Rv0253蛋白在分离结核分枝杆菌中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体涉及rv0253蛋白在分离结核分枝杆菌中的应用。
背景技术：
：结核病是由细胞内细菌病原体结核分枝杆菌引起的慢性传染病。由于结核分枝杆菌其独特的致病特点及流行和传播方式，特别是近年来耐药结核分枝杆菌的产生以及与人类免疫缺陷症病毒(hiv)的交叉感染等原因导致结核病的流行再度呈现上升趋势。结核分枝杆菌是一种胞内感染菌，它是最成功的病原体之一，已经进化出适应宿主细胞和逃避免疫监视的各种策略。结核分枝杆菌经过呼吸道进入人体后，主要在巨噬细胞内寄生，并采用多种策略逃避宿主细胞的免疫杀伤作用，其可以在巨噬细胞内长期存活并缓慢增殖。当宿主免疫力低下时，休眠的结核分枝杆菌可以被重新活化，导致机体发展为活动性结核病。感染结核分枝杆菌后病原体能在宿主体内长期潜伏或造成持续性感染，为该疾病的治疗和预防造成了极大的障碍。此外，现阶段结核病的治疗难点还在于多重耐药性和广泛耐药性结核病。结核病新药的匮乏以及结核分枝杆菌相关基础研究的不足是耐药性结核病治愈率低下的主要原因。因此，迫切需要寻找新的药物靶点，开发新的抗结核病药物来治疗结结核病。结核蛋白rv0577、rv0236a、rv2462c和rv1576c是结核分枝杆菌的固有蛋白，通过检测待检标本中这些结核蛋白之中的任一蛋白即可鉴定病原菌-结核分枝杆菌的存在，因此可以借此来实现对结核感染或结核病的快速诊断。此外，已有转座子突变实验证实，rv1576c蛋白为结核分枝杆菌体外生长必需基因，编码rv1576c蛋白的基因被破坏时将导致体外h37rv的生长缺陷(dejesusma，gerricker，xuw，parksw，etal.comprehensiveessentialityanalysisofthemycobacteriumtuberculosisgenomeviasaturatingtransposonmutagenesis.mbio.2017jan17；8(1).pii:e02133-16.)。rv1576c蛋白可能被作为新的抗结核药物靶点来开发新的抗结核药物，用于治疗结核病。研究结核分枝杆菌自身蛋白之间的相互作用可以更深入的表征细菌在宿主体内存活和结核病发病的分子机制，也将有助于寻找到新的抗结核药物靶点。技术实现要素：本发明的目的是检测结核分枝杆菌。本发明首先保护rv0253蛋白在制备结核分枝杆菌分离试剂、结核分枝杆菌富集试剂、结核分枝杆菌检测试剂、结核疫苗和抗结核药物中至少一种的应用。上述应用中，所述结核分枝杆菌分离试剂、所述结核分枝杆菌富集试剂和所述结核分枝杆菌检测试剂均可通过rv0253蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现。所述结核分枝杆菌固有蛋白可为rv1576c蛋白、rv0577蛋白、rv0236a蛋白和rv2462c蛋白中的至少一种。本发明还保护编码rv0253蛋白的核酸分子在制备结核分枝杆菌分离试剂、结核分枝杆菌富集试剂、结核分枝杆菌检测试剂、结核疫苗和抗结核药物中至少一种的应用。rv0253蛋白或编码rv0253蛋白的核酸分子在分离结核分枝杆菌和/或富集结核分枝杆菌和/或检测结核分枝杆菌中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述“分离结核分枝杆菌和/或富集结核分枝杆菌和/或检测结核分枝杆菌”均可通过rv0253蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现；所述结核分枝杆菌固有蛋白可为rv1576c蛋白、rv0577蛋白、rv0236a蛋白和rv2462c蛋白中的至少一种。本发明还保护一种试剂，可包括b1)-b3)中的至少一种：b1)rv0253蛋白；b2)编码rv0253蛋白的核酸分子；b3)含有编码rv0253蛋白的核酸分子的重组菌；所述试剂用于结核分枝杆菌分离和/或结核分枝杆菌富集或结核分枝杆菌检测。所述试剂具体可由b1)-b3)中的至少一种组成；b1)rv0253蛋白；b2)编码rv0253蛋白的核酸分子；b3)含有编码rv0253蛋白的核酸分子的重组菌。本发明还保护一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法，通过rv0253蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现；所述结核分枝杆菌固有蛋白可为rv1576c蛋白、rv0577蛋白、rv0236a蛋白和rv2462c蛋白中的至少一种。本发明还保护一种检测待测样本是否存在结核分枝杆菌的方法，包括如下步骤：(1)取待测样本的总蛋白，采用rv0253蛋白进行分离和/或富集；(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：如果分离和/或富集的产物含有目标蛋白，则待测样本存在结核分枝杆菌；如果分离和/或富集的产物不含有所述目标蛋白，则待测样本不存在结核分枝杆菌；所述目标蛋白可为rv1576c蛋白、rv0577蛋白、rv0236a蛋白和rv2462c蛋白中的至少一种。上述任一所述rv0253蛋白可为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)seqidno：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a2)seqidno：8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a3)在seqidno：2或seqidno：8所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；a4)将seqidno：2或seqidno：8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与a1)所述蛋白质具有相同功能的蛋白质。上述任一所述编码rv0253蛋白的核酸分子可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的dna分子：c1)编码区是seqidno：1所示的dna分子；c2)核苷酸序列是seqidno：1所示的dna分子；c3)核苷酸序列是seqidno：7所示的dna分子；c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于结核分枝杆菌且编码上述任一所述rv0253蛋白的dna分子；c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，来源于结核分枝杆菌且编码上述任一所述rv0253蛋白的dna分子。上述任一所述rv0236a蛋白可为seqidno：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。上述任一所述rv0577蛋白可为seqidno：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。上述任一所述rv2462c蛋白可为seqidno：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。上述任一所述rv1576c蛋白可为seqidno：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的发明人基于结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验筛选和鉴定与rv0253蛋白互作的结核蛋白。结果表明，rv0253蛋白可与rv1576c蛋白、rv0577蛋白、rv0236a蛋白和rv2462c蛋白中的任一个结合，即rv0253蛋白可与rv1576c蛋白、rv0577蛋白、rv0236a蛋白和rv2462c蛋白中的任一个蛋白发生相互作用，可以结合或捕获其中的任一个蛋白。rv1576c蛋白、rv0577蛋白、rv0236a蛋白和rv2462c蛋白均为结核分枝杆菌固有蛋白。因此，rv0253蛋白可以分离结核分枝杆菌和/或富集结核分枝杆菌和/或检测结核分枝杆菌。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为重组蛋白rv0253样本的蛋白浓度的检测结果。图2为芯片实验的流程示意图。图3为部分芯片的扫描结果。图4为rv0577蛋白、rv0236a蛋白、rv2462c蛋白和rv1576c蛋白的扫描结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pet32a载体为默克密理博novagen的产品，产品目录号为69030。实施例1、重组蛋白rv0253的表达和纯化一、重组质粒pet32a-rv0253的构建rv0253蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。编码rv0253蛋白的基因(即rv0253基因)的核苷酸序列如seqidno：1所示。将pet32a载体的限制性内切酶ecorⅰ和xhoⅰ之间的dna小片段替换为seqidno：1所示的dna分子，得到重组质粒pet32a-rv0253。重组质粒pet32a-rv0253中，seqidno：1所示的dna分子与载体骨架上的his-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成seqidno：7所示的融合基因，表达seqidno：8所示的具有his-tag标签的融合蛋白，即重组蛋白rv0253。二、重组蛋白rv0253的表达1、将重组质粒pet32a-rv0253导入大肠杆菌bl21，得到重组菌，将该重组菌命名为bl21/pet32a-rv0253。2、将bl21/pet32a-rv0253单克隆接种至5mllb液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，得到培养菌液1。3、将1-2μl培养菌液1接种至10mllb液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，得到培养菌液2。4、取培养菌液2，按体积比为1:50接种至500mllb液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至od600nm值为0.6～0.8；然后加入iptg并使其在体系中的浓度为0.5mm，37℃、200rpm振荡培养至od600nm值为1.5左右，4℃、6000rpm离心5min，收集沉淀(即菌体)。三、重组蛋白rv0253的纯化1、取步骤二中4收集的沉淀，用ph8.0、10mm的tris-hcl缓冲液重悬(每300ml培养体系收集的沉淀加入20-30mlph8.0、10mm的tris-hcl缓冲液)，得到重悬液。2、取步骤1得到的重悬液，超声破碎(超声波功率500w，循环程序为：破碎10s，停15s，共60次)，然后4℃、10000rpm离心10min，收集沉淀。3、取步骤2收集的沉淀，用20-30mlph8.0、10mm的tris-hcl缓冲液重悬，静置10min，然后12000rpm离心10min，收集沉淀1。4、取步骤3收集的沉淀1，用20-30mlph8.0、10mm的tris-hcl缓冲液重悬，静置10min，然后12000rpm离心10min，收集沉淀2。5、取步骤4收集的沉淀2，先用少量的ph8.0、10mm的tris-hcl缓冲液重悬，再用5-10ml含8m尿素的ph8.0、10mm的tris-hcl缓冲液溶解蛋白。6、完成步骤5后，12000rpm离心10min，收集上清液。该上清液即为重组蛋白rv0253溶液。实施例2、基于mtb结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验筛选和鉴定与rv0253蛋白互作的结核蛋白结核分枝杆菌蛋白质组芯片为广州博翀生物科技有限公司的产品。结核分枝杆菌蛋白质组芯片包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白质。在下文中，结核分枝杆菌蛋白质组芯片简称芯片。实验重复三次，每次重复的步骤如下：1、通过sds-page初步检测重组蛋白rv0253溶液的蛋白浓度和纯度(1)取实施例1步骤三中6制备的重组蛋白rv0253溶液，离心，然后进行sds-page。(2)取不同浓度的bsa标准品溶液，进行sds-page(上样体积与步骤(1)中重组蛋白rv0253溶液的上样体积相同)。结果表明，重组蛋白rv0253溶液的蛋白浓度约为30ng/μl(通过灰度值大致估算)，纯度大于90％。2、蛋白标记及标记效率检测(1)取实施例1步骤三中6制备的重组蛋白rv0253溶液，透析脱盐。(2)完成步骤(1)后，标记荧光cy3(cydyeproteinlabellingcy3mono5-pack，ge，pa23001)。(3)完成步骤(2)后，透析(目的为去除游离的甘氨酸等成分)，得到重组蛋白rv0253样本。(4)完成步骤(3)后，分别将梯度稀释的重组蛋白rv0253样本、cy3-bsa(作为阳性对照)和bsa(作为阴性对照)在nc膜上点样，通过dotblot定性评价荧光标记效率。结果表明，重组蛋白rv0253样本的灵敏度小于1ng。由此可见，蛋白标记效率较好。3、检测重组蛋白rv0253样本的蛋白浓度(1)取重组蛋白rv0253样本，进行sds-page。(2)取不同浓度的bsa标准品溶液，进行sds-page(上样体积与步骤(1)中重组蛋白rv0253样本的上样体积相同)。检测结果见图1(m为蛋白marker，rv0253为重组蛋白rv0253样本)。结果表明，重组蛋白rv0253样本的蛋白浓度约为30ng/μl(通过灰度值大致估算)。4、芯片实验封闭液由3ml10％(m/v)bsa水溶液和7ml1×pbs缓冲液混合而成。孵育液由1ml10％(m/v)bsa水溶液和9ml1×pbst缓冲液混合而成。清洗液为1×pbst缓冲液。芯片实验的流程示意图见图2。(1)取孵育盒，加入5ml封闭液；之后将芯片从-80℃取出，正面朝上置于孵育盒(芯片完全浸入封闭液)；再横向置于侧摆摇床，4℃、50-60rpm封闭3h。(2)完成步骤(1)后，弃封闭液，迅速加入3ml含重组蛋白rv0253的孵育液，置于侧摆摇床，4℃、20-30rpm孵育过夜。含重组蛋白rv0253的孵育液为将重组蛋白rv0253样本溶解于孵育液获得。含重组蛋白rv0253的孵育液中，重组蛋白rv0253的蛋白浓度为4μg/ml。(3)完成步骤(2)后，将所述芯片避光清洗4次，每次清洗的步骤为：将芯片置于装有清洗液的芯片清洗盒，置于水平摇床，60-70rpm振荡5min。(4)完成步骤(3)后，将所述芯片用ddh2o避光清洗2次，每次5min。(5)完成步骤(4)后，将所述芯片置于芯片干燥机，离心干燥。(6)完成步骤(5)后，用innoscan900芯片扫描仪在532nm激发的波长下进行芯片扫描(cy3在532nm激发光下显示为红光)，保存扫描图片，获得芯片数据。部分扫描结果见图3。(7)完成步骤(6)后，对所述芯片数据进行如下分析：(7-1)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，通过背景归一化方法进行处理。实现方式为每个蛋白的前景值(即f532median)与背景值(即b532median)比值，即f/b，并此基础上定义snr(信噪比)，即两个重复蛋白的f/b的均值。(7-2)对于不同芯片，为消除样本及实验操作带来的系统性误差，故在数据比对前对snr进行z-score标准化处理。(7-3)对归一化后数据，设置阳性cutoff阈值，通过阈值分别计算芯片上的阳性点个数；定义cutoff＝2，即归一化后mean+2sd(此值是根据芯片结果设定，非标准值)。在此标准下，筛选潜在的阳性蛋白。重要的参数解释如下：block、column和row依次指阵列、列和行的编号，即位置。name和id依次指蛋白质名称和基因名称。f532median：532nm通道下的信号前景值的中位数值，指每个信号点对应所有的像素点的强度中位值，用以表示信号强度。b532median：532nm通道下的背景值的中位数值，指每个信号点周围背景一定范围内的像素点的强度中位值，用以表示背景值。部分结果见图4和表1。结果表明，阳性蛋白为4个，分别为rv0577蛋白、rv0236a蛋白、rv2462c蛋白和rv1576c蛋白。表1snrrv0577蛋白5.97rv0236a蛋白3.35rv2462c蛋白3.12rv1576c蛋白2.72上述结果表明，重组蛋白rv0253可以与rv0577蛋白、rv0236a蛋白、rv2462c蛋白和rv1576c蛋白中的任一个结合，即重组蛋白rv0253可与rv0577蛋白、rv0236a蛋白、rv2462c蛋白和rv1576c蛋白中的任一个蛋白发生相互作用，可以结合或捕获其中的任一个蛋白。<110>首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所<120>rv0253蛋白在分离结核分枝杆菌中的应用<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>357<212>dna<213>artificialsequence<400>1gtgacgcttctcaacgacattcaggtatggaccaccgcctgcgcatacgaccatctcatt60ccgggacgtggtgtcggggtgttactcgatgacggtagtcaggtggcactgttccggctc120gacgacggctcggtgcacgcggtcggtaacgtcgacccgttctccggtgctgcggtgatg180tcccgcggcatcgtcggtgatcgcggaggtcgcgccatggtgcaatcgccgatcctgaag240caggctttcgcgctcgacgatggctcgtgcctcgacgatccgcgcgtttcggtgccggtg300tatccggcgcgcgtcacacccgaaggccgcattcaggtcgcgcgggtagcggtctag357<210>2<211>118<212>prt<213>artificialsequence<400>2valthrleuleuasnaspileglnvaltrpthrthralacysalatyr151015asphisleuileproglyargglyvalglyvalleuleuaspaspgly202530serglnvalalaleupheargleuaspaspglyservalhisalaval354045glyasnvalasppropheserglyalaalavalmetserargglyile505560valglyaspargglyglyargalametvalglnserproileleulys65707580glnalaphealaleuaspaspglysercysleuaspaspproargval859095servalprovaltyrproalaargvalthrprogluglyargilegln100105110valalaargvalalaval115<210>3<211>57<212>prt<213>artificialsequence<400>3metasnargilevalalaproalaalaalaservalvalvalglyleu151015leuleuglyalaalaalailepheglyvalthrleumetvalglngln202530asplyslysproproleuproglyglyaspproserserservalleu354045asnargvalglutyrglyasnargser5055<210>4<211>261<212>prt<213>artificialsequence<400>4metprolysargserglutyrargglnglythrproasntrpvalasp151015leuglnthrthraspglnseralaalalyslysphetyrthrserleu202530pheglytrpglytyraspaspasnprovalproglyglyglyglyval354045tyrsermetalathrleuasnglyglualavalalaalailealapro505560metproproglyalaprogluglymetproproiletrpasnthrtyr65707580ilealavalaspaspvalaspalavalvalasplysvalvalprogly859095glyglyglnvalmetmetproalapheaspileglyaspalaglyarg100105110metserpheilethraspprothrglyalaalavalglyleutrpgln115120125alaasnarghisileglyalathrleuvalasngluthrglythrleu130135140iletrpasngluleuleuthrasplysproaspleualaleualaphe145150155160tyrglualavalvalglyleuthrhissersermetgluilealaala165170175glyglnasntyrargvalleulysalaglyaspalagluvalglygly180185190cysmetgluproprometproglyvalproasnhistrphisvaltyr195200205phealavalaspaspalaaspalathralaalalysalaalaalaala210215220glyglyglnvalilealagluproalaaspileproservalglyarg225230235240phealavalleuseraspproglnglyalailepheservalleulys245250255proalaproglngln260<210>5<211>466<212>prt<213>artificialsequence<400>5vallysserthrvalgluglnleuserprothrargvalargileasn151015valgluvalprophealagluleugluproasppheglnargalatyr202530lysgluleualalysglnvalargleuproglypheargproglylys354045alaproalalysleuleuglualaargileglyargglualametleu505560aspglnilevalasnaspalaleuproserargtyrglyglnalaval65707580alagluseraspvalglnproleuglyargproasnilegluvalthr859095lyslysglutyrglyglnaspleuglnphethralagluvalaspile100105110argprolysileserproproaspleuseralaleuthrvalserval115120125aspproilegluileglygluaspaspvalaspalagluleuglnser130135140leuargthrargpheglythrleuthralavalaspargprovalala145150155160valglyaspvalvalserileaspleuseralathrvalaspglyglu165170175aspileproasnalaalaalagluglyleuserhisgluvalglyser180185190glyargleuilealaglyleuaspaspalavalvalglyleuserala195200205aspgluserargvalphethralalysleualaalaglygluhisala210215220glyglnglualaglnvalthrvalthrvalargservallysgluarg225230235240gluleuprogluproaspaspgluphealaglnleualasergluphe245250255aspserileaspgluleuargalaserleuseraspglnvalarggln260265270alalysargalaglnglnalagluglnileargasnalathrileasp275280285alaleuleugluglnvalaspvalproleuproglusertyrvalgln290295300alaglnpheaspservalleuhisseralaleuserglyleuasnhis305310315320aspglualaargpheasngluleuleuvalgluglnglyserserarg325330335alaalapheaspalaglualaargthralaserglulysaspvallys340345350argglnleuleuleuaspalaleualaaspgluleuglnvalglnval355360365glyglnaspaspleuthrgluargle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