测引物序列；

(6)kasp引物组筛选：以已知胞质类型的材料的dna为模板，将步骤(5)中每组kasp引物构成一个primermix，用lc480荧光定量pcr仪进行pcr扩增及荧光检测，筛选出6组cam胞质类型的引物cc1、cc2、cc3、cc4、cm1、cm2，以及7组pol胞质类型的引物pc1、pc2、pm1、pm2、pm3、pm4、pm5，具体引物信息如下(下划线表示荧光标签序列)：

第1组引物cc1的序列为：

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gaaggtcggagtcaacggattgattgataatctattttttattgtc(f)

aagtcaaatatctgggtatatttcg(r)

第2组引物cc2的序列为：

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gggacctgatactaccacttggatc(r)

第3组引物cc3的序列为：

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第4组引物cc4的序列为：

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第5组引物cm1的序列为：

gaaggtgaccaagttcatgctacgaaaattgactgtacccc(f)

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第6组引物cm2的序列为：

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第7组引物pc1的序列为：

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第8组引物pc2的序列为：

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第9组引物pm1的序列为：

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第10组引物pm2的序列为：

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第11组引物pm3的序列为：

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第12组引物pm4的序列为：

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第13组引物pm5的序列为：

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上述引物扩增的kasp分子标记的具体位点变异信息如表2。

表1

表2

表2中引物cc1、cc2、cc3、cc4、pc1和pc2是基于叶绿体基因组上的snp位点设计的kasp引物，引物cm1、cm2、pm1、pm2、pm3、pm4和pm5是基于线粒体基因组上的snp位点设计的kasp引物。

实施例2

利用本发明开发的kasp引物对已知cam和pol胞质类型的材料进行kasp试验验证：

(1)cam胞质的材料：胜利油菜，中双2号，陕2b；pol胞质的材料：简阳油菜，湘5a，20a；

(2)pcr扩增程序：94℃15min；采取降落pcr方式，94℃20s，60℃1min，(60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃)循环10次；94℃20s，55℃1min，循环30次；37℃1min，最后1s采集荧光信号，结果如图1；

(3)图1中靠近y轴的聚集点均为cam胞质的材料，其中图1a中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为c，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为a；b中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为t，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为g；c中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为t，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为g；d中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为t，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为g；e中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为a，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为c；f中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为t，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为c；

(4)图2中靠近y轴的聚集点均为pol胞质的材料，其中图2a中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为a，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为t；b中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为c，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为a；c中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为c，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为a；d中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为a，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为g；e中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为a，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为g；f中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为gac，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为tta；g中靠近y轴的聚集点表示检测的多态位点为a，靠近x轴的聚集点表示检测的多态位点为c。

本发明提供的13对kasp引物均能够实现对甘蓝型油菜cam和pol胞质类型的鉴定。芸薹属及其近缘属种(如萝卜)作物间经常共用一些胞质类型，且可以通过相互杂交转移胞质类型。cam类型存在于大多数的白菜型油菜、芥菜型油菜和甘蓝型油菜中(表2)，polima胞质不育系被广泛用于白菜育种中，萝卜的ogura不育系也被导入到甘蓝型油菜中。细胞质基因组在这些作物中都呈现为单亲遗传，稳定而保守。本发明开发的这套分子标记是可以用于新创制的cam和pol类型的白菜(b.rapa)、芥菜(b.juncea)、甘蓝类(b.oleracea)的西兰花、包菜、花椰菜及羽衣甘蓝等作物的细胞质类型的识别鉴定。

实施例3

482份甘蓝型油菜自交系的胞质类型的鉴定：

(1)待鉴定甘蓝型油菜dna样品提取：利用ctab法对482份甘蓝型油菜的每个样品采取混株提取dna的方式提取植物总dna；

(2)从实施例1中选取4对引物cc3、cm1、pc1和pm2，针对482份甘蓝型油菜dna进行kasp试验：pcr反应体系为5μl，包含1μldna模板，2.5μl2×mastermix，0.7μlprimermix，0.8μlddh2o；pcr反应程序为：94℃15min；采取降落pcr方式，94℃20s，60℃1min，60℃降落到48℃，每个循环降低1.2℃，循环10次；94℃20s，55℃1min，循环30次；37℃1min，最后1s采集荧光信号；

(3)胞质类型的判定方法：基于表2中所列出的每个位点在甘蓝型油菜cam和pol胞质类型中的等位基因进行判定，如果与表中所述等位基因相同则为cam或pol胞质类型材料，如果为另一个等位基因则不属于cam和pol胞质材料；结果显示，选取的4组kasp引物都具有良好的特异性，能够实现对所针对位点的特异性检测，从而完成甘蓝型油菜cam和pol胞质材料的鉴定工作；

(4)引物cc3和cm1鉴别482份甘蓝型油菜材料是否是cam胞质类型的分析结果见图3的a和b，图3的a和b中的每个数据点为每个样品在引物cc3和cm1中的分型结果：数据点在原点附近的为阴性对照；靠近y轴的样品表示与甘蓝型油菜cam胞质类型样本等位基因一致，为cam胞质类型；靠近x轴的样品表示与甘蓝型油菜cam胞质类型样本等位基因不一致，为非cam胞质类型；

(5)引物pc1和pm2鉴别482份甘蓝型油菜材料是否是pol胞质类型的分析结果见图3的c和d，图3的c和d中的每个数据点为每个样品在引物pc1和pm2中的分型结果：数据点在原点附近的为阴性对照；靠近y轴的样品表示与甘蓝型油菜pol胞质类型样本等位基因一致，为pol胞质类型；靠近x轴的样品表示与甘蓝型油菜pol胞质类型样本等位基因不一致，为非pol胞质类型。

结果显示在482份甘蓝型油菜中cam胞质类型的材料占比7.2％，pol胞质类型的材料占比5.7％。

参考文献：

1.u,n.genome-analysisinbrassicawithspecialreferencetotheexperimentalformationofb.napusandpeculiarmodeoffertilization.japjbot7,389-452(1935).

2.liuj.,haow.,liuj.,fans.,zhaow.,dengl.etal.anovelchimericmitochondrialgeneconferscytoplasmiceffectsonseedoilcontentinpolyploidrapeseed(brassicanapus).molplant12,582-596(2019).

3.liuz.,yangz.,wangx.,lik.,anh.,liuj.etal.amitochondria-targetedpprproteinrestorespolcytoplasmicmalesterilitybyreducingorf224transcriptlevelsinoilseedrape.molplant9,1082-1084(2016).

4.chenb.,xuk.,lih.,gaog.,yang.,qiaoj.evaluationofqualitytraitsandtheirgeneticvariationinglobalcollectionsofbrassicanapusl.plantgeneticresources,1-10(2017).

5.wuj.,lif.,xuk.,gaog.,chenb.,yang.etal.assessingandbroadeninggeneticdiversityofarapeseedgermplasmcollection.breedsci64,321-330(2014)。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>用于鉴别芸薹属作物cam和pol胞质类型的kasp标记引物及其应用

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

taagccactcagccatccctccaag25

<210>28

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

gaaggtgaccaagttcatgctaaagaaagttgacagatcaggagcg46

<210>29

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

gaaggtcggagtcaacggattaaagaaagttgacagatcaggagca46

<210>30

<211>25

<212>dna

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<400>30

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<212>dna

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gaaggtgaccaagttcatgctaaggctcggtagcacaccggag43

<210>32

<211>43

<212>dna

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gaaggtcggagtcaacggattaaggctcggtagcacaccggaa43

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gaaggtgaccaagttcatgctcaagcaagtgatttgaggtacttta46

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