一种环氧化物水解酶突变体及其应用的制作方法

文档序号：21090864发布日期：2020-06-12 17:12阅读：361来源：国知局

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种环氧化物水解酶突变体及其应用。

背景技术：

环氧化物水解酶(ec3.3.2.3)是一类无需任何辅酶、辅基或金属离子参与的催化环氧化物或其盐水解为相应邻二醇或其盐的酶的总称。环氧化物水解酶广泛分布于哺乳动物、植物和微生物中，微生物来源的环氧化物水解酶由于具有立体专一性好、酶促反应快、产物光学纯度和得率高、产物分离纯化简单易行等特点，备受人们关注。

d(-)-酒石酸[(2s,3s)-2,3-二羟丁烷-1,4-二羧酸]是天然l(+)-酒石酸的同型异构体，在自然界中极少存在，主要用于制药行业中手性合成的手性源及拆分剂。d(-)-酒石酸的生产方法主要有三种：(1)利用化学拆分剂将dl-酒石酸拆分为l(+)-酒石酸和d(-)-酒石酸的化学拆分法。如lola等(chinesejchemeng2002,10(2):244-248)以l(-)-a-甲苄基胺(l(-)-a-methylbenzylamine)为拆分剂实现了将dl-酒石酸分离制得l(+)-酒石酸和d(-)-酒石酸。不过这类手性拆分剂往往价格昂贵，一次拆分后对映体的光学纯度和得率均较低，且后续分离纯化工艺复杂，导致其生产成本居高不下；(2)利用特殊微生物将dl-酒石酸中的l(+)-酒石酸耗竭而得到d(-)-酒石酸的生物拆分法。如日本未经审查的专利申请(jp申请号24490,1975)报道的利用气杆菌(aerobactersp.)，sato等(uspatent4904589,1990；ep0311835b1,1993)利用假单胞菌(pseudomonassp.)、隐球菌(cryptococcussp.)、丝孢酵母(trichosporonsp.)和克雷伯氏菌(klebsiellasp.)，jp-63245693(1988)利用假单胞菌属的菌种等微生物对dl-酒石酸中的l(+)-酒石酸进行选择性同化。不过该方法的原理决定了从原料dl-酒石酸到产物d(-)-酒石酸的理论得率最高只有50%，从而使该方法的制备成本较高；(3)利用微生物所分泌表达的环氧化物水解酶将顺式环氧琥珀酸或其盐催化水解为d(-)-酒石酸或其盐的生物转化法。如yamagishi等(jp-08245497,1996;annnyacadsci1996,799:784-785)利用恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)mci3037，asai等(jp-2000-295992,2000)利用产碱杆菌(alcaligenessp.)mci3611，pan等(zl200810074166.2)利用博德特氏菌(bordetellasp.)bk52将顺式环氧琥珀酸转化为d(-)-酒石酸。生物转化法生产d(-)-酒石酸具有酶立体专一性好、酶促反应快、产品光学纯度和产品得率高、产品分离纯化简单易行等特点，不仅克服了前述两种方法存在的缺陷，且大幅降低了生产成本，因此采用该类环氧化物水解酶的生物转化法制备d(-)-酒石酸将成为d(-)-酒石酸生产技术的发展方向。目前产碱杆菌(alcaligenessp.)和博德特氏菌属(bordetellasp.)的环氧化物水解酶基因序列均已报道。然而已报道的环氧化物水解酶的热稳定性差，当温度超过50℃时，酶活开始骤降(jmicrobiolbiotechnol2010,20(4):659-665)。在工业生产中，酶转化的温度会达到55-60℃，这极大限制了生物催化剂的使用寿命。此外，该酶的催化活力低，最大反应速率为94.34μm/min/mg(jmicrobiolbiotechnol2010,20(4):659-665)，而产l(+)-酒石酸的环氧化物水解酶的最大反应速率（2.24mm/min/mg）是该酶的23倍（applmicrobiolbiotechnol,2007,74:99-106），这极大限制了生物催化剂的使用效率。因此，如何提高酶的温度稳定性和活性，是目前利用生物转化法生产d(-)-酒石酸急需解决的一个问题。

随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性/半理性设计的手段对酶分子进行人工进化和改造已成为当前酶工程领域研究的热点。其中易错pcr(error-pronepcr)、dna改组(dnashuffling)、半理性设计等已成为酶分子改造中常用的手段，大大加速了蛋白质的进化过程。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种环氧化物水解酶突变体及其应用的技术方案。

所述的一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于该环氧化物水解酶突变体是将seqidno.4所示的野生型环氧化物水解酶的氨基酸序列的第8位和/或第26位进行单位点突变或多位点突变获得的；所述单位点突变是将第8位的亮氨酸突变为异亮氨酸，或第26位的色氨酸突变为苯丙氨酸。

所述的一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于该环氧化物水解酶突变体为下列之一：

1）将seqidno.4所示的野生型环氧化物水解酶的氨基酸序列的第8位的亮氨酸突变为异亮氨酸，该环氧化物水解酶突变体的氨基酸序列如seqidno.1所示；

2）将seqidno.4所示的野生型环氧化物水解酶的氨基酸序列的第26位的色氨酸突变为苯丙氨酸，该环氧化物水解酶突变体的氨基酸序列如seqidno.2所示；

3）将seqidno.4所示的野生型环氧化物水解酶的氨基酸序列的第8位的亮氨酸突变为异亮氨酸，同时将seqidno.4所示的野生型环氧化物水解酶的氨基酸序列的第26位的色氨酸突变为苯丙氨酸，该环氧化物水解酶突变体的氨基酸序列如seqidno.3所示。

所述的一种编码所述环氧化物水解酶突变体的基因。

所述的一种含有所述编码基因的重组载体。

所述的一种含有所述重组载体的宿主细胞。

所述的环氧化物水解酶突变体在制备d(-)-酒石酸或其盐中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

1.通过易错pcr、定点突变技术，得到一些环氧化物水解酶突变体，其氨基酸序列如seqidno.1或seqidno.2或seqidno.3所示，由seqidno.5或seqidno.6或seqidno.7所示的核苷酸序列编码。

2.通过基因工程技术，得到了一种新的重组载体，其含有核苷酸序列如seqidno.5或seqidno.6或seqidno.7所示的dna分子。

3.通过基因工程技术，得到了一种新的宿主细胞，其含有重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列如seqidno.5或seqidno.6或seqidno.7所示的dna分子，该宿主细胞可表达突变型环氧化物水解酶。

4.本发明将seqidno.4所示的野生型环氧化物水解酶第8位的亮氨酸突变为异亮氨酸或/和第26位的色氨酸突变为苯丙氨酸，大大提高了酶的活性和热稳定性。

5.通过基因工程技术，得到了一些表达本发明突变型环氧化物水解酶的基因工程菌，利用该基因工程菌生产d(-)-酒石酸，大大提高了细胞的活性和使用寿命，符合目前工业应用的要求。

附图说明

图1野生型与突变型环氧化物水解酶纯化的sds-page图。m表示蛋白分子量标准，从上至下依次为116kda、66.2kda、45kda、35kda、25kda、18.4kda、14.4kda；1号泳道为野生型环氧化物水解酶；2号泳道为单突变体蛋白l8i；3号泳道为单突变体蛋白为w26f；4号泳道为双突变体蛋白l8i/w26f。

图2温度对野生型与突变型环氧化物水解酶活性的影响。

图3野生型与突变型环氧化物水解酶热稳定性结果。

具体实施方式

在本发明的以下实施例中，有关的检测方法如下：

（1）酶活测定方法：将0.9ml1mol/l的顺式环氧琥珀酸钠底物(ph8.0)于37℃保温10min后，加入0.1ml酶液并在37℃反应20min，测定反应液中酒石酸的含量。在上述反应条件下，每分钟产生1µmol酒石酸定义为一个酶活单位，以u表示。在上述条件下，每毫克蛋白所含的酶活单位数定义为比活力，用u/mg表示。

（2）酒石酸含量的检测方法：采用偏钒酸铵显色法（工业微生物1983,13:32-37）。

（3）蛋白浓度的测定方法：用改良型bradford蛋白浓度测定试剂盒测定（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

（4）对映体过量值的测定方法：取0.1ml环氧化物水解酶液加入0.9ml1mol/l的顺式环氧琥珀酸钠(ph8.0)中，37℃反应4h，用蒸馏水将反应液适当稀释后，用高压液相色谱(agilent1200)检测，并计算d(-)-酒石酸的对映体过量值，其具体检测条件为：手性柱astecclc(150×4.6mm)；进样量20µl；柱温30℃；流动相3mmcuso4(ph3.2)；流速1ml/min；检测波长254nm。

以下结合实施例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。

实施例1：环氧化物水解酶基因的合成及基因工程菌的构建

根据产碱杆菌环氧化物水解酶的编码基因（genbank登录号e50984），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成该基因序列，其核苷酸序列如seqidno.8所示，并在蛋白n端加6个组氨酸标签，利用ndei和bamhi限制性内切酶位点，将其插入pet22b载体中，并转化大肠杆菌bl21(de3)。继而从生工生物工程（上海）股份有限公司获得含产碱杆菌环氧化物水解酶的基因工程菌。

实施例2：易错pcr（error-pronepcr）方法构建环氧化物水解酶随机突变文库

（1）利用genemorphiirandommutagenesiskit（购自agilent，codeno.200550）对上述环氧化物水解酶基因进行随机突变。所用引物为t7和t7t，其核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示。反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共25个循环，pcr结束跑1%琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒（购自sangon，codeno.b518131）回收基因片段。

（2）将回收片段用ndei和bamhi双酶切消化后，与经过相同酶切的pet22b(+)载体（氨苄青霉素抗性）进行连接反应，反应条件为：载体和片段按照1:3的比例混合，加入1μl的t4连接酶（购自thermo，codeno.el0014），16℃连接过夜。

（3）将上述连接片段转化大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞，涂布到氨苄（浓度为50μg/ml）抗性的lb固体平板（10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l酵母提取物，15g/l琼脂，ph7.0），37℃倒置培养16h，得到突变体库。

（4）将上述平板上的突变菌株单菌落逐一转接到含有50μg/ml氨苄青霉素的150μllb培养液（10g/l胰蛋白胨，10g/l氯化钠，5g/l酵母提取物，ph7.0）的96孔板中，在孔板振荡仪37℃振荡培养4h后加入终浓度为1mm的异丙基硫代－β－d－半乳糖苷，然后振荡培养12h，获得突变体表达库。

（5）从突变体表达库中取50μl菌液于另一块新的96孔板中，分别加入49μl1m的顺式环氧琥珀酸钠或顺式环氧琥珀酸钾溶液（ph8.0）和1μl1%脱氧胆酸钠，50℃振荡反应1h。然后在每个孔中加入25μl1%偏钒酸铵溶液、10μl1m硫酸、80μl水，然后在酶标仪中测定od480的值，以野生型环氧化物酶（氨基酸序列如seqidno.4所示）为对照，选出热稳定性好、酶活力高的突变株，并进行测序以确定突变位点。

由此筛选获得2个突变株，其中突变体l8i中第8位编码亮氨酸的密码子（ctt）突变为编码异亮氨酸的密码子（att），其核苷酸序列如seqidno.5所示。突变体w26f中第26位编码色氨酸的密码子（tgg）突变为苯丙氨酸的密码子（ttt），其核苷酸序列如seqidno.6所示。

实施例3：双突变体的制备

抽取实施例2中单突变体l8i菌株的质粒，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，然后再于该菌株中抽取质粒作为模板，设计定点突变引物w26f(+)和w26f(-)，其核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示，利用fasta-ii快速定点突变试剂盒（北京赛百盛基因技术有限公司）进行定点诱变，获得双突变体（l8i/w26f），并通过测序验证，其核苷酸序列如其核苷酸序列如seqidno.7所示。

实施例4：野生型和突变型环氧化物水解酶的表达和纯化

分别接种实施例1中的工程菌、实施例2中l8i、w26f单突变体和实施例3中的双突变体l8i/w26f菌株，至含50µg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，当菌体浓度（od600）达到0.4-0.6时，加入0.2mm异丙基硫代－β－d－半乳糖苷，37℃振荡培养12h。4℃，5000rpm离心10min收集菌体，生理盐水冲洗三次后，按每克菌体5ml的比例加入裂解缓冲液(50mmol/ltris-hcl，0.5mol/lnacl，ph8.0)，冰预超声破菌，4℃，8000rpm离心30min，取上清液，上样至ni-nta亲和柱（购于上海悦克生物科技有限公司），用洗杂缓冲液(50mmol/ltris-hcl，0.5mol/lnacl，20mmol/l咪唑，ph8.0)洗去杂质成份，用洗脱缓冲液(50mmol/ltris-hcl，0.5mol/lnacl，200mmol/l咪唑，ph8.0)洗脱目的蛋白，将收集的酶液于4℃，10mmol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液中充分透析，聚乙二醇浓缩后，加入甘油至终浓度50%，并于-20℃保存。通过12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropheresis，sds-page)检测纯化效果，如图1所示，1号泳道为野生型环氧化物水解酶，2号泳道为单突变体蛋白l8i，3号泳道为单突变体蛋白为w26f，4号泳道为双突变体蛋白l8i/w26f，说明纯化后四种蛋白的条带均单一，且与理论分子量一致。

实施例5：野生型和突变型环氧化物水解酶的活性和热稳定性分析

将实施例4中纯化得到的野生型环氧化物水解酶、单突变环氧化物水解酶l8i、单突变环氧化物水解酶w26f以及双突变型环氧化物水解酶l8i/w26f分别于30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，按照上述检测方法测定酶活。结果显示(参见图2)，在不同温度条件下，突变型环氧化物水解酶的比活力都显著高于野生型环氧化物水解酶，突变型环氧化物水解酶在35-55℃、优选为40-50℃有较高的活力，最适反应温度为50℃。50℃条件下，单突变环氧化物水解酶l8i、单突变环氧化物水解酶w26f以及双突变型环氧化物水解酶l8i/w26f的比活力分别为40.6u/mg、42.6u/mg、31.4u/mg，其活力分别是野生型环氧化物水解酶（20.3u/mg）的2倍、2.1倍和1.5倍。这说明环氧化物水解酶中第8位、第26位氨基酸以及两者的联合突变可显著提高野生型环氧化物水解酶的活性。

将实施例4中纯化得到的野生型环氧化物水解酶、单突变环氧化物水解酶l8i、单突变环氧化物水解酶w26f以及双突变型环氧化物水解酶（l8i/w26f）分别于50℃放置0、10、20、30、40、50、60、70、80min后，在37℃的条件下，按照上述检测方法测定野生型和突变型环氧化物水解酶的活性，并根据对照组计算残余活力。对照组为：这4种环氧化物水解酶不经50℃保温（即50℃放置0min），直接于37℃测活，对应的酶活定义为100%。结果显示（参见图3），野生型环氧化物水解酶在50℃保温40min后，残余活力为66.7%，之后残余活力迅速下降，50℃保温50min后，只剩16.7%的活力，50℃保温60min后，活力完全散失。然而突变型的环氧化物水解酶l8i、w26f、l8i/w26f，于50℃保温40min后，残余活力分别为83.8%、80.1%、77.3%，但是之后残余活力下降速度明显慢于野生型，50℃保温60min后，残余活力仍分别有48.2%、42.2%、35.3%。单突变型l8i、单突变型w26f、双突变型l8i/w26f环氧化物水解酶在50℃的半衰期（酶活降低至起始酶活一半时所需的时间）约分别为58.2min、53.2min、50min，较野生型环氧化物水解酶的半衰期（43.3min）分别增加34.4%、22.9%、15.5%，这说明，突变型环氧化物水解酶的温度稳定性比野生型环氧化物水解酶有显著提高。本发明所述的突变型环氧化物水解酶，具有如seqidno:1或seqidno:2或seqidno:3所示的氨基酸序列，它们是由含有seqidno:5或seqidno:6或seqidno:7的核苷酸序列的重组载体在宿主细胞中表达得到的；本发明的重组载体含有核苷酸序列如seqidno:5或seqidno:6或seqidno:7所示的dna分子；本发明的宿主细胞含有重组载体，所述重组载体含有主体核苷酸序列如seqidno:5或seqidno:6或seqidno:7所示的dna分子。

实施例6：野生型和突变型环氧化物水解酶的立体特异性分析

根据上述检测方法，测定实施例4中纯化得到的野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的对映体过量值(反映酶的立体特异性)。野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶l8i、w26f、l8i/w26f的对d(-)-酒石酸的对映体过量值分别为99.4%、99.5%、99.5%、99.4%。测定结果表明，野生型环氧化物水解酶和突变型环氧化物水解酶的立体特异性基本一致，第8位和/或第26位氨基酸突变后，没有改变环氧化物水解酶的立体特异性。

实施例7：利用本发明所述的野生型和突变型基因工程菌细胞制备d(-)-酒石酸或其盐

本发明生产d(-)-酒石酸或其盐的方法是：在顺式环氧琥珀酸或其盐溶液中，加入环氧化物水解酶（野生型和/或突变型）和/或基因工程菌（野生型和/或突变型）进行酶促反应，生成d(-)-酒石酸或其盐。本发明所涉及的顺式环氧琥珀酸盐为顺式环氧琥珀酸与各种阳离子形成的盐，阳离子包括但不仅限于铵离子、钾离子、钠离子和钙离子等。以下举例说明：

分别取1g经异丙基硫代-β-d-半乳糖苷诱导的野生型和3种突变型基因工程菌细胞l8i、w26f、l8i/w26f，于100ml1mol/l顺式环氧琥珀酸二钠溶液中，37℃振荡反应24h，加入cacl2水溶液，过滤并水洗沉淀，再经硫酸酸解、阴阳离子交换柱精制、浓缩、结晶和烘干，分别得到d(-)-酒石酸15.1g、15.3g、15.1g、15.2g。在转化过程中，我们通过酶活和半衰期来检测野生型基因工程菌和突变型基因工程菌的酶活性和热稳定性。野生型基因工程菌的酶活为32038u/g，突变型基因工程菌l8i、w26f、l8i/w26f的酶活分别为63875u/g、66081u/g、47129u/g。野生型基因工程菌的酶活半衰期为13h，突变型基因工程菌l8i、w26f、l8i/w26f的酶活半衰期分别为23h、21h、20h。这说明，这些突变型基因工程菌的酶活力和热稳定性比野生型基因工程菌有显著提高。本发明所述的突变型基因工程菌含有重组载体，所述重组载体含有主体核苷酸序列如seqidno:5或seqidno:6或seqidno:7所示的dna分子，该主体核苷酸序列编码如seqidno:1或seqidno:2或seqidno:3所示的蛋白，该蛋白具有环氧化物水解酶活性。

序列表

<110>浙江科技学院

<120>一种环氧化物水解酶突变体及其应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>294

<212>prt

<213>产碱杆菌(alcaligenessp.)

<400>1

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