一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

多酚氧化酶(polyphenoloxidase,ppo)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。1938年，keilin和mann在蘑菇中首次分离纯化得到ppo，开启对该酶的研究。ppo是一类cu²⁺结合蛋白，由细胞核基因编码形成，主要定位在叶绿体的类囊体膜上，在细胞质和液泡(onoetal.,2006)、高尔基体(olmedoetal.,2018)、线粒体等细胞器上也有分布。根据催化底物的特异性和自身结构的不同，可以将ppo分为儿茶酚氧化酶(catecholoxidase,ec1.10.3.2)、酪氨酸酶(tyrosinase,ec1.14.18.1)和漆酶(laccase,ec1.10.3.1)，其中酪氨酸酶主要分布在动物中，漆酶主要分布在微生物中，而植物中的ppo以儿茶酚氧化酶为主。植物中的ppo利用氧通过两种不同的反应完成对酚类物质的催化作用，第一种是催化单酚类物质发生羟基化反应，形成双酚，第二种是催化双酚发生氧化反应，形成醌类物质。醌类物质的形成是响应植物衰老，机械损伤和病原菌侵染的结果(thipyapong,stout,&attajarusit,2007)

随分子生物学的发展，许多植物中的多酚氧化酶的基因已被克隆，从已经克隆的多酚氧化酶的基因看，均属于基因家族。在丹参中鉴定到了19条ppo基因(li,li,li,shao,&lu,2017)。马铃薯中包含7条ppo成员(goldman,seurinck,marins,goldman,&mariani,1998)，烟草中包含14条ppo成员。拟南芥基因组中没有和ppo相似的序列(tran,taylor,&constabel,2012)。这些ppo成员的表达具有时空差异和组织特异性，表明多酚氧化酶的基因在植物中所起的作用不同。如在烟草中，有两个ppo成员在雌蕊中高表达，表明其可能在烟草授粉和花粉管生长调控中发挥作用。ppo酶活性检测方法常用的有检压法和分光光度法。前者应用多酚氧化酶(ppo)可催化儿茶素等底物在有氧条件下的氧化还原反应，根据底物的氧化速率与单位酶浓度和单位时间内的耗氧量成正比这一原理，用瓦氏呼吸仪测定反应过程中的耗氧量求得ppo活性的大小，此方法设备简便，但操作复杂，误差较大。后者利用邻苯二酚和d-儿茶素在ppo催化下生成有色产物.其显色物质在460纳米处有最大吸收，吸收值在单位时间内的变化和单位酶活性成正比，计算ppo活性强度。操作方法简便，重现性好。

目前市面上并没有专门针对植物多酚氧化酶(polyphenoloxidase,ppo)的靶向抗体，因此，在蛋白层面上，对于该研究领域缺乏有效的抗体工具，快速灵敏的检测多酚氧化酶在蛋白水平的表达变化，用于其在植物抗病和生殖授粉中的功能研究。

技术实现要素：

本发明提供一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体及其应用，以通过提供一个靶向蛋白研究的工具，使得对烟草和其它植物不同组织，不同生理条件下ppo蛋白表达变化及蛋白网络图谱的更深层次研究得以实现。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体，所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含seqidno.2所示的cdr1的氨基酸序列gytftdyy，seqidno.4所示的cdr2的氨基酸序列inpyngdt和seqidno.6所示的cdr3的氨基酸序列aredysgssyvanfdy；所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含seqidno.9所示的cdr1的氨基酸序列ksllhsngity，seqidno.11所示的cdr2的氨基酸序列qms和seqidno.13所示的cdr3的氨基酸序列aqnlelwt。

进一步的；所述单克隆抗体的制备和纯化方法：

(1)抗原的制备

原核表达多酚氧化酶全蛋白作为免疫原，免疫原烟在草雌雄蕊总蛋白中提取；

(2)免疫小鼠

将抗原免疫6只balb/c小鼠，监测其血清效价以决定最优的免疫次数，初次免疫后会经过3-4次的加强；

(3)血清检测和筛选

免疫小鼠眼眶取血，并用elisa检测血清滴度；

(4)融合及筛选

取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤sp2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上进行培养，收集所有孔的上清，用elisa对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清用elisa检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合；

(5)亚克隆及筛选

进行亚克隆得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，elisa检测每个孔上清针对可溶片段检测原和相应多肽检测原的反应，取od值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；

(6)抗体上清制和纯化

获得单克隆细胞株，通过腹部注射到免疫小鼠用于抗体生产，产生的腹水用proteina/g纯化，并用于后续检测。

进一步的；所述单克隆抗体用于抗体与抗原多肽的elisa验证；

所述elisa验证：

(1)取待配对腹水抗体包被96孔elisa板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，pbs洗涤，4℃保存待用；

(2)抗原多肽孵育，pbs洗涤，同时设置对照；

(3)hrp标记检测抗体，加入到孵育有(1)中的elisa板中；

(4)tmb显色反应，酶标仪读数。

进一步的；所述单克隆抗体用于抗体的内源蛋白wb验证；

所述wb验证：使用不同烟草种雌雄蕊全蛋；白裂解液，抗体稀释浓度1：1000进行wb验证。

进一步的；所述单克隆抗体用于抗体芯片检测实验；

所述芯片检测实验：

(1)使用芯片点样仪将anti-ppo抗体及对照抗体点制于以nc膜为基质的玻璃片，形成直径为100um的抗体点；

(2)将烟草雌雄蕊全蛋白进行生物素标记，按2ug/ml的浓度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时；

(3)pbs轻柔清洗三遍，再用cy3-sa荧光二抗进行孵育，pbs清洗三遍，使用genepix荧光芯片扫描仪523nm扫描芯片。

进一步的；所述单克隆抗体用于测序。

进一步的；所述测序包括：

(1)将anti-ppo抗体的杂交瘤细胞株进行培养并提取总rna，将mrna反转录成第一链cdna；

(2)通过pcr扩增重链及轻链基因并将扩增基因克隆至测序载体，进行多个阳性克隆测序得到最终序列结果。

进一步的；所述单克隆抗体用于检测烟草不同组织多酚氧化酶蛋白表达和定位。

进一步的；所述单克隆抗体用于检测酚氧化酶蛋白的表达和定位方法：

(1)取烟草根、茎、叶、雌蕊、雄蕊和花粉管组织和细胞材料，4％多聚甲醛固定，常规石蜡切片处理；

(2)切片按免疫荧光步骤处理，分别孵抗本中的抗多酚氧化酶一抗和荧光二抗；

(3)荧光显微镜观察不同组织中多酚氧化酶的表达和定位。

进一步的；所述单克隆抗体用于其它植物材料中免疫印迹运用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

1、本发明的一种多酚氧化酶的单克隆抗体，对多酚氧化酶具有高亲和力和高特异性，能广泛地用于对多酚氧化酶检测上，特别是烟草不同组织部位多酚氧化酶表达和定位，以及不同植物叶片中多酚氧化酶表达；此外，本发明的单克隆抗体提供了一个靶向蛋白研究的工具，使得能通过免疫印迹法、酶联免疫法，免疫组化和免疫荧光法研究多酚氧化酶的表达。

2、本发明通过提取烟草雌雄蕊总蛋白，以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，elisa法得到能够产出高亲和性和高特异性的单克隆抗体的细胞株，及由细胞株分泌的单克隆抗体，并经酶联免疫，蛋白印记等验证，确定最有效抗体。并采用免疫沉淀加质谱鉴定出多酚氧化酶(polyphenoloxidase,ppo)的单克隆抗体。

3、本发明还公开了上述过多酚氧化酶的单克隆抗体在检测植物多酚氧化酶上的应用，包括用于检测烟草不同组织，雌蕊不同授粉处理前后多酚氧化酶表达量变化；并运用于检测多个植物种叶片中多酚氧化酶表达。

附图说明

图1为不同烟草种花药和授粉雌蕊抗体的蛋白印记wb验证结果示意图；

图2为anti-ppo抗体对目标蛋白的芯片识别效果图；

图3为anti-ppo抗体通过免疫荧光法检测烟草不同组织中ppo表达图；

图4为anti-ppo抗体通过免疫印迹方法检测不同植物种叶片ppo表达图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种用于检测烟草多酚氧化酶的单克隆抗体，所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含seqidno.2所示的cdr1的氨基酸序列gytftdyy，seqidno.4所示的cdr2的氨基酸序列inpyngdt和seqidno.6所示的cdr3的氨基酸序列aredysgssyvanfdy；

所述的单克隆抗体的轻链可变区序列包含seqidno.9所示的cdr1的氨基酸序列ksllhsngity，seqidno.11所示的cdr2的氨基酸序列qms和seqidno.13所示的cdr3的氨基酸序列aqnlelwt；通过提取烟草雌雄蕊总蛋白，以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和elisa法，得到能够产出高亲和性和高特异性的单克隆抗体的细胞株，及由细胞株分泌的单克隆抗体，并经酶联免疫，蛋白印记等验证，确定最有效抗体。并采用免疫共沉淀加质谱鉴定出多酚氧化酶(polyphenoloxidase,ppo)的单克隆抗体。

实施例2：

在实施例1的基础上，单克隆抗体的制备和纯化方法：

(1)抗原的制备

原核表达多酚氧化酶全蛋白作为免疫原，免疫原烟在草雌雄蕊总蛋白中提取，总蛋白偶联vlp以及传统klh系统的免疫原性增强因子；

(2)免疫小鼠

将抗原免疫6只balb/c小鼠，小鼠选用8-12周龄，监测其血清效价以决定最优的免疫次数，初次免疫后会经过4次的加强；监测其血清效价以决定最优的免疫次数，优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原多肽的高亲和力的抗体(igg亚型)，初次免疫后会经过4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度(多酚氧化酶的原核表达蛋白作为抗抗原包被)，滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强，至滴度最高后融合；

(3)血清检测和筛选

免疫小鼠眼眶取血，并用elisa检测血清滴度；血清中多酚氧化酶的原核表达蛋白作为抗原包被，血清效价需大于10k，否则继续加强免疫；

(4)融合及筛选

取全脾和1/2的淋巴结，再与骨髓瘤sp2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上进行培养，收集所有孔的上清，用elisa对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清用elisa检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合；取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤sp2/0细胞系融合，工艺为优化过的peg融合，融合细胞铺到4块384孔板上，进行培养。收集所有孔的上清，用elisa对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养。生长几天后，收集所有孔的上清用elisa检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合，以进行亲和力排序，每个多肽免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆，每个可溶片段免疫原亲和力最高的60个亲代克隆进入亚克隆；

(5)亚克隆及筛选

elisa筛选进行亚克隆得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，elisa检测每个孔上清针对可溶片段检测原和相应多肽检测原的反应，取od值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％时，得到单克隆细胞株，经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备。

(6)抗体上清制备和纯化

获得单克隆细胞株，通过腹部注射到免疫小鼠用于抗体生产，产生的腹水用proteina/g纯化，并用于后续检测。

实施例3：

在实施例1-2的基础上，单克隆抗体的制备和纯化方法：

(1)抗原的制备

原核表达多酚氧化酶全蛋白作为免疫原，免疫原烟在草雌雄蕊总蛋白中提取，总蛋白偶联vlp以及传统klh系统的免疫原性增强因子；

(2)免疫小鼠

将抗原免疫6只balb/c小鼠，小鼠选用8-12周龄，监测其血清效价以决定最优的免疫次数，初次免疫后会经过3次的加强；监测其血清效价以决定最优的免疫次数，优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原多肽的高亲和力的抗体(igg亚型)，初次免疫后会经过3次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度(多酚氧化酶的原核表达蛋白作为抗抗原包被)，滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强，至滴度最高后融合；

(3)血清检测和筛选

免疫小鼠眼眶取血，并用elisa检测血清滴度；血清中多酚氧化酶的原核表达蛋白作为抗原包被，血清效价需大于10k，否则继续加强免疫；

(4)融合及筛选

取全脾和1/2的淋巴结，再与骨髓瘤sp2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上进行培养，收集所有孔的上清，用elisa对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清用elisa检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合；取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤sp2/0细胞系融合，工艺为优化过的peg融合，融合细胞铺到4块384孔板上，进行培养。收集所有孔的上清，用elisa对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养。生长几天后，收集所有孔的上清用elisa检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合，以进行亲和力排序，每个多肽免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆，每个可溶片段免疫原亲和力最高的60个亲代克隆进入亚克隆；

(5)亚克隆及筛选

elisa筛选进行亚克隆得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，elisa检测每个孔上清针对可溶片段检测原和相应多肽检测原的反应，取od值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％时，得到单克隆细胞株，经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备。

(6)抗体上清制备和纯化

获得单克隆细胞株，通过腹部注射到免疫小鼠用于抗体生产，产生的腹水用proteina/g纯化，并用于后续检测

实施例4：

在实施例1-3的基础上，单克隆抗体用于抗体与抗原多肽的elisa验证；

elisa验证：

(1)取待配对腹水抗体包被96孔elisa板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，pbs洗涤，4℃保存待用；

(2)抗原多肽孵育，pbs洗涤，同时设置对照；

(3)hrp标记检测抗体，加入到孵育有(1)中的elisa板中；

(4)tmb显色反应，酶标仪读数；监测抗体效价。

实施例5：

在实施例1-4的基础上，单克隆抗体用于抗体的内源蛋白wb验证；

wb验证：使用不同烟草种雌雄蕊全蛋；白裂解液，抗体稀释浓度1：1000进行wb验证；检测该蛋白在不同种花药中表达量差异。

实施例6：

在实施例1-5的基础上，单克隆抗体用于抗体芯片检测实验；

芯片检测实验：

(1)使用芯片点样仪将anti-ppo抗体及对照抗体点制于以nc膜为基质的玻璃片，形成直径为100um的抗体点；

(2)将烟草雌雄蕊全蛋白进行生物素标记，按2ug/ml的浓度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时；

(3)pbs轻柔清洗三遍，再用cy3-sa荧光二抗进行孵育，pbs清洗三遍，使用genepix荧光芯片扫描仪523nm扫描芯片；检测anti-ppo抗体对目标蛋白有富集结合效果。

实施例7：

在实施例1-6的基础上，单克隆抗体用于测序；进行多个阳性克隆测序得到最终序列结果。

实施例8：

在实施例1-7的基础上，测序包括：

(1)将anti-ppo抗体的杂交瘤细胞株进行培养并提取总rna，将mrna反转录成第一链cdna；

(2)通过pcr扩增重链及轻链基因并将扩增基因克隆至测序载体，进行多个阳性克隆测序得到最终序列结果。

实施例9：

在实施例1-8的基础上，单克隆抗体用于检测烟草不同组织多酚氧化酶蛋白表达和定位；该抗体能有效检测烟草不同组织和细胞中的多酚氧化酶表达，且能初步判断多酚氧化酶在这些组织中的表达和定位。

实施例10：

在实施例1-9的基础上，单克隆抗体用于检测酚氧化酶蛋白的表达和定位方法：

(1)取烟草根、茎、叶、雌蕊、雄蕊和花粉管组织和细胞材料，4％多聚甲醛固定，常规石蜡切片处理；

(2)切片按免疫荧光步骤处理，分别孵抗本中的抗多酚氧化酶一抗和荧光二抗；

(3)荧光显微镜观察不同组织中多酚氧化酶的表达和定位；该抗体能有效检测烟草不同组织和细胞中的多酚氧化酶表达，且能初步判断多酚氧化酶在这些组织中的表达和定位。

实施例11：

在实施例1-10的基础上，单克隆抗体用于其它植物材料中免疫印迹运用，抗体能运用于检测多个植物中多酚氧化酶表达的检测，为本申请的抗体的跨物种间运用提供了指导。

抗多酚氧化酶单克隆抗体的验证

对获得的单克隆抗体细胞株进行酶联免疫，免疫印记，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定抗体有效性。

(1)抗体与抗原多肽的elisa(免疫酶联)验证

取待配对腹水抗体包被96孔elisa板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，pbs洗涤，4℃保存待用。抗原多肽孵育，pbs洗涤，同时设置对照。hrp标记检测抗体，加入到孵育有前述的elisa板中。tmb显色反应，酶标仪读数。抗体效价如表一所示：

表一抗体elisa的抗体效价

(2)抗体的内源蛋白免疫印记(wb)验证

不同烟草种雌雄蕊全蛋白裂解液，抗体稀释浓度1：1000进行wb验证。实验结果显示，anti-ppo在wb验证中，可以特异性的识别65kd条带，与预期大小相符，同时，该蛋白在不同种花药中表达量显著差异，如图1所示。由于本发明的抗体对多酚氧化酶具有特异性，可作为专门检测多酚氧化酶表达的检测抗体，可将其进一步开发为检测试剂盒。

(3)抗体芯片检测实验

使用芯片点样仪将anti-ppo抗体及对照抗体点制于以nc膜为基质的玻璃片，形成直径为100um的抗体点。将烟草雌雄蕊全蛋白进行生物素标记，按2ug/ml的浓度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时。pbs轻柔清洗三遍，再用cy3-sa荧光二抗进行孵育，pbs清洗三遍，使用genepix荧光芯片扫描仪523nm扫描芯片。

实验结果如图2所示，anti-ppo抗体对目标蛋白有明显富集结合效果，荧光强度较强，而对照抗体没有发生抗原抗体结合反应。

(4)抗多酚氧化酶单克隆抗体测序

将anti-ppo抗体的杂交瘤细胞株进行培养并提取总rna，将mrna反转录成第一链cdna；通过pcr扩增重链及轻链基因并将扩增基因克隆至测序载体，进行多个阳性克隆测序得到最终序列结果。

(5)免疫荧光检测烟草不同组织多酚氧化酶蛋白表达和定位

由于本发明的抗体对多酚氧化酶具有特异性，可运用于在组织水平原位检测蛋白表达和定位。取烟草根、茎、叶、雌蕊、雄蕊和花粉管等组织和细胞材料，4％多聚甲醛固定，常规石蜡切片处理。切片按免疫荧光步骤处理，分别孵抗本专利中的抗多酚氧化酶一抗和荧光二抗。荧光显微镜观察不同组织中多酚氧化酶的表达和定位。图3可知，该抗体能有效检测烟草不同组织和细胞中的多酚氧化酶表达，且能初步判断多酚氧化酶在这些组织中的表达和定位。

(6)烟草抗多酚氧化酶在其它植物材料中免疫印迹运用实验

基于不同植物种间的相同蛋白具有同源性，探究本发明中的抗烟草多酚氧化酶抗体在其它植物材料中的免疫印迹运用。以不同植物的叶片提取蛋白，开展实验。图4显示，图中，k代表烟草叶片；mls，马铃薯；fq，番茄；qz，茄子；kf，咖啡；pt,葡萄；cd，菜豆；bm，蓖麻2；blh，博落回；hg，黄瓜；cha,茶；wj，莴苣；kg，苦瓜本申请抗体能运用于检测多个植物中多酚氧化酶表达的检测，为本申请抗体的跨物种间运用提供了指导。

尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。