基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法与流程

本发明属于分析化学领域，特别涉及蛋白原位分析方法的开发与应用。

背景技术：

阿尔兹海默症(alzheimerdisease，ad)是一种神经退行性疾病，其主要症状有记忆力减退和认知行为困难，对患者造成极大痛苦。脑内蛋白的异常一般早于症状的出现。因此，对于阿尔兹海默症的病理研究有助于病情的发现与治疗。β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，aβ蛋白)级联假说是公认的阿尔兹海默症的发病机理，即过量的aβ蛋白在脑内沉积形成淀粉样斑块引发神经系统的退行性改变。

目前，针对aβ蛋白的研究样品主要来源于脑脊液和血浆。脑脊液中aβ水平的改变并不具有特异性；血浆样品来源于外周组织，无法对ad的病理有直观的体现。研究脑内aβ蛋白沉积情况对于阿尔兹海默症的病理研究及药物筛选等至关重要。

成像技术使脑内蛋白水平变化可视化，提供了病理变化的时间空间信息。临床上ad的分期主要通过计算机断层扫描(ct)、放射性标记共振成像(mri)来实现，但这些技术不足以呈现ad早期斑块的形成。通过正电子发射断层扫描(pet)可以检测微小斑块，但存在放射性标记的潜在危险。传统的免疫组化染色与免疫荧光检测也可对脑内的aβ进行成像研究，但存在操作复杂、影响因素多等缺陷。特别是，以上成像手段都无法对脑内的aβ进行原位定量分析。

总之，现有技术仍然缺乏快速、准确、直观的确定aβ蛋白在脑内沉积情况的方法，从而缺乏有效的筛选阿尔茨海默病治疗药物的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于金属标记技术的免疫质谱成像方法，具体来说，双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌n-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)(以下简称ru-nhs酯)和aβ抗体耦联形成螯合物后，经过免疫反应，使ru间接标记在脑组织中的aβ蛋白上，然后通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(la-icp-ms)检测脑组织切片上的ru的信号强度，绘制脑组织切片上以及进一步绘制脑组织中aβ蛋白的分布图，从而在不破坏脑组织的完整性的前提下，实现了aβ蛋白的原位成像，能够完整、精确地展现脑组织中aβ蛋白的分布位置及聚集程度，并具有溯源性，从而有利于对阿尔兹海默症的发明机理进行研究。另外，本发明还可实现对脑组织中aβ蛋白的定量检测。本发明的方法操作简单，特异性和灵敏度高，稳定性好，重复性强。

根据本发明的一个方面，本发明提供一种螯合物，由双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌n-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)(ru-nhs酯)和aβ抗体耦联形成。本领域技术人员可以理解，ru-nhs酯将aβ抗体氨基酸侧链氨酰化形成本发明的螯合物。优选地，螯合物中ru-nhs酯和aβ抗体的摩尔比为50:1-500:1，更优选为约500:1。

本领域可以理解，各种能够与aβ蛋白结合的aβ抗体均可用于本发明。优选地，所述抗体来自于哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等；所述抗体能够与哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等aβ蛋白结合；所述抗体能够与β淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein，app)、aβ1-40、aβ1-42中的一种或多种结合，优选aβ1-42；所述aβ抗体为单克隆抗体。本领域技术人员可以理解，aβ抗体可以商购获得或者通过本领域已知的方法制备得到。

根据本发明的另一个方面，本发明提供上述螯合物的制备方法，该方法包括将ru-nhs酯和aβ抗体反应的步骤。优选地，该方法包括以下步骤：

(1)将ru-nhs酯溶解溶剂中；优选，溶剂选自dmso、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物，最优选，溶剂为dmso；

(2)将aβ抗体溶解在溶剂中；优选，溶剂为pbs或pb，最优选，溶剂为pbs；

(3)将步骤(1)所得溶液和步骤(2)所得溶液混合，反应；优选，反应在避光、室温、震荡下进行；优选，反应时间为0.1-10h，最优选约1h；

(4)在步骤(3)所得溶液中加入甘氨酸以终止反应；优选，该步骤在避光、室温、震荡下进行；优选，该步骤时间为5-30min，最优选10-15min；

(5)将步骤(4)所得溶液用透析管进行透析纯化。

优选，步骤(1)所得ru-nhs酯溶液的浓度为50-500μg/ml，最优选约100μg/ml。

优选，步骤(2)所得aβ抗体溶液的浓度为0.5-10μg/ml，最优选约2μg/ml；优选，pb和pbs的ph值为7.8-8.0，浓度为10-12mm。

优选，步骤(3)中，步骤(1)所得溶液中ru-nhs酯和步骤(2)所得溶液中aβ抗体的摩尔比至少为50:1，优选至少为500:1，或者优选为50:1-1000:1，进一步优选为50:1-600:1，更优选为500:1-1000:1。

优选，步骤(4)中，甘氨酸以其水溶液的形式加入；优选，甘氨酸水溶液的浓度为1-3m，最优选约2m；优选，ru-nhs酯和甘氨酸的摩尔比为1:400-1:1200，最优选约1:800。

本领域技术人员可以理解，步骤(5)透析是为了纯化螯合物，去除未耦合的ru-nhs酯、甘氨酸等。优选，步骤(5)中透析管为10kd，透析液为pbs或pb，优选10-12mm、ph7.8-8.0的pbs或pb，透析液的用量以体积计至少为步骤(4)所得溶液的1000倍，更优选为4000-6000倍，最优选约5000倍，透析时间为10-60min，最优选约30min，优选透析两次。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种试剂盒，含有上述螯合物。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种离体脑组织中aβ蛋白的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)取离体脑组织进行冰冻切片、丙酮固定、破膜、灭活过氧化氢酶、并封闭；优选，脑组织切片的厚度约为10μm；

(2)将上述螯合物的溶液滴加到步骤(1)所得脑组织切片上，静置8-16h，优选约12h，使脑组织中的aβ蛋白与上述螯合物中的aβ抗体结合；优选，静置温度为4℃；优选，在静置过程中保持脑组织切片湿润；

(3)洗去脑组织切片中未结合的螯合物，晾干，用la-icp-ms检测ru信号；优选，用pbs溶液(例如10-12mm，ph值7.0-8.0)洗去未结合的螯合物，例如3次，每次5分钟；优选，检测¹⁰²ru信号；优选，采用¹³c信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响；

(4)根据步骤(3)得到的数据对脑组织切片上的aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的aβ进行成像。

本领域技术人员可以理解，在上述步骤(1)中，通过本领域已知的常规方法对脑组织进行冰冻切片、丙酮固定、破膜、灭活过氧化氢酶和封闭。例如：

取离体脑组织置于4％多聚甲醛中固定，隔日取出后分别在20％、30％蔗糖溶液中梯度脱水，待脑组织沉入溶液底部后取出，用oct冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切片，室温放置例如30分钟，用超纯水洗去切片上的oct包埋剂；

将切片放入4℃丙酮中固定例如10分钟，取出后用pbs(例如10-12mm，ph值7.0-8.0，优选10mm，ph7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；

向脑组织滴加破膜液(例如0.1％tritonx-100)，时间例如5分钟，用pbs(例如10-12mm，ph值7.0-8.0，优选10mm，ph7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；

向脑组织滴加3％的双氧水例如100μl以灭活过氧化氢酶，时间例如30分钟，用pbs(例如10-12mm，ph值7.0-8.0，优选10mm，ph7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；

用10％的山羊血清或牛血清例如100μl对脑组织进行封闭，时间例如20分钟，倾去血清。

优选地，步骤(2)中，螯合物的溶液中，螯合物的浓度为0.5-10μg/ml，最优选约2μg/ml，溶剂为10-12mm、ph7.8-8.0的pbs或pb。

优选地，步骤(3)中，la的条件为能量2.05j/cm²，激光频率为20hz，光斑大小为100μm，扫描速度为40μm/s。

根据本发明，脑组织来自于哺乳动物，例如来自于人、小鼠、兔、山羊等。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种离体脑组织中aβ蛋白的定量检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)取离体脑组织，进行匀浆、冰冻切片；优选，脑组织切片的厚度约为10μm；

(2)配制不同浓度的ru-nhs酯的标准溶液；优选，溶剂选自dmso、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物；

(3)将步骤(1)得到的脑组织切片反复浸泡在步骤(2)得到的不同浓度的ru-nhs酯的标准溶液中并晾干；优选，每浸泡5min取出晾干，重复6次；

(4)用la-icp-ms检测步骤(3)所得脑组织切片的ru信号；优选，检测¹⁰²ru信号；优选，采用¹³c信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响；

(5)将步骤(3)所得脑组织切片中的脑组织刮下，称重，用硝酸消解，用icp-ms对所得溶液中的ru进行测定，并根据重量得到ru的浓度；

(6)用步骤(4)及(5)所得数据制作标准曲线，其中横坐标为步骤(5)得到的ru的浓度，纵坐标为步骤(4)得到的ru的信号强度；

(7)按照本发明的方法用ru-nhs酯和aβ抗体耦联形成的螯合物对脑组织切片上的aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的aβ进行成像；

(8)根据步骤(7)所用螯合物中ru-nhs酯和aβ抗体的摩尔比，以及步骤(6)标准曲线所给出ru的浓度与信号强度之间的关系，基于步骤(7)得到的脑组织切片aβ成像图或脑组织aβ成像图得到相应的aβ定量图。

根据本发明，脑组织来自于哺乳动物，例如来自于人、小鼠、兔、山羊等。

本领域技术人员可以理解，使用本发明的方法，可以筛选治疗阿尔兹海默症的药物，因此，根据本发明的另一个方面，本发明提供一种治疗阿尔兹海默症的药物筛选方法，该方法包括以下步骤：使用本发明的方法对未给予和给予待筛选药物的患有ad的哺乳动物离体脑组织中的aβ蛋白进行检测，并比较。优选，所述哺乳动物为小鼠、兔、山羊等。

本发明的优点在于，在不破坏脑组织的完整性的前提下，实现了aβ蛋白的原位成像，能够完整、精确地展现脑组织中aβ蛋白的分布位置及聚集程度，并具有溯源性，从而有利于对阿尔兹海默症的发明机理进行研究。另外，本发明还可实现对脑组织中aβ蛋白的定量检测。本发明的方法操作简单，特异性和灵敏度高，稳定性好，重复性强。

附图说明

图1.脑组织切片上的aβ成像图，左侧为正常鼠脑，右侧为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑

图2.脑组织切片传统免疫组化染色图，左侧a为正常鼠脑，右侧b为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑

图3.脑组织切片上所检测到的ru的信号强度与浓度的标准曲线

图4.脑组织切片上的原位aβ定量图，左侧为正常鼠脑，右侧为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1.ru-nhs酯和aβ抗体耦联的螯合物及其制备

(1)精密天平称取ru-nhs酯粉末，使用dmso溶解混匀，使浓度为100μg/ml。

(2)取anti-β-amyloid(biolegend)，用10mm、ph8.0的pbs溶解，使浓度为2μg/ml。

(3)将5μl步骤(1)所形成的溶液加到100μl步骤(2)所形成溶液中，涡旋混匀，避光室温震荡反应1h。

(4)在步骤(3)所形成溶液中加入2μl，2m甘氨酸水溶液终止反应，避光室温震荡15min。

(5)步骤(4)形成溶液使用10kd透析管置于500ml，10mm、ph8.0的pbs中透析两次，每次30min。

(6)透析后的溶液可置于离心管中4℃储存。经检测，所得螯合物中ru-nhs酯和anti-β-amyloid的摩尔比为500:1。

实施例2.离体脑组织中aβ蛋白的检测

(1)分别取6月龄正常小鼠和转基因阿尔兹海默模型小鼠，麻醉后经生理盐水灌流后断头取脑。

(2)步骤(1)所得脑组织置于4％多聚甲醛中固定后，隔日取出后分别在20％、30％蔗糖溶液中梯度脱水，脑组织沉入溶液底部后取出。

(3)步骤(2)所得脑组织使用oct冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切成10μm的薄片。

(4)步骤(3)所得脑组织切片室温放置30min。用超纯水洗去切片上的oct包埋剂。

(5)将步骤(4)所得切片放入4℃预冷的丙酮中固定10min，取出后用10mmpbsph7.4清洗5min*3次。

(6)向步骤(5)处理后的脑组织滴加破膜液0.1％tritonx-100，5min后用10mmpbsph7.4清洗5min*3次。

(7)在步骤(6)所得脑组织上滴加3％的双氧水，30min以灭活过氧化氢酶，再一次用10mmpbsph7.4进行清洗5min*3次。

(8)用10％的山羊血清对步骤(7)所得脑组织进行封闭，室温20min后，倾去血清。

(9)向步骤(8)所得脑组织加入50μl2μg/ml实施例1制备得到的螯合物的pbs溶液，充分覆盖。将切片置于湿盒中，保持湿润环境，4℃孵育过夜。

(10)步骤(9)中所得脑组织使用pbs溶液(10mm,ph7.4)进行清洗，洗涤5min*3次，将未结合的抗体洗去。晾干后，进行la-icp-ms检测。la对切片上的组织进行剥蚀，icp-ms选取¹⁰²ru、¹³c进行信号监测，其中采用¹³c信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响。

(11)根据步骤(10)得到的数据对脑组织切片上的aβ进行成像，见附图1。进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的aβ进行成像。

另外，向步骤(8)所得脑组织加入50μl2μg/ml的anti-β-amyloid(biolegend)的pbs溶液，充分覆盖。将切片置于湿盒中，保持湿润环境，4℃孵育过夜。隔日取出切片后，加入辣根酶标记的二抗，置于37℃恒温箱中45min，最后加入dab显色5min，显微镜观察，见附图2。

比较附图1和2可知，或者比较正常小鼠和转基因阿尔兹海默模型小鼠脑组织切片上的aβ成像图可知，本发明的方法可用于检测离体脑组织中的aβ蛋白。

实施例3.离体脑组织中aβ蛋白的定量检测

(1)取6月龄正常小鼠，麻醉后经生理盐水灌流后断头取脑，匀浆，使用oct冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切成10μm的薄片；

(2)配置ru浓度分别为0、1、2、3、4μg/ml的ru-nhs酯的甲醇标准溶液。

(3)将步骤(1)得到的切片室温放置20min后，浸泡在步骤(2)得到的不同浓度ru的甲醇标准溶液中，浸泡方式为每浸泡5min取出晾干，重复6次。

(4)la对步骤(3)所得切片进行剥蚀，icp-ms选取¹⁰²ru、¹³c进行信号监测，其中采用¹³c信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响。

(5)另取步骤(3)所得切片，将脑组织刮下，称重后，置于消解罐中，加入2ml重蒸硝酸，将消解罐置于加热板上，180℃，加热3h，用icp-ms对所得溶液中的ru进行测定，并根据重量得到ru的浓度。

(6)用步骤(4)及(5)所得数据制作标准曲线，其中横坐标为步骤(5)得到的ru的浓度，纵坐标为步骤(4)得到的ru的信号强度，见附图3，用于脑成像图中ru的信号强度与ru浓度的转换。

(7)根据实施例1所制备的螯合物中ru-nhs酯和aβ抗体的摩尔比500:1，以及步骤(6)标准曲线所给出ru的浓度与信号强度之间的关系，基于实施例2得到的脑组织切片aβ成像图，绘制原位aβ定量图，见附图4。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。