基因枪介导的日本结缕草高效基因编辑方法与流程

本发明涉及基因工程和植物遗传育种领域，具体地说，涉及一种基因枪介导的日本结缕草高效基因编辑方法。

背景技术：

日本结缕草(zoysiajaponicasteud.)是我国资源丰富唯一不需要进口的禾本科优质暖季型草坪草，具有适应力强，耐旱、抗热、抗寒、耐践踏和耐贫瘠等许多优良性状，在现代城市绿化和运动场建设及水土保持中，都占有重要地位。全世界草坪草育种学家多年来一直致力于日本结缕草新品种的培育，但多采用传统育种方法，而由于植物抗逆性本身的复杂性和其数量性状位点连锁关系的复杂性使得利用传统育种方法获得优良的抗性品种十分困难，利用基因工程技术获得适应或抵抗不利环境因素的草坪草品种成为解决该问题快速且有效的方法之一。基因枪转化法是目前较为常见的一种转化方式，避开了原生质体再培养的困难，克服了农杆菌的宿主限制，受体材料来源广泛。crispr基因编辑系统是目前研究比较多的基因编辑系统，本发明构建了一套基于crispr/cas9的基因编辑系统，使其适用于日本结缕草目标基因的编辑，在此基础上建立了基因枪介导的日本结缕草遗传转化方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基因枪介导的日本结缕草高效基因编辑方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基因枪介导的日本结缕草高效基因编辑方法，针对日本结缕草中的目标基因zjsgr设计基于crispr/cas9的sgrna序列，将含有编码所述sgrna序列的dna片段连接到携带crispr/cas9的载体中，采用基因枪介导转化法转化日本结缕草，或者，将含有编码所述sgrna序列的dna片段的载体、携带crispr/cas9的载体以及含筛选标记基因的载体，采用基因枪介导转化法共同转化日本结缕草，实现对日本结缕草基因zjsgr的定点突变，进而获得该基因功能缺失的转基因日本结缕草植株。

优选地，sgrna作用的靶点序列为5’-ccccgggacccgtggcgaaggcg-3’(seqidno:1)。

日本结缕草基因zjsgr的序列见seqidno:2。

前述的方法，根据sgrna作用的靶点序列，选择对应的限制性内切酶，将编码所述sgrna序列的dna片段插入tau6载体上，得到含有编码所述sgrna序列的dna片段的载体，命名为tau6-grna。tau6载体为北京林业大学草坪研究所保存质粒。tau6载体可参见张淑娟等，小麦pinb基因启动子区crispr/cas9基因编辑载体的构建[j/ol].山东农业科学,2020(01):1-14[2020-01-18].

优选地，所述携带crispr/cas9的载体为pjit163-2nlscas9，所述含筛选标记基因(bar)的载体为pahc20。

在基因枪转化过程中，进行dna包裹时，将3-5μl质粒dna与50μl金粉(金粉悬浮液)、50μl2.5mcacl2和20μl0.1m亚精胺混匀，点于微粒载膜中央，使其平铺晾至完全干燥后用于轰击日本结缕草胚性愈伤组织。

优选地，质粒dna中tau6-grna、pjit163-2nlscas9和pahc20的体积比为1：1：1。

可以采用美国bio-rad公司的pds-1000/he型基因枪，具体操作方法参照说明书进行。具体参数为：选用直径为1μm的金粉、每枪250μg金粉+0.5μgdna、6cm的轰击距离、轰击3次，轰击压力为1100psi。

以日本结缕草胚性愈伤组织作为转化受体材料，可采用如下方法制备：

日本结缕草成熟种子以70％酒精浸泡灭菌1分钟，蒸馏水冲洗3次，以次氯酸钠溶液在磁力搅拌器上灭菌1小时，以无菌水冲洗3-5次，4℃下浸泡3天，再以次氯酸钠溶液消毒20分钟，无菌水冲洗3次后，用无菌滤纸吸干多余水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，黑暗状态下28℃诱导愈伤，愈伤组织每月继代一次，继代时挑选白色或黄色紧凑颗粒状愈伤组织转接到继代培养基上培养18-22天，作为转化的受体材料。

本发明中，所述愈伤组织诱导培养基为：zj-id培养基：ms4.43g/l，α-酮戊二酸(α-ketoglutaricacid)0.1mg/l，蔗糖(sucrose)30g/l，维生素b1(vitaminb1)1ml/l，6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-ba)0.2mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-d)5mg/l，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌至完全溶解，调节ph至5.8，加入琼脂8g/l后高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中倒入培养皿中待用。

所用继代培养基与愈伤组织诱导培养基相同。

第二方面，本发明提供按照上述方法获得的日本结缕草在植物育种中的应用。育种目的是选育绿期较长的植物。

育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

第三方面，本发明提供靶向编辑日本结缕草zjsgr基因的crispr/cas9系统，所述系统包括载体tau6-grna、pjit163-2nlscas9和pahc20。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明以日本结缕草胚性愈伤组织作为转化受体材料，通过结缕草基因组序列比对，根据靶点位置和gc含量，确定sgrna位点，据此设计靶点序列并选定对应的限制性内切酶。将sgrna插入tau6载体上，提取质粒，对质粒进行检测，均呈阳性。在tau6载体上设计合成带有粘性末端的，能与靶标序列互补结合的双链dna。本发明提供的基因枪介导的日本结缕草高效基因编辑方法，结合了tau6、pjit163-2nlscas9、pahc20三种载体对日本结缕草滞绿基因zjsgr进行编辑，获得高达37.5％的编辑效率。

附图说明

图1为本发明实施例1中pcr分析sgrna的结果。

图2为本发明实施例1中tau6-grna载体结构图。

图3为本发明实施例1中pjit163-2nlscas9载体结构图。

图4为本发明实施例1中pahc20载体结构图。

图5为本发明实施例1中抗性愈伤组织及抗性植株。

图6为本发明实施例1中移栽后的转基因植株。

图7为本发明实施例1中转化植株序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1基因枪介导的日本结缕草高效基因编辑方法

1材料和方法

1.1植物材料

日本结缕草品种“chinesecommon”(购于北京正道生态科技有限公司)成熟种子以70％酒精浸泡灭菌1分钟，蒸馏水冲洗3次，以30％次氯酸钠溶液(北京化工厂生产，>5％活性氯，加入一滴吐温-20)在磁力搅拌器上灭菌1小时，以无菌水冲洗3-5次，4℃下浸泡3天，再以次氯酸钠溶液消毒20分钟，无菌水冲洗3次后，用无菌滤纸吸干多余水分，接种于愈伤组织诱导培养基上，黑暗状态下28℃诱导愈伤，愈伤组织每月继代一次，继代时挑选白或黄色紧凑颗粒状愈伤组织转接到继代培养基上培养20天左右，作为转化的受体材料。

1.2sgrna

使用日本结缕草zjsgr基因序列与结缕草基因组序列进行比对，只能特异地比对到zjsgr基因，根据基因序列外显子区域查找cas9靶点，根据靶点位置和gc含量最终确定靶点序列用以设计sgrna。对sgrna结缕草基因组数据库进行blast比对，只能特异地比对到zjsgr基因，说明该sgrna特异性很高，理论上不会脱靶。将它连接到tau6载体上，提取质粒，命名为tau6-grna，对质粒进行检测，均呈阳性(图1)。

表1靶点序列及对应的限制性内切酶

注：下划线部分为酶切位点。

1.3表达载体

本实施例中采用以下方法构建zjsgr敲除载体：

1、tau6promoter启动sgrna，tau6载体图谱如图2所示，tau6载体上无cas9，需要与pjit163-2nlscas9共转化。

2、ubipromoter启动r-cas9，利用pjit163-2nlscas9载体，载体图谱如图3所示。

3、ubipromoter启动bar，利用pahc20载体，载体图谱如图4所示。

在tau6载体上设计合成带有粘性末端的，能与靶标序列互补结合的双链dna。

表2tau6载体上互补的双链dna序列

1.3基因枪转化

1.4.1基因枪转化因素

采用美国bio-rad公司的pds-1000/he型基因枪，具体操作方法参照说明书进行。具体参数为：选用直径为1μm的金粉、每枪250μg金粉+0.5μgdna、6cm的轰击距离、轰击3次，轰击压力为1100psi。

1.4.2微弹的制备

1、ep管称取60mg金粉；

2、加入1ml无水乙醇，振荡1min，10000rpm离心10s；

3、弃上清液后加入1ml无菌水清洗，振荡1min，10000rpm离心10s；

4、弃上清液，加入1ml无菌水清洗，振荡1min，-20℃保存。制得金粉悬浮液。

1.4.3dna的包裹

1、取50μl金粉悬浮液于ep管；

2、依次加入3-5μl质粒dna(tau6-grna：pjit163-2nlscas9：pahc20体积比为1：1：1。说明：基因枪轰击法中，对质粒浓度的要求相对较高，至少为1μg/μl，本次实验提取的质粒符合要求，测得od＝421.1ng/ul，260/280＝1.92，260/230＝2.24)，50μl2.5mcacl2和20μl0.1m亚精胺(每加完一种试剂振荡3s)，静置10min(亚精胺应该现配现用，如果经常使用，可以配置成1m的母液，分装于ep管中，在-20℃条件下可保存1-2个月)；

3、振荡3s，放置于冰上10min，10000rpm离心10s，弃上清液；

4、加入80μl无水乙醇，震荡重悬，10000rpm离心10s，弃上清液；

5、加入10μl无水乙醇定容；

6、每次使用10μl点于微粒载膜中央，使其平铺晾至完全干燥，待用。

1.4.4基因枪的操作

转化前5天将愈伤组织转移到新鲜的继代培养基中进行预培养，将直径约在5mm的愈伤组织转移至新的继代培养基上，并将其紧密的集中排列在一起。

1、打开真空泵和基因枪的电源开关；

2、打开氦气瓶的开关，同时旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压力200psi左右；

3、旋下可裂膜挡盖，将可裂膜放在挡盖中央，旋上挡盖，用专用板水平加固；

4、把微粒发射装置移出轰击室，旋下盖子，放入阻挡网，把微粒载片安装在固定槽中(有微粒的一面朝下)，旋上盖子，将发射装置放回轰击室；

5、将样品盘放置在轰击室的适当位置，关上轰击室门；

6、按vac开关(上档)抽真空，当表上读数为所需值时，开关打到hold(下档)，然后按住fier开关，当达到适当压力时可裂膜自动破裂，松开fier，开关打到vent(中间档)，以释放轰击室内的真空；

7、打开轰击室门，取出样品盘；

8、取出微粒发射装置，卸下微粒载膜和阻挡网(阻挡网和微粒载膜放入70％的乙醇浸泡)；

9、旋下可裂膜挡盖，清除可裂膜碎片；

10、重复以上步骤，直至轰击完成所有实验样品；

11、若pds-1000/he型基因枪不再使用，关掉氦气瓶的阀门，按住fier开关放掉气体加速管内的氦气压力，最后关闭电源。

使用基因枪之前应注意，腔体内部应当用70％的乙醇反复擦拭清洁；可裂膜以及微粒载片在使用前也同样需要在70％的乙醇中浸泡约10min，然后自然风干待用；可裂膜挡盖，微粒发射装置、超净工作台等在使用前应该先用70％乙醇进行擦拭消毒。应注意的是，可裂膜、阻挡网及微粒载片的夹取都必须要用平头镊子，以防止产生刮痕或夹碎。

1.5转化植株的筛选再生

转化16小时，将轰击过的愈伤组织转至无渗透压的愈伤组织继代培养基上，黑暗条件下恢复培养，5天后转入愈伤组织筛选培养基，20天继代一次，可以观察到有抗性的愈伤组织生长旺盛，较为白嫩，没有抗性的愈伤组织出现褐化，2个月后将具有抗性的愈伤组织转到抗性愈伤再生培养基上，诱导体胚发生和植株再生(图5)。约1个月后，待小植株出现，将其转入1/2ms培养基中壮苗。根系强壮后，小心洗去植株根部琼脂，移栽入由蛭石与草炭土混合基质中(蛭石与草炭土的体积比为1:3)。移栽后的转基因植株见图6。

所述愈伤组织继代培养基为：sm培养基：ms4.43g/l，蔗糖30g/l，2,4-d2mg/l加入蒸馏水用玻璃棒搅拌至完全溶解，调节ph至5.8，加入琼脂8g/l后高压灭菌，温度降至55℃左右，在超净工作台中倒入培养皿中待用。

筛选培养基为：gm培养基：ms4.43g/l，蔗糖30g/l，2,4-d2mg/l加入蒸馏水用玻璃棒搅拌至完全溶解，调节ph至5.8，加入琼脂8g/l后高压灭菌，温度降至55℃左右，在超级工作台中加入草铵膦5mg/l混匀后倒入培养皿中待用。

抗性愈伤再生培养基为：rm培养基：ms2.215g/l，蔗糖15g/l，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌至完全溶解，调节ph至5.8，加入琼脂8g/l后高压灭菌，温度降至55℃左右，在超级工作台中加入激动素(kinetin,kt)0.2mg/l，草铵膦5mg/l混匀后倒入培养皿中待用。

1.6测序检测

对筛选再生的转化植株进行测序检测。

2结果与分析

2.1测序结果

经过测序检测，筛选再生得到的8株转基因日本结缕草植株中，有3株植株显示zjsgr基因编辑成功，为单碱基g缺失(图7)。

2.2编辑效率

编辑效率＝(单碱基缺失的转基因结缕草植株数/筛选再生的转化植株数)×100％统计结果如表3所示。

表3编辑效率统计结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京林业大学

<120>基因枪介导的日本结缕草高效基因编辑方法

<130>khp201110084.7

<160>2

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<212>dna

<213>日本结缕草(zoysiajaponicasteud.)

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