一种区分玉米南方锈菌和普通锈菌孢子的方法与流程

本发明属于植物病理学技术领域，尤其涉及一种区分玉米南方锈菌和普通锈菌孢子的方法。

背景技术：

中国发生的玉米锈病主要有普通锈病和南方锈病玉米锈病。高粱柄锈菌(pucciniasorghi.)会引起的玉米普通锈病(commoncornrust)、玉米多堆柄锈菌(pucciniapolysoraunderw.)可引起的玉米南方锈病(southerncornrust)，玉米普通锈病和玉米南方锈病是我国流行的严重病害。

普通玉米锈病病原菌夏孢子近球形、椭圆形，大小(23～32)μm×(20～31)μm，淡黄色或黄褐色，表面有刺。玉米南方锈菌夏孢子呈圆形或椭圆形，单胞，表面有少量刺状突起，橘黄色至红褐色，大小在22.5～35μm×26.7～44μm之间，平均大小约为25.71μm×33.46μm。田间条件下，由于不同地区气候差异明显，玉米品种多样等原因，导致不能明显区分出玉米锈病类型，玉米锈病都主要危害土表上部，严重时可侵染果穗，苞叶乃至雄花。发病初期在叶片基部和上部及两侧，聚生或者散生，形成散生或聚生黄色斑点夏孢子堆。玉米锈病发生严重的时候，叶片布满孢堆子，影响光合作用，造成叶片干枯，籽粒不饱满，减产甚至绝收。在西南地区，北部地区普通锈病和南方锈病经常混发，在实验研究中，极易在混发地区由于不易识别出现交叉污染，严重阻碍了繁菌及研究工作。而温室培养后也不易区分来源和品种会造成宏观形态形似(图1和图2所示)，往往导致菌源污染，导致工作徒劳无功。现有技术中虽然可以采用realtime-pcr分子手段可以区分玉米南方锈菌和玉米普通锈菌，或者利用its序列对我国玉米锈病进行分子检测。但是由于鉴定过程繁琐，器材药剂要求较高，实验成本和时间成本较高。实验中急需快速鉴别方法对田间和温室的玉米锈菌类型进行鉴定。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提出了一种区分玉米南方锈菌和普通锈菌孢子的方法，包括如下步骤：

将锈菌的孢子放于载有盐酸或硫酸溶液的载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察并区分；

区分方法为：

盐酸溶液处理后，如锈菌孢子的原生质体均浓缩成一个圆形大团，则为南方锈菌，如锈菌孢子的原生质体浓缩成多个小团或者无变化，则为普通锈菌；

硫酸溶液处理后，如锈菌孢子的原生质体出现一个大团，则为南方锈菌；如锈菌孢子的原生质体出现多个小团，则为普通锈菌

所述硫酸浓度为13.2～13.8moll^-1；盐酸浓度为9～12moll^-1。

所述硫酸浓度为13.8或13.2moll^-1，盐酸浓度为11.4或9moll^-1。

区分玉米南方锈菌和普通锈菌孢子的方法还包括锈菌孢子的培育。

所述锈菌孢子的培育的方法包括：将玉米南方锈菌或普通锈菌的孢子挑接或喷接到健康玉米苗上。

所述健康玉米苗为三叶一心苗期的玉米苗；接菌叶片为健康玉米苗的第二叶和/或第三叶上。

所述健康玉米苗接菌前，对接菌叶片进行脱蜡处理，并且利用质量分数为0.05％吐温20水溶液处理脱蜡后的叶片。

所述健康玉米苗接菌后，保持温度20-30℃，空气相对湿度≥80％，在该条件下，先在自然光环境培养24-48h，然后在光照充足环境继续培养。

所述孢子转接1～2代。

本发明的有益效果在于：

1.本发明所述方法，使用稀释后盐酸处理玉米南方锈菌夏孢子时，其原生质体均浓缩成一个圆形大团，而普通玉米锈菌原生质体未浓缩成多个大小不一的原生质团。使用稀释后硫酸处理玉米南方锈菌原生质体出现一个大团，而玉米普通锈菌原生质体会出现多个小团，操作简便，实验室和温室等条件下均可实现，方便观察，区分程度大。

2.本发明实验方法鉴定过程简便，器材药剂方便易得，极大程度节约了实验成本和时间成本。

附图说明

图1为温室玉米普通锈菌的形态图；

图2为温室玉米南方锈菌的形态图；

图3为清水处理后的玉米普通锈菌孢子的形态图；

图4为清水处理后的玉米南方锈菌孢子的形态图；

图5为95:25(hcl:h2o)比例下的玉米普通锈菌孢子的形态图；

图6为95:25(hcl:h2o)比例下的玉米南方锈菌孢子的形态图；

图7为72:28(h2so4:h2o)比例下的玉米普通锈菌孢子的形态图；

图8为72:28(h2so4:h2o)比例下的玉米南方锈菌孢子的形态图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明：

如图1和图2所示，玉米锈菌在叶片上产孢快，形态上没有田间所见的未破孢子堆，均呈现黄褐色或深褐色，不易区分(图1和图2)。玉米普通锈菌孢子颜色多为深褐色，且喜欢侵染叶片背部，玉米南方锈菌孢子颜色黄褐色锈状，会有少量侵染叶片背部或茎。但两种菌的孢子形态并不唯一，不能极好的分别。

1)种苗；包括玉米种子催芽和播种；所述催芽方法为：选取饱满的玉米种子，所用玉米品种为天贵糯932和郑丹95。用0.1％的双氧水在室温条件下浸泡种子24h-48h，取出种子后，在种子上面盖上湿纸巾或湿布，在通风处催芽。玉米种子前端长出1-2mm胚根后即可播种，播种时，胚根朝上且朝向种植容器的中心，沿盆周种为圆形，方便接菌收菌。

2)菌种初繁：挑取病叶上的玉米南方锈菌和普通锈菌的单孢子堆接种到健康玉米苗的第二叶和/或第三叶上，每片叶子只接种一个单孢子堆；玉米南方锈病所用菌系分别于2019年3月海南采样，2019年9月河南开封采样。供试菌种为海南继代活体扩繁所得分离物以及河南开封分离活体扩繁所得，玉米普通锈菌来源于2019年9月宁夏固原采样，以及2019年10月温室自然发病。

3)菌株转接：待初繁的玉米苗发病后，将生长在叶片上玉米南方锈菌和普通锈菌的孢子挑接或喷接到到多株健康玉米苗的第二叶和第三叶上。

步骤2)和3)健康玉米苗为三叶一心苗期的玉米苗；健康玉米苗在接菌之前，对玉米苗的第二叶和第三叶进行脱蜡处理，并且利用质量分数为0.05％吐温20水溶液处理脱蜡后的叶片。玉米苗可转接1～2代。接菌后，保持温度为20-30℃，保湿24-48h，之后转移到光照充足环境条件下继续培养，保持空气相对湿度≥80％，温度为20-30℃。

4)将玉米南方锈菌和普通锈菌的单孢子堆接种到健康玉米苗叶片上，经转接培养，繁殖足量孢子。

实施例

1)天贵糯932或郑丹958玉米种子经泡种24小时，纱布保湿催芽33小时后播种于盆中，土壤用草炭蛭石一比一混合后装盆，一盆八颗玉米种子靠盆周围播种，浇水后30度条件下，十五天后玉米长成三叶一心的健康幼苗。2019年3月海南采样活体继代扩繁至接种时候。首先对玉米叶片脱蜡，使得吐温-20溶液可附着在叶片上同时玉米锈菌也能更好的侵染。玉米叶片若不脱蜡洗苗，吐温-20溶液极易聚成水滴落下，接种效果会大大减少。

2)准备好可供接种的健康玉米苗后，挑病叶上的玉米南方锈菌的孢子堆，使用0.50％吐温-20溶液喷到玉米苗上后，将孢子粉均匀涂抹于第二、第三个叶片上，繁殖后利用新的健康玉米苗先后经转接和喷接到健康玉米苗为三叶一心苗期的玉米苗上，20-30℃，自然光照的条件下，保湿24-48h，之后转移到光照充足，空气相对湿度80％以上，温度20-30℃的环境条件下继续培养十五天后获得新鲜的孢子。由于目前，玉米南方锈菌除活体继代扩繁保存外无法保存方法。海南的菌系一直重复接种继续培养到十月。待所有菌系的孢子基本足够后收集孢子粉。将收集的孢子粉加入0.50％吐温-20配制成孢子悬浮液，喷接种到多株健康的玉米苗上，扩繁到足够量。

3)繁好所需用量的玉米南方锈菌和玉米普通锈菌。

4)将质量分数为98％的硫酸，硫酸稀释比例为h2so4:h2o＝72:28、73:27、74:26、75:25；将质量分数为36-38％的盐酸，稀释比例为hcl:h2o＝75:25、95:5、100:0配制好硫酸和盐酸水溶液。将玉米普通锈菌和玉米南方锈菌分别用稀释好的硫酸盐酸处理后对比两种菌的原生质体变化。首先分别用针挑少量新鲜玉米普通锈菌和玉米南方锈菌孢子到载有硫酸溶液的载玻片上，盖上盖玻片，立即放到显微镜下观察。用针挑少量玉米普通锈菌和玉米南方锈菌孢子到载有盐酸溶液的载玻片上，盖上盖玻片，立即放到显微镜下观察。

每次实验选取50个以上的孢子统计后发现经不同浓度下盐酸处理以后形态统计如表1所示，在体积比(hcl:h2o)75:25比例下玉米南方锈菌原生质体浓缩为大团，而玉米普通锈菌未出现变化。

当体积比(hcl:h2o)95:5，玉米锈菌的原生质体出现了明显差异，视野中(图5)玉米南方锈菌孢子原生质体浓缩为一个大团，玉米普通锈菌在同等比例下，原生质体未浓缩为多个小团(图6)。

当体积比(hcl:h2o)达到100：0时玉米南方锈菌浓缩大团而玉米普通锈菌并没有呈现出一个大团或几个大团的现象。

表1不同浓度盐酸处理下孢子原生质体的变化情况

表1中，pbhcl:玉米普通锈菌孢子盐酸处理后大团数量，pshcl:玉米普通锈菌孢子盐酸处理后小团数量，nbhcl玉米南方锈菌孢子盐酸处理后大团数量，nshcl玉米南方锈菌孢子盐酸处理后小团数量。

经不同比例浓度下硫酸处理以后的孢子形态统计如表2所示，在体积比(h2so4:h2o)72:28之后比例下原生质体出现了差异，视野中(图7)玉米南方锈菌98％的孢子原生质体浓缩为一个大团，玉米普通锈菌在同等比例下，原生质体未浓缩为多个小团(图8)。在体积比(h2so4:h2o)72:28至75:25，大团的形状会趋于圆形，呈现不规则分散状态。

表2不同浓度硫酸处理下孢子原生质体的变化情况

表2中，pbh2so4：玉米普通锈菌孢子硫酸处理后大团数量(n:多个)，psh2so4：玉米普通锈菌孢子硫酸处理后小团数量(n:多个)，nbh2so4：玉米南方锈菌孢子硫酸处理后大团数量，nsh2so4：玉米南方锈菌孢子硫酸处理后小团数量(n:多个)。

对比例1

步骤1)—3)同实施例1。

用针挑少量玉米普通锈菌和玉米南方锈菌孢子到载有蒸馏水的载玻片上，盖上盖玻片，立即放到显微镜下观察。

玉米普通锈菌和玉米南方锈菌孢子经蒸馏水处理后，在显微镜下直接观察其特征(图3和图4)结果显示玉米普通锈菌和玉米南方锈菌未发生质壁分离现象。玉米普通锈菌多为圆形，少数椭圆形单孢子，玉米南方锈菌多为椭圆，少量圆形的单孢子。形态接近的菌并不能清晰的分辨，且表面都有刺状突起。除典型症状外，也会出现不能区分的情况。颜色差异不大，形态接近，并不能通过显微镜极好分辨。蒸馏水处理下玉米普通锈菌和玉米南方锈菌孢子原生质体的变化情况示于表3。

表3蒸馏水处理下玉米普通锈菌和玉米南方锈菌孢子原生质体的变化情况表

表3中，pbh2o：清水处理玉米普通锈菌后的原生质体大团数量，psh2o：清水处理玉米普通锈菌后原生质体的小团数量，nbh2o：清水处理南玉米南方锈菌后的原生质体大团数量，nsh2o：清水处理玉米南方锈菌后原生质体的小团数量。

表明玉米锈菌会因为来源不同有不同的形状，椭圆或圆形。

对比例2

步骤1)—3)同实施例1。

4)将质量分数为36-38％的盐酸，稀释比例为hcl:h2o＝0:100、35:65、55:45配制好硫酸和盐酸水溶液。将玉米普通锈菌和玉米南方锈菌分别用稀释好的盐酸处理后对比两种菌的原生质体变化。用针挑少量玉米普通锈菌和玉米南方锈菌孢子到载有盐酸溶液的载玻片上，盖上盖玻片，立即放到显微镜下观察。

每次实验选取50个以上孢子统计后发现经不同浓度下盐酸处理以后形态统计如表4所示，在t体积比(hcl:h2o)0:100、35:65、55:45比例下，原生质体都未有明显变化。

表4不同浓度盐酸处理下孢子原生质体的变化情况

表4中，pbhcl:玉米普通锈菌孢子盐酸处理后大团数量，pshcl:玉米普通锈菌孢子盐酸处理后小团数量，nbhcl玉米南方锈菌孢子盐酸处理后大团数量，nshcl玉米南方锈菌孢子盐酸处理后小团数量。

对比例3

4)将质量分数为98％的硫酸，硫酸稀释比例为h2so4:h2o＝0:1、35:65、55:45、95:5、100：0。将玉米普通锈菌和玉米南方锈菌分别用稀释好的硫酸处理后对比两种菌的原生质体变化。首先分别用针挑少量新鲜玉米普通锈菌和玉米南方锈菌夏孢子到载有硫酸溶液的载玻片上，盖上盖玻片，立即放到显微镜下观察。

经不同比例浓度下硫酸处理以后的孢子形态统计如表5所示，在体积比(h2so4:h2o)0:1、35:65、55:45比例下，原生质体未有变化；当体积比(h2so4:h2o)95:5、100：0时两者未有显微镜可观测的区别。

表5不同浓度硫酸处理下孢子原生质体的变化情况

表5中，pbh2so4：玉米普通锈菌孢子硫酸处理后大团数量(n:多个)，psh2so4：玉米普通锈菌孢子硫酸处理后小团数量(n:多个)，nbh2so4：玉米南方锈菌孢子硫酸处理后大团数量，nsh2so4：玉米南方锈菌孢子硫酸处理后小团数量(n:多个)。

供试菌株会因为如玉米品种、地区等各种因素不一致导致有不同的孢子形态，但实验中原生质体变化较为一致。在不同来源的菌可能存在一些形状差异，但是玉米南方锈菌和玉米普通锈菌在显微镜下镜检随酸浓度的变化形态有所不同。用此法可方便、快速地进行玉米锈病种类辅助鉴别，孢子用量少，且成本低、操作简便，便于田间农业科技工作者掌握，运用于田间玉米锈菌的鉴定和繁菌研究中的识别。然而，科学研究实验中，如若时间和实验设备允许的情况下，分子实验准确率更高且更加灵敏。玉米锈菌孢子经盐酸或硫酸溶液处理后的原生质体变化现象不是玉米普通锈菌和玉米南方锈菌鉴定的唯一手段，在运用中要结合发病情况，孢子堆颜色形状等进行初步判断，再结合酸处理、分子手段进行综合判断。