一种双T-DNA载体pBID-RTEnhanced及其构建方法和应用与流程

本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种双t-dna载体pbid-rtenhanced及其构建方法和应用。

背景技术：

甘蓝型油菜(b.napusl.)是世界上最重要的油料作物之一，是生产富含蛋白质产品的主要植物。为了满足日益增长的需求，有必要利用遗传工程方法改良现有的品种和创造新的优良甘蓝型油菜品种，这为创造具有改良性状和不能通过传统育种方法获得的理想特征的新品种提供了另一种途径。自首次报道成功改造甘蓝型油菜以来，目前已利用农杆菌介导系统成功地将遗传转化技术用于甘蓝型油菜改良。许多重要特性的改良，包括除草剂，昆虫以及真菌抗性，以及改善油脂成分和蛋白质，已通过转基因方法引入甘蓝型油菜。转基因甘蓝型油菜的安全性与其他转基因作物面临着同样的问题和争论，其中一个问题是选择标记基因的关注。

目标基因的遗传转化过程需要同时伴随转化其他的抗生素或抗除草剂的选择标记基因，以帮助选择携带目标基因的阳性转基因植物。一旦转基因植株得到再生和鉴定，就不再需要选择标记基因。此外，带有标记基因的转基因植物不仅影响了公众的接受度，而且增加了标记基因导入亲缘杂草和非转基因作物的环境风险。这些因素使转基因植物商业化的监管过程复杂化。此外，对于不同基因进行多次转化，标记基因则会限制了这种多基因叠加过程。因此，生产无标记转基因甘蓝型油菜品种将有利于甘蓝型油菜的开发和最终的商业化利用。

迄今为止，已经开发了许多能够去除可选择标记基因的方法，包括共转化、位点特异性重组和同源重组。在这些方法中，共转化是一种简单、清洁的技术，并且在删除了标记基因的的转基因植物中不留下反向重复和重组位点等残留dna序列，因而得到了广泛的应用。共转化是指一个t-dna携带标记基因和另一个t-dna携带目标基因的同时整合到基因组，如果两个基因整合到一个非连锁的位点上，那么它们在后代中的随后就会发生重组和分离。共转化在许多物种中都有应用，包括大豆、烟草、玉米、高粱、水稻和硬质小麦。但是利用现有的共转化技术，“双t-dna”载体是通过将“右边框和左边框”序列插入二元载体一个t-dna中而构建的；且多是将gus作为目标基因，bar作为标记基因，最后获得的是具有gus，去除bar的无标记植株，没有应用价值。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种双t-dna载体pbid-rtenhanced及其构建方法和应用，降低t-dna整合到连锁位点的频率，从而提高无标记转基因植株的出现概率，同时获得多种具有实际应用价值的转基因材料。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种双t-dna载体pbid-rtenhanced，所述载体pbid-rtenhanced以pcambia3300的质粒为基础，包含两个反向独立的t-dna区，第一t-dna区的核苷酸序列如seqidno.1所示，第二t-dna区的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述第一t-dna区和第二t-dna区之间的距离大于2kb。

优选的，所述第一t-dna区包含选择标记基因，所述选择标记基因包括cp4-epsps基因和gox-v247基因；所述cp4-epsps基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述gox-v247基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。

优选的，所述第二t-dna区包含目标基因bar，所述目标基因bar的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本发明还提供了所述载体pbid-rtenhanced的构建方法，包括以下步骤：(1)双酶切去除pcambia3300质粒的多克隆位点mcs，补齐粘性末端后，酶连成环，得无mcs的pcambia3300质粒；

(2)在所述无mcs的pcambia3300质粒的pbr322bom和pvs1oriv位点之间插入新的所述多克隆位点mcs；

(3)将包含选择标记基因的序列插入新的所述多克隆位点mcs中，得第一t-dna区，构建得到所述载体pbid-rtenhanced。

优选的，步骤(1)所述双酶切所用的酶包括ecori和pmei；用klenow酶将粘性末端补齐；用连接酶将粘性末端补齐后的线性分子连接成环。

本发明还提供了所述载体pbid-rtenhanced或利用所述构建方法构建得到的所述载体pbid-rtenhanced在油菜遗传转化中的应用。

优选的，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化油菜。

本发明提供了一种双t-dna载体pbid-rtenhanced，所述载体pbid-rtenhanced载体的两个t-dna之间的距离大于2kb，并且t-dna呈倒置排列。可降低t-dna整合到连锁位点的频率；在本发明实施例中，在13个t1代和f1代中共鉴定出10个株系存在无标记转基因植株，占76.92％；

本发明以bar作为目标基因，cp4-epsps基因和gox-v247基因作为标记基因，最后除了可以获得含有bar，去除cp4-epsps的无标记植株(抗草铵膦除草剂转基因材料)，还可以获得同时有bar和cp4-epsps的转基因植株(既抗草铵膦也抗草甘膦除草剂转基因材料)，还可获含有cp4-epsps，去除bar的转基因植株(抗草甘膦除草剂转基因材料)。

本发明采用农杆菌介导草甘膦筛选法，共获得76株再生甘蓝型油菜植株，结果表明，在76株独立t0植株中，18株为bar⁺epsps⁺gox⁺，39株为bar^-epsps⁺gox+，所述载体pbid-rtenhanced的共转化率为31.58％；且bar基因和cp4-epsps基因以不同的拷贝数插入到同一转基因植株的基因组中，且此处携带cp4-epsps的t-dna插入拷贝数低，因为该t-dna片段大，可以获得高的后代分离标记基因频率。

利用本发明的双t-dna的载体pbid-rtenhanced可以成功并且高效的生产无标记转基因甘蓝型油菜植株，并创造两种抗除草剂品种，本发明所述载体可用于试验、作物改良和商业需求，且在实际应用中有潜力转化许多植物物种，包括双子叶植物和单子叶植物。

附图说明

图1为载体pbid-rtenhanced的质粒结构图；

图2为转基因检测结果图，其中a为pcr检测bar基因，b为pcr检测cp4-epsps基因，c为pcr检测gox-v247基因，且a、b和c中，m:表示dl2000dna标记；泳道1-17表示用pbid-rtenhanced转化获得的单个t0植株；p表示表达载体pbid-rtenhanced；wt表示野生型zs6；d为试纸条检测转基因甘蓝型油菜植株里epsps蛋白表达，其中p表示阳性对照，转bar蛋白的ms8甘蓝型油菜植株；wt表示野生型zs6；e为试纸条检测转基因甘蓝型油菜植株里bar蛋白表达，其中p表示含有epsps蛋白的gt73转基因甘蓝型油菜植株，wt表示野生型zs6；

图3为southern杂交检测转t0转基因甘蓝型油菜内的基因拷贝数，其中：southern杂交检测转t0转基因甘蓝型油菜(a，b，d，f)的bar(a，c，e)和epsps(b，d，f)基因拷贝数，从pbid-rtenhanced的双t-dna系统中鉴定t1代(c，d，e，f)无标记植株；a和b中泳道1～17表示t0代植株具有bar⁺epsps⁺基因型；c、d、e和f中泳道1～12表示t1植株具有bar⁺epsps基因型，泳道13～24表示t1植株具有bar⁺epsps⁺基因型；且m表示dna分子量标记，wt表示野生型zs6，p表示阳性对照；

图4为pcr筛选t1代无标记转基因植株，其中a为检测bar基因，b为检测epsps基因，c为检测gox基因；在图中m表示dl1000dna标记；泳道1～17表示单个t1植株；p表示阳性对照；wt表示野生型zs6。

具体实施方式

本发明提供了一种双t-dna载体pbid-rtenhanced，所述载体pbid-rtenhanced以pcambia3300的质粒为基础，包含两个反向独立的t-dna区，第一t-dna区的核苷酸序列如seqidno.1所示，第二t-dna区的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述第一t-dna区和第二t-dna区之间的距离大于2kb。

本发明所述载体pbid-rtenhanced中，两个t-dna之间的距离大于2kb，含有cp4-epsps标记基因的t-dna显著长于另一个t-dna，导致含有cp4-epsps标记基因的t-dna整合到基因组的拷贝数低，t1代更容易分离丢掉该t-dna；并且t-dna呈倒置排列，可以降低t-dna整合到连锁位点的频率。

本发明所述第一t-dna区包含选择标记基因，所述选择标记基因优选包括cp4-epsps基因(简称epsps基因)和gox-v247基因(简称gox基因)。本发明所述cp4-epsps基因优选来源于鼠伤寒沙门菌(salmonellatyphimurium)，可编码5-烯醇丙酮酸苯草酸盐-3-磷酸脂肪酶，使植物对除草剂草甘膦产生抗性；所述cp4-epsps基因的核苷酸序列优选如seqidno.3所示。

本发明所述gox-v247基因优选来源于人仓白杆菌(ochrobactrumanthropi)，为草甘膦降解基因，所述gox-v247基因的核苷酸序列优选如seqidno.4所示。本发明将所述cp4-epsps基因和gox-v247基因结合后，可在降低草甘膦残留量的同时提高草甘膦抗性，避免草甘膦残留对植物的敏感授粉和生殖发育发生负面影响。

本发明所述第二t-dna区优选包含目标基因bar，所述目标基因bar的核苷酸序列优选如seqidno.5所示。

本发明还提供了所述载体pbid-rtenhanced的构建方法，包括以下步骤：(1)双酶切去除pcambia3300质粒的多克隆位点mcs，补齐粘性末端后，酶连成环，得无mcs的pcambia3300质粒；

(2)在所述无mcs的pcambia3300质粒的pbr322bom和pvs1oriv位点之间插入新的所述多克隆位点mcs；

(3)将包含选择标记基因的序列插入新的所述多克隆位点mcs中，得第一t-dna区，构建得到所述载体pbid-rtenhanced。

本发明双酶切去除pcambia3300质粒的多克隆位点mcs，补齐粘性末端后，酶连成环，得无mcs的pcambia3300质粒。本发明所述双酶切所用的酶优选包括ecori和pmei。本发明优选用klenow酶将粘性末端补齐。本发明优选用连接酶将粘性末端补齐后的线性分子连接成环。本发明对上述酶的反应体系和程序并没有特殊限定，利用本领域的常规体系和程序即可。

得所述无mcs的pcambia3300质粒后，本发明在所述无mcs的pcambia3300质粒的pbr322bom和pvs1oriv位点之间插入新的所述多克隆位点mcs。本发明利用双酶切去除的所述多酶切位点mcs优选与新插入的多克隆位点mcs相同。

本发明将包含选择标记基因的序列插入新的所述多克隆位点mcs中，得第一t-dna区，构建得到所述载体pbid-rtenhanced。本发明在所述插入时，优选的将包含左边界、增强型camv35s启动子、cp4-epsps基因、nos终止子、增强型camv35s启动子、gox-v247基因、nos终止子和右边界的合成序列插入pcambia3300中的新mcs中，全长5776bp，形成如seqidno.1所示序列的第一t-dna区。由于pcambia3300质粒本身含有bar基因，且包含有bar基因的第二t-dna区与第一t-dna区之间的距离大于2kb，从而形成增强型双t-dna载体pbid-rtenhanced。

本发明还提供了所述载体pbid-rtenhanced或利用所述构建方法构建得到的所述载体pbid-rtenhanced在油菜遗传转化中的应用。本发明优选利用农杆菌介导的遗传转化方法转化油菜，且对所述遗传转化方法并没有特殊限定，优选的参考liuf,xiongxj,wul,fudh,haywarda,zengxh,caoyl,wuyh,liyj,&wug(2014)braltp1,alipidtransferproteingeneinvolvedinepicuticularwaxdeposition,cellproliferationandflowerdevelopmentinbrassicanapus.plosone(if3.534)9(10):e110272。

下面结合实施例对本发明提供的双t-dna载体pbid-rtenhanced及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

pbid-rtenhanced的构建

对含有bar基因的质粒pcambia3300，用ecori和pmei酶切除mcs(多克隆位点)，然后用klenow酶将粘性末端补齐，再用连接酶让该线性分子自连成环。然后在pbr322bom和pvs1oriv位点之间插入新的mcs(与切除的mcs序列相同)。将包含左边界、增强型camv35s启动子、cp4-epsps基因、nos终止子、增强型camv35s启动子、gox-v247基因、nos终止子和右边界的合成序列插入pcambia3300中的新mcs中，全长5776bp(seqidno.1)。构建得到表达载体pbid-rtenhanced(质粒如图1所示)。

参考liu等的方法对pbid-rtenhanced双t-dna载体在油菜中的遗传转化(liuf,xiongxj,wul,fudh,haywarda,zengxh,caoyl,wuyh,liyj,&wug(2014)braltp1,alipidtransferproteingeneinvolvedinepicuticularwaxdeposition,cellproliferationandflowerdevelopmentinbrassicanapus.plosone(if3.534)9(10):e110272)：通过电转化法将pbid-rtenhanced质粒导入根癌农杆菌gv3101，在37℃的lb琼脂平板上培养，平板添加适当浓度的抗生素(庆大霉素50mg/l，利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l)，筛选阳性克隆并进行pcr验证。用单一阳性农杆菌菌落转化甘蓝型油菜，受体采用中双6号。中双6号的种子在75％乙醇中浸泡1min，在1.5％氯化汞中浸泡10～15min，在黑暗条件下萌发5～6d后，将黄化的下胚轴切成7mm的小段，与50ml农杆菌(农杆菌od值约0.3)在液体dm培养基(ms+30g/l蔗糖+100μm乙酰丁香酮，ph5.8)中混合浸泡0.5h。然后将表面风干的下胚轴转移到共培养基(ms+30g/l蔗糖+18g/l甘露醇+1mg/l2，4-d+0.3mg/l激动素+100μm乙酰丁香酮+8.5g琼脂糖，ph值5.8)培养2d，然后到选择培养基(ms+30g/l蔗糖+18g/l甘露醇+1mg/l2，4-d+0.3mg/l激动素+20mg/lagno3+8.5g/l琼脂糖+250mg/l羧苄青霉素二钠，ph值5.8)进行增殖。3周后，将下胚轴愈伤组织转移到再生培养基(ms+10g/l葡萄糖+0.25g/l木糖+0.6g/l2-(n-吗啉基)乙磺酸水合物+2mg/l玉米素+0.1mg/l吲哚-3-乙酸+8.5g/l琼脂糖+80mg/l草甘膦+250mg/l羧苄青霉素二钠，ph5.8)中培养2周。下胚轴每2周移入新的再生培养基中，一共需要3～4个再生周期，成苗后移入生根培养基(ms+10g/l蔗糖+10g/l琼脂，ph5.8)生根(约3周)。将转化后的带根植物移栽到花盆中进行生长。

在转化过程中由于下胚轴对草甘膦敏感，只在再生期向培养基中加入草甘膦，使转化细胞比未转化细胞更有竞争力。再生芽在含80mg/l草甘膦的选择培养基上进行筛选。

采用农杆菌介导草甘膦筛选法，共获得76株再生甘蓝型油菜植株。用pcr检测再生甘蓝型油菜植株中存在的bar、epsps和gox基因，并用测试条检测bar和epsps蛋白的表达，结果如表1和图2所示，在76株独立t0植株中，18株为bar⁺epsps⁺gox⁺，39株为bar^-epsps⁺gox⁺，pbid-rtenhanced载体共转化率为31.58％。

表1pbidrtenhanced双t-dna载体系统t0转化子共转化频率

pbid-rtenhanced的双t-dna体系的southern杂交：用hindⅲ酶切的dna与bar探针杂交，杂交产物262bp，探针引物分别为：

bar-f(seqidno.6)：gaaggcacgcaacgcctacga；

bar-r(seqidno.7)：tggcatgacgtgggtttctgg；

用ecorⅰ酶切的dna与epsps探针杂交，杂交产物579bp，探针引物分别为：

epsps-f(seqidno.8)：gtggggattgaagaagagtgg；

epsps-r(seqidno.9)：ccaaagactccaacgccaat。

通过southernblot鉴定共整合t0转基因植株，以检测bar和epsps基因的整合状态和拷贝数(图3)。blot结果显示，bar基因在17个转基因植株中有4个以单拷贝的形式整合，在大多数植株中以3个拷贝的形式整合(图3中a)。然而，在17株甘蓝型油菜植株中，有9株的epsps基因是单一拷贝(图3中b)。结果表明，bar基因和epsps基因以不同的拷贝数插入到同一转基因植株的基因组中。所有t0阳性转基因植株育性正常，未发现不育转基因植株。

随机选择8株t0bar⁺epsps⁺gox⁺植物，自交或与转化受体zs6杂交，在温室中生长成熟。为了获得无标记转基因甘蓝型油菜植株(图4，表2)，对13个t1代或f1代株系的植株进行分析。在苗期，用pcr方法检测每株t1代植株中是否存在bar、epsps和gox基因。在t1代中检测到4种转基因植物：bar⁺epsps⁺gox⁺、bar^-epsps⁺gox⁺、bar⁺epsps^-gox^-和bar^-epsps^-gox^-。大多数t1植物是bar⁺epsps⁺gox⁺，而一些是无标记的bar⁺epsps^-gox^-植物。13个t1代和f1代转基因株系当中的10个株系里共鉴定出37株无标记植物，无标记基因株系出现的频率为76.92％，不同品系间的标记基因分离效率在4.35％～52.94％之间。在t1代无标记子代的10个t0系中，平均标记基因分离效率为21.06％。

表2t1代株系epsps和bar基因分型检测

选择12个无标记的甘蓝型油菜bar⁺epsps^-gox^-进行southern杂交分析(图3中c和d)。由于epsps和gox是在同一t-dna中的紧密相连的位点，鉴定epsps即可代表这两个基因。所有的12个t1bar⁺epsps^-gox^-都表现出1～2个bar的条带，没有epsps条带，并且显示出四种不同的条带模式，代表四个独立的t0转基因系。对应的这四个t0系都显示一个epsps带(图3中b的第2、6、8和15号株系)，表示四个t0株系中epsps基因是单个拷贝。

利用本发明所述方案除获得bar⁺epsps^-gox^-植株(抗草铵膦)外，还获得了bar⁺epsps⁺gox⁺转基因甘蓝型油菜(草铵膦和草甘膦抗性)，对两种除草剂产生抗性。因此，选择12个具有bar⁺epsps⁺gox⁺基因型的t1或f1后代，并以未转化野生型zs6为对照，通过southern杂交进行了验证(图3中e和f)。12个t1或f1bar⁺epsps⁺gox⁺子代表现出1～4条bar条带和1～2条epsps条带，而所有子代都表现出6种不同的带型，代表6个独立的转基因t0系(图3中e和f)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>一种双t-dna载体pbid-rtenhanced及其构建方法和应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5776

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

taaacgctcttttctcttaggtttacccgcagcggataacaatttcacacaggaaacagc60

tatgaccatgattacgccaagctatttaggtgacactatagaatactcaagctatgcatc120

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