一种原核表达载体及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种原核表达载体及其构建方法和应用。

背景技术：

猪瘟(csf)是由猪瘟病毒(csfv)引起的一种猪的高度接触性传染病，除北美洲和大洋洲外几乎遍及全世界，是危害养猪业安全的重要疫病之一。c蛋白是csfv编码的第一个结构蛋白，构成病毒的核衣壳，在病毒的增殖过程中发挥重要作用。研究发现，c蛋白上存在的抗原表位对t、b淋巴细胞介导的免疫反应有重要作用，但不能诱导机体产生中和性抗体。己经证实与csfv同科的牛病毒性腹泻病毒(bvdv)的c蛋白具有免疫原性，丙型肝炎病毒的c蛋白已经被用于临床感染治疗和疫苗研发。由此推测csfv的c蛋白可能具有与之相似的免疫学特性和功能。因此，c蛋白在基础研究与临床应用上具有重要价值。猪瘟病毒c蛋白抗体是进行csfv研究的重要材料，且市场上很难买到好用的c蛋白抗体，所以自制c蛋白抗体非常必要，而c蛋白的原核表达为c蛋白抗体的制备奠定了重要的材料基础。

因此，提供一种原核表达载体及其构建方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种原核表达载体及其构建方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种原核表达载体，是由pet-32a改造获得的仅含单一his标签的原核表达载体。所述原核表达载体为pet-32a-gai，它是双链环状dna，长度约为5.4kb；是表达his标签的诱导型原核表达载体。

进一步，一种原核表达载体，是诱导带his标签的小分子蛋白表达的载体；其仅含一个his标签，免于所表达的蛋白因标签太大而结构被标签覆盖。

进一步，一种原核表达载体的构建方法，通过双酶切将大标签切掉，连接形成仅含his标签的原核表达载体，具体步骤如下：

(1)以pet-32a为原始载体，利用xhoⅰ(ctcgag)、xbaⅰ(tctaga)双酶切pet-32a原核表达载体；

(2)合成两条含rbs序列(aaggag)及分别含有bamhⅰ(ggatcc)、ecorⅰ(gaattc)的酶切位点的单链，退火形成带缺口的双链；

所述两条单链序列分别为：

a：5’-ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggatccgcggaattcc-3’；seqidno.1；

b：5’-tcgaggaattccgcggatcccatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattattt-3’；seqidno.2；

(3)将步骤(2)合成的双链与步骤(1)双酶切的pet-32a原核表达载体连接，经转化、培养、测序，获得仅含单一his标签的原核表达载体pet-32a-gai。

进一步，步骤(2)将两条单链序列95℃-60℃依次梯度退火，每个梯度5℃，每个梯度退火5min，形成一条有缺口的双链。

进一步，步骤(3)所述连接为使用t4连接酶过夜连接。

进一步，步骤(3)所述转化为用cacl2法转入大肠杆菌dh5α感受态细胞。

进一步，所述的原核表达载体在表达外源小分子蛋白中的应用。

进一步，所述外源小分子蛋白为猪瘟病毒石门株衣壳蛋白c。

进一步，一种表达猪瘟病毒石门株衣壳蛋白c的方法，利用上述的原核表达载体进行诱导表达，具体步骤如下：

(1)pcr扩增c蛋白的基因片段；

(2)将获得的基因片段与pet-32a-gai原核表达载体连接，获得pet-32a-gai-c原核表达载体；

(3)将pet-32a-gai-c导入宿主细胞，iptg诱导表达得到带his标签的c蛋白。

pet-32a-gai-c为双链环状dna，长度约为5.7kb。

进一步，所述宿主细胞为大肠杆菌。

进一步，所述大肠杆菌为bl21。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种原核表达载体及其构建方法和应用，本发明以pet-32a为原始载体，在其基础上进行改造；双酶切pet-32a原核表达载体，并合成两条含rbs序列及分别含有bamhⅰ、ecorⅰ的酶切位点的单链，退火形成带缺口的双链，进而连入双酶切的pet-32a原核表达载体，形成仅含单一his标签的原核表达载体pet-32a-gai。pcr扩增c蛋白的基因序列，将其连入pet-32a-gai原核表达载体形成pet-32a-gai-c原核表达载体。利用本发明方法获得的菌体干重约为25mg/ml，诱导表达的总可溶性蛋白含量约为10mg/ml，表达的可溶性c蛋白占总可溶性蛋白的5％。本发明的原核表达载体将在外源小分子蛋白(特别是猪瘟病毒石门株衣壳蛋白c)表达的生产中发挥重要作用。采用本发明的原核表达载体表达的外源小分子蛋白，可免于所表达的蛋白因标签太大而导致外源蛋白的结构被标签覆盖。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明pet-32a-gai及pet-32a-gai-c在bl21中表达的上清；

其中，m.pageruler^tmprestainedproteinladder；1.未诱导的bl21(pet-32a-gai)上清；2.经诱导的bl21(pet-32a-gai)上清；3.未诱导的bl21(pet-32a-gai-c)上清；4.经诱导的bl21(pet-32a-gai-c)上清。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中所述方法如无特殊说明均为常用方法，所用产品如无特殊说明均为takara公司产品。

实施例1原核表达载体pet-32a-gai的构建

原核表达载体pet-32a-gai的构建方法，具体步骤如下：

(1)以pet-32a为原始载体，利用xhoⅰ、xbaⅰ双酶切pet-32a原核表达载体；将载体xhoⅰ、xbaⅰ之间的基因序列全部切除；

(2)根据载体设计两条基因序列，由华大基因公司合成，合成两条含rbs序列(aaggag)及分别含有bamhⅰ、ecorⅰ的酶切位点的单链，将两条序列95℃-60℃依次梯度退火，每个梯度5℃，每个梯度退火5min，使两条单链形成一条有缺口的双链；

所述两条单链序列分别为：

a：5’-ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggatccgcggaattcc-3’；seqidno.1；

b：5’-tcgaggaattccgcggatcccatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattattt-3’；seqidno.2；

(3)将步骤(2)合成的双链与步骤(1)双酶切的pet-32a原核表达载体经t4连接酶4℃过夜连接，将连接产物用cacl2法转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，在100μg/ml氨苄抗性的lb平板上培养16h；挑取大小均一合适的单菌落，提取质粒；测定质粒浓度后进行双酶切鉴定，将阳性质粒送华大基因公司测序；测序鉴定正确的质粒命名为pet-32a-gai。

实施例2c蛋白基因的克隆

根据csfv石门株全基因序列中c基因的编码区序列设计一对引物p1、p2，引物两端分别设有bamhⅰ(ggatcc)、xhoⅰ(ctcgag)酶切位点，可扩增出csfv石门株c蛋白基因(878-1174，共297bp)的基因片段。

所述猪瘟病毒石门株c蛋白的基因序列如下：

tctgatgatggcgcaagtggaagtaaagagaagaagccagataggatcaacaagggtaaattaaaaatagccccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaagccacccgacgctacgattgtagtggaaggagtaaaataccaggtcaaaaagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgtaccacaacaagaataaaccaccagaatctaggaagaaattagaaaaagccctattggcatgggcggtaataacaattatgttgtatcaaccagttgaagcc；seqidno.3。

引物序列分别为：

p1：5’-cgggatcctctgatgatggcgca-3’；seqidno.4；

p2：5’-ccgctcgagggcttcaactggttg-3’；seqidno.5。

以猪瘟病毒石门株cdna为模板，pcr扩增c蛋白的基因序列；其中，pcr反应体系如下：2×tappcrmastermix(康为试剂)10μl；上下游引物各1μl；ddh2o8.5μl；cdna0.5μl。pcr反应条件如下：95℃10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；16℃2min。

用bamhⅰ、xhoⅰ双酶切c蛋白基因的胶回收产物与原核表达载体pet-32a-gai，将双酶切产物胶回收后，经t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物用cacl2法转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，在100μg/ml氨苄抗性的lb平板上培养16h，挑取大小均一合适的单菌落，提取质粒，测定质粒浓度后进行双酶切鉴定，将阳性质粒送华大基因公司测序，鉴定正确的克隆命名为pet-32a-gai-c。

实施例3c蛋白的表达

将重组的pet-32a-gai-c质粒转入bl21感受态细胞。挑选生长良好的单克隆菌落，接入lb培养基(含40～100μg/ml氨苄青霉素)，过夜培养的菌液以1/50的体积比稀释后，37℃剧烈振荡培养至od600＝0.4～0.6。加入适量iptg至终浓度1mmol/l，37℃振荡培养12h，离心收集沉淀。将收集的菌体破碎离心后收集上清，进行sds-page电泳，结果如图1所示，在图中泳道4，17kda处有一特异性的蛋白条带，为带his标签的c蛋白，表明基因工程菌能够成功表达融合蛋白。结果发现，利用本发明的方法获得的菌体干重约为25mg/ml，诱导表达的总可溶性蛋白含量约为10mg/ml，表达的可溶性衣壳蛋白c占总可溶性蛋白的5％。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种原核表达载体及其构建方法和应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>60

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggatccgcggaattcc60

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<211>60

<212>dna

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<400>2

tcgaggaattccgcggatcccatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattattt60

<210>3

<211>297

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

tctgatgatggcgcaagtggaagtaaagagaagaagccagataggatcaacaagggtaaa60

ttaaaaatagccccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaagccacccgacgctacg120

attgtagtggaaggagtaaaataccaggtcaaaaagaaaggtaaagttaaaggaaagaat180

acccaagacggcctgtaccacaacaagaataaaccaccagaatctaggaagaaattagaa240

aaagccctattggcatgggcggtaataacaattatgttgtatcaaccagttgaagcc297

<210>4

<211>23

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<400>4

cgggatcctctgatgatggcgca23

<210>5

<211>24

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<400>5

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