生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

β-石竹烯(β-caryophyllene，简称为石竹烯)是一种双环倍半萜类化合物，分子式为c15h24，常温下不溶于水，仅溶于乙醇、氯仿等有机熔剂，石竹烯广泛存在于各种植物之中，在植物抵抗细菌、真菌感染以及虫害中有重要作用。石竹烯常温下为无色至微黄色液体，有丁香气味，味道温和，因此在中国被批准为允许使用的食品香料(gb2760-1996)，此外在药品、化妆品等方面都有广泛应用。同时又由于其有较高的密度和燃烧热，因此被列为下一代航空燃料。目前石竹烯的来源主要依赖自植物中提取，同时早在1964年就实现了石竹烯的化学合成，但这些方法都面临着效率低，浓度低，类似物难以分离，回收率低等问题。近年来随着“微生物细胞工厂”的兴起，以微生物作为宿主生产化合物受到了更多的关注，为石竹烯的合成提供了新的思路。

与其他萜烯类化合物的合成类似，在合成石竹烯的宿主中，经由甲羟戊酸(mva)途径或2-c-基-d-赤藓糖醇-4-磷酸(mep)途径合成萜烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)以及异戊二烯焦磷酸(ipp)，随后二者在牻牛儿基焦磷酸合成酶(gpps)的作用下合成牻牛儿基焦磷酸(gpp)，随后在法尼基焦磷酸合酶(fpps)的作用下与一分子异戊二烯焦磷酸加成生成法尼基焦磷酸(fpp)。最后在石竹烯合酶(cs)的作用下合成石竹烯。早在2011年，有研究者在工程菌内实现了石竹烯的异源生物合成。通过过表达artemisiaannua来源的石竹烯合酶(qhs1)在光和蓝细菌集胞藻pcc6803中实现了46.4±2.9μg/l/week的石竹烯产量，此后在大肠杆菌中研究者通过引入mva途径，加强从五碳前体dmapp和ipp到倍半萜前体fpp的转化以及投入可快速转化mva途径前体乙酰辅酶a的乙酸盐实现了72小时1.05g/l的石竹烯产量。

尽管在大肠杆菌中，石竹烯的生产取得了较好的成果，但是大肠杆菌等异养生物发酵，消耗大量的糖类等生物质，可能存在与人争粮等问题，并造成一些经济和道德影响。由于蓝细菌能够仅利用空气中的二氧化碳以及光照作为唯一碳源和能量来源，因此，光和蓝细菌作为传统上以生物质作为基础的“微生物细胞工厂”的替代品来生产绿色燃料及化学品受到了广泛的关注，目前已经实现了以二氧化碳为底物合成几十种化合物。

目前“光合微生物细胞工厂”主要以集胞藻pcc6803，聚球藻pcc7942和聚球藻pcc7002作为底盘细胞，这几种光合底盘细胞较慢的生长速度，对于高光和高温的低耐受性限制了其作为“光合微生物细胞工厂”的应用。聚球藻utex2973是一种在聚球藻utex625中最新分离出来的一种聚球藻，它能在41℃，1500μmolephotonsm^-2s^-1以及3％二氧化碳的情况下达到1.5h的倍增时间，这一生长速度与酿酒酵母中1.5h的倍增时间相近，远远超过目前几种模式蓝细菌。同时utex2973的基因组与被广泛研究的聚球藻pcc7942有99.8％的相似度，仅存在55个单碱基突变或插入缺失以及一个大的染色体翻转，这使得对于聚球藻pcc7942的研究对于在聚球藻utex2973中工作的开展起到了很好的帮助。在早先的研究中，聚球藻utex2973在作为生产蔗糖和糖原的“光合微生物细胞工厂”时有着非常好的表现。在本课题组先前的研究中，我们为聚球藻utex2973验证了一系列启动子和诱导系统，开发了转录调控系统，使得在聚球藻utex2973复杂的代谢工程成为可能。先前虽然蓝细菌中以及实现了石竹烯的生产，但是仅46.4±2.9μg/l/week的产量难以满足工业需求。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌。

本发明的第二个目的是提供一种生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌在生产石竹烯中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)分别构建基础载体psi-spe、psii-cm和psiii-kan：

按照pbr322质粒骨架、中性位点nsi上游同源臂基因、壮观霉素抗性基因spe^r、启动子pcpc560、终止子trbcl、中性位点nsi下游同源臂基因的顺序组装成载体psi-spe；

按照pbr322质粒骨架、中性位点nsii上游同源臂基因、氯霉素抗性基因cm^r,、启动子pcpc560、终止子trbcl、中性位点nsii下游同源臂基因的顺序组装成载体psii-cm；

按照pbr322质粒骨架、中性位点nsiii上游同源臂基因、卡那霉素抗性基因kan^r、启动子pcpc560、终止子trbcl、中性位点nsiii下游同源臂基因的顺序组装成载体psiii-kan；

pbr322基本骨架如seqidno.56所示；

所述中性位点nsi上游同源臂基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；

所述壮观霉素抗性基因spe^r的核苷酸序列如seqidno.9所示,

所述启动子pcpc560的核苷酸序列如seqidno.1所示；

所述终止子trbcl的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述中性位点nsi下游同源臂基因的核苷酸序列如seqidno.4所示；

所述中性位点nsii上游同源臂基因的核苷酸序列如seqidno.5所示；

所述氯霉素抗性cm^r的核苷酸序列如seqidno.10所示；

所述中性位点nsii下游同源臂基因的核苷酸序列如seqidno.6所示；

所述中性位点nsiii上游同源臂基因的核苷酸序列如seqidno.7所示；

所述卡那霉素抗性基因kan^r的核苷酸序列如seqidno.11所示；

所述中性位点nsiii下游同源臂基因的核苷酸序列如seqidno.8所示；

(2)用启动子ppsba1替换psi-spe中的启动子pcpc560，在启动子ppsba1终止子trbcl之间按顺序插入牻牛儿基焦磷酸/法尼基焦磷酸合酶基因ispa、蓝细菌用高强度核糖体结合位点序列rbs、经密码子优化的牻牛儿基焦磷酸合酶基因gpps、启动子ptrc和异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi1，构建载体psi-ispa-gpps-idi1sc；

所述启动子ppsba1的核苷酸序列如seqidno.18所示；

所述牻牛儿基焦磷酸/法尼基焦磷酸合酶基因ispa的核苷酸序列如seqidno.14所示；

所述蓝细菌用高强度核糖体结合位点序列rbs的核苷酸序列如seqidno.55所示；所述经密码子优化的牻牛儿基焦磷酸合酶基因gpps的核苷酸序列如seqidno.16所示，所述基因gpps是根据北美冷杉abiesgrandis中gpps2氨基酸序列对于聚球藻utex2973密码子优化后得到的；

所述启动子ptrc的核苷酸序列如seqidno.17所示；

所述异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi1核苷酸序列如seqidno.15所示；

(3)在psii-cm的启动子pcpc560与终止子trbcl之间插入异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi1，构建载体psii-idi1sc；

所述异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi1核苷酸序列如seqidno.15所示；

(4)用启动子ppsba3替换psiii-kan中的启动子pcpc560，在启动子ppsba3与终止子trbcl之间插入经密码子优化的石竹烯合酶基因tps21，构建载体psiii-tps21；

所述启动子ppsba3核苷酸序列如seqidno.12所示；

所述石竹烯合酶基因tps21的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述基因tps21为根据拟南芥arabidopsisthaliana中tps21氨基酸序列对于聚球藻utex2973密码子优化后得到的，

(5)将所述质粒psi-ispa-gpps-idi1sc，psiii-tps21以及psii-idi1sc转入聚球藻utex2973获得基因工程菌。

上述方法构建的生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌。

上述生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌在生产石竹烯中的应用。

本发明的优点：

本发明利用合成生物学方法围绕石竹烯高效生物合成的限速问题对聚球藻utex2973进行系统的针对性改造，得到高效的一种生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌，命名为nsi-gpps-ispa-idi1sc-ii-idi1sc-iii-tps21。实验证明，本发明的基因工程菌最终石竹烯的产量在96h达到212.37μg/l，单位时间产量为现有技术的8倍，这对利用光合微生物生产石竹烯具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为载体psi-ispa-gpps-idi1sc图示。

图2为载体psii-idi1sc图示。

图3为载体psiii-tps21图示。

图4为工程菌nsi-gpps-ispa-idi1sc-ii-idi1sc-iii-tps21在光生物反应器中的生长和生产曲线。

具体实施方式

本发明各实施例使用聚球藻utex2973(synechococcuselongatesutex2973)，保藏自美国utex藻种资源保藏中心，于2015年9月7日购入。

pcp3031(sunt,lis,songx,etal.re-directionofcarbonfluxtokeyprecursormalonyl-coaviaartificialsmallrnasinphotosyntheticsynechocystissp.pcc6803[j].biotechnologyforbiofuels,2018,11(1):26.)

pcp0168(sunt,lis,songx,etal.re-directionofcarbonfluxtokeyprecursormalonyl-coaviaartificialsmallrnasinphotosyntheticsynechocystissp.pcc6803[j].biotechnologyforbiofuels,2018,11(1):26.)

pja2-sll0649(taos,lex,linaw,etal.identificationofanewtargetslr0946oftheresponseregulatorsll0649involvingcadmiumtoleranceinsynechocystissp.pcc6803[j].frontiersinmicrobiology,2017,8:1582-.)

通用质粒pbr322、ptrc99a均为市售质粒。

大肠杆菌dh5α(escherichiacolidh5α)感受态细胞购自全式金公司。

下面的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明但并不用于限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

分别构建基础载体psi-spe、psii-cm和psiii-kan

采用细菌基因组提取试剂盒提取聚球藻utex2973基因组作为模板，以seqidno.19和seqidno.20所示序列为上、下游引物，进行pcr扩增得到中性位点nsi上游同源臂基因(seqidno.3)；以seqidno.21和seqidno.22所示序列为上、下游引物，进行pcr扩增得到中性位点nsi下游同源臂基因(seqidno.4)；以seqidno.23和seqidno.24所示序列为上、下游引物，进行pcr扩增得到中性位点nsii上游同源臂基因(seqidno.5)；以seqidno.25和seqidno.26所示序列为上、下游引物，进行pcr扩增得到中性位点nsii下游同源臂基因(seqidno.6)；以seqidno.27和seqidno.28所示序列为上、下游引物，进行pcr扩增得到中性位点nsiii上游同源臂基因(seqidno.7)；以seqidno.29和seqidno.30所示序列为上、下游引物，进行pcr扩增得到中性位点nsiii下游同源臂基因(seqidno.8)；

以整合型质粒pcp3031作为模板，以seqidno.31、seqidno.32分别作为从启动子pcpc560到终止子trbcl序列的上、下游引物，进行pcr扩增，获得启动子pcpc560与终止子trbcl。(seqidno.1，seqidno.2)

采用通用载体pbr322，以seqidno.33、seqidno.34分别作为pbr322质粒骨架的上、下游引物，进行pcr扩增，获得pbr322质粒骨架(seqidno.56)。

采用pcp3031作为模板，以seqidno.35、seqidno.36分别作为壮观霉素抗性基因上、下游引物，进行pcr扩增，获得壮观霉素抗性基因spe^r(seqidno.9)。

采用pcp0168作为模板，以seqidno.37、seqidno.38分别作为氯霉素抗性基因上、下游引物，进行pcr扩增，获得氯霉素抗性基因cm^r(seqidno.10)。

采用pja2-sll0649作为模板，以seqidno.39、seqidno.40分别作为卡那霉素抗性基因上、下游引物，进行pcr扩增，获得卡那霉素抗性基因kan^r(seqidno.11)。

取浓度为10ng/μl的dna模板溶液1μl，2×phantamaxbuffer10μl，10μm的dntp0.4μl，10μm的上、下游片段引物各1μl，phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase0.2μl，无菌水6.4μl，在pcr管中混匀；将pcr管放入pcr仪中进行扩增循环，扩增程序为：95℃180s；95℃15s，55℃15s，72℃30s/kb，共30个循环；72℃300s，4℃5min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，经dna纯化试剂盒纯化，获得目的基因片段。

将扩增得到的pbr322质粒骨架、中性位点nsi上游同源臂基因、壮观霉素抗性基因spe^r、启动子pcpc560与终止子trbcl、中性位点nsi下游同源臂基因的顺序利用组装试剂盒进行组装成基础载体psi-spe；

将扩增得到的pbr322质粒骨架、中性位点nsii上游同源臂基因、氯霉素抗性基因cm^r,、启动子pcpc560与终止子trbcl、中性位点nsii下游同源臂基因的顺序利用组装试剂盒进行组装成基础载体psii-cm；

将扩增得到的pbr322质粒骨架、中性位点nsiii上游同源臂基因、卡那霉素抗性基因kan^r、启动子pcpc560与终止子trbcl、中性位点nsiii下游同源臂基因的顺序利用组装试剂盒组装成基础载体psiii-kan；

将获得的pcr产物按照10ng/1000bp/μl的稀释，取每种pcr产物1μl，无菌水1μl，5×cemultisbuffer2μl，multis1μl，37℃反应30min。反应结束后转化大肠杆菌dh5a，克隆分别用引物seqidno.19，seqidno.22；seqidno.23，seqidno.26；seqidno.27，seqidno.30验证。

实施例2

构建载体psi-ispa-gpps-idi1sc采用基础载体psi-spe，以seqidno.41、seqidno.42分别作为psi-spe质粒骨架的上、下游引物，进行pcr扩增，获得不含启动子pcpc560的psi-spe质粒骨架。

采用聚球藻utex2973基因组作为模板，以seqidno.43、seqidno.44分别作为ppsba1启动子的上、下游引物，进行pcr扩增，获得ppsba1启动子(seqidno.18)。

采用细菌基因组提取试剂盒提取的大肠杆菌mg1655基因组作为模板，以seqidno.45、seqidno.46分别作为牻牛儿基焦磷酸/法尼基焦磷酸合酶基因ispa的上、下游引物，进行pcr扩增，获得基因ispa(seqidno.14)。

以连接到通用载体puc57的经密码子优化的牻牛儿基焦磷酸基因gpps为模板，以seqidno.47、seqidno.48分别作为经密码子优化的牻牛儿基焦磷酸合酶基因gpps的上、下游引物，进行pcr扩增，获得经密码子优化的牻牛儿基焦磷酸合酶基因gpps。(seqidno.16)。seqidno.47中带有蓝细菌用高强度核糖体结合位点序列rbs(seqidno.55)。

采用通用载体ptrc99a作为模板，以seqidno.49、seqidno.50分别作为ptrc启动子的上、下游引物，进行pcr扩增，获得启动子ptrc(seqidno.17)。

采用酵母基因组提取试剂盒提取的酿酒酵母by4741基因组作为模板，以seqidno..51、seqidno.52分别作为异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi1的上、下游引物，进行pcr扩增，获得基因idi1(seqidno.15)。

取浓度为10ng/μl的dna模板溶液1μl，2×phantamaxbuffer10μl，10μm的dntp0.4μl，10μm的上下游片段引物各1μl，phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase0.2μl，无菌水6.4μl，在pcr管中混匀；将pcr管放入pcr仪中进行扩增循环，扩增程序为：95℃180s；95℃15s，55℃15s，72℃30s/kb，共30个循环；72℃300s，4℃5min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，经dna纯化试剂盒纯化，获得目的基因片段。

将不含启动子pcpc560的psi-spe质粒骨架、启动子ppsba1、基因ispa、基因gpps、启动子ptrc和基因idi1利用组装试剂盒进行组装得到载体psi-ispa-gpps-idi1sc。

将获得的pcr产物按照10ng/1000bp/μl的稀释，取每种pcr产物1μl，无菌水1μl，5×cemultisbuffer2μl，multis1μl，37℃反应30min。反应结束后转化大肠杆菌，克隆分别用引物seqidno.43，seqidno.32验证。

实施例3

构建载体psii-idi1sc采用基础载体psii-cm，以seqidno.53、seqidno.54分别作为psii-cm质粒骨架的上、下游引物，进行pcr扩增，获得psii-cm质粒骨架。

采用酵母基因组提取试剂盒提取的酿酒酵母by4741基因组作为模板，以seqidno.51、seqidno.52分别作为异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi1的上、下游引物，进行pcr扩增，获得基因idi1(seqidno.15)。

将psii-cm质粒骨架与基因idi1利用组装试剂盒进行组装得到载体构建载体psii-idi1sc。

将获得的pcr产物按照10ng/1000bp/μl的比例稀释，取每种pcr产物1μl，无菌水1.5μl，5×cemultisbuffer1μl，multis0.5μl，37℃反应30min。反应结束后转化大肠杆菌，克隆分别用引物seqidno.31、seqidno.32验证。

实施例4

构建载体psiii-tps21采用基础载体psiii-kan，以seqidno.57、seqidno.58分别作为psiii-kan质粒骨架的上、下游引物，进行pcr扩增，获得不含启动子pcpc560的psiii-kan质粒骨架。

采用聚球藻utex2973基因组作为模板，以seqidno.59、seqidno.60分别作为ppsba3启动子的上、下游引物，进行pcr扩增，获得启动子ppsba3(seqidno.12)。

以连接到通用载体puc57的经密码子优化的石竹烯合酶基因tps21为模板，以seqidno.61、seqidno.62分别作为石竹烯合酶基因tps21的上、下游引物，进行pcr扩增，获得基因tps21(seqidno.13)。

将不含启动子pcpc560的psiii-kan质粒骨架、启动子ppsba3以及基因tps21利用组装试剂盒进行组装得到载体构建载体psiii-tps21。

将获得的pcr产物按照10ng/1000bp/μl的稀释，取每种pcr产物0.5μl，无菌水2μl，5×cemultisbuffer1μl，multis0.5μl，37℃反应30min。反应结束后转化大肠杆菌，克隆分别用引物seqidno.59，seqidno.32验证。

实施例5

(1)大肠杆菌的转化

大肠杆菌的转化采用氯化钙法，将过夜培养的大肠杆菌dh5a培养过夜以1:50的比例将其转移到50毫升新鲜lb培养基中，细胞生长到对数期(od600nm≈0.3)时，将大肠杆菌置于冰上冷却30分钟，之后将菌体于离心管内在4℃、6000转离心5分钟，弃去培养基，用0.1m氯化钙重悬细胞，冰上孵育30分钟，之后于离心管内在4℃、6000转离心5分钟，将菌体用5毫升0.1m氯化钙和1毫升80％(v/v)甘油重悬，按200μl一个分装至1.5毫升离心管，冻存于-80℃冰箱中，制成感受态细胞。

转化时按每个转化1管感受态取出感受态细胞，于冰上融化后，加入10μl组装产物，冰上孵育30分钟后，于水浴锅中，42℃热击1分钟后放回冰上孵育3分钟，每管转化加入500μl新鲜lb培养基于37℃摇床孵育60分钟，离心将菌体涂在含有适当(100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml氯霉素，100μg/ml壮观霉素，50μg/ml卡那霉素)抗生素的固体lb培养基上。

(2)聚球藻的转化

将带有prl443和prl623的大肠杆菌hb101，即helper，和带有单一目标质粒的大肠杆菌培养过夜，然后以1:50的比例将其转移到含有适当(分别为100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml氯霉素，100μg/ml壮观霉素，50μg/ml卡那霉素)抗生素的新鲜lb培养基中。当细胞生长到对数期(od600nm≈0.5)时，将2ml每种大肠杆菌菌株用新鲜(lb)培养基洗涤两次，以去除所有抗生素，然后重悬于0.1mllb培养基中，混合在一起，并孵育30分钟。将1ml处于对数生长期的聚球藻utex2973(od750nm≈0.5)培养物离心并重悬于0.2ml液体bg11培养基中(当转化的菌株培养基含有抗生素时，需要再洗涤两次)。然后将样品与上述大肠杆菌悬浮液混合并温育30分钟。将混合物涂布在铺有无菌滤膜(孔径为0.45μm)的含5％(v/v)lb培养基的固体bg11培养基上。在大约100μmolphotosm^-2s^-1的光照强度下孵育24小时后，将滤膜转移到新的固体bg11培养基上，其中应添加抗生素(分别为80μg/ml氯霉素，50μg/ml壮观霉素，50μg/ml卡那霉素)。连续三次转化后得到菌株nsi-gpps-ispa-idi1sc-ii-idi1sc-iii-tps21。

所述液体bg11培养基：nano31.5g，k2hpo4.3h2o0.04g，mgso4·7h2o0.075g，edta0.001g，na2co30.02g，h3bo32.86g，mncl2·4h2o1.81g，znso4·7h2o0.222g，namoo4·5h2o0.390g，cuso4·5h2o0.079g，co(no3)2·6h2o0.0494g，cacl2·2h2o0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，加水至1l。

所述固体bg11培养基：nano31.5g，k2hpo4.3h2o0.04g，mgso4·7h2o0.075g，edta0.001g，na2co30.02g，h3bo32.86g，mncl2·4h2o1.81g，znso4·7h2o0.222g，namoo4·5h2o0.390g，cuso4·5h2o0.079g，co(no3)2·6h2o0.0494g，cacl2·2h2o0.036g，柠檬酸铁铵0.006g，琼脂15g，加水至1l。

(3)将菌株nsi-gpps-ispa-idi1sc-ii-idi1sc-iii-tps21在液体bg11培养基中光照培养96h后，将30ml聚球藻utex2973的菌体离心收集在离心管中，冷冻干燥后，利用甲醇-氯仿-水萃取的方法将菌体中的脂溶性物质提出，氯仿相用0.22μm过滤器过滤，通过gc-ms检测测定石竹烯的含量。菌株nsi-gpps-ispa-idi1sc-ii-idi1sc-iii-tps21的石竹烯产量为121.233±9.732μg/l。

(4)将菌株nsi-gpps-ispa-idi1sc-ii-idi1sc-iii-tps21按照接种比例为10％接种在含有终体积5l液体bg11培养基的7.5l光生物反应器中，控制温度为38℃，ph为8.5，光照为1000μmolephotonsm^-2s^-1，搅拌桨转速为600rpm，通入空气速度为1vvm的情况下，石竹烯产量在96h时达到最大，为212.37μg/l。

序列表

<110>天津大学

<120>生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌及其构建方法与应用

<160>62

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>560

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acctgtagagaagagtccctgaatatcaaaatggtgggataaaaagctcaaaaaggaaag60

taggctgtggttccctaggcaacagtcttccctaccccactggaaactaaaaaaacgaga120

aaagttcgcaccgaacatcaattgcataattttagccctaaaacataagctgaacgaaac180

tggttgtcttcccttcccaatccaggacaatctgagaatcccctgcaacattacttaaca240

aaaaagcaggaataaaattaacaagatgtaacagacataagtcccatcaccgttgtataa300

agttaactgtgggattgcaaaagcattcaagcctaggcgctgagctgtttgagcatcccg360

gtggcccttgtcgctgcctccgtgtttctccctggatttatttaggtaatatctctcata420

aatccccgggtagttaacgaaagttaatggagatcagtaacaataactctagggtcatta480

ctttggactccctcagtttatccgggggaattgtgtttaagaaaatcccaactcataaag540

tcaagtaggagattaattca560

<210>2

<211>179

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

accggtgtttggattgtcggagttgtactcgtccgttaaggatgaacagttcttcggggt60

tgagtctgctaactaattagccattaacagcggcttaactaacagttagtcattggcaat120

tgtcaaaaaattgttaatcagccaaaacccactgcttactgatgttcaacttcgacagc179

<210>3

<211>1000

<212>dna

<213>聚球藻(synechococcuselongatus)

<400>3

agcaggtcgttcaaagactgctttggcaatctgaagacccgccaactgttcctgaccaaa60

cagagaggcattgccggtttgagcgatcgccaagcccaagggctgggatccggcagccgg120

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<213>聚球藻(synechococcuselongatus)

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<213>聚球藻(synechococcuselongatus)

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<213>聚球藻(synechococcuselongatus)

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<213>聚球藻(synechococcuselongatus)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

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<211>867

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<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

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<210>16

<211>1146

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

atggcctattccgccatggccaccatgggctacaacggtatggccgccagttgccacact60

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ggcaagcccaccaaccacaaaatctttggcgaagacaccgccgttaccgccggtaacgcc600

ttgcacagttatgccttcgagcatatcgccgtgtccacctccaaaaccgttggcgccgac660

cggattttgcggatggtgtccgaattgggtcgggctaccggcagtgaaggtgtgatgggc720

ggccaaatggtggatattgcctccgaaggcgacccctccattgatttgcagaccttagaa780

tggattcatattcataaaaccgccatgttgttggagtgttccgttgtgtgtggcgccatt840

attggtggcgcctccgaaatcgtgattgaacgggcccggcggtacgctcggtgtgtgggc900

ttgttgtttcaagtggtggacgacatcttggacgtgaccaagtcctccgacgagttaggc960

aagactgccggcaaggatttgatctccgataaggccacctaccccaagttgatgggtttg1020

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<213>聚球藻(synechococcuselongatus)

<400>18

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

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<210>22

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

aaacaaataggggttccgcgcgccggggctggcagcttag40

<210>23

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

ttccattcaggtcgaggtggggatccacgcattttaattctggatg46

<210>24

<211>41

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