美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因PdeMIXTA02及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及美洲黑杨(poplusdeltoides)杨絮起始发育的调控基因pdemixta02及其应用。

背景技术：

杨树(populusspp.)是世界上分布最广、适应性最强的树种。我国杨树栽培主要集中在华北、华中、东北和西北等地区。杨树不仅是重要的速生丰产用材林树种，而且是环境绿化的重要树种；由于其极快的生长速度和良好的细胞壁化学性质，也是第二代生物燃料生产的合适原料；其栖息地适应性强，还可广泛用于生态防护林、三北防护林、农林防护林。其自身的经济价值、生态价值和社会价值体现出的优越性，是其他树种无法具备和取代的。

杨树飘絮造成季节性环境污染的问题，成为当前制约杨树产业发展的重要因素。杨树在生殖特征上是雌雄异株，杨树雌株材质好，生长表现普遍优于雄株，因此选育推广的杨树优良无性系以雌株为主，然而雌株杨树的蒴果生长成熟后，果实开裂产生很多杨絮四处飞扬，而且飞絮持续的时间也很长，通常能达到半个月之久。杨絮的到处散播不仅会造成环境污染，还能让人呼吸道不畅，而且由于其易燃，很容易造成火灾。因此行道树禁止种植雌株杨树，选用雄株取代雌株，但杨树雄株在生长性状上普遍弱于雌株，成熟后会产生大量的花粉，同样会带来严重的环境污染。因此，如何既能发挥杨树强大的生态效益和较高的经济效益，同时又能控制杨树季节性飘絮污染，是当今社会亟待解决的问题。

近年来，对杨絮的形态研究取得了一定进展，杨絮是附着在种子端部，起辅助种子扩散作用的絮状纤维，纤维长度约9.5～15.9mm，直径约8～11μm，超过了种子的长度。石蜡切片发现卵巢基部的胎座为杨絮纤维发生的起源，并观察到纤维细胞凸起时细胞核扩大，并且发生了细胞核的复制，但是细胞没有发生分裂，表明其复制的周期绕过正常的有丝分裂，是维持杨絮纤维单细胞结构的潜在机制。在差异表达分析中发现纤维素合成和细胞壁生物合成相关的基因在这一生物过程中得到了丰富，这表明杨絮纤维结构的这一成分与来自种皮表皮细胞的棉纤维中发现的一致。扫描电镜观察发现，杨絮是由胎座表皮细胞在授粉后1天开始凸起发育而成，与棉絮在授粉后1天由胚珠表皮细胞凸起发育过程类似。因此，杨絮的起始发育调控的研究，可以借鉴棉絮的起始发育调控机制。目前，研究发现棉花的ghmml3基因沉默后，胚珠表皮细胞不再凸起发育，进而出现无絮表型；棉花的ghmml4沉默后，胚珠表皮细胞凸起数量极显著减少，出现极少絮的表型，两者均属于mixta基因家族成员。另外，在棉花无棉絮突变体中，棉花的10个mixta基因由6个基因家族成员表达量极显著降低，包括ghmml3，ghmml4，ghmml7，ghmml8，ghmml9，ghmml10。所以，根据mixta基因在棉絮起始发育的调控作用，推测杨树中的mixta基因同样对杨絮的起始发育起调控作用。

mixta基因属于r2r3-myb基因家族的第九亚类，最早在金鱼草(antirrhinummajus)突变体中发现，调控花瓣表皮中圆锥细胞形状的发育。在拟南芥中，该类基因家族成员包括atmyb16、atmyb17和atmyb106三个基因。mixta基因除了含有r2r3-myb结构域外，还包括一个motif是aqwesar**ae*rl*res。mixta在生物功能方面，首先调控花瓣的圆锥细胞的分化和毛状体的形成，例如金鱼草(antirrhinummajus)的ammixta、ammybml2、ammybml3和陆地棉(gossypiumhirsuta)的ghmybml10等；其次与叶片表皮毛的密度有关，例如拟南芥(arabidopsisthaliana)的atmyb16、玄参科猴面花(mimulusguttatus)的mgmybml8和鸽石斛(dendrobiumcrumenatum)的dcmybml1；最后还可以调控胚珠表皮细胞的分化，例如棉花(gossypiumhirsuta)的ghmyb25、ghmml3和ghmml4。综合mixta基因在不同的植物中的相关的功能报道，均与调控植物不同部位的表皮毛的分化有关，主要集中在胚珠、花瓣和叶片，综上所述，mixta类基因在不同的植物中的功能较为保守。杨絮是胎座的表皮细胞分化形成，与棉花的胚珠表皮分化形成纤维具有相似的生物学特征。因此，推断mixta基因在杨絮的起始发育过程中起关键调控作用。

随着杨树的大面积种植，杨絮对环境的污染和社会的危害也日益严重。但是目前杨絮产生的分子机制尚未得到很好的了解。因此，通过研究杨絮的起始发育调控机理，发掘调控其起始发育的关键基因，对于获得不飘絮的杨树新品种具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02。本发明所要解决的另一技术问题在于提供美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02在培育不飞絮杨树新品种中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述的美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02的表达蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

含有所述的美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02的载体、重组菌或宿主细胞。

进一步地，所述的美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02的载体为pcambia1301-pdemixta02。

所述的美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02在培育不飞絮杨树新品种中的应用。

进一步地，所述的美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02在培育不飞絮杨树新品种中的应用，包括以下步骤：

1)制备pdemixta02基因的反义载体、rnai载体或crispr载体；

2)利用杨树的遗传转化体系，对美洲黑杨中pdemixta02进行基因表达沉默或基因编辑，使pdemixta02基因功能丧失；

3)培育筛选pdemixta02基因失活的转基因材料，获得雌株不飞絮的转基因杨树新品种。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过扫描电镜确定杨絮的起始发育时间点为授粉后1天，由胎座表皮细胞起始发育而成，结合棉纤维起始发育的调控机理，推断出mixta基因为调控杨絮起始发育的候选基因。在美洲黑杨基因组中鉴定到八个mixta基因，通过基因序列进化分析，杨絮起始发育不同时期的表达模式分析和拟南芥中的遗传转化验证，确定pdemixta02基因是杨絮起始发育调控的关键基因。结果显示，基因序列进化分析时，该基因与调控棉絮起始发育基因处于同一进化分支；基因表达模式分析显示，该基因为杨絮起始发育时期特异表达，其他组织中均不表达；拟南芥的遗传转化表明，该基因的转基因材料的表皮毛数量极显著的高于野生型材料，表明该基因可以促进拟南芥表皮细胞凸起分化为表皮毛。综上，可以验证pdemixta02基因是调控美洲黑杨杨絮起始发育的关键基因，对该基因进行基因沉默或基因编辑等遗传操作，可以获得不飞絮的杨树新品种。

附图说明

图1为杨絮起始发育部位和起始时间点的扫描电镜图；结果显示，杨絮细胞起始于胎座表皮细胞，且在授粉后1天(1dpa)开始凸起，授粉后3-5天快速伸长(3dpa，5dpa)；

图2为mixta基因序列聚类进化分析结果图；结果显示，美洲黑杨pdemixta02基因与调控棉絮起始发育的ghmml3和ghmml4等基因聚在一个进化分支，该进化树中的基因均属于mixta基因，其中8个来自美洲黑杨(pde：populusdeltoides)，10个来自陆地棉(gh：gossypiumhirsutum)，3个来自拟南芥(at：arabidopsisthaliana)，7个来自玉米(zm：zeamays)，5个来自水稻(os：oryzasativ)，8个来自柳树(spu：salixpurpurea)，3个来自桉树(eg：eucalyptusgrandis)，11个来自烟草(nt：nicotianatabacuml)；

图3为pdemixta02基因的qpcr表达模式分析结果图；选取授粉前3天雌花序(-3dpa)，授粉当天雌花序(0dpa)，授粉后3天雌花序(3dpa)，授粉后5天雌花序(5dpa)，叶(leaf)，叶芽(bud)和树皮(bark)共7个不同组织进行基因表达模式分析，柱状图数字代表三次生物重复的平均值，误差线是三次生物学重复的标准误差结果；

图4为pdemixta02基因的克隆及过量表达载体构建结果图；图4a是以授粉后1天雌花序的cdna为模板，进行基因全长克隆的电泳凝胶图；图4b是构建的过表达载体酶切结果电泳凝胶图；图4c是构建过表达载体结构示意图；

图5为在拟南芥中转化杨树pdemixta02基因的功能验证结果图；其中图5a显示在土壤生长10天的拟南芥幼苗；图5b显示对5a拟南芥叶片进行分解，按生长先后顺序排列，灰色圆圈为表皮毛数量统计区域，直径3mm，bar＝1.5mm；图5c显示pdemixta02基因在拟南芥中过表达极显著提高了表皮毛的密度，bar＝0.5mm；图5d显示转基因拟南芥与wt的叶片在相同部位相同叶面积中的表皮毛数量统计结果，柱状图数值代表50株拟南芥第一片真叶相同区域表皮毛数目的平均值，误差线是标准误差，***代表与野生型拟南芥存在极显著差异(p<0.005)；图5e显示是pdemixta02基因不同转基因株系的半定量rt-pcr分析电泳凝胶图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1：

(1)杨絮起始发育部位和时间点确定

在南京林业大学校园内(北纬32°，西经118°)，选择生长时间超过15年以上的美洲黑杨主推品种南林895速生杨(nl895)雌株。

于2018年3月采集nl895杨树雌花在授粉后1天(1dpa)，授粉后3天(3dpa)和授粉后5天(5dpa)的雌花序小花，放置于faa固定液中，抽真空保存。把保存在固定液中的雌性小花进行纵向刨开，使用梯度酒精浓度脱水后，干燥处理，使用扫描电镜进行观察。结果显示，杨絮在1dpa时间点开始，由胎座的表皮细胞开始凸起，3dpa时间点以后杨絮细胞快速伸长(图1)。该生理过程与棉絮起始发育类似。目前，已知的研究结果显示，调控棉絮起始发育的基因主要是mixta类基因，包括ghmml3和ghmml4等。结合mixta基因在不同植物中的功能主要是调控不同组织部位的表皮毛的起始发育，其功能在植物间高度的保守性，推断mixta基因在杨絮的起始发育过程中起调控作用。

(2)mixta基因鉴定及序列进化分析

mixta类基因属于r2r3-myb的第九亚类基因，其序列特征即包含两个myb保守域单元，也包括aqwesar**ae*rl*res的motif序列。根据mixta序列特征，在美洲黑杨(populusdeltoides)中鉴定出8个mixta基因，同时还鉴定了以下物种中的mixta基因家族成员，分别包括棉花(gossypiumherbaceum)10个，拟南芥(arabidopsisthaliana)3个，玉米(zeamays)7个，水稻(oryzasativa)5个，柳树(salixpurpurea)8个，桉树(eucalyptusgrandis)3个，烟草(nicotianatabacuml)11个。总共55条蛋白序列，利用mega5.0软件，根据maximumlikelihoodtree方法构建进化树。结果显示pdemixta02基因与调控棉絮起始发育的关键基因聚在同一分支中(图2)。推测其可能对杨絮的起始发育起调控作用。

(3)pdemixta02基因在杨絮起始发育不同时间点的表达模式分析

于2018年春季，采集杨絮起始发育不同时间点的雌性花序，包括授粉前3天(-3dpa)，授粉当天(0dpa)，授粉后3天(3dpa)和授粉后5天(5dpa)共4个时间节点。另外，再选择叶片(leaf)、叶芽(bud)和树皮(bark)共3个营养器官作为对照。提取上述采集样品的rna进行cdna的反转录。设计pdemixta02基因的定量引物如下：

n00954f：5′-gtttgccggcgatcataacgc-3′；

n00954r：5′-gagaagcatcgaccagatcattgagtaagctat-3′。

以ptubq基因为内参基因，内参基因引物序列如下：

ptubqf：5′-gttgatttttgctgggaagc-3′；

ptubqr：5′-gatcttggccttcacgttgt-3′。

配置20μl反应体系，包括100ng的cdna、4pmol的上下游引物，10μlaceqqpcrsybrgreenmastermix，无菌超纯水补齐至20μl。

时实定量pcr实验程序：首先95℃变性3分钟，然后进行40个反应循环包括95℃变性15秒、60℃退火15秒、72℃延伸30秒。

基因的表达计算使用2-^δct方法，即δct＝ct目的基因-ct内参基因。利用t测验的方法分析pdemixta02基因在美洲黑杨不同组织中相对表达模式。结果显示，pdemixta02为授粉后5天内特异表达基因，不在其他组织中表达(图3)。该基因的特异表达时间节点与杨絮起始发育的时间节点完全吻合。结合前面序列分析结果，推断pdemixta02基因为杨絮起始发育调控基因。

(4)pdemixta02基因同源克隆及过量表达载体构建

根据在美洲黑杨基因组中鉴定的pdemixta02基因的全长序列设计引物mixta02f：5′-atggttaagtctcaatgctttgagaaggt-3′，mixta02r：5′-tcaaaatacagatgacccagttggagaagc-3′，以nl895授粉后3天花序的cdna为模板，同源克隆pdemixta02(图4a)，将目的片段连接到blunt载体进行测序，测得pdemixta02基因全长为1149bp，具体序列如seqidno.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

以pcambia1301载体为骨干载体，通过同源重组的方法，把pdemixta02基因全长重组到多克隆位点的kpni和xbai两个限制性内切酶之间，camv35s作为目的基因的启动子。使用kpni和xbai进行双酶切验证，获得清晰的酶切凝胶电泳条带(图4b)，证明载体构建完成，该载体命名为pcambia1301-pdemixta02(图4c)。

(5)pdemixta02基因转拟南芥进行功能验证

用于植物转化的哥伦比亚野生型拟南芥(col-0)来自实验室保存。将拟南芥种子在75％乙醇中表面灭菌30秒，然后在无菌水中洗涤3次，然后在10％naclo(v/v)中表面灭菌10分钟，然后再次用无菌水清洗6次，然后均匀播种在含有3％蔗糖和0.8％琼脂，ph为5.8的1/2ms培养基中。种子首先在黑暗中于4℃培养3天，以进行春化处理，然后将其移至生长室(22-23℃，16h光照/8h黑暗)中进行发芽，将生长约两周的拟南芥幼苗移植到营养钵中，营养土：黑土：珍珠岩：蛭石＝3：3：1：1，在相同条件下(22-23℃，16h光照/8h黑暗)生长。

把构建完成的过表达载体pcambia1301-pdemixta02转化到根癌农杆菌gv3101(pmp90)中。进行农杆菌的扩大培养，收集菌体后，用悬浮液(1/2ms+0.5％蔗糖)调整浓度到od＝0.8，用于拟南芥的转化实验。野生型拟南芥转化采用花器官浸染法。在野生型拟南芥的盛花期(生长4周左右)，用配置好的农杆菌悬浮液浸泡花序30s，在生长室暗培养24h，再恢复正常生长条件直至成熟后分株收获种子(t1)。使用含30mg/l潮霉素的ms培养基进行t1代转基因阳性植株筛选，筛选获得阳性植株移栽到土壤中，放置在生长室(22-23℃，16h光照/8h黑暗)中进行正常的管理。待幼苗在土壤中生长10天时(图5a)，在显微镜下观察第一片真叶指定1.5mm区域的表皮毛数量(图5b)。选择pdemixta02转基因拟南芥9#株系的第一片真叶，在指定区域内表皮毛数量与野生型相比明显增多(图5c)。为了验证该结果的真实可靠，选择pdemixta02转基因拟南芥的5个株系(1#，5#，9#，17#和23#)，其t2代各选择10株阳性植株，在第一片真叶的相同区域统计表皮毛数目。结果显示pdemixta02基因可以极显著提高拟南芥的表皮毛数目(图5d)。同时，对pdemixta02转基因拟南芥的1#，5#，9#，17#和23#五个阳性植株，在t2代采集第一片真叶进行半定量rt-pcr。结果显示，目的基因均能在阳性植株中高表达(图5e)。拟南芥的转化实验证实了pdemixta02基因具有促进表皮细胞分化为凸起细胞的潜能，进而证实了该基因对杨絮起始发育的调控作用。所以，可以利用遗传转化技术，把pdemixta02基因在杨树中敲除或沉默，用于培育不飘絮杨树新品种。

序列表

<110>南京林业大学

<120>美洲黑杨杨絮起始发育的调控基因pdemixta02及其应用

<130>20200211

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1149

<212>dna

<213>poplusdeltoides

<400>1

atggttaagtctcaatgctttgagaaggtgggactgaagaaagggccatggactcctgaa60

gaagaccagaagcttttggcttacgtcgaagagcatggccatggaagctggcaagccttg120

cctgccaaagctggacttcagagatgcgggaagagctgtagactcaggtggaccaactac180

cttcggccagatatcaagagaggaaagtttaatttgcaggaagaacaatcaatcattcag240

ctgcatgctcttcttggaaacaggtggtcagccattgctacacacttgccgaaaagaacc300

gataacgagatcaagaattactggaacacacatcttaagaaaagattagacaaaatgggc360

attgatcctgtgacccacaagccaaaagctgattctttcggctccggaagtggccattcc420

aagggttctgccaatttaagccacatggctcaatgggagagtgctcgactagaggccgaa480

gccagattggtccgtgagtcaaagttaagtgtacctaaccctcccaaaaaccttctaggc540

tttgcagtttcagctcaagtctccgacaaaggtagtgcagctccaacagaaagaccacgg600

tgtcttgatgtactcaaagcatggcaaggggtcgttttcagcatgttctcggttggcagc660

agtgactctctcgagtctccaacgtccactttgaatttctcagaaaatgcattagccatc720

ccactcattggagttcagaaaaatccaaccaccacactagcttttgccacaaataatgct780

acatgcaacagagggactacggccagtgagtttgataggggaaaccagttggagtgctgt840

gagaaactgaaagaaccagcacaagtgaaacggaatttggacagttcaatggcaattcat900

gatacaagcccgtttgccggcgatcataatgcgtggtttgttgactcttcagcgattgaa960

aacgcacctgtggggaatatcattgatggattttcggaaattttagtgtgtaattctctg1020

gaccacaacccgacctgttctggagagaatattaatgataactatgctggtaatcttgaa1080

gataattattggaatagcttactcaatgatctggtcgatgcctctccaactgggtcatct1140

gtattttga1149

<210>2

<211>382

<212>prt

<213>populusdeltoides

<400>2

metvallysserglncyspheglulysvalglyleulyslysglypro

151015

trpthrproglugluaspglnlysleuleualatyrvalglugluhis

202530

glyhisglysertrpglnalaleuproalalysalaglyleuglnarg

354045

cysglylyssercysargleuargtrpthrasntyrleuargproasp

505560

ilelysargglylyspheasnleuglnglugluglnserileilegln

65707580

leuhisalaleuleuglyasnargtrpseralailealathrhisleu

859095

prolysargthraspasngluilelysasntyrtrpasnthrhisleu

100105110

lyslysargleuasplysmetglyileaspprovalthrhislyspro

115120125

lysalaaspserpheglyserglyserglyhisserlysglyserala

130135140

asnleuserhismetalaglntrpgluseralaargleuglualaglu

145150155160

alaargleuvalarggluserlysleuservalproasnproprolys

165170175

asnleuleuglyphealavalseralaglnvalserasplysglyser

180185190

alaalaprothrgluargproargcysleuaspvalleulysalatrp

195200205

glnglyvalvalphesermetpheservalglyserseraspserleu

210215220

gluserprothrserthrleuasnphesergluasnalaleualaile

225230235240

proleuileglyvalglnlysasnprothrthrthrleualapheala

245250255

thrasnasnalathrcysasnargglythrthralaserglupheasp

260265270

argglyasnglnleuglucyscysglulysleulysgluproalagln

275280285

vallysargasnleuaspsersermetalailehisaspthrserpro

290295300

phealaglyasphisasnalatrpphevalaspserseralaileglu

305310315320

asnalaprovalglyasnileileaspglyphesergluileleuval

325330335

cysasnserleuasphisasnprothrcysserglygluasnileasn

340345350

aspasntyralaglyasnleugluaspasntyrtrpasnserleuleu

355360365

asnaspleuvalaspalaserprothrglyserservalphe

370375380