一种非综合征型先天缺牙相关的低频/罕见突变及其检测方法与流程

文档序号：20787375发布日期：2020-05-19 21:50阅读：498来源：国知局

本发明属于医学的生物医药领域，涉及非综合征型先天缺牙相关的低频/罕见突变及其检测方法。

背景技术：

先天性缺牙(toothagenesis)指由于牙胚发育异常造成的先天性牙齿数量减少。根据是否伴有全身症状可分为非综合征型先天缺牙(non-syndromictoothagenesis)和综合征型先天缺牙(syndromictoothagenesis)。先天性缺牙的发病率据报道为2.2％-10.1％(不包括第三磨牙缺失)，且女性的发病率高于男性。

先天性缺牙(toothagenesis)分类：根据缺牙的数量可分为少数牙缺失(缺牙数＜6个，最常见第三磨牙的缺失)、多数牙缺失(除第三磨牙以外，缺牙数≥6个)和先天性无牙(所有牙齿先天缺失)。非综合征型先天缺牙多被认为和遗传相关，其遗传方式涉及常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和x连锁遗传，可为散发性或家族性。

发现先天性缺牙相关的致病基因及突变，对先天性缺牙的诊断筛查具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供一种非综合征型先天缺牙相关的低频/罕见突变，同时将非综合征缺牙家系作为非综合征先天缺牙相关疾病的研究模型，结合全基因组外显子测序及sanger测序检测方法，可以为非综合征型先天缺牙致病机理的解析、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据。

本发明提供了一种非综合征型先天缺牙相关的低频/罕见突变，突变基因为fgfr1，其突变后序列为seqidno.3所示。

本发明提供的一种非综合征型先天缺牙相关的fgfr1突变基因，与野生型fgfr1基因相比，fgfr1基因序列的第三外显子上第103位碱基由g突变为a。

本发明中所涉及fgfr1基因突变经检测和验证，符合常染色体显性遗传，为非综合征先天缺牙致病基因，突变基因为杂合突变，fgfr1:exon3:c.g103a。其中野生型fgfr1基因在ncbi数据库中的转录组编号为nm_001174063，该基因在第三外显子中第103位碱基由g突变为a，其他部分与野生型相同。由于突变发生在外显子区，因此本发明提供的seqidno.4是fgfr1野生型的基因序列，供参比。

本发明还提供一种突变的fgfr1蛋白，np_001167534，p.g35r在该野生型蛋白的第35位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸，即所述蛋白是在野生型fgfr1蛋白的第35位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸，其他部分与野生型相同。

野生型fgfr1蛋白在ncbi数据库中的编号为：np_001167534。

本发明还提供所述的fgfr1突变基因在非综合征型先天缺牙机理研究、筛查、辅助诊断和/或治疗中的应用。

本发明还提供本发明所述的fgfr1突变基因的检测方法，包括如下主要步骤：

(1)提取基因组dna；

(2)sanger测序：对fgfr1突变基因合成引物，进行基因型检测，fgfr1基因序列的第三外显子中的第103位碱基由g突变为a，为非综合征型先天缺牙的指示。

本发明所述的检测方法中，步骤(1)提取基因组dna可以为本领域常用的生物样品，例如血液。

在一种实施例中，本发明所述的检测方法中，步骤(2)所述引物序列如seqidno：1和seqidno：2所示。

本发明还提供一种用于检测所述fgfr1突变基因的引物，序列如seqidno：1和seqidno：2所示。

本发明还提供了所述引物在制备用于筛选fgfr1突变基因的试剂中的应用。

一种筛选fgfr1突变基因的试剂盒，包括本发明所述的引物，所述试剂盒还可以进一步包含dna提取试剂。

本发明基于遗传家系，结合全基因组外显子测序及sanger测序检测方法，包括如下主要步骤：

(1)收集家系，并对家系成员进行规范的口腔检查：口内先天缺牙(不包括第三磨牙缺失)，并询问是否有家族缺牙遗传史(无先天缺牙家族史)，签署知情同意，并收集家系成员外周血；

(2)辅助检查：全景片：母亲13、23缺失(第三磨牙缺失除外)，儿子15、13、23、25、35、33、31、41、43、45缺失(第三磨牙缺失除外)，父亲无缺牙；

(3)基因检测：抽取外周血，抽提dna，通过全基因组外显子测序筛选出致病基因；

(4)筛选候选基因：根据1000gemomesproject、esp6500siv2-all、genomad-all和genomad-eas及sift、polyphen-2、mutationtaster等软件进行生物信息学分析，并遵循基因型-表型共分离。

sanger测序验证：在所有家系成员中进行验证，明确其是否携带该基因，同时符合常染色体显性遗传模式。

在本发明的一种实施例中，还提供一种更为具体的非综合征缺牙的致病基因检测方法，主要步骤如下：

(1)对患者进行详细家族史调查(无先天缺牙家族史)；进行规范的口腔检查，患者的体征：口内牙齿缺失(不包括第三磨牙缺失)；签署知情同意，采集家系成员外周血，并抽提dna；

(2)利用序列捕获技术将全基因组外显子区域dna捕获并富集后在illumina平台进行高通量测序；

(3)对测序结果进行生物信息学分析，按照基因型表型共分离分析，筛选出候选突变基因；

(4)通过患者家系相关成员样本进行sanger测序，pcr正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示。

本发明的优点是：非综合征型先天缺牙是临床常见的缺牙类型，通过对这个遗传家系患者的基因检测我们发现了fgfr1基因对牙齿发育的影响。因此，这个家系可以作为非综合征型先天缺牙相关疾病的研究模型，并对非综合征型先天缺牙等相关疾病的临床基因诊断、筛查及精准治疗等具有潜在的重要价值。本发明所述的突变基因可以为非综合征型先天缺牙致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础。

附图说明

图1是非综合征型先天缺牙的家系d图谱；

图2是家系中所有成员的全景片；

图3是筛选致病基因流程图；

图4是sanger测序验证结果，其中野生型为ⅰ1基因分型结果，突变型为ⅰ2和ⅱ1基因分型结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1.样本的选择(均为中国汉族)

发明人从南京医科大学附属口腔医院收集了诊断明确的一个非综合征型先天缺牙家系。家系d共三人(图1)，经检查后发现其中母亲13、23缺失(第三磨牙缺失除外)，儿子15、13、23、25、35、33、31、41、43、45缺失(第三磨牙缺失除外)，父亲表型正常(图2)。家系中每个人均不伴有其他相关系统性疾病。在该遗传疾病的诊治过程中，患者依从性较好，具有主观治疗的意愿，所有研究对象均签署知情同意书(18岁以下者，由其监护人代签)，并经过医疗机构的伦理审批，完成相应流行病学调查，并提供1-3ml外周血标本。

2.基因组dna提取

采用qiagen试剂盒提取每个研究对象的基因组dna，经异丙醇沉淀后得到基因组dna，dna沉淀经ae溶解测定浓度后，稀释分装存入-20℃冰箱保存备用。

具体步骤：

(1)400μl抗凝血中加入500μl细胞裂解液cl，颠倒混匀5次；

(2)12,000rpm(13,400×g)离心1min，弃上清；

(3)重复上述1,2步骤，充分裂解细胞；

(4)加入200μl缓冲液fg与proteasek混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块；

(5)65℃水浴15min，期间颠倒混匀数次；

(6)加入200μl异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组dna；

(7)12,000rpm(13,400×g)离心5min，弃上清；

(8)加入200μl70％乙醇，涡旋震荡5s，12,000rpm(13,400×g)离心2min，弃上清；

(9)将离心管倒置在干净的吸水纸上至少5min，确保沉淀在管中；

(10)空气干燥dna沉淀直至所有液体挥发干净；

(11)加入ae50μl，4℃冰箱保存10天后，使用紫外分光计检测dna的浓度和纯度，依据所测浓度稀释分装，分装完成后将三种液体(原液即母液、次级母液、使用液)置于-20℃冰箱中保存备用。

3.本研究对家系成员分别进行全外显子测序，由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，步骤包括对dna样品进行检测；建库捕获；库检；上机测序。

4.生物信息分析流程：如图3所示，包括测序数据质量评估；变异检测；变异筛选及与疾病相关性的预测。

根据条件筛选致病基因：

(1)对家系中所有人进行全基因组外显子测序，在所有snp/indel中剔除1000genomesproject，esp6500siv2-all，genomad-all和gnomad-eas四个数据库中maf＞0.01的突变，并保留其中的错义突变、移码突变及产生终止密码子的突变共1882个snp/indel突变位点；

(2)保留sift(＜0.05),polyphen-2(＞0.909),mutationtaster(d)和cadd(＞20)四个软件中至少有三个预测为有害的突变位点，共1310个snp/indel突变位点；

(3)根据常染色体显性/伴性的遗传模型，筛选后留有161个snp/indel变异位点；

(4)在筛选出的候选基因中，用phenolyzer软件进行与非综合征型先天缺牙的相关性预测，经分析获得其中fgfr1基因c.g103a突变是有可能在此家系中导致非综合征型先天缺牙的一个重要突变位点。

为进一步验证fgfr1基因第三外显子上c.g103a突变与非综合征型先天缺牙的关联性，我们进一步通过sanger测序验证家系中成员是否携带该基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成：

(1)dna提取及质检；

(2)利用软件primerpremier5引物设计(seqidno：1和seqidno：2所示)用于pcr；

(3)pcr扩增后，将pcr产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的pcr条带切胶回收；

(4)测序产物进行纯化，上机电泳，用sequenceanalysis分析结果，基因分型结果，如图4所示，非综合征型先天缺牙患者均为杂合突变，而正常对照在该位点未发现突变。由此根据本发明的设计方案，可以在此实施例中成功证实通过全基因组外显子测序所检测到的该fgfr1基因第三外显子上的c.g103a突变可能为非综合征型先天缺牙新致病位点，且杂合即可致病，可见，本发明所提供的fgfr1突变基因可以用于非综合征型先天缺牙机理研究、筛查、辅助诊断和/或治疗。

序列表

<110>南京医科大学附属口腔医院

<120>一种非综合征型先天缺牙相关的低频/罕见突变及其检测方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aaacattgacggagaagtaggtg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>5691

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>3

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<210>4

<211>5691

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>4